JP2013227330A - 損傷組織の機能的再生促進医薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1)骨髄由来細胞が移植皮膚内に大量に動員され、2)動員された骨髄由来細胞は移植皮膚片内で真皮線維芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、表皮角化細胞、のいずれにも分化しており、動員された骨髄由来細胞の中に骨髄由来間葉系幹細胞が含まれている、3)骨髄由来間葉系幹細胞を末梢血から植皮片に動員しているのは、移植皮膚の壊死組織から放出されたHMGB1、HMGB2、HMGB3である、4)精製したそれらは、骨髄から分離・培養した間葉系幹細胞の遊走を促進する、5)HMGB1を含む活性物質を皮膚、脳、心臓を含む多数の臓器抽出液から簡便に精製できる、6)骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性物質を培養細胞から簡便に抽出できる、7)皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分が脳損傷時に骨髄由来細胞を大量に動員する。
【選択図】なし
Description
従来、脳や脊髄の中枢神経細胞は一度障害を受けると、再生はおこらないとされてきた。しかし、近年神経幹細胞の存在およびこの誘導が可能になった。また、正常神経系での神経幹細胞ニッチも同定されてきた。このため、もはや不可能とされていた損傷中枢神経系細胞の回復も期待できるようになった。現在、脳脊髄損傷、変性疾患などに対する神経再生に関する研究が果敢に展開されている。
脳組織(細胞)損傷の原因として、外傷による脳挫傷、脳虚血性疾患が主要なものである。他の原因として、脳腫瘍摘出手術をはじめとした脳外科的手術に起因するものがあげられる。とくに、脳実質細胞から発生するような、神経膠腫の全摘出は困難であり、運動や言語機能障害を避けるためには、姑息的摘出にとどまらざるを得えない。また、悪性神経膠腫は生命予後も悪く、化学療法や放射線療法をはじめ、近年研究が盛んに行われている免疫・遺伝子治療も十分な効果を示すまでには至っていない。よって、可及的に多くの腫瘍細胞の摘出を行い、その結果生じる脳機能損傷を回復させるような治療があれば理想的である。
〔1〕以下の(a)から(i)のいずれかに記載の成分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔2〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔1〕に記載の誘導剤。
〔3〕以下の(a)から(i)のいずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進剤;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔4〕以下の(a)から(i)のいずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進用キット;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔5〕細胞を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される細胞の抽出液であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する抽出液。
〔6〕細胞を溶媒に浸す工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する細胞の抽出液の製造方法。
〔7〕以下の工程を含む方法で製造されるヘパリン結合画分であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する画分;
(a)細胞を溶媒に浸す工程、
(b)工程(a)で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
(c)固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
〔8〕以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有するヘパリン結合画分の製造方法;
(a)細胞を溶媒に浸す工程、
(b)工程(a)で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
(c)固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
〔9〕〔5〕に記載の抽出液もしくは〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、または〔7〕に記載の画分もしくは〔8〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤。
〔10〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔9〕に記載の誘導剤。
〔11〕〔5〕に記載の抽出液もしくは〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、または〔7〕に記載の画分もしくは〔8〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進剤。
〔12〕〔5〕に記載の抽出液もしくは〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、または〔7〕に記載の画分もしくは〔8〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進用キット。
〔13〕以下の工程を含む、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する方法であって、工程(b)における被験細胞の誘導活性が、対照と比較して高い場合に、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれると判定される方法;
(a)細胞の抽出液を調製する工程、および
(b)工程(a)で調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。
〔14〕以下の工程を含む、被験細胞を誘導する因子が含まれる細胞の抽出液をスクリーニングする方法;
(a)複数の抽出液について、〔13〕に記載の方法で、該抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する工程、および
(b)工程(a)で被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する工程
〔15〕〔13〕または〔14〕に記載の方法によって、被験細胞を誘導する因子を含むと判定された抽出液から、被験細胞の誘導活性を指標に、被験細胞を誘導する因子を精製する工程を含む、被験細胞を誘導する因子の同定方法。
〔16〕以下の(a)から(i)のいずれかに記載の物質を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する方法;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔17〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔16〕に記載の方法。
〔18〕以下の(a)から(i)のいずれかに記載の物質を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔19〕〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する方法。
〔20〕〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の方法によって製造された画分を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する方法。
〔21〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔19〕または〔20〕に記載の方法。
〔22〕〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法。
〔23〕〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の方法によって製造された画分を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法。
〔24〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における以下の(a)から(i)のいずれかに記載の物質の使用;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔25〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔24〕に記載の使用。
〔26〕組織再生促進剤の製造における以下の(a)から(i)のいずれかに記載の物質の使用;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔27〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液の使用。
〔28〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の方法によって製造された画分の使用。
〔29〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔27〕または〔28〕に記載の使用。
〔30〕組織再生促進剤の製造における〔5〕に記載の抽出液または〔6〕に記載の方法によって製造された抽出液の使用。
〔31〕組織再生促進剤の製造における〔7〕に記載の画分または〔8〕に記載の方法によって製造された画分の使用。
本発明は、以下の(a)から(i)に記載の成分のうち少なくとも1つの成分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤を提供する。
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
該誘導剤を使用することにより、局所(上記成分の投与・添加部位やその近傍)に骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)を誘導して組織の機能的再生を促進することが可能になるため、該誘導剤は、再生医療、再生誘導医療開発のための基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。例えば、実験動物における必要な生体組織に骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)を動員し、組織修復、組織機能再建の程度を検討することが可能になる。また試験管内で骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)の動員による組織再生誘導研究を行うことができる。
また、上記誘導剤を使用することにより、損傷組織の再生を促進することができる。また、上記誘導剤には、機能的組織再生誘導・促進剤としての用途のみならず、組織幹細胞の減少による組織・臓器機能の低下を予防する、いわゆる予防医薬としての用途、あるいは加齢性変化の進行を遅延させる、抗加齢医薬としての用途が期待できる。
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
該組織再生促進剤または組織再生促進用キットは、損傷組織部位またはその近傍に投与されることで、血液中に循環している骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)を、末梢血中から該損傷組織に誘導(局所誘導する)することを特徴とする。
また組織再生促進用キットとしては、(1)フィブリノゲンに溶解した上記抽出液もしくは上記画分等、および(2)トロンビンを含む組織再生促進用キット、または、(1)上記抽出液もしくは上記画分等、(2)フィブリノゲン、および(3)トロンビンを含む組織再生促進用キットが例示できる。本発明においては、市販のフィブリノゲンやトロンビンを使用することができる。例えば、フィブリノゲンHT-Wf(ベネシスー三菱ウェルファーマー)、ベリプラスト(ZLBベーリング)、ティシール(バクスター)、ボルヒール(化血研)、タココンブ(ZLBベーリング)が挙げられるが、これらに制限されるものではない。
溶媒に浸される細胞としては、特に制限はないが、組織由来細胞、組織由来細胞から樹立された株化細胞(例えば、Hela、HEK293が例示できるが、これらに制限されない)、単離された細胞、単離されていない細胞(例えば単離された組織中に存在する細胞)、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAが導入された細胞などが例示できる。上記組織としては、どのような組織でもよく、例えば、生体皮膚組織、体内生検(手術)組織(脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など)が例示できるが、これらに制限されるものではない。
上記溶媒としては生理食塩水、PBS(Phosphate-buffered saline)、TBS(Tris-buffered saline)が例示できるが、これらに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸す時間としては、細胞壊死が誘導されるために必要・十分な時間、すなわち1時間から48時間(例えば6時間から48時間)、好ましくは12から24時間であるが、この時間に限定されるものではない。よって、「細胞を溶媒に浸す工程」は「壊死が誘導されるために必要・十分な時間、細胞を溶媒に浸す工程」や「細胞を壊死させる工程」と言い換えることができる。また、細胞や組織を溶媒に浸す温度として4℃から25℃(例えば4℃から8℃)、好ましくは4℃が例示できるが、これに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸すpHとしてはpH7から8、好ましくはpH7.5が例示できるが、これに制限されない。また、緩衝液の成分として、10 mM〜50mM、好ましくは10〜20mMの濃度のリン酸緩衝液が挙げられるが、これに制限されない。
また、本発明においては、細胞や組織を溶媒に浸した後に、細胞や組織を含む溶媒から該細胞や該組織を取り除くこともできる。溶媒から細胞や組織を取り除く方法は当業者に周知な方法であれば、特に制限されない。例えば、4℃〜25℃(例えば4℃)、また重力加速度10G〜4000G(例えば440G)で遠心し、上清を分取することにより、溶媒から細胞や組織を取り除くことができるが、これに制限されない。該上清を細胞や組織の抽出液として利用できる。
(a)細胞や組織を溶媒に浸す工程、
(b)工程(a)で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
(c)固定化ヘパリンからヘパリン結合画分(ヘパリン精製画分、ヘパリンカラム精製画分とも表現しうる)を溶出する工程。
固定化ヘパリンとは、ヘパリンを不溶性担体に共有結合させたものである。上記不溶性担体としては、Sepharose beads(Sepharose 4B,Sepharose 6B等:GE Healthcare)が例示されるが、これに制限されるものではない。本発明においては、市販の固定化ヘパリン(Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)を用いてもよい。
細胞や組織の抽出液と固定化ヘパリンの接触条件としては、pH7〜8程度(このましくはpH7.5)、塩濃度は0〜200mM、好ましくは100〜200mM程度が例示されるが、これらに制限されない。抽出液と固定化ヘパリンとが接触している時間は特に限定されないが、ヘパリン結合画分を固定化ヘパリンに十分吸着させるという観点では5分以上保持されることが好ましい。また、温度としては、4〜8℃、好ましくは4℃が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、固定化ヘパリンに吸着したヘパリン結合画分の溶出条件としては、pH7〜8程度、塩濃度200〜1000mM(好ましくは1000mM程度)が例示されるが、これらに制限されるものではない。
(a)細胞や組織を溶媒に浸す工程、
(b)工程(a)で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、
(c)固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程、
(d)工程(c)で得られるヘパリン結合画分を陰イオン交換体に接触させる工程、および
(e)陰イオン交換体から陰イオン交換体結合画分を溶出する工程。
陰イオン交換体としては、DEAE(diethylaminoethyl)やQ(quaternary ammonium)を利用した交換体が例示できるが、これらに制限されない。本発明においては、市販の陰イオン交換体(例えばSource15Q ,Source30Q, MonoQ,MiniQ,PC3.2/3,Mini Q4.6/50 PE,HiTrap IEX Columns,HiTrap SP HP,Q Sepharose High Performance, Hiload 16/10 Q Sepharose HP,HiPrep 16/10 SP XL,Q Sepharose XL,HiPrer 16/10 Q FF,HiPrep 16/10DEAE FF,Q Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow(いずれもGE Healthcare))を用いてもよい。
ヘパリン結合画分と陰イオン交換体の接触条件としては、pH7〜9程度(好ましくはpH8)、塩濃度は0〜100mM、好ましくは50mM程度が例示されるが、これらに制限されない。抽出液と陰イオン交換体とが接触している時間は特に限定されないが、陰イオン交換体結合画分を陰イオン交換体に十分吸着させるという観点では5分以上保持されることが好ましい。また、温度としては、4〜16℃、好ましくは4℃が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、陰イオン交換体に吸着した陰イオン交換体結合画分の溶出条件としては、pH7〜9程度(好ましくは、pH 8程度)、塩濃度100〜2000mM(好ましくは1000mM程度)が例示されるが、これらに制限されるものではない。
該誘導剤を使用することにより、局所(上記成分の投与・添加部位やその近傍)に骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)を誘導して組織の機能的再生を促進することが可能になるため、該誘導剤は、再生医療、再生誘導医療開発のための基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。例えば、実験動物における必要な生体組織に骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)を動員し、組織修復、組織機能再建の程度を検討することが可能になる。また試験管内で骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)の動員による組織再生誘導研究を行うことができる。
また、上記誘導剤を使用することにより、損傷組織の再生を促進することができる。また、上記誘導剤には、機能的組織再生誘導・促進剤としての用途のみならず、組織幹細胞の減少による組織・臓器機能の低下を予防する、いわゆる予防医薬としての用途、あるいは加齢性変化の進行を遅延させる、抗加齢医薬としての用途が期待できる。
該組織再生促進剤または組織再生促進用キットは、損傷組織部位またはその近傍に投与されることで、血液中に循環している骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)を、末梢血中から該損傷組織に誘導(局所誘導する)することを特徴とする。
また組織再生促進用キットとしては、(1)フィブリノゲンに溶解した上記抽出液もしくは上記画分等、および(2)トロンビンを含む組織再生促進用キット、または(1)上記抽出液もしくは上記画分等、(2)フィブリノゲン、および(3)トロンビンを含む組織再生促進用キットが例示できる。本発明においては、市販のフィブリノゲンやトロンビンを使用することができる。
本発明における組織としては、骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)が分化可能な組織である限り、特に制限はないが、例えば皮膚組織、骨組織、軟骨組織、筋組織、脂肪組織、心筋組織、神経系組織、肺組織、消化管組織、肝・胆・膵組織、泌尿・生殖器など、生体内のすべての組織が例示できる。また、上記組織再生促進剤を用いることで、難治性皮膚潰瘍、皮膚創傷、水疱症、脱毛症などの皮膚疾患はもとより、脳梗塞、心筋梗塞、骨折、肺梗塞、胃潰瘍、腸炎、などの組織損傷において、機能的組織再生を誘導する治療が可能となる。上記組織再生促進剤が投与される動物種としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、骨髄由来間葉系幹細胞とは、骨髄内に存在する細胞であって、骨髄から直接あるいはその他の組織(血液や皮膚、脂肪などの間葉系組織)から間接的に採取され、(プラスチックあるいはガラス製)培養皿への付着細胞として培養・増殖可能であり、骨、軟骨、脂肪などの間葉系組織への分化能を有するという特徴を持つ細胞であり、骨髄血採血、末梢血採血、さらには間葉組織からの採取によって取得することができる。また骨髄由来間葉系幹細胞は一度培養皿へ付着させた細胞を生体の損傷部に投与することにより、例えば皮膚を構成するケラチノサイトなどの上皮系組織への分化能も有するという特徴も持つ。
本発明の骨髄由来間葉系幹細胞は多能性幹細胞であり、骨芽細胞(分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めること等で特定可能)、軟骨細胞(アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性等で特定可能)、脂肪細胞(ズダンIII染色陽性等で特定可能)の他に、例えば線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞などの間葉系細胞、神経細胞、色素細胞、表皮細胞、毛包細胞(サイトケラチンファミリー、ヘアケラチンファミリー等を発現する)、上皮系細胞(たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリー等を発現する)、内皮細胞、さらに肝臓、腎臓、膵臓等の実質臓器細胞に分化する能力を有することが好ましいが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではない。
また、ヒト骨髄間葉系幹細胞は骨髄採血、末梢血採血、脂肪採取し、直接あるいは単核球分画を分離後に培養して付着細胞として取得することができる細胞が例示できるが、これに制限されるものではない。ヒト骨髄間葉系幹細胞のマーカーとしては、Lin陰性、CD45陰性、CD44陽性、の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
また、マウス骨髄間葉系幹細胞は、例えば、実施例の記載の方法によって取得できる細胞が例示できるが、これに制限されるものではない。マウス骨髄間葉系幹細胞のマーカーとしては、Lin陰性、CD45陰性、CD44陽性、Sca-1陽性、c-kit陰性、の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
組織前駆細胞は、血液系以外の特定組織細胞への一方向性分化能を持つ未分化細胞と定義され、上述した間葉系組織、上皮系組織、神経組織、実質臓器、血管内皮への分化能を有する未分化細胞を含む。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤における抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の起源となる動物種としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、上記抽出液等が投与される動物種と同じ動物種であることが好ましい。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤におけるHMGB2タンパク質としては、配列番号:7、9または11に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB2タンパク質には、配列番号:7、9または11に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、1)配列番号:7、9または11に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号:7、9または11に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、2)配列番号:8、10または12に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号:7、9または11に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤におけるHMGB3タンパク質としては、配列番号:13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB3タンパク質には、配列番号:13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、1)配列番号:13または15に記載のアミノ酸配列において1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号:13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、2)配列番号:14または16に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号:13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のホモログあるいはパラログでありうる。配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者によって公知の方法(実験医学別冊・遺伝子工学ハンドブック, pp246-251、羊土社、1991年発行)で単離することができる。
配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、骨髄由来細胞(例えば骨髄由来間葉系幹細胞)の誘導活性を有するタンパク質が挙げられる。
改変されるアミノ酸の数は、典型的には50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内(例えば、1アミノ酸)であると考えられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇(例えば恒常的活性化型タンパク質などを含む)させることも考えられる。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえば配列番号:1、3、5、7、9、11、13または15に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質以外のHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質のホモログをコードするDNAの単離が可能である。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重1 kgあたり0.0000001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.00001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を分泌する細胞やHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、損傷組織において、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本発明の誘導剤や組織再生促進剤はこれらの投与量に制限されるものではない。
(1)細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターを、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法、
(2)細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターを、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄細胞を誘導する方法、
(3)骨髄由来細胞の誘導剤または組織再生促進剤の製造における、細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターの使用。
上記組織が損傷した対象としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに制限されない。
(a)細胞や組織の抽出液を調製する工程、および
(b)工程(a)で調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。
(a)複数の抽出液について、上記の評価方法で、該抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する工程、および
(b)工程(a)で被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する工程
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕
目的:生体移植皮膚組織の機能的再生時における骨髄由来細胞寄与の評価
方法:上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
1)GFP骨髄移植マウスに対する生体皮膚移植系を利用して、移植皮膚片の機能的再生時の骨髄由来細胞寄与程度を検討した。具体的には、C57BL/6雄マウス(6〜8週齢)に致死量放射線(10Gy)を照射し、その直後に尾静脈よりGFP(green fluorescent protein)トランスジェニックマウス由来骨髄細胞(5x106個/0.1ml 生理的リン酸緩衝溶液pH7.4)を移植した(図1)。
2)移植骨髄細胞の生着を待って(6週間)得られたGFP骨髄移植マウスの背部皮膚に、新生マウス皮膚(雌)を移植した。
3)移植皮膚片の生着と十分な皮膚組織再生を待って(4週間)、移植皮膚片領域におけるGFP蛍光の集積程度を、蛍光実体顕微鏡を利用して観察した。
4)吸入麻酔下に移植皮膚片を生検により採取し、冷却装置付ミクロトームを用いて皮膚凍結切片(6μm)を作製、4%パラホルムアルデヒド固定(30分間)、組織内細胞核をDAPIで染色、表皮細胞特異的ケラチン5の抗体を用いて免疫染色を施行した後、組織を封入して共焦点レーザー顕微鏡によりGFP陽性骨髄由来細胞の存在を検討した。また一部の標本はHE染色によりその組織構築を検討した。
結果:GFP骨髄移植マウスへの生体皮膚移植系において、再生した皮膚領域に一致した強いGFP蛍光の集積が観察された(図2)。また、移植皮膚片のHE標本を用いた組織学的観察では、多数の毛包を含む皮膚組織の機能的再生が確認された(図2)。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、ケラチン5を発現している表皮角化細胞、真皮線維芽細胞、さらには平滑筋細胞や脂肪細胞の多くがGFP蛍光を示し、これらの細胞が骨髄由来であることが示された(図3)。即ち、移植皮膚の機能的再生時に必要な上皮系および間葉系細胞の多くが、骨髄由来幹細胞により供給されていることが初めて明らかとなった。
考察:これらの研究結果は、これまで臨床現場で日常的に行われている皮膚移植における皮膚再生時に、骨髄由来細胞が大きく寄与していることを初めて明確に示したものであり、極めて画期的な発見である。
目的:皮膚組織抽出液内に存在する骨髄間葉系幹細胞誘導因子の同定
方法:疎血状態にある切除皮膚からの放出が予想される骨髄間葉系幹細胞動員因子の同定を目的として、以下の方法により研究を進めた。
1)マウス骨髄由来間葉系幹細胞を得るために、C57BL/6マウスの骨髄細胞を大腿骨もしくは下腿の骨から採取し、10%胎仔ウシ血清含D-MEM(Nacalai 社製)を細胞培養培地として細胞培養皿に撒き、37℃、炭酸ガス濃度5%の条件下で培養した。細胞が占める面積が培養皿底面積に対して70から100%に増殖した時点で、0.25%トリプシン1mMEDTA(Nacalai社製)を用いて細胞を培養皿からはがし、さらに同じ条件で継代培養した。継代作業は少なくとも5回以上繰り返した。さらにこれらの付着細胞を単離培養しフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析を行いLin陰性、CD45陰性、CD44陽性、Sca-1陽性、c-kit陰性であることを確認した。これらの細胞は骨細胞、脂肪細胞に分化可能で骨髄間葉系幹細胞の性質を有することを確認した。
2)新生マウス400匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4(PBS)400ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。
3)得られた皮膚抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、本発明者らが既に株化しているC57BL6マウス骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。具体的にはボイデン・チャンバーの下槽(容量25μl)に皮膚抽出液(25μl)を挿入し、8μmの微細穴を持つポリカーボネートメンブレンを乗せ、さらにこれに接してボイデン・チャンバー上槽(容量50μl)を載せて、その中に骨髄由来間葉系幹細胞浮遊液(5x104個/50ml培養液:DMEM/10%ウシ胎仔血清)を入れ、CO2インキュベーター内で37℃、4〜24時間培養した。培養後、チャンバーの上槽をはずし、シリコン薄膜を取り出して、その微細穴を通過してチャンバー下槽に遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の数を染色により定量的に検討した。
4)皮膚抽出液内の骨髄由来間葉幹細胞動員活性をもつ因子を精製するために、ヘパリンアフィニティーカラム・クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラム(Qカラム)クロマトグラフィーを施行した。皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した(希釈液A)。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5(30ml)をHiTrap Hepalin HP column(カラム容量: 5ml、GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液Aをカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 100mM NaCl(30ml)でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出するため20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、2)で説明したボイデン・チャンバーを利用した遊走活性評価法により遊走能を有する画分を集めた。これを9倍容50 mM Tris HCl pH 8.0で希釈した(希釈液B)。あらかじめ、50 mM Tris HCl pH 8.0(30ml)をHiTrap mono Q column(カラム容量: 1ml、GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液Bをカラムに結合させた。吸着したタンパクを溶出するためTris HCl pH 8.0, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。以上の精製過程はすべて4〜16℃で行うことが可能であるが、4〜8℃で行うことが好ましく、4℃で行うことが更に好ましい。この溶出液を2)で説明したボイデン・チャンバーを利用した遊走活性評価方法により評価した。
6)5)のSDS-PAGE電気泳動および銀染色により単一バンドとしてゲル内分画された皮膚抽出液由来蛋白群の中で、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の最も強いクロマトグラフィー精製標品から得られた蛋白バンドをすべて切り出して、質量分析およびデータベース解析により当該蛋白の同定を進めた。
7)同定した蛋白群の中から骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ候補蛋白を選定し、その候補蛋白を含む精製標品を中和抗体で処理(精製標品溶液100μlを当該蛋白のポリクロナール抗体100倍希釈条件にて氷上で30分間インキュベート)した後、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の阻害程度を、ボイデン・チャンバーを用いた遊走能アッセイにて検討した。
8)得られた骨髄由来間葉系幹細胞精製標品をマトリゲルの中に約10%ボリュームとなるように混入し、直径約1mm、5mm長のシリコンチューブ内に挿入し、これをGFP骨髄移植マウス背部皮下に移植した。2週間後に挿入チューブを取り出して、チューブ内に遊走した骨髄由来細胞から出るGFP蛍光を蛍光測定装置により定量的に解析した。さらに、チューブ内から遊走細胞を取り出し、DMEM/10%ウシ胎仔血清培地に播種してCO2インキュベーター内で培養することにより、骨髄由来間葉系幹細胞の生体内動員活性を検討した。2週間継続して培養した細胞は2%パラホルムアルデヒドで25℃の条件下で、10分間固定した後、5分間ずつ4回PBSを用いてパラホルムアルデヒドを洗浄し、2%スキムミルク液で処理をし、0.5% tween20含有2%スキムミルクで1000倍に希釈した抗マウスケラチン5抗体を4℃の条件下で16時間反応させた。5分間ずつ4回PBSを用いて抗体を洗浄し、2%スキムミルクで1000倍に希釈したAlexa546標識抗ウサギIgG抗体を25℃の条件下で1時間反応させた。以上の1)〜8)の実験過程は図4にまとめた。
さらに、HMGB1が生体内で骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つことを確認する目的で、この精製標品を入れたシリコンチューブをGFP骨髄移植マウス背部皮下に挿入し、2週間後にチューブ内に動員された細胞の性質を検討した(図9)。その結果、対照コントロール(図7におけるSDS-PAGEレーン4に用いた精製標品)に比較して、HMGB1精製標品はGFP陽性の骨髄由来細胞をチューブ内に多数(対照コントロールの約3倍)動員していた(図10)。図11に蛍光実体顕微鏡による強拡大像を示す。さらに、チューブ内に動員されたGFP陽性細胞を取り出し、DMEM/10%ウシ胎仔血清培地内で培養した結果、培養開始直後は円形の浮遊細胞状態であったが(図12)、24時間後にはGFP陽性骨髄由来細胞は培養シャーレに付着し、紡錘系の線維芽細胞様形態、さらには類円形の上皮細胞様形態の細胞として増殖することが確認された(図13)。さらにこれらの細胞を2週間継続して培養するとGFP陽性骨髄由来細胞の中に毛包の形態を呈する細胞を確認した。(図14A;明視野、弱拡大、図14B;GFP蛍光、弱拡大、図14C明視野、強拡大、図14D;GFP蛍光、強拡大)また、上皮ケラチノサイトのマーカーであるケラチン5に対する免疫組織化学を行ったところ、GFP陽性骨髄由来細胞の中にケラチン5陽性細胞を確認した。(図14E;明視野、図14F;ケラチン5陽性細胞の蛍光)
目的:皮膚抽出液中HMGB1ファミリーの同定と骨髄間葉系幹細胞誘導活性の検討
方法:新生マウス皮膚抽出液中に含まれるHMGB蛋白ファミリーの有無をWestern blot 法を用いて確認した。サンプルとして〔実施例2〕で得られた皮膚抽出液を10μl をSDS-PAGE法を用いて電気泳動し、ゲル中で分離した蛋白をブロッティング装置(ATTO)を用いPVDF膜にトランスファーした。3%スキムミルク0.1% Tween 20 含PBS(S-T-PBS)にて、室温で1時間インキュベートした後、S-T-PBSで1000倍に希釈したラビット抗マウスHMGB1 抗体、ラビット抗マウスHMGB2抗体、ラビット抗マウスHMGB3抗体をそれぞれ4℃で16時間反応させた。反応後、同PVDF膜をS-T-PBSにて5分間5回洗浄後、S-T-PBSで2000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラビットIgG抗体(GE Healthcare)にて同PVDF膜を25℃で1時間インキュベートした。さらにS-T-PBSにて5分間5回洗浄後ECL Western Blotting Detection System (GE Healthcare)を同PVDF膜と反応させ、ECL film を感光させた後現像してHMGB1、HMGB2、HMGB3タンパクの存在を検出した。
目的:骨髄間葉系幹細胞誘導因子組織抽出液の作製方法の確立
方法:6週齢C57BL6一匹分の脳、心臓、腸、腎臓、肝臓及び新生マウス皮膚一匹分を生理的リン酸緩衝液pH7.4(PBS)1ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して組織抽出液とした。得られた抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、〔実施例2〕と同様に骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。また、同じサンプル中に含まれるHMGB1の濃度をHMGB1 ELISA kit(シノテスト)を用いて計測した。更に脳、心臓および皮膚の組織抽出液を〔実施例2〕と同様に、ヘパリンアフィニティーカラムに結合させ、結合画分のタンパクの骨髄間葉系幹細胞誘導活性をボイデンチャンバーを用いて確認した。
目的:培養細胞から間葉系幹細胞遊走活性物質を抽出する方法を確立する。
方法:ヒト胎児腎由来培養細胞株HEK293及びヒト子宮頸癌細胞株HeLaはそれぞれ10%胎仔牛血清含D-MEM(nacalai 社製)で培養した。それぞれの細胞をPBSで洗浄後、細胞107個を4℃の5mlのPBS(nacalai社製)に16時間浸した。重力加速度440Gで4℃で5分間遠心し上清を回収した。ボイデンチャンバーの上層にヒト骨髄間葉系幹細胞をいれ、下層にDMEMで5倍希釈した細胞抽出液をいれ、ヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性を確認した。
結果:HEK293抽出液もHeLa抽出液も同様に骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性を示した(図22)。
考察:培養細胞をPBSに浸すという簡便な方法で骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性物質を抽出することに成功した。
目的:マウス脳欠損モデルを作成し、局所損傷部位に皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を徐放化して投与することで、自己の骨髄系に含まれる幹細胞を局所損傷部位に遊走させ、神経系細胞の再生を誘導できないか検討する。
方法:
(1) 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の作製
切除した新生マウス皮膚からPBS(一匹/ml)中に4℃で16時間インキュベーションし抽出した皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5(30ml)をHiTrap Hepalin HP column(カラム容量: 5ml、GE Healthcare)の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液をカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 100mM NaCl(30ml)でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出するため20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、マウス骨髄由来細胞株の遊走活性を実施例2で示したボイデンチャンバー法を用いて評価し遊走能を有する画分を集めた。この活性を有する溶液を皮膚抽出液ヘパリン精製画分として以下の実施例に使用した。
マウスに10GyのX線単回照射を行い、骨髄抑制マウスを作成した。
GFPマウスの両側大腿骨および下腿骨より骨髄細胞を採取した。これを照射後24時間経過した骨髄抑制マウスの尾静脈より投与した。なお、投与はイソフルランによる吸入麻酔下に施行した。
GFPマウスの骨髄細胞を移植した骨髄抑制マウスにイソフルランにて吸入麻酔を行い、ペントバルビタール(45mg/kg)を腹腔内に注入した。マウスを脳定位固定装置に固定し、メスにて頭部に正中切開を加えた。ブレグマから右外側2.5mm、前方1mmにドリルを用いて穿頭を施した(図23A)。この部位から深さ3mmの位置を先端にして、20Gサーフロー針の外筒を挿入して固定した。ここでシリンジを用いて、陰圧をかけ、脳組織を一部吸引した(図23B)。
前述の位置に、ハミルトンシリンジと26Gシリンジを用いて、フィブリン糊製剤のフィブリノゲン(ボルヒール(化血研))に溶解した皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を5μl注入し、次にフィブリン糊製剤のトロンビン(ボルヒール(化血研))を5μl注入した(図23C)。この操作によって、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の徐放剤としての効果を狙った。
コントロール群と治療群のマウスとを用いて評価した。適切な経過設定を決め(経時的に)、マウスを4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定後、脳の切り出しを行った。さらに、4%パラホルムアルデヒドを外固定した。15%と30%の勾配をつけたショ糖にて脱水後、凍結切片を作成した。
DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)solusionにて核染色を行い、退光防止剤を用いて封入した。共焦点レーザー顕微鏡にて損傷部位(脳組織欠損部)でのGFP陽性細胞の集積を評価した。
結果:投与後、2週間および6週間後のGFP陽性細胞集積を定性的に示す。2週間後(コントロール;図23D, 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分;図23E)および6週間後(コントロール;図23F 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分;図23G)ともに、コントロール群に比して治療群の損傷部位にGFP陽性細胞の集積が高い傾向にあった。
考察:皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分投与により、骨髄由来細胞が脳組織欠損部位に集積し神経細胞の形態を示した。骨髄由来間葉系幹細胞は神経細胞にも分化することが知れており、本結果から、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分によって脳損傷部位における神経系細胞再生の誘導できることが明らかになった。また、これは、脳虚血性疾患や脳挫傷における脳組織障害部位での神経再生にも応用可能である。
Claims (1)
- 以下の(a)から(i)のいずれかに記載の成分を含有する、骨髄由来間葉系幹細胞の誘導剤;
(a)HMGB1タンパク質
(b)HMGB1タンパク質を分泌する細胞
(c)HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(d)HMGB2タンパク質
(e)HMGB2タンパク質を分泌する細胞
(f)HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
(g)HMGB3タンパク質
(h)HMGB3タンパク質を分泌する細胞
(i)HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
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