CN101374538A - 损伤组织的功能再生促进药物 - Google Patents

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Abstract

本发明人等在世界上首次明确：1)骨髓来源细胞会被大量动员至移植皮肤内；2)所动员的骨髓来源细胞在移植皮肤片内分化为真皮成纤维细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、血管内皮细胞、表皮角化细胞的任一种，在所动员的骨髓来源细胞中含有骨髓来源间充质干细胞；3)将骨髓来源间充质干细胞从末梢血中动员至植皮片的是从移植皮肤的坏死组织中释放的HMGB1、HMGB2、HMGB3；4)精制的HMGB1、HMGB2、HMGB3促进从骨髓分离、培养的间充质细胞的迁移；5)可以简便地从包括皮肤、脑、心脏的多种脏器提取液中精制含有迁移骨髓间充质干细胞的HMGB1的活性物质；6)可以从培养细胞中简便地提取迁移骨髓间充质干细胞的活性物质；7)皮肤提取液肝素柱精制馏分在脑损伤时会大量地动员骨髓来源细胞。

Description

损伤组织的功能再生促进药物
技术领域
本发明涉及损伤组织的功能再生促进药物。
背景技术
近年来，各种干细胞在损伤组织的修复过程中的贡献已经明确，通过将大量干细胞动员至损伤部位来诱导功能的组织再生的新型再生医疗的开发正在盛行。为了实现这种新型的再生医疗，有必要的是：1)生物体内丰富地存在可动员至损伤部位的干细胞、2)将干细胞动员至损伤部位的因子可以被分离、鉴定。
可动员至损伤部位的干细胞有存在于损伤部或其附近组织的组织干细胞和存在于末梢血中的骨髓来源干细胞。近年来有报告指出，骨髓来源细胞对多个损伤组织再生具有作用，但对于骨髓来源细胞对损伤组织的动员机理还不清楚。这里所说的骨髓来源细胞与具有向血液细胞(白细胞、红细胞)的分化能力的造血系干细胞不同，目前包括以被称作骨髓间充质干细胞的细胞为代表的干细胞或者存在于骨髓中的组织前体细胞集团。骨髓间充质干细胞为具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的分化能力的未分化干细胞，而且可以进一步分化为成纤维细胞、肌肉细胞、基质细胞、肌腱细胞等其它间充质细胞。近年来，已经证明骨髓间充质干细胞分化成神经细胞、进而分化成上皮细胞(皮肤角化细胞等)和血管内皮细胞(非专利文献9)。组织前体细胞被定义为具有向血液系统以外的特定组织细胞的单方向性分化能力的未分化细胞，其包括具有向上述间充质组织、上皮组织、神经组织、实质脏器、血管内皮的分化能力的未分化细胞。
HMGB1(High mobility group box 1：高迁移率族蛋白1)是存在于生物体内几乎所有细胞内的分子量约为25000的蛋白质，根据过去的报告，已知有下述功能：1)在细胞内与DNA结合，通过控制染色质结构来调节基因表达(非专利文献1)、2)通过炎症性细胞因子TNF-α、IL-1、LPS的作用，由存在于炎症组织的单细胞或巨噬细胞分泌，并在细胞外结合于RAGE(糖化终产物受体)(非专利文献2)，从而诱导强的炎症反应(非专利文献3)、3)从由于灌注不足而陷入坏死的细胞向周围组织释放(非专利文献4)、4)与重症感染症的败血症患者的炎症进展有关(非专利文献5)、5)在心肌梗塞模型中，通过向梗塞部投予，促进存在于心肌内的干细胞的分裂和增殖，从而促进心肌的再生和功能恢复(专利文献1)、6)在灌注不足肝脏模型动物中，通过在制作灌注不足状态前进行前投予，减轻肝损害的程度(非专利文献6)、7)在肌肉损伤模型中，投予至损伤部位的HMGB1将同时投予的血管前体细胞诱导至损伤部位，从而促进肌肉组织再生(非专利文献7)、8)在神经细胞中诱导神经突起的形成(非专利文献8)等。但是，将骨髓来源干细胞、特别是成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等可分化的所谓间充质干细胞动员至损伤部位的报告之前是没有的。
以往当脑或脊髓的中枢神经细胞一旦受到损害时，是无法再生的。但是，近年来神经干细胞的存在及其诱导成为可能。另外，正常神经系统内的神经干细胞生态位也可以被鉴定。因此，原本不可能的损伤中枢神经系细胞的恢复也变得可以期待。目前，正在果断地展开对于脑脊髓损伤、退行性疾病等的神经再生的相关研究。
作为脑组织(细胞)损伤的原因，主要是外伤导致的脑挫伤、脑缺血性疾病。其它原因可以举出以脑肿瘤摘除手术为代表的脑外科手术所引起的。特别是，由脑实质细胞产生的神经胶质瘤的全部摘除很困难，为了避免运动或语言功能障碍，不得不姑息地摘除。另外，恶性神经胶质瘤的生命预后也差，以化学疗法或放射线疗法为首的近年来研究盛行的免疫-基因治疗也未显示充分的效果。因此，理想的是尽可能地摘除更多的肿瘤细胞、从而结果是脑功能损伤恢复的治疗。
非专利文献1：Bustin等，Mol Cell Biol，19：5237-5246，1999年
非专利文献2：Horiet等，J.Biol.Chem.，270，25752-25761，1995年
非专利文献3：Wang等，Science，285：248-251，1999年
非专利文献4：Muller等，EMBO J，20：4337-4340，2001年
非专利文献5：Wang等，Science，285：248-251，1999年
非专利文献6：Germani等，J.Leukoc.Biol.，81，2007电子期刊版
非专利文献7：Palumbo等，J.Cell Biol.，164：441-449，2004年
非专利文献8：Merenmies等，J.Biol.Chem.，266：16722-16729，1991年
非专利文献9：Yaojiong等，Stem cells，25：2648-1659
专利文献1：日本特表2005-537253
发明内容
本发明的目的在于提供对将分化为损伤组织的细胞动员至损伤部位的因子进行分离、鉴定并利用该因子的发明。
当明确分化成损伤组织的细胞的动员因子时，通过将该因子投予至损伤部位，可以将存在于末梢血中分化为损伤组织的细胞或存在于局部组织中分化为损伤组织的细胞大量地动员至损伤部位，从而可以开发用于促进功能组织再生的新型再生医疗。
本发明人等对于在移植皮肤片在生物体组织中生长的过程中将骨髓来源细胞从皮肤外组织动员至移植皮肤片以有助于皮肤组织再生的可能性进行了研究，在世界上首次发现：1)骨髓来源细胞被大量动员至移植皮肤内、2)被动员的骨髓来源细胞在移植皮肤片内分化成真皮成纤维细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、血管内皮细胞、表皮角化细胞中的任一种，且在被动员的骨髓来源细胞中含有骨髓来源间充质干细胞、3)将骨髓来源间充质干细胞从末梢血中动员至植皮片是通过从移植皮肤的坏死组织释放的HMGB1、HMGB2、HMGB3进行的、4)经精制的HMGB1、HMGB2、HMGB3促进从骨髓中分离、培养的间充质干细胞的迁移、5)利用肝素亲和柱通过柱色谱法可以简便地从包括皮肤、脑、心脏的多种脏器提取液中精制含有使骨髓间充质干细胞迁移的HMGB1的活性物质、6)可以从培养细胞简便地提取使骨髓间充质干细胞迁移的活性物质、7)皮肤提取液肝素柱精制馏分在脑损伤时会大量动员骨髓来源细胞。本申请以此发现为基础，提供以下的发明。
[1]一种骨髓来源细胞的诱导剂，其含有下述(a)～(i)中任一项所述的成分：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
[2]根据上述[1]所述的诱导剂，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
[3]一种组织再生促进剂，其含有下述(a)～(i)中任一项所述的成分：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
[4]一种组织再生促进用试剂盒，其含有下述(a)～(i)中任一项所述的成分：
(a)HMGB1蛋白质，
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞，
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
[5]一种具有骨髓来源细胞诱导活性的提取液，其为通过包括将细胞浸渍于溶剂的工序的方法而制造的细胞的提取液。
[6]一种具有骨髓来源细胞诱导活性的细胞的提取液的制造方法，其包括将细胞浸渍于溶剂的工序。
[7]一种具有骨髓来源细胞诱导活性的馏分，其为用包括下述工序的方法制造的肝素结合馏分：
(a)将细胞浸渍在溶剂中的工序；
(b)使工序(a)获得的提取液接触于固定化肝素的工序；以及
(c)从固定化肝素中洗脱肝素结合馏分的工序。
[8]一种具有骨髓来源细胞诱导活性的肝素结合馏分的制造方法，其包括下述工序：
(a)将细胞浸渍在溶剂中的工序；
(b)使工序(a)获得的提取液接触于固定化肝素的工序；以及
(c)从固定化肝素中洗脱肝素结合馏分的工序。
[9]一种骨髓来源细胞的诱导剂，其含有上述[5]所述的提取液或通过上述[6]所述的方法制造的提取液、或者上述[7]所述的馏分或通过上述[8]所述的方法制造的馏分。
[10]根据上述[9]所述的诱导剂，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
[11]一种组织再生促进剂，其含有上述[5]所述的提取液或通过上述[6]所述的方法制造的提取液、或者上述[7]所述的馏分或通过上述[8]所述的方法制造的馏分。
[12]一种组织再生促进用试剂盒，其含有上述[5]所述的提取液或通过上述[6]所述的方法制造的提取液、或者上述[7]所述的馏分或通过上述[8]所述的方法制造的馏分。
[13]一种评价细胞的提取液中是否含有诱导受试细胞的因子的方法，其包括下述工序，其中，工序(b)中的受试细胞的诱导活性比对照高时，则判定细胞的提取液中含有诱导受试细胞的因子，
(a)制备细胞的提取液的工序；以及
(b)测定工序(a)制备的提取液的受试细胞的诱导活性的工序。
[14]一种筛选方法，其对含有诱导受试细胞的因子的细胞的提取液进行筛选，其包括下述工序：
(a)对于多个提取液，利用[13]所述的方法来评价该提取液中是否含有诱导受试细胞的因子的工序；以及
(b)选择在工序(a)中被评价为含有诱导受试细胞的因子的提取液的工序。
[15]一种诱导受试细胞的因子的鉴定方法，其包括下述工序：以受试细胞的诱导活性为指标，从通过[13]或[14]所述的方法判定为含有诱导受试细胞的因子的提取液中精制诱导受试细胞的因子的工序。
[16]一种将骨髓来源细胞诱导至损伤的组织的方法，其包括将下述(a)～(i)中任一项所述的物质投予给组织损伤的对象的工序，
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
[17]根据上述[16]所述的方法，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
[18]一种促进损伤的组织的再生的方法，其包括将下述(a)～(i)中任一项所述的物质投予给组织损伤的对象的工序，
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
[19]一种将骨髓来源细胞诱导至损伤的组织的方法，其包括将[5]所述的提取液或通过[6]所述的方法制造的提取液投予给组织损伤的对象的工序。
[20]一种将骨髓来源细胞诱导至损伤的组织的方法，其包括将[7]所述的馏分或通过[8]所述的方法制造的馏分投予给组织损伤的对象的工序。
[21]根据上述[19]或[20]所述的方法，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
[22]一种促进损伤组织的再生的方法，其包括将[5]所述的提取液或通过[6]所述的方法制造的提取液投予给组织损伤的对象的工序。
[23]一种促进损伤的组织的再生的方法，其包括将[7]所述的馏分或通过[8]所述的方法制造的馏分投予给组织损伤的对象的工序。
[24]下述(a)～(i)中任一项所述的物质在骨髓来源细胞的诱导剂的制造中的用途：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
[25]根据上述[24]所述的用途，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
[26]下述(a)～(i)中任一项所述的物质在组织再生促进剂的制造中的用途：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
[27]上述[5]所述的提取液或通过[6]所述的方法制造的提取液在骨髓来源细胞的诱导剂的制造中的用途。
[28]上述[7]所述的馏分或通过[8]所述的方法制造的馏分在骨髓来源细胞的诱导剂的制造中的用途。
[29]根据上述[27]或[28]所述的用途，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
[30]上述[5]所述的提取液或通过[6]所述的方法制造的提取液在组织再生促进剂的制造中的用途。
[31]上述[7]所述的馏分或通过[8]所述的方法制造的馏分在组织再生促进剂的制造中的用途。
附图说明
图1为表示GFP骨髓移植小鼠制作方法的图。
图2为表示向GFP骨髓移植小鼠背部进行皮肤移植后观察到的移植皮肤片上的GFP荧光聚集的照片。上部左侧照片表示皮肤移植部的肉眼像、上部中央的照片表示移植皮肤和受皮的边界处(“↓”表示的部分)附近处受皮的HE组织像、上部右侧照片表示植皮皮肤的HE组织像。另外，下部左侧照片表示GFP荧光在植皮皮肤上的聚集、下部中央照片表示植皮部的放大像、下部右侧照片表示GFP荧光在相同放大部皮肤上的聚集。
图3为表示聚集在GFP骨髓移植小鼠背部的移植皮肤片上的骨髓来源表皮细胞、骨髓来源真皮成纤维细胞的照片。由左开始的第1列为DAPI染色(核染色)、上部照片表示植皮部皮肤的低倍放大像(100倍)、中部照片以高倍放大像(200倍)表示表皮、真皮边界部、下部以高倍放大像(200倍)表示毛囊部。由左开始的第2列为第1列的各个区域的GFP荧光像，由左开始的第3列表示其角蛋白5(K5)的免疫染色像，由左开始的第4列表示重叠各个荧光而成的像(Merge)。观察到了大量GFP阳性表皮细胞和真皮成纤维细胞。
图4为表示皮肤提取液内的骨髓来源间充质干细胞诱导因子鉴定的流程的图。
图5为表示从切除皮肤片中提取再生诱导因子(骨髓来源间充质干细胞动员因子)的方法的图。
图6为表示使用Boyden小室的皮肤提取液的骨髓来源间充质干细胞迁移能力活性测定结果的照片。上部左侧照片为将从Boyden小室的上槽内经过硅膜上的微细孔后迁移至皮肤提取液侧(下槽侧)并附着在硅膜下槽侧的骨髓间充质干细胞用蓝色色素进行染色而得到的图像，由上开始表示刚开始培养(0h)、12小时后(12h)、24小时后(24h)的染色像(各为4孔)。上部右侧照片为0h的高倍放大像、下部左侧照片为12h的高倍放大像、下部右侧照片为24h的高倍放大像。
图7为表示皮肤提取液精制分馏标准品组中使用Boyden小室的骨髓来源间充质干细胞迁移能力活性测定结果与各个精制分馏标准品的SDS-PAGE电泳结果的对应的照片。由左开始的第1列(M.W.)为将分子量标记物电泳后的银染色图像、第2列(C.E.)为将精制前皮肤提取液电泳后的银染色图像、第3列(H.E.)为将肝素亲和柱结合馏分(中间精制馏分)电泳后的银染色图像、第4～13列(A.E.)为将以各种NaCl浓度洗脱而得到的阴离子交换柱结合馏分(最终精制馏分)电泳后的银染色图像。而且，将骨髓来源间充质干细胞迁移活性最强的最终精制馏分序号4的电泳凝胶银染色图像(列7)的各染色条带切出，进行质量分析和数据库解析，结果可知“←”所示的条带为HMGB1。
图8为表示使用了Boyden小室的HMGB1的骨髓来源间充质干细胞迁移活性测定结果的照片。上部分的两个表示向皮肤提取液中迁移的骨髓来源间充质干细胞的染色像、中间部分的两个表示向HMGB1精制标准品迁移的骨髓来源间充质干细胞的染色像、下部分表示向在中间部分所用的HMGB1精制标准品中添加抗HMGB1多克隆抗体而进行了中和的溶液迁移的骨髓来源间充质干细胞的染色像(迁移活性几乎消失)。
图9为表示生物体内骨髓来源间充质干细胞诱导活性测定方法的图。
图10为表示HMGB1所产生的生物体内骨髓来源间充质干细胞动员活性的照片。HMGB1馏分(最终精制馏分序号4)显示了对象对照(最终精制馏分序号1)的约3倍的动员活性。
图11为表示通过HMGB1馏分(最终精制馏分序号4)在生物体内被动员的细胞的高倍放大的照片。
图12为表示硅胶管内迁移细胞刚开始培养后的照片。左侧照片表示接种于培养基内的迁移细胞的明视野像、右侧照片表示其暗视野的GFP荧光像。
图13为表示硅胶管内迁移细胞在开始培养24小时后的照片。左侧照片表示附着在培养塑料皿中并增殖的成纤维细胞样细胞和上皮细胞样细胞的明视野像，右侧照片表示其暗视野的GFP荧光像。
图14为表示硅胶管内迁移细胞在开始培养2周后的照片。左右的照片为相同视野，左侧照片表示明视野，右侧照片表示透过荧光滤光片(B和D检测GFP荧光，F检测角蛋白5的荧光)的照片。在培养塑料皿上形成圆形群落的骨髓来源GFP阳性细胞集团的左侧可见线状的毛发状形态<用△(箭头)表示)>。F表示骨髓来源细胞呈现毛发状形态变化、且表达了角蛋白5(用△(箭头)表示)。
图15为表示使用Westernblot法检测新生小鼠皮肤提取液中的HMGB家族的照片。
图16为表示哺乳类细胞的HMGB家族的表达载体的MAP的图。大量合成了带有巨细胞病毒增强子(cytomegalovirus enhancer)和鸡β-肌动蛋白启动子(chicken β-actin promoter)、且存在于启动子下游的HMGB家族的cDNA(互补DNA)所编码的mRNA。
图17为表示HEK293细胞中表达的精制重组Flag tag-HMGB家族融合蛋白的Western blot结果的照片。
图18为表示使用Boyden小室的重组HMGB1、HMGB2、HMGB3的骨髓间充质干细胞迁移活性的图。任一重组蛋白与对照相比均显示了迁移活性。
图19为表示小鼠的皮肤溃疡治疗模型的利用HMGB家族进行治疗的效果的图。HMGB1、HMGB2、HMGB3与对照组相比，均显示了显著的溃疡面积缩小的效果。
图20为表示使用Boyden小室来确认人HMGB1和人皮肤提取液迁移人骨髓来源间充质干细胞的活性的照片。
图21为表示用肝素柱精制小鼠心脏、小鼠脑和小鼠皮肤提取液中的骨髓间充质干细胞诱导活性物质、并使用Boyden小室来确认活性的照片。
图22为表示使用Boyden小室法来确认培养细胞株HEK293和HeLa提取液的人骨髓间充质干细胞迁移活性的照片。任一培养细胞株均显示了人骨髓间充质干细胞迁移活性。
图23A为将小鼠固定在脑定位固定装置上，使用手术刀将头部正中央切开、使用钻孔器实施穿头的照片。图23B为使用注射器对脑施加负压、并部分抽吸脑组织的照片。图23C为注入溶解在纤维蛋白糊制剂(纤维蛋白原)中的皮肤提取液肝素柱精制馏分5μl、接着注入纤维蛋白糊制剂(凝血酶)5μl后的照片。图23D和图23E为脑损伤模型治疗后2周后的照片。与对照的23D相比，在利用皮肤提取液肝素柱精制馏分的治疗组23E中可见GFP阳性细胞的聚集。图23F和图23G为脑损伤模型治疗后6周后的照片。与对照的23F相比，在利用皮肤提取液肝素柱精制馏分的治疗组23G中可见GFP阳性细胞的聚集。
具体实施方式
本发明提供一种骨髓来源细胞的诱导剂，其含有以下(a)～(i)所述成分中的至少1个成分：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
通过使用该诱导剂，由于能够将骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)诱导至局部(上述成分的投予、添加部分或其附近)以促进组织的功能再生，因此该诱导剂可以作为用于再生医疗、再生诱导医疗开发的基础研究和临床研究所必需的试剂来使用。例如，能够将骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)动员至实验动物的必要生物体组织，从而可以研究组织修复、组织功能重建的程度。另外，可以在试管内进行利用骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)的动员的组织再生诱导研究。
另外，通过使用上述诱导剂，可以促进损伤组织的再生。另外，上述诱导剂不仅可以期待作为功能性组织再生诱导-促进剂的用途，还可以期待预防组织干细胞的减少所导致的组织-脏器功能降低的所谓预防药物的用途，或者还可以期待作为延缓老龄性变化进行的抗老化药物的用途。
本发明还提供一种组织再生促进剂或组织再生促进用试剂盒，其含有下述(a)～(i)所述成分中的至少1个成分：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
该组织再生促进剂或组织再生促进用试剂盒的特征在于，通过投予在损伤组织部位或其附近，可以将在血液中循环的骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)从末梢血中诱导至该损伤组织(局部诱导)。
另外，作为组织再生促进用试剂盒，可以例示出含有(1)溶解于纤维蛋白原中的上述提取液或上述馏分等和(2)凝血酶的组织再生促进用试剂盒、或者含有(1)上述提取液或上述馏分等、(2)纤维蛋白原和(3)凝血酶的组织再生促进用试剂盒。本发明中，可以使用市售的纤维蛋白原和凝血酶。例如可以举出纤维蛋白原HT-Wf(Benesis-Mitsubishi Pharma)、Beriplast(ZLB Behring)、Tisseel(Baxter)、Bolheal(化血研)、TachoComb(ZLB Behring)，但并非限定于这些。
本发明涉及一种具有骨髓来源细胞诱导活性的细胞的提取液的制造方法，其包括将细胞浸渍于溶剂中的工序。另外，本发明还涉及一种具有骨髓来源细胞诱导活性的提取液，其为通过该制造方法制造的细胞的提取液。
作为浸渍于溶剂中的细胞并无特别限定，可以例示出组织来源细胞、由组织来源细胞建立的细胞株(例如可以例示出Hela、HEK293，但并非局限于这些)、经分离的细胞、未分离的细胞(例如存在于经分离的组织中的细胞)、导入有对HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质进行编码的DNA的细胞等。上述组织可以是任何组织，例如可以例示出生物体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸和血液等)，但并非局限于这些。
上述溶剂可以例示出生理盐水、PBS(Phosphate-buffered saline，磷酸盐缓冲液)、TBS(Tris-buffered saline)，但并非局限于这些。另外，将细胞或组织浸渍于溶剂中的时间为用于诱导细胞坏死所需要的充分的时间，即1小时～48小时(例如6小时～48小时)、优选12～24小时，但并非局限于该时间。因此，“将细胞浸渍于溶剂中的工序”可以说是“将细胞在溶剂中浸渍用于诱导坏死所需要的充分的时间的工序”或“使细胞坏死的工序”。另外，将细胞或组织浸渍于溶剂中的温度可以例示出4℃～25℃(例如4℃～8℃)、优选4℃，但并非局限于此。另外，将细胞或组织浸渍于溶剂中的pH可以例示出pH7～8、优选pH7.5，但并非局限于此。另外，缓冲液的成分可以举出10mM～50mM、优选10～20mM浓度的磷酸缓冲液，但并非局限于此。
另外，本发明中，在将细胞或组织浸渍于溶剂后，还可以从含有细胞或组织的溶剂中除去该细胞或该组织。从溶剂除去细胞或组织的方法只要是本领域技术人员公知的方法，则无特别限定。例如可以在4℃～25℃(例如4℃)、重力加速度为10G～4000G(例如440G)下进行离心并分取上清，从而从溶剂中除去细胞或组织，但并非局限于此。可以将该上清作为细胞或组织的提取液来利用。
而且，本发明还涉及一种包括以下工序的具有骨髓来源细胞诱导活性的肝素结合馏分的制造方法。另外，本发明还涉及一种具有骨髓来源细胞诱导活性的馏分，其为通过该制造方法制造的肝素结合馏分。
(a)将细胞或组织浸渍在溶剂中的工序；
(b)使工序(a)获得的提取液接触于固定化肝素的工序；以及
(c)从固定化肝素中洗脱肝素结合馏分(也记为肝素精制馏分、肝素柱精制馏分)的工序。
固定化肝素是指使肝素共价键合在不溶性载体上而得到的肝素。上述不溶性载体可以例示出琼脂糖珠(琼脂糖4B、琼脂糖6B等：GE Healthcare)，但并非限定于此。本发明中，还可以使用市售的固定化肝素(Hitrap HepalinHP column：GE Healthcare)。
作为细胞或组织的提取液与固定化肝素的接触条件，可以例示出pH为7～8左右(优选pH7.5)、盐浓度为0～200mM、优选100～200mM左右，但并非局限于此。提取液与固定化肝素的接触时间并无特别限定，但从使肝素结合馏分充分吸附在固定化肝素上的观点出发，优选保持5分钟以上。另外，温度可以举出4～8℃、优选4℃，并非局限于此。而且，吸附在固定化肝素上的肝素结合馏分的洗脱条件可以例示出pH为7～8左右、盐浓度为200～1000mM(优选1000mM左右)，但并非局限于此。
另外，本发明还涉及一种包含以下工序的具有骨髓来源细胞诱导活性的阴离子交换体结合馏分的制造方法。另外，本发明还涉及一种具有骨髓来源细胞诱导活性的馏分，其为通过该制造方法制造的阴离子交换体结合馏分。
(a)将细胞或组织浸渍在溶剂中的工序；
(b)使工序(a)获得的提取液接触于固定化肝素的工序；
(c)从固定化肝素中洗脱肝素结合馏分的工序；
(d)使工序(c)获得的肝素结合馏分接触于阴离子交换体的工序；以及
(e)从阴离子交换体中洗脱阴离子交换体结合馏分的工序。
阴离子交换体可以例示出利用了DEAE(二乙氨基乙基)或Q(季铵)的交换体，但并非限定于此。本发明中还可以使用市售的阴离子交换体(例如Source 15Q、Source 30Q、MonoQ、MiniQ、PC3.2/3、MiniQ4.6/50PE、HiTrap IEX Columns、HiTrap SP HP、Q Sepharose High Performance、Hiload16/10 Q Sepharose HP、HiPrep 16/10SP XL、Q Sepharose XL、HiPrer 16/10Q FF、Hi Prep 16/10DEAE FF、Q Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose FastFlow(均为GE Healthcare))。
作为肝素结合馏分与阴离子交换体的接触条件，可以例示出pH为7～9左右(优选pH8)、盐浓度为0～100mM、优选50mM左右，但并非局限于这些。提取液与阴离子交换体的接触时间并无特别限定，但从使阴离子交换体结合馏分充分吸附于阴离子交换体的观点出发，优选保持5分钟以上。另外，温度可以举出4～16℃、优选4℃，但并非局限于这些。而且，作为吸附于阴离子交换体的阴离子交换体结合馏分的洗脱条件，可以例示出pH为7～9左右(优选pH8左右)、盐浓度为100～2000mM(优选1000mM左右)，但并非局限于这些。
另外，本发明涉及一种骨髓来源细胞的诱导剂，其含有上述提取液或上述馏分、或者通过上述方法制造的提取液或通过上述方法制造的馏分。
通过使用该诱导剂，由于能够将骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)诱导至局部(上述成分的投予、添加部位或其附近)以促进组织的功能再生，因此该诱导剂可以作为用于再生医疗、再生诱导医疗开发的基础研究和临床研究所必要的试剂来使用。例如，可以将骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)动员至实验动物的必要的生物体组织，从而可以研究组织修复、组织功能重建的程度。另外，可以在试管内进行利用骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)的动员的组织再生诱导研究。
另外，通过使用上述诱导剂，可以促进损伤组织的再生。另外，上述诱导剂不仅可以期待作为功能性组织再生诱导-促进剂的用途，还可以期待作为预防组织干细胞的减少所导致的组织-脏器功能降低的所谓预防药物的用途，或者还可以期待作为延缓老龄性变化进行的抗老化药物的用途。
而且，本发明涉及一种组织再生促进剂或组织再生促进用试剂盒，其含有上述提取液或上述馏分、或者通过上述方法制造的提取液或通过上述方法制造的馏分。作为再生的组织并无特别限定，只要是损伤的组织，可以是任何组织，例如可以例示出生物体皮肤细胞、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸和血液等)。
该组织再生促进剂或组织再生促进用试剂盒的特征在于，通过投予至损伤组织部位或其附近，将在血液中循环的骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)从末梢血中诱导至该损伤组织(局部诱导)。
另外，组织再生促进用试剂盒可以例示出：含有(1)溶解于纤维蛋白原中的上述提取液或上述馏分等和(2)凝血酶的组织再生促进用试剂盒，或者含有(1)上述提取液或上述馏分等、(2)纤维蛋白原和(3)凝血酶的组织再生促进用试剂盒。本发明中可以使用市售的纤维蛋白原和凝血酶。
被动员至损伤组织的骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)分化成各种细胞，对损伤组织的功能再生和功能维持、功能强化具有作用。本发明中，损伤组织可以举出引起缺血、灌注不足-低氧状态的各种病态、由于外伤、热伤、炎症、自身免疫、基因异常等造成损伤的组织，但并非局限于这些原因。另外，损伤组织还包括坏死组织。
本发明的组织只要是骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)能够分化的组织，则无特别限定，例如可以例示出皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织、脂肪组织、心肌组织、神经系组织、肺组织、消化道组织、肝-胆-胰组织、泌尿-生殖器等生物体内的全部组织。另外，通过使用上述组织再生促进剂，不必说难治性皮肤溃疡、皮肤创伤、水疱症、脱发症等皮肤疾病，就是在脑梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃溃疡、肠炎等组织损伤中也可以进行诱导功能性组织再生的治疗。作为投予上述组织再生促进剂的动物种，可以举出人或非人动物，例如可以例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠等，但并非局限于这些。
本发明的骨髓来源细胞为造血系干细胞及来源于其的白细胞、红细胞、血小板以外的细胞，目前包括以称作骨髓来源间充质干细胞的细胞为代表的干细胞或存在于骨髓中的组织前体细胞集团。本发明的骨髓来源细胞为可以通过骨髓采血或末梢血采血进行分离的细胞。造血系干细胞为非粘附细胞，本发明的骨髓来源细胞通过利用骨髓采血、末梢血采血而获得的血液中的单核细胞馏分细胞培养，作为粘附细胞而获得。另外，本发明的骨髓来源细胞含有间充质干细胞，并优选具有向成骨细胞(可以通过诱导分化时可见钙沉着来鉴定)、软骨细胞(可以通过阿辛蓝(alcian blue)染色阳性、番红O染色阳性等来鉴定)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性来鉴定)、和成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞、以及神经细胞、上皮细胞(例如表皮角质化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、血管内皮细胞的分化能力，但分化后的细胞并非局限于上述细胞，还包括向肝脏、肾脏、胰脏等实质脏器细胞的分化能力。
本发明中，骨髓来源间充质干细胞是指存在于骨髓内的细胞，其从骨髓直接或从其它组织(血液或皮肤、脂肪等间充质组织)间接地采集，能够作为向(塑料或玻璃制)培养皿的粘附细胞来培养和增殖，该细胞的特征是具有向骨、软骨、脂肪等间充质组织的分化能力，其可以通过骨髓血采血、末梢血采血、从间充质组织的采集而获得。另外，骨髓来源间充质干细胞还具有以下特征：通过将暂时粘附在培养皿上的细胞投予至生物体的损伤部，例如还具有向构成皮肤的角化细胞等上皮系组织的分化能力。
本发明的骨髓来源间充质干细胞为多能性干细胞，优选具有除了分化为成骨细胞(可以通过诱导分化时可见钙沉着来鉴定)、软骨细胞(可以通过阿辛蓝染色阳性、番红O染色阳性等来鉴定)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性来鉴定)的能力以外，还优选具有分化为例如成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、肌腱细胞等间充质细胞，神经细胞，色素细胞，表皮细胞、毛囊细胞(表达细胞角蛋白家族、人发角蛋白家族等)、上皮系细胞(例如表皮角质化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族等)，内皮细胞、以及肝脏、肾脏、胰脏等实质脏器细胞的能力，但分化后的细胞并非局限于上述细胞。
另外，人骨髓间充质干细胞可以例示出能够进行骨髓采血、末梢血采血、脂肪采集、直接或将单核细胞馏分分离后进行培养，从而作为粘附细胞而获得的细胞，但并非局限于此。作为人骨髓间充质干细胞的标记物，可以例示出Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性的全部或一部分，但并非局限于这些。
另外，小鼠骨髓间充质干细胞例如可以例示出能够通过实施例所述的方法获得的细胞，但并非局限于此。作为小鼠骨髓间充质干细胞的标记物，可以例示出Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、Sca-1阳性、c-kit阴性的全部或一部分，但并非局限于这些。
组织前体细胞定义为具有向血液系统以外的特定组织细胞单方向性分化能力的未分化细胞，包括具有向上述间充质组织、上皮系组织、神经组织、实质脏器、血管内皮的分化能力的未分化细胞。
本发明的诱导剂和本发明的组织再生促进剂中，作为上述提取液、上述肝素结合馏分、上述阴离子交换体结合馏分或上述(a)～(i)所述成分中至少1个成分以外的成分，只要不阻碍骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)的诱导或组织再生促进，则无特别限定。例如，本发明的组织再生促进剂中除了上述提取液、上述肝素结合馏分、上述阴离子交换体结合馏分或上述(a)～(i)所述成分中的至少1个成分以外，还可以含有强化HMGB1、HMGB2或HMGB3的功能性组织再生诱导功能的相关分子(群)、抑制HMGB1、HMGB2或HMGB3所期待效果以外的作用的分子(群)、控制骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)的增殖或分化的因子、强化-维持这些因子或细胞的功能的其它因子。
作为成为本发明诱导剂或组织再生促进剂中的提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分或HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质的起源的动物种，可以举出人或非人动物，例如可以例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔子、仓鼠、豚鼠等，但优选为与投予上述提取液等的动物种相同的动物种。
作为本发明的诱导剂和组织再生促进剂中的HMGB1蛋白质，可以例示出包含序列号1、3或5所记载的氨基酸序列的蛋白质，但并非局限于这些。本发明的HMGB1蛋白质还包括与包含序列号1、3或5所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质。这种蛋白质例如可以举出：1)包含在序列号1、3或5所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、与包含序列号1、3或5所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的经分离的蛋白质；2)由在严格条件下与包含序列号2、4或6所记载的碱基序列的DNA发生杂交的DNA所编码的蛋白质，其是与包含序列号1、3或5所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的经分离的蛋白质。
作为本发明的诱导剂和组织再生促进剂中的HMGB2蛋白质，可以例示出包含序列号7、9或11所记载的氨基酸序列的蛋白质，但并非局限于这些。本发明的HMGB2蛋白质还包括与包含序列号7、9或11所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质。这种蛋白质例如可以举出：1)包含在序列号7、9或11所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、与包含序列号7、9或11所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的经分离的蛋白质；2)由在严格条件下与包含序列号8、10或12所记载的碱基序列的DNA发生杂交的DNA所编码的蛋白质，其是与包含序列号7、9或11所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的经分离的蛋白质。
作为本发明的诱导剂和组织再生促进剂中的HMGB3蛋白质，可以例示出包含序列号13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质，但并非局限于这些。本发明的HMGB3蛋白质还包括与包含序列号13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质。这种蛋白质例如可以举出：1)包含在序列号13或15所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、与包含序列号13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的经分离的蛋白质；2)由在严格条件下与包含序列号14或16所记载的碱基序列的DNA发生杂交的DNA所编码的蛋白质，其是与包含序列号13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的经分离的蛋白质。
与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的经分离的蛋白质可以为包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质的同族或旁系同源。与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质可以通过本领域技术人员所公知的方法(实验医学别册-基因工程学手册、pp246-251、羊土社、1991年发行)进行分离。
作为与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质，可以举出具有骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)的诱导活性的蛋白质。
包含在序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质包括天然存在的蛋白质。一般来说，真核生物的基因如干扰素基因等中已知的那样，具有多态现象。由于该多态现象所产生的碱基序列的变化，有1个或多个氨基酸被置换、缺失、插入和/或附加的情况。如此自然存在的蛋白质、且具有在序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列中置换、缺失、插入和/或附加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质包括在本发明的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质中。
另外，只要是与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质，即便是人为制作的突变蛋白质也包含在本发明中。作为对所赋予的碱基序列随机地加以突变的方法，例如已知有利用DNA的亚硝酸处理进行的碱基对的置换(Hirose，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，79：7258-7260，1982)。该方法中，通过对预导入突变的片段进行亚硝酸处理，可以将碱基对的置换随机地导入特定的片段内。或者，作为将目标突变引至任意位置的技术，有缺口双链体(gapped duplex)法等(Kramer W.and Fritz H.J.，Methods in Enzymol.154：350-367，1987)。将克隆有应导入突变的基因的环状双链的载体制成单链，并使带有突变的合成寡核苷酸杂交于目标部位。使利用限制性酶剪切而成线状的载体来源的互补单链DNA与上述环状单链载体退火，并用DNA聚合酶填充与上述合成核苷酸之间的空隙，然后通过连接而制成完整的双链环状载体。
所改变的氨基酸数量典型地为50个氨基酸以内，优选为30个氨基酸以内、更优选为5个氨基酸以内(例如1个氨基酸)。
人为地置换氨基酸时，认为如果置换成性质相似的氨基酸，则易于维持原本蛋白质的活性。本发明的蛋白质中包括在上述氨基酸置换中加有保存性置换、且与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质。保存性置换在置换对蛋白质活性重要的结构域的氨基酸等时是非常重要的。这种氨基酸的保存性置换是本领域技术人员所周知的。
作为相当于保存性置换的氨基酸的群组，例如可以举出碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、非带电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
另外，还认为通过非保存性置换，可以进一步提高蛋白质的活性等(例如包括恒定活化型蛋白质等)。
另外，作为获得与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质的方法，可以举出利用杂交的方法。即，将序列号2、4、6、8、10、12、14或16所示的对本发明的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质进行编码的DNA或其片断作为探针，从而将能够与其杂交的DNA分离。在严格的条件下实施杂交时，作为碱基序列选择同源性高的DNA，结果分离的蛋白质中含有与HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质功能相同的蛋白质的可能性提高。同源性高的碱基序列是指可以表现出例如70％以上、优选90％以上的同源性。
另外，严格的条件是指具体例如可以表示6×SSC、40％甲酰胺、25℃下的杂交和1×SSC、55℃下洗涤的条件。严格性由盐浓度、甲酰胺的浓度或温度等条件所左右，但只要是本领域技术人员，就可以按照获得所需严格性来设定这些条件。
通过利用杂交，例如可以分离对包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质以外的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的同族进行编码的DNA。
与包含序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列的蛋白质功能相同的蛋白质通常与序列号1、3、5、7、9、11、13或15所记载的氨基酸序列具有较高的同源性。较高的同源性是指至少30％以上、优选50％以上、更优选80％以上(例如95％以上)的序列的同源性。碱基序列或氨基酸序列的同源性可以使用利用了互联网的同源性检索网址进行[例如日本DNA数据库(DDBJ)中，可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST、以及SSEARCH等同源性检索[例如日本DNA数据库(DDBJ)的网页的同源性检索(Search and Analysis)页：http://www.ddbj，nig，ac.jp/E-mail/homology-j.html]。另外，在National Center for Biotechnology Information(NCBI)中可以进行使用BLAST的检索(例如NCBI主页的网页的BLAST页：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/；Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.，1990，215(3)；403-10；Altschul，S.F.& Gish，W.，Meth.Enzymol.，1996，266：460-480；Altschul，S.F.et al.，Nucleic Acids Res.，1997，25：3389-3402)]。
例如Advanced BLAST 2.1的氨基酸序列的同源性的计算如下进行：程序使用blastp、Expect值设为10、Filter全部为OFF、Matrix使用BLOSUM62、Gap existence cost、Per residue gap cost和Lambda ratio分别设定为11、1、0.85(系统默认值)来进行检索，从而可以获得同源性(identity)的值(％)(Karlin，S.and S.F.Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68；Karlin，S.and S.F.Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-7)。
本发明的蛋白质或与其功能相同的蛋白质可以为加以糖链等生理性修饰、荧光或放射性物质等标记、或与其它蛋白质融合的各种修饰的蛋白质。特别是在后述的基因重组体中，根据所表达的宿主的不同，有糖链所带来的修饰产生差异的可能性。但是，即便糖链的修饰不同，只要是显示与本说明书中公开的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质同样的性状的物质，则均为本发明的HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质或功能相同的蛋白质。
HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质不仅可从生物体材料获得，还可以以将对其编码的基因并入适当的表达体系的基因重组体的形式而获得。为了通过基因工程学方法获得HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质，将编码上述HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质的DNA并入适当的表达体系中并使其表达即可。作为本发明中能够应用的宿主/载体体系，例如可以示出表达载体pGEX和大肠杆菌。pGEX可以使外来基因作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白质而表达(Gene，67：31-40，1998)，因此通过热休克将并入有编码HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的基因的pGEX导入至BL21等大肠杆菌株中，并在适当的培养时间后添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，从而诱导GST融合HMGB1、GST融合HMGB2或GST融合HMGB3蛋白质的表达。本发明的GST由于吸附在谷胱甘肽琼脂糖4B上，因此表达产物可以通过亲和柱色谱法容易地分离并精制。
作为用于获得HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质的重组体的宿主/载体体系，还可以应用以下物质。首先，将细菌用于宿主时，市售有利用了组氨酸标签、HA标签、FLAG标签等的融合蛋白的表达用载体。在酵母中，Pichia属酵母对于具备糖链的蛋白质的表达有效是公知的。在糖链的附加方面，利用以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体的表达体系也是有用的(Bio/Technology，6：47-55，1998)。而且，利用哺乳动物的细胞，进行利用了CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染，这些宿主/载体体系均可作为HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的表达体系来利用。另外，还可以利用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等病毒载体来导入基因。
所得的本发明的蛋白质可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离出来，可以作为实质上纯粹且均匀的蛋白质进行精制。蛋白质的分离、精制可以使用在通常的蛋白质精制中使用的分离、精制方法，并无任何限定。例如，当将色谱柱、滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等进行适当选择、组合时，可以分离、精制蛋白质。
作为色谱法，例如可以举出亲和柱色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤、反相色谱法、吸附色谱法等(Marshak et al.，Strategies forProtein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.EdDaniel R.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1996)。这些色谱法可以使用液相色谱法、例如HPLC、FPLC等液相色谱法来进行。
另外，本发明的蛋白质优选实质上精制过的蛋白质。这里“实质上精制过的”是指本发明的蛋白质的精制度(本发明的蛋白质占全部蛋白质成分的比例)为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％或接近100％。接近100％的上限依赖于本领域技术人员的精制技术和分析技术，例如为99.999％、99.99％、99.9％、99％等。
另外，为具有上述精制度的蛋白质时，无论是通过何种精制方法精制了的蛋白质，都包含在实质上精制过的蛋白质中。例如可以例示出通过适当选择或组合上述的色谱柱、滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等而实质上精制过的蛋白质，但并非局限于这些。
作为释放或分泌本发明的诱导剂或组织再生促进剂中的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的细胞，基本相当于生物体内全部的组织来源细胞。作为易于采集和培养的细胞，例如可以例示出成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和来源于其的细胞株)，但并非局限于此。另外，分泌HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的细胞也可以如下制作：通过将对HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质进行编码的DNA或者在编码HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的DNA上结合有编码分泌信号的DNA(ATGCAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG TGG GTTCCA GGT TCC ACT GGT GAC；序列号17)的DNA插入在公知的表达载体或基因治疗用载体中，将由此制作的载体导入至成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞和来源于其的细胞株)等哺乳类细胞或昆虫细胞、其它细胞中，由此制作。这些细胞来源的动物种并无特别限定，优选使用来源于进行组织再生的对象动物种的细胞、对象本身的细胞、或者与进行组织再生的对象具有血缘者的细胞。
对本发明的诱导剂或组织再生促进剂中的HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质进行编码的DNA只要是编码HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质，则可以是cDNA、也可以是基因组DNA、还可以是天然的DNA、也可以是人工合成的DNA。编码HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的DNA通常在插入在载体(例如基因治疗用载体)的状态下含有在本发明的诱导剂或组织再生促进剂中。
作为本发明的基因治疗用载体，可以例示出质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒被膜载体、乳头瘤病毒载体等，但并非局限于这些。该基因治疗用载体中还可以含有有效诱导基因表达的启动子DNA序列、控制基因表达的因子、用于维持DNA稳定性的必要分子。
另外，在本发明的诱导剂和本发明的组织再生促进剂中还可以含有作为HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的部分肽的具有骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞)的诱导活性的肽、分泌该部分肽的细胞或插入有编码该部分肽的DNA的载体。
本发明的诱导剂或组织再生促进剂的投予方法可以举出口服投予或非口服投予，作为投予方法，具体可以举出注射投予、经鼻投予、经肺投予、经皮投予等。作为注射投予的例子，例如通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等，可以全身或局部地(例如皮下、皮内、皮肤表面、眼球或眼睑结膜、鼻腔粘膜、口腔内和消化道粘膜、阴道-子宫内粘膜或损伤部位等)投予本发明的诱导剂或组织再生促进剂。
另外，可以根据患者的年龄、症状来选择适当的投予方法。投予HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质时，例如在每次投予中，可以在每1kg体重为0.0000001mg～1000mg的范围内选择投予量。或者，例如可以在每位患者为0.00001～100000mg/body的范围内选择投予量。当投予分泌HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的细胞或插入有编码HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的DNA的基因治疗用载体时，对于损伤组织，也可以按照HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的量达到上述范围内的方式进行投予。但是，本发明的诱导剂或组织再生促进剂并非局限于这些投予量。
本发明的诱导剂或组织再生促进剂可以通过常规方法制成制剂(例如Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)、还可以同时含有药学上可容许的载体或添加物。例如可以举出表面活性剂、赋形剂、着色料、香料、保存料、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并非局限于这些，可以适当使用其它常用的载体。具体地说，可以举出轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
另外，上述的细胞提取液，肝素结合馏分，阴离子交换体结合馏分、HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质、分泌HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的细胞、插入有编码HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的DNA的载体、HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞或插入有编码该部分肽的DNA的载体的用途也可以如以下(1)或(2)所示那样表现出来。
(1)一种促进损伤的组织的再生的方法，其包括将细胞提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分、HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的载体、该蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞或插入有编码该部分肽的DNA的载体投予给组织损伤的对象的工序。
(2)一种将骨髓细胞诱导至损伤的组织的方法，其包括将细胞提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分、HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的载体、该蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞或插入有编码该部分肽的DNA的载体投予给组织损伤的对象的工序。
(3)细胞提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分、HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白质、分泌该蛋白质的细胞、插入有编码该蛋白质的DNA的载体、该蛋白质的部分肽、分泌该部分肽的细胞或插入有编码该部分肽的DNA的载体在骨髓来源细胞的诱导剂或组织再生促进剂的制造中的用途。
作为上述组织损伤的对象，可以举出人或非人动物，例如可以例示出人、小鼠、大鼠、猴子、猪、狗、兔子、仓鼠、豚鼠等，但并非局限于这些。
另外，本发明提供评价细胞或组织的提取液中是否含有诱导受试细胞的因子的方法，其包括下述工序，其中，工序(b)中的受试细胞的诱导活性比对照高时，则判定细胞或组织的提取液中含有诱导受试细胞的因子。
(a)制备细胞或组织的提取液的工序；以及
(b)测定工序(a)制备的提取液的受试细胞的诱导活性的工序。
本发明的受试细胞只要是具有能够有助于损伤组织的再生的细胞(也可以表述为可期待诱导损伤组织的再生的细胞)，则无特别限定。本发明的受试细胞可以举出未分化的细胞、处于各种分化阶段的细胞，但并非局限于这些。另外，本发明的受试细胞可以举出干细胞、非干细胞等，但并非局限于这些。另外，作为本发明的受试细胞，可以例示出循环性的细胞、非循环性的细胞。该非循环性的细胞可以例示出组织锚定性的细胞，但并非局限于此。另外，本发明的受试细胞可以例示出循环性的血液细胞、循环性的非血液细胞。另外，本发明的受试细胞可以例示出用于再生损伤组织而有可能需要的细胞。
另外，作为本发明的受试细胞，可以举出骨髓来源细胞、骨髓来源造血系细胞、骨髓来源间充质细胞、损伤组织来源的细胞、来自于与由于损伤而需要再生的组织为同种的组织的细胞、来自于与由于损伤而需要再生的组织不同的组织的细胞、具有损伤组织的个体的组织来源细胞、具有损伤组织的个体以外的同种个体的组织来源细胞、具有损伤组织的个体以外的不同种类个体的组织来源细胞、由上述细胞和组织来源细胞建立的细胞株、上述组织来源癌细胞、将上述细胞进行基因工程学改变而成的细胞等，但并非局限于这些。这些细胞包含具有上述特征的细胞。
作为本发明的受试细胞，可以例示出从骨髓、损伤组织、与由于损伤而需要再生的组织同种的组织、与由于损伤而需要再生的组织不同的组织、具有损伤组织的个体的组织、具有损伤组织的个体以外的同种个体的组织或具有损伤组织的个体以外的不同种类个体的组织中直接或间接地分离出来的细胞。另外，作为本发明的受试细胞，还可以例示出来自于骨髓、损伤组织、与由于损伤而需要再生的组织同种的组织、与由于损伤而需要再生的组织不同的组织、具有损伤组织的个体的组织、具有损伤组织的个体以外的同种个体的组织或具有损伤组织的个体以外的不同种类个体的组织的培养细胞。另外，作为本发明的受试细胞，还可以例示出通过基因工程学的方法或细胞生物学的方法将来自骨髓、损伤组织、与由于损伤而需要再生的组织同种的组织、与由于损伤而需要再生的组织不同的组织、具有损伤组织的个体的组织、具有损伤组织的个体以外的同种个体的组织或具有损伤组织的个体以外的不同种类个体的组织的细胞或培养细胞进行修饰而成的细胞。另外，作为本发明的受试细胞，还可以例示出来自于骨髓、损伤组织、与由于损伤而需要再生的组织同种的组织、与由于损伤而需要再生的组织不同的组织、具有损伤组织的个体的组织、具有损伤组织的个体以外的同种个体的组织或具有损伤组织的个体以外的不同种类个体的组织的肿瘤细胞。
另外，作为本发明的受试细胞，可以例示出含有多种具有特定性质的单一细胞集团的细胞集团、或者具有特定性质的单一细胞集团。前者的具体例子可以例示出从骨髓或损伤组织(血液、皮肤、脂肪等)中直接或间接地采集的细胞群，后者的具体例子可以例示出骨髓来源间充质干细胞或皮肤成纤维细胞，但并非局限于此。
上述方法中，首先将细胞或组织浸渍于溶剂中。上述细胞并无特别限定，可以例示出组织来源细胞、由组织来源细胞建立的细胞株(例如可以例示出Hela、HEK293，但并非局限于这些)、经分离的细胞、未分离的细胞(例如存在于经分离的组织中的细胞)、导入有编码HMGB1、HMGB2或HMGB3蛋白质的DNA的细胞等。上述组织可以是任何组织，例如可以例示出生物体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰脏、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸和血液等)、损伤组织。另外，该溶剂可以例示出生理盐水、PBS、TBS，但并非局限于这些。另外，作为将细胞或组织浸渍于溶剂的时间，优选为诱导细胞坏死所必要的充分的时间(通常为24小时以上)，但并非局限于该时间。另外，本发明中，还可以在将细胞或组织浸渍于溶剂中后，将该细胞或该组织从含有细胞或组织的溶剂中去除。从溶剂中去除细胞或组织的方法只要是本领域技术人员所周知的方法就可，无特别限定。
接着，测定所得的细胞或组织的提取液所产生的受试细胞的诱导活性。作为对照，可以例示出浸渍细胞或组织之前的溶剂。受试细胞的诱导活性例如可以用实施例记载的方法测定，但并非局限于此，还可以通过其它试管内或生物体内细胞迁移能力测定方法来测定。
例如，隔着例如带有孔的膜(例如带有8μm孔的膜)使细胞来源提取液或组织来源提取液与受试细胞相接近、沟通。接着，确认受试细胞是否迁移至细胞或组织的提取液一侧。另外，例如将细胞或组织的提取液投予给实施例所记载的GFP骨髓移植小鼠。GFP骨髓移植小鼠可以如下制作：将从导入有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的转基因小鼠(GFP小鼠)中分离出来的骨髓细胞移植至经致死性放射线照射的小鼠。更具体地说，经由刚照射了致死性放射线(10Gy)后的小鼠尾静脉投予从GFP小鼠的长骨中采集的骨髓细胞(约105个/只)，并等待移入(通常需要约6周以上)。接着，确认作为受试细胞的GFP阳性骨髓来源细胞是否被动员至细胞或组织来源提取液的投予部位。
另外，本发明提供一种筛选方法，其对含有诱导受试细胞的因子的细胞或组织的提取液进行筛选，其包括下述工序：
(a)对于多个提取液，利用上述的评价方法来评价该提取液中是否含有诱导受试细胞的因子的工序；以及
(b)选择在工序(a)中被评价为含有诱导受试细胞的因子的提取液的工序。
而且，本发明还提供一种诱导受试细胞的因子的鉴定方法，其包括下述工序：以受试细胞的诱导活性为指标，从通过上述的评价方法或筛选方法判定为含有诱导受试细胞的因子的提取液中精制诱导受试细胞的因子的工序。诱导受试细胞的因子的精制可以使用在通常蛋白质精制中使用的分离、精制方法，并无任何限定。例如，当将色谱柱、滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等适当选择、组合时，可以分离、精制蛋白质。所精制的因子例如可以通过质量分析等本领域技术人员所周知的方法来进行鉴定。通过使用经鉴定的因子，可以促进损伤组织的再生。因此，该因子可以表述为促进损伤组织的再生的因子或有助于损伤组织的再生的因子。另外，该因子还可以表述为促进损伤组织的再生的候补或有助于损伤组织的再生的候补。
本发明的方法中，还可以使具有特定性质的单一细胞集团从含有多种具有特定性质的单一细胞集团的细胞集团中迁移。在这种情况下，通过本发明的方法，可以鉴定具有特定性质的单一细胞集团和诱导该细胞集团的因子这两者。
另外，本说明书中所引用的全部现有技术文献作为参照编入在本说明书中。
实施例
以下通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并非局限于这些实施例。
[实施例1]
目的：生物体移植皮肤组织的功能再生时的骨髓来源细胞作用的评价
方法：对于上述目的，通过以下的方法进行了研究。
1)利用对GFP骨髓移植小鼠的生物体皮肤移植体系，研究了移植皮肤片的功能再生时的骨髓来源细胞的贡献程度。具体地说，对C57BL/6雄性小鼠(6～8周龄)照射致死量放射线(10Gy)，之后马上经由尾静脉移植GFP(绿色荧光蛋白)转基因小鼠来源骨髓细胞(5×106个/0.1ml生理磷酸缓冲溶液pH7.4)(图1)。
2)等待移植骨髓细胞的移入(6周)，在所获得的GFP骨髓移植小鼠的背部皮肤上移植新生小鼠皮肤(雌性)。
3)等待移植皮肤片的移入和充分的皮肤组织再生(4周)，利用荧光立体显微镜观察移植皮肤片区域上的GFP荧光的聚集程度。
4)在吸入麻醉下利用活检采集移植皮肤片，使用带冷却装置的切片机制作皮肤冷冻切片(6μm)，进行4％多聚甲醛固定(30分钟)，用DAPI对组织内细胞核进行染色，使用表皮细胞特异性角蛋白5的抗体实施免疫染色后，封闭组织，利用共聚焦激光显微镜研究了GFP阳性骨髓来源细胞的存在。另外，一部分的标本通过HE染色研究了其组织结构。
结果：在对GFP骨髓移植小鼠的生物体皮肤移植体系中，观察到了与再生皮肤区域一致的强的GFP荧光的聚集(图2)。另外，在使用了移植皮肤片的HE标本的组织学观察中，确认了含有大量毛囊的皮肤组织的功能再生(图2)。在利用共聚焦激光显微镜的观察中，表达角蛋白5的表皮角化细胞、真皮成纤维细胞、以及平滑肌细胞或脂肪细胞的多数显示GFP荧光，表示这些细胞为骨髓来源(图3)。即，首次明确了移植皮肤的功能再生时所必要的上皮系和间充质细胞的大多数是由骨髓来源干细胞供给的。
考察：这些研究结果首次明确地显示目前临床现场中日常进行的皮肤移植中的皮肤再生时，骨髓来源细胞起着很大作用，是极为划时代的发现。
据报告，在骨髓内存在造血系干细胞和间充质干细胞这2个干细胞系统。难以预测到本次研究所示的大量动员至移植皮肤内的骨髓来源上皮系细胞和间充质干细胞是由骨髓来源造血系干细胞供给的，这强烈地暗示了骨髓来源间充质干细胞有助于移植组织的功能再生的可能性。即可以预想到，在刚植皮后，从处于灌注不足-坏死方向的移植皮肤组织中释放骨髓来源间充质干细胞动员因子，介由末梢血液循环将间充质干细胞从骨髓动员至移植皮肤片内，从而诱导功能性皮肤组织再生。
[实施例2]
目的：存在于皮肤组织提取液内的骨髓间充质干细胞诱导因子的鉴定
方法：以预想到从处于灌注不足状态的切除皮肤中释放的骨髓间充质干细胞动员因子的鉴定为目的，利用以下方法进行了研究。
1)为了获得小鼠骨髓来源间充质干细胞，从大腿骨或下腿骨采集C57BL/6小鼠的骨髓细胞，将含10％胎牛血清的D-MEM(Nacalai公司制)作为细胞培养基而接种于细胞培养皿中，在37℃、二氧化碳浓度5％的条件下进行培养。在细胞所占面积相对于培养皿底面积增殖至70～100％时，使用0.25％胰蛋白酶1mM EDTA(Nacalai公司制)将细胞从培养皿上剥离，进而在相同条件下进行传代培养。传代操作至少重复5次以上。进而，将这些粘附细胞进行分离培养，并利用流式细胞仪进行细胞表面抗原的分析，确认为Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、Sca-1阳性、c-kit阴性。确认了这些细胞能够分化成骨细胞、脂肪细胞且具有骨髓间充质干细胞的性质。
2)将由400只新生小鼠获得的游离皮肤片浸渍在生理磷酸缓冲液pH7.4(PBS)400ml中，在4℃下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下、440G下离心10分钟，回收上清，从而制作了皮肤提取液。
3)为了确认在所得皮肤提取液中存在骨髓间充质干细胞诱导活性，使用Boyden小室，研究了对于本发明人等已经建立了细胞株的C57BL6小鼠骨髓来源间充质干细胞的迁移活性。具体地说，在Boyden小室的下槽(容量为25μl)中插入皮肤提取液(25μl)，放上具有8μm微细孔的聚碳酸酯膜上，进而与其相邻地放置Boyden小室上槽(容量为50μl)，并在其中放入骨髓来源间充质干细胞悬浮液(5×104个/50ml培养液：DMEM/10％胎牛血清)，在CO2培养箱内、37℃下培养4～24小时。培养后，取下小室的上槽，取出硅膜，通过染色，定量地研究了通过其微细孔后迁移至小室下槽的骨髓来源间充质干细胞的数量。
4)为了精制皮肤提取液内具有骨髓来源间充质干细胞动员活性的因子，实施了肝素亲和柱色谱法和阴离子交换柱(Q柱)色谱法。使用4℃的9倍容量的20mM磷酸缓冲液pH7.5将皮肤提取液稀释至10倍(稀释液A)。首先，将20mM磷酸缓冲液pH7.5(30ml)流入HiTrap Hepalin HP柱(柱容量：5ml、GE Healthcare)中，将柱平衡。进而，使稀释液A结合于柱。之后利用20mM磷酸缓冲液pH7.5、100mM NaCl(30ml)来洗涤柱。为了将吸附的蛋白质洗脱，将20mM磷酸缓冲液pH7.5、100mM NaCl流入柱内，将洗脱液分在管中。将各个吸附馏分通过2)中说明的利用Boyden小室的迁移活性评价法来收集具有迁移能力的馏分。将其用9倍容量的50mM TrisHCl pH8.0进行稀释(稀释液B)。首先，将50mM Tris HCl pH8.0(30ml)流入HiTrap mono Q柱(柱容量：1ml、GE Healthcare)中，将柱平衡。进而，使稀释液B结合于柱。为了将吸附的蛋白质洗脱，将Tris HCl pH8.0、1000mM NaCl流入柱内，将洗脱液分在管中。以上的精制过程全部可以在4～16℃下进行，但优选在4～8℃下进行、更优选在4℃下进行。通过2)中说明的利用Boyden小室的迁移活性评价方法来评价该洗脱液。
5)利用SDS-PAGE电泳法，根据分子量，将利用通过Boyden小室的迁移活性评价和柱色谱法的组合而获得的具有骨髓来源间充质干细胞动员活性的皮肤提取液来源精制标准品进行凝胶内分离，并利用银染色来检测电泳蛋白的条带。
6)在通过5)的SDS-PAGE电泳和银染色而以单一条带的形式经凝胶内分离的皮肤提取液来源的蛋白组中，将由骨髓来源间充质干细胞动员活性最强的色谱法精制标准品中获得的蛋白条带全部切出，通过质量分析和数据库分析进行该蛋白的鉴定。
7)从经鉴定的蛋白组中选定具有骨髓来源间充质干细胞动员活性的候补蛋白，利用中和抗体对含有该候补蛋白的精制标准品进行处理(在该蛋白的多克隆抗体100倍稀释条件下，在冰上孵育100μl精制标准品溶液30分钟)后，通过使用了Boyden小室的迁移能力分析来研究骨髓来源间充质干细胞动员活性的阻碍程度。
8)将所得骨髓来源间充质干细胞精制标准品混入在Matrigel中，以达到约10％体积，插入在直径约为1mm、5mm长的硅管中，并将其移植于GFP骨髓移植小鼠背部皮下。2周后取出插入管，利用荧光测定装置定量地分析由迁移至管内的骨髓来源细胞发出的GFP荧光。然后，从管内取出迁移细胞，接种于DMEM/10％胎牛血清培养基中，在CO2培养箱内进行培养，由此研究骨髓来源间充质干细胞的生物体内动员活性。继续培养2周后的细胞利用2％多聚甲醛在25℃的条件下固定10分钟后，每5分钟使用4次PBS洗涤多聚甲醛，然后利用2％脱脂奶液进行处理，将用含有0.5％tween20的2％脱脂奶稀释至100倍的抗小鼠角蛋白5抗体在4℃的条件下反应16小时。每5分钟使用4次PBS洗涤抗体，然后将用2％脱脂奶稀释至1000倍的Alexa546标记抗兔IgG抗体在25℃的条件下反应1小时。以上1)～8)的实验过程综合于图4。
结果：将从切除的新生小鼠皮肤提取至PBS中的溶液(图5)作为起始材料，利用上述方法进行具有骨髓来源间充质干细胞动员活性的蛋白质的鉴定和功能解析。通过利用Boyden小室的迁移活性解析可知，在皮肤提取液中具有极强的骨髓来源间充质干细胞诱导活性(图6)。以该活性为指标，使用肝素亲和柱和阴离子交换柱(Q柱)进行目标因子的精制，使用SDS-PAGE电泳将所得各馏分进行分析，结果表明，在含有通过银染色而以单一条带的形式经凝胶内分离的数个蛋白的精制标准品内具有较强的骨髓来源间充质干细胞动员活性(图7列7)。切出所得银染色条带，进行质量分析、数据库分析，结果表明以箭头所示的分子量约为25000的蛋白为HMGB1(图7)。为了明确该精制馏分(列7)中所含的HMGB1具有目标骨髓来源间充质干细胞动员活性，进行利用抗HMGB1多克隆抗体的迁移阻碍实验。结果可知，抗HMGB1多克隆抗体强烈地阻碍了该精制标准品中的骨髓来源间充质干细胞迁移活性(图8)，从而可知存在于皮肤提取液内的骨髓来源间充质干细胞动员因子为HMGB1。
进而，为了确认HMGB1在生物体内具有骨髓来源间充质干细胞动员活性，将放入有该精制标准品的硅管插入GFP骨髓移植小鼠背部皮下，2周后研究了动员至管内的细胞的性质(图9)。该结果与对照(图7的SDS-PAGE列4所用的精制标准品)相比较，HMGB1精制标准品将GFP阳性的骨髓来源细胞大量地(对照的约3倍)动员至管内(图10)。图11表示利用荧光立体显微镜得到的高倍放大像。进而，取出动员至管内的GFP阳性细胞，在DMEM/10％胎牛血清培养基内进行培养，结果确认了在刚开始培养后为圆形的浮游细胞状态(图12)，但在24小时后GFP阳性骨髓来源细胞粘附在培养皿上，以纺锤系的成纤维细胞样形态、进而以类圆形的上皮细胞样形态的细胞进行增殖(图13)。进而，继续培养这些细胞2周时，在GFP阳性骨髓来源细胞中确认到了呈现毛囊形态的细胞(图14A：明视野、低倍放大；图14B：GFP荧光、低倍放大；图14C：明视野、高倍放大；图14D：GFP荧光、高倍放大)。另外，进行对作为上皮角化细胞的标记物的角蛋白5的免疫组织化学，结果在GFP阳性骨髓来源细胞中确认到了角蛋白5阳性细胞(图14E：明视野、图14F：角蛋白5阳性细胞的荧光)。
考察：本次本发明人等在世界上首次发现：游离皮肤片会产生HMGB1；所产生的HMGB1具有将骨髓来源间充质干细胞大量地动员至皮肤片内的活性；动员至皮肤片内的骨髓来源间充质干细胞在皮肤组织内分化为成纤维细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞等间充质细胞；进而通过分化为形成表皮细胞毛囊的细胞而诱导了移植皮肤组织的功能再生。可以容易地预想到：该HMGB1产生的骨髓来源间充质干细胞动员和作为其结果的功能组织再生不仅对于移植皮肤再生发挥功能，而且在伴随灌注不足-坏死的多个脏器及组织损伤时，作为功能性组织再生诱导机理而发挥功能。可以确信，如果通过开发利用HMGB1制剂的药品而可以在损伤组织再生时将骨髓来源间充质干细胞动员至局部位置，则不会发生由于纤维性疤痕治愈而陷入功能不全，伴随必要功能性脏器的功能性组织再生诱导医疗成为可能。
[实施例3]
目的：皮肤提取液中HMGB1家族的鉴定和骨髓间充质干细胞诱导活性的研究
方法：使用Western blot法确认了新生小鼠皮肤提取液中所含HMGB蛋白家族的有无。作为样品，使用[实施例2]中获得的皮肤提取液10μl，使用SDS-PAGE法进行电泳，使用印迹法(blotting)装置(ATTO)将凝胶中分离的蛋白转移至PVDF膜上。使用含3％脱脂奶0.1％Tween 20的PBS(S-T-PBS)在室温下孵育1小时后，使利用S-T-PBS稀释至1000倍的兔抗小鼠HMGB1抗体、兔抗小鼠HMGB2抗体、兔抗小鼠HMGB3抗体分别在4℃下反应16小时。反应后，使用S-T-PBS洗涤同一PVDF膜5分钟5次，然后使用用S-T-PBS稀释至2000倍的过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(GE Healthcare)，在25℃下孵育同一PVDF膜1小时。进而，使用S-T-PBS洗涤5分钟5次后，使ECL Western Blotting Detection System(GE Healthcare)与同一PVDF膜反应，使ECL膜感光后进行显影，从而检测HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白的存在。
使用Trizol(invitrogen)从新生小鼠皮肤中提取RNA，进而使用SuperScript III cDNA synthesis kit(Invitrogen)合成了cDNA。将该cDNA作为模板，使用PCR(聚合酶链反应)法扩增HMGB1、HMGB2、HMGB3的cDNA，按照表达在氨基酸序列的N末端附加有Flag标签的序列(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；序列号18)的蛋白质的方式，插入在哺乳类细胞中使蛋白质表达的质粒载体pCAGGS中。将这些质粒载体基因导入至HEK293(人胚肾细胞来源培养细胞株)并培养48小时，使蛋白质表达。将使HMGB1、HMGB2、HMGB3分别表达的细胞和培养上清在4℃下孵育16小时后，在4400g离心5分钟并回收上清。混合相对于每50mL的该上清为100μL的Anti Flag抗体Gel(Sigma)，并在4℃下孵育16小时。离心并回收Gel后，使用PBS洗涤5次。进而，使用3X Flag肽(终浓度100μg/ml)进行洗脱。通过使用了用S-T-PBS稀释1000倍的小鼠抗Flag抗体和用S-T-PBS稀释2000倍的过氧化酶标记抗小鼠IgG抗体(GEHealthcare)的Western blot法，确认了重组蛋白质的表达。与[实施例2]同样地使用Boyden小室来评价这些精制重组蛋白质的小鼠骨髓间充质干细胞的迁移活性。另外，为了观察HMGB家族的体内药效，将8周龄C57BL/6小鼠的背部皮肤切成直径8μm的圆形、制作皮肤溃疡模型，将所精制的HMGB1、HMGB2、HMGB3分别(100ng)与1g/100mL PBS浓度的透明质酸溶液等量地混合，将其中的100μL投予至溃疡面内。按照溃疡面不干燥的方式，用粘合性透明创伤包覆-保护材料Tegaderm(3M Healthcare)覆盖，经时地测定创伤面积，测定治愈效果。
进而，为了研究人皮肤提取液和人精制HMGB1是否具有迁移人骨髓间充质干细胞的活性，与[实施例2]同样地使用Boyden小室进行评价。将面积1cm2的人皮肤浸渍于1ml的PBS中，在4℃的条件下孵育16小时后，在4℃的条件下、在440G下离心10分钟。仅回收上清，作为人皮肤提取液来使用。另外，放入Boyden小室上部的细胞使用人骨髓间充质干细胞(Cambrex公司)。(本细胞利用流式细胞仪进行细胞表面抗原的分析结果为CD105阳性、CD166阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD34阴性、CD45阴性。而且，通过分化诱导试验向脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞的分化为阳性。)另外，在小室下部放入人HMGB1 100ng/well(R&D公司)和用PBS稀释10倍的人皮肤提取液，并使用PBS作为对照。
结果：Western blot的结果除了HMGB1的条带之外，还检测到HMGB2和HMGB3的条带。由此确认了在新生小鼠皮肤提取液中除了HMGB1之外，还存在作为家族蛋白的HMGB2和HMGB3(图15)。制作在各个蛋白质的N末端附加有Flag标签的HMGB1、HMGB2、HMGB3的表达载体(图16)。在HEK293细胞中基因导入表达载体，使用Flag标签将表达后的蛋白质精制后，使用Western blot法确认了蛋白质(图17)。测定使用这些精制蛋白质的小鼠骨髓间充质干细胞的迁移活性，结果在任一蛋白质中均确认了活性(图18)。每7天测量制作在小鼠背部的溃疡面积，结果与非治疗组相比，可以确认利用HMGB1、2和3的治疗组具有显著的溃疡面积的缩小效果(图19)。与小鼠的情况同样，可知人HMGB1和人皮肤提取液具有迁移人骨髓间充质干细胞的活性(图20)。
考察：作为与HMGB1同源性高的蛋白质，已知有HMGB2和HMGB3。期待这些蛋白质也具有与HMGB1相同的性质。因此，确认了由游离皮肤片提取液也能产生作为HMGB1家族的HMGB2和HMGB3。进而，制作HMGB1、HMGB2、HMGB3的重组蛋白质，确认了在体外的骨髓间充质干细胞迁移活性，还确认了体内的皮肤溃疡治疗效果。可知新生小鼠游离皮肤片中的HMGB家族(HMGB1、HMGB2、HMGB3)和重组HMGB家族具有骨髓间充质干细胞诱导活性和将能够分化为骨髓来源的上皮系的干细胞诱导至局部位置的活性，进而这些被诱导的骨髓来源的细胞群在损伤组织中分化成表皮角化细胞或毛囊或成纤维细胞等各种细胞，从而具有促进损伤组织治愈的效果。另外，由于骨髓间充质干细胞为多能性干细胞，因此可以确信，通过将HMGB家族全身投予或局部投予至其它的组织损伤状态、例如脑损伤、心肌梗塞、骨折等组织损伤的治疗中，同样可以期待治疗效果。
另外，可知构成人和小鼠的各自HMGB1的氨基酸序列有98％(213/215)的同源性，构成各自HMGB2的氨基酸序列有96％(201/210)的同源性，构成各自HMGB3的氨基酸序列有97％(195/200)的同源性。因此，认为人的HMGB具有与小鼠HMGB同样的活性，由本实施例的结果可知，人的皮肤提取液或HMGB1与小鼠的皮肤提取液或HMGB1同样，具有诱导骨髓间充质干细胞的活性。
[实施例4]
目的：骨髓间充质干细胞诱导因子组织提取液的制作方法的确立
方法：将6周龄C57BL6的一只量的脑、心脏、肠、肾脏、肝脏和新生小鼠一只量的皮肤浸渍于生理磷酸缓冲液pH7.4(PBS)1ml内，在4℃下孵育24小时后，为了除去组织，在4℃的条件下、在440G下离心10分钟，回收上清，制成组织提取液。为了确认在所得提取液中存在骨髓间充质细胞诱导活性，使用Boyden小室，与[实施例2]同样地研究了对骨髓来源间充质干细胞的迁移活性。另外，使用HMGB1 ELISA kit(Shino-Test)来测定相同样品中所含的HMGB1的浓度。进而，与[实施例2]同样地使脑、心脏和皮肤的组织提取液结合于肝素亲和柱，使用Boyden小室确认了结合馏分的蛋白质的骨髓间充质干细胞诱导活性。
结果：小鼠脑提取液中含有与新生小鼠皮肤提取液同等的HMGB1。进而，骨髓间充质干细胞的诱导活性在小鼠脑中和在皮肤中是同样的。在小鼠肠提取液和小鼠心脏提取液中基本不含HMGB1，但观察到了骨髓间充质干细胞的诱导活性。另外，小鼠脑、小鼠心脏的肝素柱结合馏分与小鼠皮肤的肝素柱结合馏分同样地具有诱导骨髓间充质干细胞的活性(图21)。表1表示测定小鼠各组织提取液的HMGB1浓度和骨髓间充质干细胞的诱导活性的结果。
          表1
 
HMGB1浓度(ng/mL) 骨髓间充质干细胞诱导活性
皮肤 110 有
脑 140 有
心脏 4 有
肠 0 有
肾脏 115 ND
肝脏 61 ND
ND：未实施
考察：开发出了利用不仅是皮肤、即便是脑只要仅将脏器浸渍在生理缓冲液中的简单方法，将HMGB1简便地进行提取的方法。该方法对其它脏器、例如肝脏或肾脏也是同样的。另外，尽管来自心脏或肠的提取液中基本不含HMGB1，也可见骨髓间充质干细胞诱导活性。这是由于，提取液中含有与HMGB1不同的其它骨髓间充质干细胞诱导物质。这些提取液所含的物质原本存在于各个组织中，在生理性组织损伤时，将骨髓间充质干细胞诱导至损伤组织。通过本发明，开发出了将含有HMGB1的多个骨髓间充质干细胞诱导物质从各种脏器中功能性且简便地进行提取的新型方法。而且，为了从组织提取液中精制骨髓间充质干细胞诱导物质，开发出了使其结合于肝素柱的方法。另外，这些具有骨髓间充质干细胞诱导活性的成分通过与皮肤同样的方法，也可以使用肝素柱从脑或心脏中精制。
[实施例5]
目的：从培养细胞中提取间充质干细胞迁移活性物质方法的确立。
方法：人胚肾来源培养细胞株HEK293和人子宫颈癌细胞株HeLa分别在含10％胎牛血清的D-MEM(nacalai公司制)中培养。用PBS洗涤各个细胞后，将107个细胞在4℃的5ml PBS(nacalai公司制)中浸渍16小时。在重力加速度440G、4℃下离心5分钟，并回收上清。在Boyden小室的上层放入人骨髓间充质干细胞，在下层放入用DMEM稀释5倍的细胞提取液，确认人骨髓间充质干细胞迁移活性。
结果：HEK293提取液、HeLa提取液均同样显示了迁移骨髓间充质干细胞的活性(图22)。
考察：利用将培养细胞浸渍于PBS中的简便方法，成功地将迁移骨髓间充质干细胞的活性物质进行提取。
[实施例6]
目的：制作小鼠脑缺损模型，将皮肤提取液肝素柱精制馏分缓释投予至局部损伤部位，从而使自身骨髓体系所含的干细胞迁移至局部损伤部位，研究能否诱导神经系细胞的再生。
方法：
(1)皮肤提取液肝素柱精制馏分的制作
使用4℃的9倍容量的20mM磷酸缓冲液pH7.5，将由切除的新生小鼠皮肤中通过在PBS(1只/ml)中4℃下孵育16小时而提取的皮肤提取液稀释至10倍。首先，将20mM磷酸缓冲液pH7.5(30ml)流入HiTrap HepalinHP柱(柱容量：5ml、GE Healthcare)中，将柱平衡。进而，使稀释液与柱结合。之后，用20mM磷酸缓冲液pH7.5、100mM NaCl(30ml)洗涤柱。为了将吸附的蛋白质洗脱，将20mM磷酸缓冲液pH7.5、1000mM NaCl流入柱内，将洗脱液分在管中。将各个吸附馏分通过实施例2所示的Boyden小室法来评价小鼠骨髓来源细胞株的迁移活性，收集具有迁移能力的馏分。将该具有活性的溶液作为皮肤提取液肝素柱精制馏分，用于以下的实施例中。
(2)骨髓抑制小鼠的制作
对小鼠进行10Gy的X射线单次照射，制作骨髓抑制小鼠。
(3)对骨髓抑制小鼠的GFP小鼠骨髓移植
从GFP小鼠的两侧大腿骨和下腿骨中采集骨髓细胞。将其经由照射经过24小时后的骨髓抑制小鼠的尾静脉进行投予。另外，投予是在利用异氟醚的吸入麻醉下实施的。
(4)小鼠脑损伤(脑组织缺损)模型的制作
使用异氟醚对移植了GFP小鼠的骨髓细胞的骨髓抑制小鼠实施吸入麻醉，将戊巴比妥(45mg/kg)注入至腹腔内。将小鼠固定在脑定位固定装置上，使用手术刀在头部正中央切开。在距离前囱右外侧2.5mm、前方1mm处使用钻孔器实施穿头(图23A)。以距离此部位深3mm的位置为前端，插入20G Surflow针的外筒并固定。这里使用注射器施加负压，部分抽吸脑组织(图23B)。
(5)皮肤提取液肝素柱精制馏分向脑组织缺损部的投予
在上述位置上，使用汉密尔顿注射器和26G注射器注入溶解于纤维蛋白糊制剂(纤维蛋白原)(Bolheal(化血研))的皮肤提取液肝素柱精制馏分5μl，接着注入纤维蛋白糊制剂(凝血酶)5μl(Bolheal(化血研))(图23C)。通过该操作，目的在于皮肤提取液肝素柱精制馏分作为缓释剂的效果。
(6)脑组织缺损部的神经系细胞再生效果的评价
使用对照组和治疗组的小鼠进行了评价。确定适当的经过设定(经时地)，使用4％多聚甲醛灌流并固定小鼠后，进行脑切除。进而，进行4％多聚甲醛外固定。使用带有15％和30％梯度的蔗糖脱水后，制成冷冻切片。
使用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)溶液进行核染色，使用防光褪色剂进行封闭。使用共聚焦激光显微镜评价损伤部位(脑组织缺损部)的GFP阳性细胞的聚集。
结果：投予后，定性地显示2周后和6周后的GFP阳性细胞聚集。2周后(对照：图23D、皮肤提取液肝素柱精制馏分：图23E)和6周后(对照：图23F、皮肤提取液肝素柱精制馏分：图23G)与对照相比，GFP阳性细胞在治疗组的损伤部位的聚集均为较高的倾向。
考察：通过皮肤提取液肝素柱精制馏分的投予，骨髓来源细胞聚集在脑组织损伤部位，显示神经细胞的形态。已知骨髓来源间充质干细胞也分化成神经细胞，由此结果可知，通过皮肤提取液肝素柱精制馏分，可以诱导脑损伤部位的神经系细胞的再生。另外，其还可以应用于脑缺血性疾病或脑挫伤的脑组织障碍部位处的神经再生。
通过本发明提供了具有骨髓来源细胞(例如骨髓来源间充质干细胞、以下同样)诱导活性的细胞提取液、具有骨髓来源细胞诱导活性的肝素结合馏分以及具有骨髓来源细胞诱导活性的阴离子交换体结合馏分。另外，提供了细胞提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分、含有HMGB1、HMGB2或HMGB3的骨髓来源细胞诱导剂和组织再生促进剂。通过将细胞提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分、HMGB1、HMGB2或HMGB3作为骨髓来源细胞动员药物进行开发，促进难治性损伤组织的功能再生的新型再生医疗成为可能。HMGB1、HMGB2或HMGB3从由于血流降低而陷于低氧状态、处于坏死方向的组织细胞中释放出来，具有将骨髓来源细胞或来源于其的各种细胞动员至其局部位置的作用。所动员的骨髓来源细胞通过分化成各个组织中所需要的细胞系谱，从而促进由于灌注不足-坏死而丧失的功能的恢复、即促进所谓的功能性组织再生。例如，通过将细胞提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分、HMGB1、HMGB2或HMGB3投予至由于皮肤的血流障碍而产生的难治性皮肤溃疡部，从而将骨髓来源细胞动员至溃疡面，当所动员的细胞分化成血管内皮细胞时，则局部的血流有所改善。同时，通过分化为成纤维细胞、神经细胞、毛囊细胞、进而表皮细胞，并非纤维性疤痕治愈，而是可以诱导、促进具有需要的皮肤附属器官的功能性皮肤再生。即便是心肌梗塞、脑梗塞等其它脏器的灌注不足性坏死状态，细胞提取液、肝素结合馏分、阴离子交换体结合馏分、HMGB1、HMGB2或HMGB3也同样可以期待作为其功能性组织再生诱导剂是有效的。
序列表
Figure A200780003894E00481
Figure A200780003894E00491
Figure A200780003894E00501
Figure A200780003894E00511
Figure A200780003894E00521
Figure A200780003894E00531
Figure A200780003894E00541
Figure A200780003894E00551
Figure A200780003894E00561
Figure A200780003894E00571

Claims (15)

1.一种骨髓来源细胞的诱导剂，其含有下述(a)～(i)中任一项所述的成分：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
2.权利要求1所述的诱导剂，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
3.一种组织再生促进剂，其含有下述(a)～(i)中任一项所述的成分：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
4.一种组织再生促进用试剂盒，其含有下述(a)～(i)中任一项所述的成分：
(a)HMGB1蛋白质；
(b)分泌HMGB1蛋白质的细胞；
(c)插入有对HMGB1蛋白质进行编码的DNA的载体；
(d)HMGB2蛋白质；
(e)分泌HMGB2蛋白质的细胞；
(f)插入有对HMGB2蛋白质进行编码的DNA的载体；
(g)HMGB3蛋白质；
(h)分泌HMGB3蛋白质的细胞；
(i)插入有对HMGB3蛋白质进行编码的DNA的载体。
5.一种具有骨髓来源细胞诱导活性的提取液，其为通过包括将细胞浸渍在溶剂中的工序的方法制造的细胞的提取液。
6.一种具有骨髓来源细胞诱导活性的细胞的提取液的制造方法，其包括将细胞浸渍在溶剂中的工序。
7.一种具有骨髓来源细胞诱导活性的馏分，其为通过包括下述工序的方法制造的肝素结合馏分：
(a)将细胞浸渍在溶剂中的工序；
(b)使工序(a)获得的提取液接触于固定化肝素的工序；以及
(c)从固定化肝素中洗脱肝素结合馏分的工序。
8.一种具有骨髓来源细胞诱导活性的肝素结合馏分的制造方法，其包括下述工序：
(a)将细胞浸渍在溶剂中的工序；
(b)使工序(a)获得的提取液接触于固定化肝素的工序；以及
(c)从固定化肝素中洗脱肝素结合馏分的工序。
9.一种骨髓来源细胞的诱导剂，其含有权利要求5所述的提取液或通过权利要求6所述的方法制造的提取液、或者权利要求7所述的馏分或通过权利要求8所述的方法制造的馏分。
10.权利要求9所述的诱导剂，其中，骨髓来源细胞为骨髓来源间充质干细胞。
11.一种组织再生促进剂，其含有权利要求5所述的提取液或通过权利要求6所述的方法制造的提取液、或者权利要求7所述的馏分或通过权利要求8所述的方法制造的馏分。
12.一种组织再生促进用试剂盒，其含有权利要求5所述的提取液或通过权利要求6所述的方法制造的提取液、或者权利要求7所述的馏分或通过权利要求8所述的方法制造的馏分。
13.一种评价细胞的提取液中是否含有诱导受试细胞的因子的方法，其包括下述工序，其中，工序(b)中的受试细胞的诱导活性比对照高时，则判定细胞的提取液中含有诱导受试细胞的因子，
(a)制备细胞的提取液的工序；以及
(b)测定工序(a)制备的提取液的受试细胞的诱导活性的工序。
14.一种筛选方法，其对含有诱导受试细胞的因子的细胞的提取液进行筛选，其包括下述工序：
(a)对于多个提取液，利用权利要求13所述的方法来评价所述提取液中是否含有诱导受试细胞的因子的工序；以及
(b)选择在工序(a)中被评价为含有诱导受试细胞的因子的提取液的工序。
15.一种诱导受试细胞的因子的鉴定方法，其包括下述工序：以受试细胞的诱导活性为指标，从通过权利要求13或14所述的方法判定为含有诱导受试细胞的因子的提取液中精制诱导受试细胞的因子的工序。
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