BR112021005982A2 - peptídeo possuindo atividade de mobilização de células-tronco mesenquimais - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEO POSSUINDO ATIVIDADE DE MOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS. A presente invenção refere-se a um peptídeo de sequência artificial com base nos resultados de estudo original conduzido até o momento, no qual se descobriu que o peptídeo apresenta uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico. A presente invenção também se refere à descoberta de que o peptídeo de sequência artificial tem um efeito terapêutico sobre doença intestinal inflamatória, dermatite atópica, e enfarte cerebral. Com base nestas descobertas, a presente invenção também se refere a uma nova tecnologia de medicina regenerativa que pode superar os problemas da terapia de transplante celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEO POSSUINDO ATIVIDADE DE MOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS". Campo Técnico

[001] A presente Invenção refere-se a peptídeos tendo uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais, composições para mobilização de células tronco mesenquimais, e agentes para o tratamento de doenças baseado na mobilização de células tronco mesenquimais. Antecedentes da Técnica

[002] As células tronco mesenquimais contidas no líquido da medula óssea e similares têm a capacidade de se diferenciarem em vários tecidos (pluripotência) tais como osso, cartilagem, gordura, músculo, nervo e epitélio. Nos últimos anos, têm sido feitas amplamente tentativas para realizar medicina regenerativa (terapia de transplante celular) usando células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea proliferadas por cultura. No entanto, a coleta de sangue da medula óssea contendo células tronco mesenquimais é feita com uma técnica invasiva, a qual insere uma agulha grossa dentro do osso ilíaco repetidamente, deste modo colocando uma grande carga sobre o doador. Além disso, as células tronco mesenquimais gradualmente perdem sua capacidade proliferativa e pluripotência, quando subcultivadas continuamente in vitro. Além disso, a cultura de células tronco mesenquimais com base em controle de alta qualidade que garante a segurança do transplante in vivo requer equipamento de cultura especial, tal como CPC (centro de processamento celular), de modoque a situação corrente é que pode ser realizada somente em um número limitado de universidades e empresas.

Lista de Citações Literatura Não-Patente

[003] PNAS 2011 Apr 19; 108 (16): 6609-14 Literatura de Patente

[004] WO2008/053892

[005] WO2009/133939

[006] WO2012/147470 Sumário da Invenção Problema Técnico

[007] Um objetivo do presente requerimento é desenvolver uma nova tecnologia de medicina regenerativa que possa superar os problemas da terapia de transplante celular. Solução para o Problema

[008] Os presentes inventores desenharam um peptídeo de sequência artificial com base nos resultados de estudo original conduzido até o momento, e descobriram que o peptídeo apresenta uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico. Também foi descoberto que o peptídeo de sequência artificial tem efeitos terapêuticos sobre doença intestinal inflamatória, dermatite atópica, e enfarte cerebral. Com base nestas descobertas, o presente requerimento proporciona uma nova tecnologia de medicina regenerativa que pode superar os problemas da terapia de transplante celular.

[009] Especificamente, o presente requerimento proporciona o seguinte:

[1]

[0010] Composição para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1;

(b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

[2]

[0011] Composição para uso no tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

[3]

[0012] Composição do item [2], caracterizada pelo fato de que o tratamento de uma doença ou condição patológica é selecionado entre terapia de supressão de inflamação, terapia imunomoduladora, terapia de indução de regeneração de tecidos, e terapia de supressão de fibrose tecidual.

[4]

[0013] Composição do item [2], caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é selecionada entre uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença acompanhada por dano tecidual, isquemia, ou necrose, e uma doença fibrótica.

[5]

[0014] Composição do item [2], caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é doença intestinal inflamatória.

[6]

[0015] Composição do item [2], caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é colite ulcerativa.

[7]

[0016] Composição do item [2], caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é dermatite atópica.

[8]

[0017] Composição do item [2], caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é enfarte cerebral.

[9]

[0018] Composição para uso no tratamento de uma doença selecionada entre doença intestinal inflamatória, dermatite atópica, e enfarte cerebral, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

[10]

[0019] Peptídeo caracterizado pelo fato de ser selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [A1]

[0020] Método para mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um indivíduo, de uma quantidade eficaz de um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [A2]

[0021] Método para o tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, o qual é caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [A3]

[0022] Método do item [A2], caracterizado pelo fato de que o tratamento de uma doença ou condição patológica é selecionado entre terapia de supressão de inflamação, terapia imunomoduladora, terapia de indução de regeneração de tecidos, e terapia de supressão de fibrose tecidual. [A4]

[0023] Método do item [A2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é selecionada entre uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença acompanhada por dano tecidual, isquemia, ou necrose, e uma doença fibrótica. [A5]

[0024] Método do item [A2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é doença intestinal inflamatória. [A6]

[0025] Método do item [A2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é colite ulcerativa. [A7]

[0026] Método do item [A2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é dermatite atópica. [A8]

[0027] Método do item [A2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é enfarte cerebral. [A9]

[0028] Método para o tratamento de uma doença selecionada entre doença intestinal inflamatória, dermatite atópica, e enfarte cerebral em um indivíduo, o qual é caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao indivíduo, de uma quantidade eficaz de um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [B1]

[0029] Peptídeo para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, o qual é caracterizado pelo fato de ser selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [B2]

[0030] Peptídeo para uso no tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, o qual é caracterizado pelo fato de ser selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [B3]

[0031] Peptídeo do item [B2], caracterizado pelo fato de que o tratamento de uma doença ou condição patológica é selecionado entre terapia de supressão de inflamação, terapia imunomoduladora, terapia de indução de regeneração de tecidos, e terapia de supressão de fibrose tecidual. [B4]

[0032] Peptídeo do item [B2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é selecionada entre uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença acompanhada por dano tecidual, isquemia, ou necrose, e uma doença fibrótica. [B5]

[0033] Peptídeo do item [B2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é doença intestinal inflamatória.

[B6]

[0034] Peptídeo do item [B2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é colite ulcerativa. [B7]

[0035] Peptídeo do item [B2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é dermatite atópica. [B8]

[0036] Peptídeo do item [B2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é enfarte cerebral. [B9]

[0037] Peptídeo para uso no tratamento de uma doença selecionada entre doença intestinal inflamatória, dermatite atópica, e enfarte cerebral, o qual é caracterizado pelo fato de ser selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [C1]

[0038] Uso de um peptídeo selecionado entre o seguinte caracterizado pelo fato de ser na fabricaçãode um medicamento ou reagente para a mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1;

(b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [C2]

[0039] Uso de um peptídeo selecionado entre o seguinte caracterizado pelo fato de ser na fabricaçãode um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. [C3]

[0040] O uso do item [C2], caracterizado pelo fato de que o tratamento de uma doença ou condição patológica é selecionado entre terapia de supressão de inflamação, terapia imunomoduladora, terapia de indução de regeneração de tecidos, e terapia de supressão de fibrose tecidual. [C4]

[0041] O uso do item [C2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é selecionada entre uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença acompanhada por dano tecidual, isquemia, ou necrose, e uma doença fibrótica. [C5]

[0042] O uso do item [C2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é doença intestinal inflamatória. [C6]

[0043] O uso do item [C2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é colite ulcerativa. [C7]

[0044] O uso do item [C2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é dermatite atópica. [C8]

[0045] O uso do item [C2], caracterizado pelo fato de que a doença ou condição patológica é enfarte cerebral. [C9]

[0046] Uso de um peptídeo selecionado entre o seguinte caracterizado pelo fato de ser na fabricaçãode um medicamento para o tratamento de uma doença selecionada entre doença intestinal inflamatória, dermatite atópica, e enfarte cerebral: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

Breve Descrição dos Desenhos

[0047] [Figura 1] A Figura 1 é um gráfico do número de colônias obtidas por cultura de sangue periférico coletado 14 horas depois da administração de solução salina fisiológica ou do peptídeo. No gráfico, "salina" indica o grupo de controle, e "1r10" indica o grupo de administração do peptídeo 1r10. O número de colônias foi mostrado como o valor por volume do sangue periférico (cerca de 800 μL) coletado de um camundongo. A barra horizontal longa representa o valor médio, e a barra curta representa o desvio padrão.

[0048] [Figura 2] A Figura 2 é um gráfico mostrando mudanças no peso corporal dos camundongos (média ± erro padrão (SEM); * p <0,05 (t teste de Student)). No gráfico, "salina" indica o grupo de controle, e "1r10" indica o grupo de administração do peptídeo 1r10. O eixo horizontal mostra o número de dias depois de começar a beber uma solução aquosa de sulfato de dextrano de sódio (DSS).

[0049] [Figura 3] A Figura 3 é um gráfico mostrando pontuações das fezes dos camundongos (média ± erro padrão (SEM)). No gráfico, "salina" indica o grupo de controle, e "1r10" indica o grupo de administração do peptídeo 1r10. O eixo horizontal mostra o número de dias depois de começar a beber uma solução aquosa de sulfato de dextrano de sódio (DSS).

[0050] [Figura 4] A Figura 4 é um gráfico mostrando as pontuações do Índice de Atividade da Doença (DAI) dos camundongos (média ± erro padrão (SEM); * p <0,05 (teste U de Mann Whitney)). No gráfico, "salina" indica o grupo de controle, e "1r10" indica o grupo de administração do peptídeo 1r10. O eixo horizontal mostra o número de dias depois de começar a beber uma solução aquosa de sulfato de dextrano de sódio (DSS).

[0051] [Figura 5] A Figura 5 é um gráfico mostrando o comprimento do intestino grosso 10 dias depois de começar a beber uma solução aquosa de sulfato de dextrano de sódio (DSS) (média ± erro padrão (SEM)). No gráfico, "salina" indica o grupo de controle, e "1r10" indica o grupo de administração do peptídeo 1r10.

[0052] [Figura 6] A Figura 6 apresenta fotografias mostrando a aurícula dos camundongos 4 dias depois do início da administração do peptídeo. As setas indicam a borda da aurícula onde é mais provável de ser vista escamação.

[0053] [Figura 7] A Figura 7 é um gráfico mostrando mudanças na espessura do auricular durante o período de administração do peptídeo (o eixo vertical é um valor relativo com a data de início da administração do peptídeo como 100%). Cada ponto mostra a média e erro padrão (* p <0,05; teste ANOVA one way repetido; teste post hoc de Tukey-Kramer).

[0054] [Figura 8] A Figura 8 apresenta fotografias representativas mostrando Imagens coradas com H.E. de seções de pele da aurícula no 4o. dia depois do início da administração do peptídeo. As setas nas fotografias mostram exemplos da espessura da derme medida.

[0055] [Figura 9] A Figura 9 é um gráfico [(gráfico de caixa e bigode (Box-Whisker)) mostrando a espessura da derme de cada grupo no 4o. dia depois do início da administração do peptídeo. O Box e Whisker centrais indicam a mediana, quartil, e valores máximo/mínimo. O Losango na Caixa mostra o valor médio. (**p <0,01 teste U de Mann Whitney; 7 camundongos em cada grupo x 9 medições por camundongo)

[0056] [Figura 10] A Figura 10 apresenta fotografias mostrando as imagens de múltipla imunocoloração por fluorescência de seções de pele da aurícula no 4º. dia depois do início da administração do peptídeo (Laminina (verde)-CD45 (vermelho)-DAPI (azul)). Laminina foi usada para marcar estruturas no tecido (vasos sanguíneos, membranas basais, nervos), e DAPI foi usado como um contracorante para o DNA de cada célula.

[0057] [Figura 11] A Figura 11 é um gráfico (gráfico de caixa e bigode) mostrando o número de células CD45-positivas (células imunes CD45+) por unidade de área de campo de alta potência (400x) em cada grupo nas seções de pele auricular 4 dias depois do início da administração do peptídeo. O Box e Whisker centrais indicam a mediana, quartil, e valores máximo/mínimo. O Losango na Caixa mostra o valor médio. "x" representa o ponto fora da curva. (** p <0,01 Teste U de Mann Whitney; 7 camundongos em cada grupo x 9 medições por camundongo. Pontos fora da curva apareceram em 1 de 7 indivíduos (cerca de 14%) tanto no grupo de controle quanto no grupo de administração de peptídeo. Portanto, para cada grupo, o ponto fora da curva foi substituído com o valor médio dos outros 6 indivíduos não tendo pontos fora da curva.)

[0058] [Figura 12] A Fig.12 é um gráfico mostrando a proporção de volume do enfarte cerebral 48 horas depois de oclusão da artéria cerebral média direita (média ± erro padrão). ** p <0,01, teste U de Mann-Whitney. Descrição de Modalidades

[0059] Os presentes inventores descobriram previamente uma substância tendo uma atividade de ativação de células tronco em um corpo vivo ou mobilização das mesmas para um tecido lesado através da circulação periférica, e acreditam que a substância é promissora como um novo tipo de medicamento que pode superar as debilidades da terapia celular. Especificamente, os presentes inventores descobriram que a proteína do grupo de alta mobilidade box 1 (HMGB1, High Mobility Group Box 1), a qual é liberada a partir de tecido necrótico, mobiliza células que são positivas para o receptor α do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα), o qual tem um papel na indução da regeneração tecidual in vivo (acredita-se que sejam células tronco mesenquimais (MSC)), para um tecido necrótico através da circulação periférica, deste modo suprime inflamação do tecido necrótico e promove regeneração tecidual. Além disso, os presentes inventores descobriram que peptídeos de fragmentos de HMGB1 apresentam uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico e uma atividade de indução de regeneração tecidual. Desta vez, em consequência do desenho de um peptídeo de sequência artificial tendo uma sequência de aminoácidos específica com base nos resultados de estudo original conduzido até o momento, os presentes inventores confirmaram que o peptídeo demonstra uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico.

[0060] Além disso, os presentes inventores descobriram que o peptídeo de sequência artificial mostra efeitos terapêuticos sobre doenças intestinais inflamatórias. Especificamente, foi confirmado que o peptídeo de sequência artificial melhora a pontuação do índice de atividade da doença (DAI), o qual é um índice para avaliar a atividade da doença, em um modelo de doença intestinal inflamatória em camundongos.

[0061] Além disso, os presentes inventores descobriram que o peptídeo de sequência artificial mostra efeitos terapêuticos sobre a dermatite atópica. Especificamente, foi confirmado que o peptídeo de sequência artificial suprime escamação e edema, suprime aumentos na espessura da derme, e suprime a infiltração de células CD45- positivas em um modelo de dermatite atópica em camundongos.

[0062] Além disso, os presentes inventores descobriram que o peptídeo de sequência artificial mostra efeitos terapêuticos sobre enfarte cerebral. Especificamente, foi confirmado que o peptídeo de sequência artificial reduz a lesão do enfarte cerebral em um modelo de enfarte cerebral em ratos.

[0063] É de conhecimento geral dos peritos na arte que as células tronco mesenquimais exercem uma ação anti-inflamatória, uma ação imunomoduladora, e uma ação anti-fibrótica. Além disso, como as células tronco mesenquimais também têm pluripotência que permite que as mesmas se diferenciem em vários tecidos, é de conhecimento geral dos peritos na arte que elas exercem uma ação de promoção de regeneração de tecidos lesados. Portanto, quando um peptídeo de sequência artificial tendo uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico é administrado a um indivíduo, as células tronco mesenquimais são recrutadas para dentro do sangue periférico, e a ação anti-inflamatória, a ação imunomoduladora, a ação anti-fibrótica, a ação de promoção de regeneração tecidual (devido à diferenciação e/ou ação anti- inflamatória das células tronco mesenquimais) das células tronco mesenquimais são consideradas para produzir efeitos terapêuticos sobre várias doenças.

[0064] Na presente invenção, o "peptídeo de sequência artificial" se refere a um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos que não existe na natureza. Além disso, na presente invenção, o "peptídeo de sequência artificial" também é simplesmente referido como um "peptídeo artificial".

[0065] O presente requerimento proporciona composições contendo um peptídeo de sequência artificial específico para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico.

[0066] As composições para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico do presente requerimento podem ser usadas como uma composição farmacêutica ou uma composição reagente. Na presente invenção, o termo "composição farmacêutica" é usado de modo intercambiável com "medicamento", "fármaco" ou "composição farmacológica", e o termo

"composição reagente" é usado de modo intercambiável com "reagente".

[0067] As composições para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico do presente requerimento podem ser usadas para o tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo, por exemplo, por mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico.

[0068] Células tronco mesenquimais mobilizadas para dentro do sangue periférico usando a composição para a mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico do presente requerimento também podem ser coletadas do corpo, concentradas, e em seguida usadas para o tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo. O presente requerimento também proporciona o uso de um peptídeo de sequência artificial específico na fabricação de um medicamento ou de um reagente para coletar células tronco mesenquimais do corpo.

[0069] As composições para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico do presente requerimento também podem ser usadas, por exemplo, em pesquisa básica, pesquisa clínica e similares. Pesquisa básica e pesquisa clínica incluem, mas não estão limitadas a, pesquisa de mobilização de células tronco mesenquimais in vitro e pesquisa de mobilização de células tronco mesenquimais em animais de laboratório. O presente requerimento também proporciona o uso de peptídeos de sequência artificial específicos na fabricação de fármacos ou reagentes para pesquisa básica ou clínica.

[0070] As composições para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico podem compreender um ou mais peptídeos de sequência artificial.

[0071] Na presente invenção, "células tronco mesenquimais" são células que são coletadas da medula óssea ou de outros tecidos (sangue tal como sangue do cordão umbilical, e pele, gordura, pulp, etc.), podem ser cultivadas e proliferadas sobre pratos de cultura (de plástico ou de vidro) como células aderentes, e têm a capacidade de se diferenciarem em tecidos mesenquimais tais como osso, cartilagem, gordura e músculo. Em uma modalidade, as células tronco mesenquimais também têm a capacidade de se diferenciarem em tecidos epiteliais e tecidos nervosos. Em uma modalidade, as células tronco mesenquimais são células capazes de formar colônias. Na presente invenção, as células tronco mesenquimais podem existir como uma população celular heterogênea compreendendo não somente células tronco em um sentido restrito (células tendo capacidade de auto-renovação e capacidade de diferenciação) mas também células progenitoras. Sob condições de cultura, as células tronco mesenquimais podem incluir células tronco em um sentido restrito, ou podem ainda incluir células diferenciadas além de células tronco em um sentido restrito e células progenitoras. Em uma modalidade, as células tronco mesenquimais podem ser compostas somente de células tronco em um sentido restrito.

[0072] Na presente invenção, células progenitoras são definidas como células com uma capacidade unidirecional para se diferenciarem em células de tecidos específicos diferentes do sistema sanguíneo, e incluem células que têm a capacidade de se diferenciarem em tecidos mesenquimais, tecidos epiteliais, tecidos nervosos, órgãos parenquimatosos, endotélio vascular.

[0073] Na presente invenção, as células tronco mesenquimais incluem, mas não estão limitadas a, células tronco mesenquimais da medula óssea e células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea. As "células tronco mesenquimais da medula óssea" existem na medula óssea, e podem ser colhidas da medula óssea e cultivadas e proliferadas como células aderentes sobre prato de cultura (feito de plástico ou de vidro); e são células caracterizadas pelo fato de terem a capacidade de se diferenciarem em tecidos mesenquimais, tais como osso, cartilagem, gordura, músculo e similar. Em uma modalidade, células tronco mesenquimais da medula óssea também tê a capacidade de se diferenciarem em tecidos epiteliais e tecidos nervosos. Em uma modalidade, células tronco mesenquimais da medula óssea são células capazes de formar colônias. Na presente invenção, o termo "célula tronco mesenquimal da medula óssea" é usado de modo intercambiável com "célula estromal mesenquimal da medula óssea", "célula tronco pluripotente da medula óssea" ou "célula estromal pluripotente da medula óssea".

[0074] "Células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea" se refere a células tronco mesenquimais da medula óssea que tenham sido mobilizadas a partir da medula óssea para o exterior da medula óssea, e são células que podem ser coletadas por coleta do sangue periférico, e além disso a partir de tecidos mesenquimais, tais como gordura, tecidos epiteliais, tais como a pele, ou tecidos nervosos, tais como o cérebro. Na presente invenção, o termo "célula tronco mesenquimal derivada da medula óssea" pode ser usado de modo intercambiável com "célula estromal mesenquimal derivada da medula óssea", "célula tronco pluripotente derivada da medula óssea" ou "célula estromal pluripotente derivada da medula óssea".

[0075] Em uma modalidade, células tronco mesenquimais da medula óssea e células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea também são caracterizadas pelo fato de que, ao serem administradas a uma parte ferida de um corpo vivo diretamente depois da coleta ou depois de uma vez anexadas a uma placa de cultura, as células também são capazes de se diferenciarem em, por exemplo, tecidos epiteliais, tais como queratinócitos que constituem a pele ou tecidos do sistema nervoso, o qual constitui o cérebro.

[0076] As células tronco mesenquimais da medula óssea e as células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea de modo preferencial têm a capacidade de se diferenciarem em células de osteoblastos (identificáveis por deposição de cálcio observada quando é induzida diferenciação), células de cartilagem (identificáveis por serem positivas para coloração com azul Alcian, positivas para coloração com safranina-O, ou similares), e células de gordura (identificáveis por serem positivas para coloração com Sudan III ou similares), e também se diferenciarem em, por exemplo, células mesenquimais, tais como fibroblastos, células musculares lisas, células musculares esqueléticas, células estromais, e células de tendões, células nervosas, células de pigmentos, células epidérmicas, células de folículos capilares (expressando a família da citoqueratina, a família da queratina do cabelo ou similares), células epiteliais (por exemplo, células queratinizadas epiteliais e células epiteliais intestinais expressam a família da citoqueratina ou similares), células endoteliais, e além disso se diferenciam em células de órgãos parenquimatosos, tais como o fígado, os rins e o pâncreas, mas as células diferenciadas não estão limitadas às células acima.

[0077] Marcadores de células tronco mesenquimais humanas podem ser exemplificados por alguns ou todos entre PDGFRα positivos, PDGFRβ positivos, Lin negativos, CD45 negativos, CD44 positivos, CD90 positivos, CD29 positivos, Flk-1 negativos, CD105 positivos, CD73 positivos, CD90 positivos, CD71 positivos, Stro-1 positivos, CD106 positivos, CD166 positivos, CD31 negativos, CD271 positivos, e CD11b negativos, mas não estão limitados a estes.

[0078] Marcadores de células tronco mesenquimais murinas podem ser exemplificados por alguns ou todos entre CD44 positivos, PDGFRα positivos, PDGFRβ positivos, CD45 negativos, Lin negativos,

Sca-1 positivos, c-kit negativos, CD90 positivos, CD105 positivos, CD29 positivos, Flk-1 negativos, CD271 positivos, e CD11b negativos, mas não estão limitados a estes.

[0079] Marcadores de células tronco mesenquimais de rato podem ser exemplificados por alguns ou todos entre PDGFRα positivos, CD44 positivos, CD54 positivos, CD73 positivos, CD90 positivos, CD105 positivos, CD29 positivos, CD271 positivos, CD31 negativos, e CD45 negativos, mas não estão limitados a estes.

[0080] Na presente invenção, exemplos de células tronco mesenquimais incluem células tronco mesenquimais PDGFRα- positivas, células tronco mesenquimais derivadas da medula óssea PDGFRα-positivas, e células derivadas da medula óssea PDGFRα- positivas obtidas como células aderentes por cultura celular de uma fração de células mononucleares em sangue obtido por coleta da medula óssea (coleta de células da medula óssea) ou por coleta de sangue periférico, mas não estão limitadas a estas. Exemplos de células tronco mesenquimais PDGFRα-positivas incluem células PDGFRα- e CD44-positivas, células PDGFRα- e CD90-positivas, células PDGFRα- e CD105-positivas, células PDGFRα- e CD29- positivas, e similares. Em uma modalidade, células tronco mesenquimais PDGFRα-positivas podem ser células CD44-negativas.

[0081] O presente requerimento proporciona composições para uso no tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico, compreendendo um peptídeo de sequência artificial específico.

[0082] As composições para uso no tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico na presente invenção podem ser usadas como composições farmacêuticas.

[0083] O indivíduo na presente invenção não é particularmente limitado, e exemplos do mesmo incluem mamíferos, aves e peixes. Mamíferos incluem ser humano e animais não humanos, por exemplo, ser humano, camundongo, rato, macaco, porco, cão, coelho, hamster, porquinho da índia, cavalo, carneiro, e baleia, mas não estão limitados a estes. Na presente invenção, o termo "indivíduo" é usado de modo intercambiável com "paciente", "indivíduo" ou "animal".

[0084] A composição para uso no tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico na presente invenção pode compreender um ou mais peptídeos de sequência artificial.

[0085] Na presente invenção, o tratamento de uma doença ou condição patológica é selecionado entre, por exemplo, terapia de supressão de inflamação, terapia imunomoduladora, terapia de indução de regeneração de tecidos, e terapia de supressão de fibrose tecidual, mas não está limitado a estas.

[0086] Na presente invenção, a doença ou condição patológica é selecionada entre doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças acompanhadas por dano tecidual, isquemia, ou necrose, e doenças fibróticas, mas não está limitada a estas.

[0087] Na presente invenção, a doença inflamatória inclui, por exemplo, doença intestinal inflamatória e dermatite atópica, mas não está limitada a estas. A doença autoimune inclui, por exemplo, doença intestinal inflamatória, mas não está limitada a esta. A doença fibrótica inclui, por exemplo, fibrose pulmonar, mas não está limitada a esta. A doença acompanhada por dano tecidual, isquemia, ou necrose inclui, por exemplo, doença intestinal inflamatória e enfarte cerebral, mas não está limitada a estas. A doença intestinal inflamatória inclui, mas não está limitada a, colite ulcerativa e doença de Crohn.

[0088] Na presente invenção, o termo "atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico" é usado de modo intercambiável com "atividade para aumentar a abundância de células tronco mesenquimais no sangue periférico".

[0089] A atividade de um peptídeo de sequência artificial Na presente invenção para mobilizar células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico pode ser avaliada i) coletando sangue periférico de um indivíduo ao qual foi administrado um peptídeo de sequência artificial e de um indivíduo ao qual não foi administrado o peptídeo de sequência artificial, semeando e cultivando em uma placa de cultura (vários dias até 10 dias), e contando o número de colônias formadas; e ii) confirmando que as colônias formadas têm a capacidade de aderir à fase sólida e se proliferarem (capacidade de auto-renovação), e a capacidade de se diferenciarem em osteoblastos, condrócitos e adipócitos. Em i) acima, antes de semear o sangue periférico coletado sobre uma placa de cultura, os glóbulos sanguíneos podem ser removidos do sangue periférico em uma maneira desejada.

[0090] O peptídeo de sequência artificial na presente invenção pode ser obtido como um recombinante por incorporação de DNA codificando o mesmo em um sistema de expressão apropriado, ou pode ser sintetizado artificialmente. Deste modo, peptídeos de sequência artificial neste requerimento incluem peptídeos preparados usando células, e peptídeos sintetizados artificialmente (isto é, peptídeos sintéticos).

[0091] De modo a obter o peptídeo de sequência artificial na presente invenção por técnicas de engenharia genética, DNA codificando o peptídeo pode ser incorporado em um sistema de expressão apropriado e expresso.

[0092] Hospedeiros aplicáveis ao presente requerimento incluem, mas não estão limitados a, células procarióticas e células eucarióticas. Além disso, hospedeiros aplicáveis ao presente requerimento também incluem bactérias (por exemplo, Escherichia coli), leveduras, células animais (por exemplo, células de mamíferos, tais como células HEK293 e células CHO, células de insetos, tais como células do bicho- da-seda), células vegetais e similares, mas não estão limitados a estas.

[0093] Como o sistema de hospedeiro/vetor aplicável ao presente requerimento, por exemplo, pode ser mostrado o vetor de expressão pGEX e Escherichia coli. pGEX pode expressar um gene estranho como uma proteína de fusão com glutationa S-transferase (GST) (Gene, 67: 31-40, 1988). Assim sendo, pGEX no qual DNA codificando o peptídeo de sequência artificial do presente requerimento tenha sido incorporado é introduzido em uma cepa de E. coli, tal como BL21 por choque térmico, e depois de cultura por um período de tempo apropriado, isopropiltio-β-D-galactosídeo (IPTG) é adicionado para induzir a expressão do peptídeo de fusão GST. GST Na presente invenção adsorve à glutationa Sepharose 4B, e deste modo o produto de expressão pode ser facilmente separado e purificado por cromatografia de afinidade.

[0094] Além disto, o seguinte pode ser aplicado como um sistema de hospedeiro/vetor para obter um recombinante genético do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento. Primeiro, quando uma bactéria é usada como um hospedeiro, um vetor para expressar uma proteína de fusão usando um marcador ou similar está disponível comercialmente. Além disso, o recombinante genético do presente requerimento também inclui aqueles nos quais um marcador ou um peptídeo parcial do mesmo é adicionado.

[0095] O marcador adicionado ao peptídeo de sequência artificial do presente requerimento não é particularmente limitado, contanto que não afete a atividade do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento, e inclui, por exemplo, uma etiqueta de histidina (por exemplo, 6x His, 10x His), etiqueta HA, etiqueta FLAG, etiqueta GST, T7-tag, HSV-tag, E-tag, lck tag, e B-tag.

[0096] Entre leveduras, é de conhecimento geral que a levedura Pichia é efetiva para a expressão de proteínas tendo cadeias de açúcar. Em termos da adição de cadeias de açúcar, também é útil o sistema de expressão que usa um vetor de Baculovírus, o qual usa uma célula de inseto como um hospedeiro (Bio/Technology, 6:47-55, 1988). Além disso, células de mamífero são usadas para transfecção com um vetor que usa o promotor de CMV, RSV, SV40 ou similares. Estes sistemas de hospedeiro/vetor podem ser usados como um sistema de expressão para o peptídeo de sequência artificial do presente requerimento. Além disso, vetores de plasmídeo, vetores de retrovírus, vetores de lentivírus, vetores de adenovírus, vetores de vírus adeno-associado, vetores do vírus Sendai, vetores do envelope do vírus Sendai, vetores do vírus do papiloma, e vetores de vírus similares também podem ser usados para introduzir o gene, sem limitação a estes. O vetor também pode conter uma sequência de DNA promotor que induz de modo eficaz expressão genética, fatores que controlam a expressão genética, e moléculas necessárias para manter a estabilidade do DNA.

[0097] O peptídeo de sequência artificial resultante na presente invenção pode ser isolado a partir da célula hospedeira ou do exterior da célula (tal como o meio), e purificado como um peptídeo homogêneo substancialmente puro. Para separação e purificação de peptídeos, podem ser utilizados quaisquer métodos de separação e purificação usados em purificação de peptídeos de rotina, sem limitação. Por exemplo, colunas de cromatografia, filtros, ultrafiltração, salgamento, precipitação de solventes, extração de solventes, destilação, imunoprecipitação, eletroforese por gel de poliacrilamida- SDS, focagem isoelétrica, diálise, recristalização, e similares são adequadamente selecionados e combinados para separação e purificação de peptídeos.

[0098] Cromatografia inclui, por exemplo, cromatografia por afinidade, cromatografia por permuta de íons, cromatografia por hidrofóbica, filtração por gel, cromatografia de fase reversa, cromatografia por adsorção e similares (Marshak et al, Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas cromatografias podem ser realizadas usando cromatografia líquida tal como HPLC e FPLC.

[0099] Além disso, o peptídeo de sequência artificial na presente invenção de modo preferencial é um peptídeo substancialmente purificado. No presente documento, "substancialmente purificado" significa que o grau de purificação do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento (a proporção do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento no componente protéico inteiro) é de 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 100% ou quase 100%. O limite superior de quase 100% depende das técnicas de purificação e das técnicas de análise dos peritos na arte e pode ser, por exemplo, de 99,999 %, 99,99 %, 99,9 %, ou 99%.

[00100] Além disso, o peptídeo de sequência artificial substancial- mente purificado inclui os purificados por qualquer método de purificação, contanto que tenham a pureza acima. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de sequência artificial substan- cialmente purificados selecionando ou combinando adequadamente as colunas de cromatografia acima mencionadas, filtros, ultrafiltração, salgamento, precipitação de solventes, extração de solventes, destilação, immunoprecipitação, eletroforese em gel de poliacrilamida- SDS, focagem isoelétrica, diálise, recristalização e similar.

[00101] Por outro lado, os peptídeos de sequência artificial na presente invenção também podem ser sintetizados artificialmente.

No método de síntese de peptídeo do presente requerimento, os peptídeos podem ser sintetizados quimicamente por métodos tais como um método de síntese de fase líquida de peptídeo e um método de síntese de fase sólida de peptídeo.

O método de síntese de fase sólida de peptídeo é um dos métodos usados de modo geral ao sintetizar quimicamente um peptídeo.

Contas de gel de polímero de poliestireno tendo um diâmetro de cerca de 0,1 mm modificadas com grupos de amino sobre a superfície são usadas como uma fase sólida, a partir da qual a cadeia de aminoácidos é estendida um a um através de reação de desidratação.

Quando a sequência do peptídeo alvo é completada, é excisada da superfície da fase sólida de modo a obter a substância alvo.

A síntese de fase sólida permite a síntese de peptídeos do ribossoma, os quais são difíceis de sintetizar em bactérias, a introdução de aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos substituídos com isótopos estáveis (2H, 13 C, 15 N, etc.) e a forma D, a introdução de aminoácidos substituídos com átomos pesados aminoácidos (por exemplo, selenoaminoácidos tais como selenometionina), a modificação de cadeias principais de peptídeos e proteínas, e similares.

Ao sintetizar uma cadeia peptídica longa de 70 a mais de 100 aminoácidos no método de fase sólida, pode ser sintetizada por ligação de duas cadeias peptídicas usando o método de ligação química nativa.

O peptídeo de sequência artificial na presente invenção pode estar sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável do peptídeo.

Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, hidrocloretos, acetatos, e trifluoroacetatos.

O peptídeo de sequência artificial Na presente invenção pode estar sob a forma de um solvato do peptídeo, ou um solvato de um sal farmaceuticamente aceitável do peptídeo. Um solvato se refere a uma molécula de soluto, à qual um número arbitrário de moléculas de é coordenado, e exemplos dos mesmos incluem hidratos, mas não estão limitados a estes.

[00102] O comprimento de aminoácidos do peptídeo de sequência artificial na presente invenção inclui, por exemplo, 25 a 35 aminoácidos, 20 a 40 aminoácidos, 10 a 50 aminoácidos, 10 a 70 aminoácidos, e 10 a 100 aminoácidos, mas não está limitado a estes.

[00103] Exemplos do peptídeo de sequência artificial na presente invenção incluem peptídeos selecionados entre abaixo: um peptídeo de sequência artificial compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (ii) um peptídeo de sequência artificial consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (iii) um peptídeo de sequência artificial consistindo na porção da sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (iv) um peptídeo de sequência artificial compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (v) um peptídeo de sequência artificial consistindo em uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (vi) um peptídeo de sequência artificial compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo cerca de 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (vii) um peptídeo de sequência artificial consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo cerca de 90% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1;

(viii) um peptídeo de sequência artificial codificado por um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID Nº: 2; e (ix) um peptídeo de sequência artificial codificado por um DNA que hibridiza sob condições estringentes com um DNA consistindo na sequência de nucleotídeos de SEQ ID Nº: 2.

[00104] Na presente invenção, "vários" inclui, por exemplo, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, ou 1 ou 2.

[00105] Na presente invenção, "cerca de 90% ou mais" significa, por exemplo, cerca de 90% ou mais, cerca de 91% ou mais, cerca de 92% ou mais, cerca de 93% ou mais, cerca de 94% ou mais, cerca de 95% ou mais, cerca de 96% ou mais, cerca de 97% ou mais, cerca de 98% ou mais, ou cerca de 99% ou mais.

[00106] Na presente invenção, as "condições estringentes" podem ser mostradas como condições de, por exemplo, hibridização a 6× SSC, 40% de formamida, 25°C, e lavagem a 1× SSC, 55°C. A estringência é afetada por condições tais como a concentração salina, a concentração de formamida, ou a temperatura, e os peritos na arte podem ajustar estas condições de modo a obter a estringência requerida.

[00107] Quando a hibridização é realizada sob condições estringentes, é selecionado um DNA tendo uma alta homologia em termos de sequência de nucleotídeos, e a possibilidade é aumentada para o peptídeo isolado em consequência compreender um peptídeo funcionalmente equivalente a um peptídeo consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. Uma sequência de nucleotídeos tendo alta homologia pode apresentar, por exemplo, cerca de 60% ou mais, cerca de 70% ou mais, ou cerca de 80% ou mais de identidade. No presente documento, neste requerimento de patente, "funcionalmente equivalente" significa equivalência na função referente a uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico.

[00108] O peptídeo de sequência artificial selecionado entre (i) a (ix) acima é um peptídeo de sequência artificial tendo uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico. Portanto, imagina-se que estes peptídeos de sequência artificial tenham o efeito de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico, bem como efeitos terapêuticos sobre doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças acompanhadas por dano tecidual, isquemia, ou necrose, e doenças fibróticas.

[00109] O presente requerimento também proporciona um peptídeo de sequência artificial selecionado entre (i) a (ix) acima.

[00110] A sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID Nº: 1 é a sequência de aminoácidos do peptídeo de sequência artificial 1r10 do presente requerimento.

[00111] A sequência de nucleotídeos descrita em SEQ ID Nº: 2 é um exemplo da sequência de nucleotídeos de DNA codificando o peptídeo de sequência artificial 1r10 do presente requerimento. Outras sequências de DNA codificando o peptídeo de sequência artificial 1r10 do presente requerimento podem ser produzidas por um método de conversão dos resíduos de aminoácidos do peptídeo de sequência artificial 1r10 para códons correspondentes usando tabelas de códons de conhecimento dos peritos na arte (translação reversa). Translação reversa pode ser realizada usando uma variedade de software (incluindo programas, algoritmos, etc.) desenvolvidos para a análise de sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos, como desejado.

[00112] Uma quantidade eficaz de um peptídeo de sequência artificial do presente requerimento, ou uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo (nas partes que se seguem referida como uma composição farmacêutica e similar) é administrado a um indivíduo para o tratamento de doenças e condições descritas no presente documento, neste requerimento de patente.

[00113] A quantidade eficaz na presente invenção significa uma quantidade suficiente para o tratamento das doenças ou condições patológicas descritas no presente documento, neste requerimento de patente. O tratamento na presente invenção inclui alívio, atraso, inibição, melhora, remissão, cura, e recuperação total, mas não está limitado a estes.

[00114] Não existe nenhuma limitação sobre o sítio de administração da composição farmacêutica e similar do presente requerimento, e a composição farmacêutica e similar do presente requerimento podem exercer seu efeito quando administrados a um sítio, tal como um sítio onde aparecem os sintomas da doença ou condição patológica ou um sítio próximo, um sítio diferente destes sítios (sítios além destes sítios), um sítio separado de um sítio onde aparecem os sintomas da doença ou condição patológica, um sítio distal a um sítio onde aparecem os sintomas da doença ou condição patológica, ou um sítio distal e ectópico a um sítio onde aparecem os sintomas da doença ou condição patológica.

[00115] Além disso, a composição farmacêutica e similar do presente requerimento podem exercer seu efeito quando administrados a qualquer tecido, tal como um tecido diferente de um tecido no qual aparecem os sintomas da doença ou da condição patológica, um tecido separado de um tecido no qual aparecem os sintomas da doença ou da condição patológica, um tecido distal a um tecido no qual aparecem os sintomas da doença ou da condição patológica, ou um tecido distal e ectópico a um tecido no qual aparecem os sintomas da doença ou da condição patológica.

[00116] Os métodos de administração da composição farmacêutica e similar do presente requerimento incluem, mas não estão limitados a, administração oral e administração parenteral, e ps métodos de administração parenteral incluem administração intravascular (administração intraarterial, administração intravenosa, etc.), administração intramuscular, administração subcutânea, administração intradérmica, administração intraperitoneal, administração nasal, administração pulmonar, administração transdérmica, e similar. Além disso, a composição farmacêutica e similar do presente requerimento podem ser administrados sistemicamente ou localmente (por exemplo, por via subcutânea, por via intradérmica, ou na superfície da pele, globo ocular, ou conjuntiva palpebral, mucosa nasal, mucosa oral e gastrointestinal, mucosa vaginal e endometrial, ou local ferido) por administração de injeção, por exemplo, injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, e injeção subcutânea.

[00117] Ao invés do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento, pode ser usada uma célula secretando o peptídeo de sequência artificial, um vetor de terapia genética, no qual é inserido um DNA codificando o peptídeo de sequência artificial, e uma composição farmacêutica compreendendo os mesmos.

[00118] Além disso, o método de administração pode ser selecionado adequadamente dependendo da idade e dos sintomas de um paciente. Quando é administrada a composição farmacêutica e similar do presente requerimento, por exemplo, a dose pode ser selecionada entre uma faixa de 0,0000001 mg a 1000 mg por quilograma de peso corporal por administração. Alternativamente, por exemplo, a dose pode ser selecionada entre uma faixa de 0,00001 a 100000 mg/corpo por paciente. Ao administrar células secretando o peptídeo de sequência artificial do presente requerimento ou vetores de terapia genética nos quais é inserido DNA codificando o peptídeo de sequência artificial, podem ser administrados de modo a que a quantidade do peptídeo de sequência artificial esteja dentro da faixa acima. No entanto, as composições farmacêuticas na presente invenção não são limitadas a estas dosagens.

[00119] As composições farmacêuticas do presente requerimento podem ser formuladas de acordo com métodos convencionais (por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, E.U.A.), e podem conter juntos veículos ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, surfactantes, excipientes, agentes colorantes, perfumes, preservantes, estabilizantes, tampões, agentes de suspensão, agentes de isotonicidade, agentes de ligação, desintegrantes, lubrificantes, agentes de estimulação de fluidez, e agentes flavorizantes. Outros veículos comumente usados também podem ser usados como apropriado. Exemplos específicos incluem ácido silícico anídrico leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, cálcio carmelose, sódio carmelose, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicerídeo de ácidos graxos de cadeia média, óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno 60, açúcar branco, carboximetil celulose, amido de milho, e sais inorgânicos.

[00120] Todos os documentos da arte anterior citados no presente documento, neste requerimento de patente, são incorporados no presente documento, a este requerimento de patente, como referências.

[00121] No presente documento abaixo, neste requerimento de patente, a presente invenção será adicionalmente ilustrada com referência aos Exemplos, mas não deve ser considerada como sendo limitada aos mesmos. Exemplos Exemplo 1 Mobilização de células tronco mesenquimais por peptídeo de sequência artificial

(1) Materiais e métodos i) Produção do peptídeo

[00122] Um peptídeo de sequência artificial consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 foi sintetizado quimicamente (o peptídeo obtido estava sob a forma de um sal de ácido trifluoroacético (TFA)). Nas partes que se seguem, o peptídeo é referido como "peptídeo de sequência artificial 1r10" ou "peptídeo 1r10". ii) Administração do peptídeo

[00123] Camundongos C57BL/6J (8 semanas de idade, machos, peso corporal de 25 g) foram preparados e divididos em um grupo ao qual foi administrado o peptídeo de sequência artificial 1r10 e um grupo de controle. O peptídeo foi administrado injetando dentro da veia da cauda uma solução do peptídeo 1r10 ajustado para uma concentração de 1 µg/µL usando salina fisiológica como um solvente em uma quantidade de 100 µL/ animal (4 mg/kg de dose do peptídeo). Para o grupo de controle, salina fisiológica foi injetada dentro da veia da cauda em uma quantidade de 100 µL/animal. iii) Coleta celular do sangue periférico

[00124] Quatorze horas depois da administração de salina fisiológica ou do peptídeo de sequência artificial 1r10, cerca de 800 µL a 1000 µL de sangue periférico foi coletado dos corações sob anestesia geral (foi usada uma seringa de 1 mL contendo heparina). De modo a remover os glóbulos vermelhos, um volume igual de Hetasep (STEMCELL Technologies Inc., Cat No. ST-07906) como o sangue coletado foi adicionado e centrifugado por 2 min a 100G, incubado por 15 min em temperatura ambiente, e em seguida o sobrenadante foi coletado. O sobrenadante foi usado no experimento seguinte como uma amostra contendo células nucleadas no sangue periférico.

iv) Ensaio de colônias

[00125] O sobrenadante (amostra contendo células derivadas do sangue periférico) obtido pelo procedimento acima foi semeado sobre placas de 6 cavidades revestidas com colágeno I (Corning, Cat No. 356400), e cultivado por 10 dias sob as condições de 37°C, 5% de CO2 e 5% d eO2, usando um meio contento meio de expansão (Expansion Medium) preparado usando o kit MesenCult Expansion Kit (STEMCELL Technologies, Cat No. ST-05513) de acordo com o manual do kit, 1% de L-glutamina (Nacalai Tesque Inc.), 10 µM de inibidor ROCK (Y27632, Tocris Bioscience) e 1% de penicilina/estreptomicina (Nacalai Tesque Inc.) (todos os valores numéricos são concentrações finais). O meio foi substituído com meio fresco duas vezes por semana durante o período de cultura. Nº 10o. dia de cultura, as células sobre as placas foram coradas com um kit Differential Quik Stain Kit (Sysmex Corporation, Cat No. 16920), e foi contado o número de colônias contendo 50 ou mais células.

[00126] Nos experimentos conduzidos pelos presentes inventores até o momento, todas as colônias obtidas em consequência de cultura do sangue periférico sobre uma fase sólida, tal como um prato ou uma placa têm aderabilidade à fase sólida e têm capacidade de auto- renovação. Além disso, foi confirmado que são positivas para PDGFRα, e têm a capacidade de se diferenciarem em osso, cartilagem, gordura, epitélio e similares.

[00127] Além disso, foi confirmado que as colônias obtidas em consequência de cultura, sobre uma fase sólida, de sangue periférico depois da administração de um peptídeo consistindo nos resíduos de aminoácidos 1-44 da proteína HMGB1 humana (nas partes que se seguem, peptídeo HMGB1 1-44), a qual tem uma atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico, têm aderabilidade à fase sólida e capacidade de auto-

renovação, e são positivas para PDGFRα. Também foi confirmado que têm um perfil de expressão genética característico de células tronco mesenquimais, com base nos resultados de agrupamento dos dados de análise do transcriptoma e realização de análise de ontologia genética.

[00128] Além disso, foi confirmado que o número de colônias obtidas por cultura de fase sólida é maior no sangue periférico depois da administração do peptídeo HMGB1 1-44 do que no sangue periférico depois da administração de salina fisiológica.

[00129] Portanto, as colônias obtidas em consequência da cultura de sangue periférico sobre uma fase sólida são células tronco mesenquimais, e considera-se que um aumento no número de colônias detectadas em uma cultura de fase sólida de sangue periférico indica um aumento no número de células tronco mesenquimais no sangue periférico.

[00130] Além disso, como geralmente as células tronco mesenquimais raramente estão presentes no sangue periférico, imagina-se que o aumento da quantidade de células tronco mesenquimais foi mobilizado para dentro do sangue periférico a partir de tecidos diferentes do sangue periférico (por exemplo, medula óssea).

[00131] A partir do acima exposto, o número de colônias detectadas na cultura de fase sólida de sangue periférico depois da administração de uma substância de teste pode ser usado como um indicador da atividade da substância de teste para mobilizar células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico. (2) Resultado

[00132] Nos camundongos aos quais foi administrado o peptídeo 1r10, o número de colônias obtidas sobre a placa por cultura das células derivadas do sangue periférico foi maior do que o número de colônias nos camundongos aos quais foi administrada salina fisiológica (Figura 1).

[00133] Como descrito acima, um aumento no número de colônias detectado pelo ensaio de colônias descrito no presente documento, neste requerimento de patente, indica um aumento no número de células tronco mesenquimais no sangue periférico, e, portanto, estes resultados demonstram que o peptídeo 1r10 tem a atividade de mobilização de células tronco mesenquimais para dentro do sangue periférico. Exemplo 2 Eficácia do peptídeo de sequência artificial para doença intestinal inflamatória (1) Materiais e métodos i) Fármaco

[00134] Sulfato de dextrano de sódio (DSS) (peso molecular de

36.000 a 50.000, fabricado pela MP Biomedicals, Product No. 160110) foi dissolvido em água purificada para preparar uma solução aquosa de DSS a 2,5% (em peso/volume). Além disso, o peptídeo 1r10 (sal de TFA) descrito no Exemplo 1 foi usado como a substância de teste. ii) Geração de camundongos do modelo de doença intestinal inflamatória (IBD)

[00135] Camundongos BALB/c (9 semanas de idade, machos) foram deixados para beber a solução aquosa de DSS a 2,5% livremente por 7 dias de modo a induzir colite. Depois disso, a bebida foi trocada de DSS para água da torneira, e o intestino grosso foi coletado 3 dias depois (10 dias depois de começar a beber a solução aquosa de DSS). iii) Administração do peptídeo

[00136] Os camundongos do modelo de IBD preparados como descrito acima foram divididos no grupo de administração do peptídeo

1r10 (n = 8) e no grupo de controle (n = 8). A administração do peptídeo foi realizada injetando dentro da veia da cauda, a solução do peptídeo 1r10 ajustada para uma concentração de 0,5 mg/mL usando salina fisiológica como um solvente em uma quantidade de 10 mL/kg nos Dias 1, 4, 7, 8 e 9 depois de começar a beber a solução aquosa de DSS (dose do peptídeo de 5 mg/kg). O grupo de controle foi injetado com solução salina fisiológica em uma dose de 10 mL/kg dentro da veia da cauda nos Dias 1, 4, 7, 8 e 9 depois de começar a beber a solução aquosa de DSS. iv) Avaliação do efeito da administração do peptídeo

[00137] Por 10 dias a partir de começar a beber a solução aquosa de DSS, os camundongos foram pesados e observados para os sintomas (condição das fezes e sangramento) todos os dias, com a exceção de sábados, domingos e feriados, e foi avaliado o grau dos sintomas calculando a pontuação do índice de atividade da doença (DAI). A pontuação do índice de atividade da doença foi calculada pontuando a taxa de perda de peso, a condição das fezes, e o sangramento das fezes, como mostrado na tabela abaixo, e somando as pontuações destes três ítens. Os critérios de pontuação foram parcialmente baseados no método de Li et al. (PLoS One. 2015 Dec 7; 10 (12): e0144101).

Tabela 1 Pontuação do Índice de Atividade da Doença (DAI) Item Pontuação Taxa de perda de peso Sem redução 0 1 – 5% 1 5- 1 0% 2 10 - 20% 3 >20% 4 Condição das fezes Normal 0 Fezes moles 2 Diarréia ou fezes aquosas 4 Sangramento Ausente 0 Fezes sanguinolentas 1 Fezes sanguinolentas (em geral) 2 Sangramento do reto 4

[00138] Além disso, o comprimento do intestino grosso (do cólon até o reto) coletado 10 dias depois de começar a beber DSS foi medido usando um calibrador digital. (2) Resultado

[00139] A Figura 2 mostra as mudanças no peso corporal dos camundongos durante o período de teste (vide "salina" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo). Tanto o grupo de controle quanto o grupo de administração do peptídeo perderam seu peso corporal ao longo do tempo depois de começar a beber DSS, mas o grau de diminuição foi menor no grupo de administração do peptídeo do que no grupo de controle, e 10 dias depois de começar a beber a solução aquosa de DSS, o grupo de administração do peptídeo apresentaram uma tendência para recuperar o peso corporal.

[00140] A pontuação das fezes (soma da pontuação da "condição das fezes" e a pontuação de "sangramento" marcada como mostrado na Tabela 1 acima) e a pontuação do Índice de Atividade da Doença (DAI) 8 a 10 dias depois de começar a beber a solução aquosa de DSS são mostradas nas Figuras 3 e 4, respectivamente (vide "salina" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo). Tanto a pontuação das fezes quanto a pontuação do Índice de Atividade da Doença foram menores no grupo de administração do peptídeo do que no grupo de controle.

[00141] Dez dias depois de começar a beber a solução aquosa de DSS, o comprimento do cólon do grupo de administração do peptídeo foi mais longo do que o do grupo de controle (Figura 5; vide "salina" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo).

[00142] Na doença intestinal inflamatória, ocorre inflamação na membrana mucosa do trato intestinal, são formadas úlceras e erosões, e podem ocorrer sintomas tais como estreitamento e encurtamento do trato intestinal. Sabe-se que outro sintoma de doença intestinal inflamatória é a ocorrência de perda de peso corporal, e imagina-se que a razão seja a desnutrição devido à inflamação e ao dano tecidual (tal como úlcera) que ocorrem na mucosa intestinal. Além disso, sabe- se que injeção intravenosa de células tronco mesenquimais em um modelo de doença intestinal inflamatória animal melhora vários sintomas, incluindo a perda de peso corporal, o dano epitelial no trato intestinal, a infiltração de células inflamatórias, e similares. A melhora de sintomas referida é devida à supressão de inflamação da mucosa intestinal pelo efeito anti-inflamatória das células tronco mesenquimais, e a resultante facilitação da regeneração do tecido da mucosa, e similares.

[00143] Esta ocasião, por administração do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento aos camundongos do modelo de doença intestinal inflamatória, foi suprimida a perda de peso corporal, foi suprimida a redução do comprimento do cólon, e foi melhorada a pontuação do Índice de Atividade da Doença. Isto é considerado como sendo uma consequência do fato das células tronco mesenquimais serem mobilizadas para dentro do sangue periférico pela ação do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento, e das células exercerem o efeito anti-inflamatório e o efeito de regeneração tecidual. Exemplo 3 Eficácia do peptídeo de sequência artificial para dermatite atópica (1) Materiais e métodos i) Fármaco

[00144] MC903 (nome genérico: Calcipotriol) foi usado para induzir dermatite atópica (nas partes que se seguem, também referida como "AD") em camundongos. Além disso, o peptídeo 1r10 (sal de TFA) descrito no Exemplo 1 foi usado como a substância de teste. ii) Geração de camundongos de modelo de dermatite atópica

[00145] Camundongos C57BL/6 (C57BL/6JJcl, 7 a 8 semanas de idade, machos, grau microbiano SPF) foram obtidos da Japan Claire Co., Ltd., aclimatados no ambiente de criação de animais por 5 dias ou mais, e em seguida submetidos aos seguintes experimentos. Uma solução de MC903 ajustada com etanol foi aplicada à pele da aurícula dos camundongos em uma dose de 2,25 nmol de MC903/orelha/uma vez/dia, cinco vezes por semana por duas semanas (dez vezes no total) para induzir dermatite atópica (AD). Este modelo de dermatite atópica induzida por MC903 é um modelo no qual pode ser reproduzida patologia similar a dermatite atópica em um curto período de tempo (uma a duas semanas) induzindo artificialmente a secreção de TSLP pelas células epiteliais, o que na verdade é visto em pacientes com dermatite atópica, deste modo provocando uma série de cascatas de respostas imunes tipo 2 (Li M et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103:11736-41.). Além disso, como um teste preliminar, o aspecto e o tecido da aurícula foram observados em camundongos normal e em camundongos com dermatite atópica induzida por MC903 (14 dias depois do início da indução), e em consequência, foi visto que os camundongos com dermatite atópica induzida desenvolvem eritema devido a inflamação, escamação na área marginal, e liquenização queratinosa, acantose epidérmica (espessamento da epiderme devido a proliferação de células espinhosas), destruição de barreiras locais, infiltração de células imunes para dentro da derme, aumento de espessura da derme, e espongiose em partes da epiderme. iii) Administração do peptídeo

[00146] Duas semanas (Dia 15) depois do início da aplicação de MC903 (referida como Dia 1), somente foram selecionados indivíduos nos quais foi claramente induzida dermatite atópica, a julgar pelos principais sintomas de escamação, eritema e edema. Em seguida, foram divididos no grupo de controle e no grupo de administração do peptídeo (n = 7 em cada grupo), enquanto os grupos foram equalizados com base na aurícula espessura levando em conta a diferença na gravidade da inflamação entre os indivíduos. Para a administração do peptídeo, a solução do peptídeo 1r10 ajustada para 0,3 mg/mL com salina fisiológica foi injetada dentro da veia da cauda em um volume de 5 mL/kg (dose do peptídeo de 1,5 mg/kg) duas vezes no total, uma vez no dia de agrupamento (Dias 15) e uma vez durante os 4 dias seguintes (Dia 16 ao Dia 19). Para o grupo de controle, uma solução de albumina do soro bovino (BSA) ajustada para 0,3 mg/mL com salina fisiológica foi injetada dentro da veia da cauda em um volume de 5 mL/kg (dose de BSA de 1,5 mg/kg) duas vezes no total, uma vez no dia de agrupamento (Day 15) e uma vez durante os 4 dias seguintes (Dia 16 ao Dia 19).

iv) Avaliação do efeito da administração do peptídeo Avaliação do edema e da escamação

[00147] Durante o período de administração do peptídeo (Dia 15 ao Dia 19), as tumefações da orelha foram medidas diariamente para determinar o edema. A escamação, a qual é o principal sintoma de dermatite atópica, foi determinada por fotografia (três vezes por semana) usando uma câmera digital (E-M1 II; Olympus) a partir de uma base fixa em uma altura de 13 a 14 cm da aurícula. Análise patológica

[00148] No 4o. dia (Day 19) depois do início da administração do peptídeo, os camundongos foram colocados sob a influência de anestesia por isoflurano e sacrificados com deslocamento da coluna cervical. A pele no sítio de inflamação auricular e seu entorno foi rapidamente excisada e coletada, enquanto sobre gelo, de modo a evitar a desnaturação de proteínas da amostra. Depois de remover o excesso de pelo e pele com pinças, a pele auricular coletada foi imersa em 10% de formalina e fixada a 4°C de um dia para o outro enquanto agitando sobre gelo usando um shaker. Depois de fixação, a pele foi minuciosamente lavada com salina tamponada com fosfato (PBS) e aparada, e em seguida foi feito um bloco de parafina usando um dispositivo de incorporação automático (Excelsior ES; Thermo Scientific) com atenção para a polaridade do tecido no eixo dorsoventral/eixo esquerdo-dierito específico para a pele). Em seguida, foi fatiada (5 μm de espessura) com um micrótomo rotativo (HM 325; Thermo Scientific), fixado sobre uma lâmina de vidro, e submetida a coloração variada. Como análise patológica, a espessura da pele e a infiltração de células imunes foram avaliadas por coloração histoquímica e imunocoloração fluorescente, respectivamente. Medição da espessura da derme

[00149] De modo a avaliar quantitativamente a condição de cura do sítio de inflamação, foi realizada coloração com hematoxilina-eosina (HE) das seções finas de parafina (5 μm de espessura) de tecido de pele gerado como descrito acima para medir a espessura da derme. Especificamente, foram preparadas três seções para cada indivíduo, e cada seção foi fotografada com um microscópio (Keyence BZ-X710) em um sítio cada uma do centro de inflamação, lado da cabeça, e lado da cauda (isto é, um total de 9 sítios foram fotografados por indivíduo). Em seguida, para a imagem fotografada, foram desenhadas linhas perpendiculares a partir da junção epiderme-derme até a junção de gordura subcutânea-cartilagem, e somente a linha perpendicular mais longa no campo visual foi selecionada e usada como o valor medida de espessura da derme. Quantificação de células imunes

[00150] De modo a avaliar quantitativamente o número de células imunes no sítio de inflamação, foi realizadas imunocoloração fluorescente sobre a fatia de parafina (5 μm de espessura) preparada como descrito acima usando um anticorpo anti-Laminina e anticorpo anti-CD45 (para a detecção de Laminina, Anti-Laminina (Sigma Aldrich; Catálogo No. L9393) foi usado como o anticorpo primário, e Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific; Catálogo No. A-21206) foi usado como o anticorpo secundário. Para a detecção de CD45, Goat Anti-mouse CD45 (R&D Systems; Catálogo No. AF114) foi usado como o anticorpo primário e Cy3 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H + L) (Jackson ImmunoReseach; Catálogo Nº. 805-165-180) foi usado como o anticorpo secundário. Para detalhes de quantificação, foram preparadas três seções para cada indivíduo, e cada seção foi fotografada usando um microscópio (Keyence BZ-X710) sob campo de alta potência (HPF: 400x) em um sítio cada uma do centro de inflamação, lado da cabeça, e lado da cauda (isto é, um total de 9 sítios foram fotografados por indivíduo). Em seguida, para a imagem fotografada, as células CD45-positivas (detectadas por fluorescência de Cy3) no campo de visão, foram contadas e usadas como o valor medido. Processamento Estatístico

[00151] Os valores medidos obtidos pela análise acima ou os valores calculados depois de correção foram analisados/julgados depois de cada valor estatístico ter sido calculado usando software de análise estatística (statcel-3 (OMS Publishing) e estatística do Excel (BellCurve)). Especificamente, como um teste preliminar, foram realizados (1) teste de normalidade (teste D'Agostino com coeficiente de distorção/curtose; P> 0,05 é considerado como uma distribuição normal) e (2) teste de rejeição (teste de Grubbs; P <0,05 é considerado como um ponto fora da curva); e quando o resultado obtido em (1) mostrou uma distribuição normal, foi realizado t-teste entre os grupos. Quando o resultado não mostrou uma distribuição normal, foi realizado U teste de Mann-Whitney como um teste não paramétrico baseado nas classificações entre os grupos, e uma diferença significativa foi determinada como estando presente se p <0,05. Para as mudanças no peso corporal e na espessura da aurícula, as quais foram essencialmente medidas repetidamente em séries temporais, foi realizado o teste ANOVA one-way repetido e foi realizado o teste de Tukey-Kramer como um teste post hoc. Com relação ao processamento de pontos fora da curva, foi empregado o seguinte método: (a) se o número de indivíduos no grupo com P <0,05 no teste de Grubbs tiver sido de 10% ou menos do número total de indivíduos (n) no grupo, os pontos fora da curva foram tratados como valores ausentes, e (b) se o número de indivíduos com P <0,05 tiver excedido 10% do número n, foram imputados com o valor médio dos outros indivíduos sem pontos fora da curva (a chamada substituição média).

(2) Resultado Escamação

[00152] Na aurícula dos camundongos do grupo de controle depois da indução do modelo de dermatite atópica, frequentemente ocorreu escamação parte marginal, devido à epiderme exfoliada causada por eczema e secura, as quais são imagens típicas de dermatite atópica (Figura 6, parte das setas na fotografia da esquerda). Por outro lado, no grupo de administração do peptídeo, foi observada redução da escamação na aurícula (Figura 6, parte das setas na fotografia da direita). Espessura Auricular (edema)

[00153] A transição de espessura do auricular (edema) durante o período de administração do peptídeo é mostrada na Figura 7 (vide "Controle" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo). Foi observada uma redução estatisticamente significativa na espessura do auricular no grupo de administração do peptídeo em comparação com o grupo de controle. Espessura da derme

[00154] Em consequência da coloração com HE das seções de tecido da pele, no grupo de controle foi observado um aumento na espessura da derme não visto nos camundongos nos quais não foi induzida dermatite atópica (possivelmente devido a infiltração celular e aumento da permeabilidade vascular associado com a resposta imune causada pela dermatite atópica) (Figura 8; vide "Controle" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo). Por outro lado, no grupo de administração do peptídeo, foi observada uma redução estatisticamente significativa na espessura da derme em comparação com o grupo de controle (Figura 9; vide "Controle" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo). Além disso, quando o peptídeo 1r10 foi administrado em uma dose de 0,5 mg/kg, foi observada uma redução estatisticamente significativa na espessura da derme em comparação com o grupo de controle (dados não mostrados). Infiltração de células imunes

[00155] Em consequência de imunocoloração fluorescente sobre seções de tecido de pele, no grupo de controle, a infiltração tecidual de células imunes CD45-positivas associada com a resposta imune causada pela dermatite atópica foi observada por toda a pele, inclusive em torno dos vasos sanguíneos (marcada com Laminina) (a parte das setas na Figura 10; vide "Controle" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo). Por outro lado, no grupo de administração do peptídeo, foi observada uma redução estatisticamente significativa no número de células CD45-positivas em comparação com o grupo de controle (Figura 11; vide "Controle" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo).

[00156] As mudanças no peso corporal dos camundongos durante o período deste estudo (a partir do início da administração (Dia 15) até o momento da coleta de pele (Dia 19)) não foram significativamente diferentes entre os grupos e não foram observadas alterações estatisticamente significativas entre os grupos (p> 0,05, ANOVA one- way repetida).

[00157] Neste Exemplo, a administração do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento aos camundongos do modelo de dermatite atópica suprimiu escamação e edema, suprimiu o aumento na espessura da derme, e suprimiu a infiltração de células CD45- positivas. Isto é considerado como sendo a consequência das células tronco mesenquimais serem mobilizadas para dentro do sangue periférico pela ação do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento e do efeito anti-inflamatório exibido pelas células.

Exemplo 4 Eficácia do peptídeo de sequência artificial para enfarte cerebral (1) Materiais e métodos i) Fármaco

[00158] O peptídeo 1r10 (sal de TFA) descrito no Exemplo 1 foi usado como a substância de teste. ii) Geração de rato de modelo de enfarte cerebral

[00159] Ratos Crl:CD (SD) (7 semanas de idade, machos) foram obtidos do Charles River Laboratories, Japão, e depois de 6 dias de aclimatação, foram divididos no grupo de controle (n = 8) e no grupo de administração do peptídeo (n = 8). No dia de agrupamento seguinte, os ratos foram fixados na posição supina sob anestesia por inalação de isoflurano a 2% (fundo da anestesia: óxido nitroso: oxigênio = 7:3). De modo a regular a temperatura corporal durante a cirurgia, uma sonda de termômetro conectada a um termômetro digital foi inserida dentro do reto, e foram monitoradas mudanças na temperatura retal antes e depois da cirurgia. Em consequência, não foi observada nenhuma diminuição na temperatura retal em qualquer um dos ratos, e, portanto, não foi realizado aquecimento. A artéria carótida comum direita, a artéria carótida externa direita e a artéria carótida interna direita foram expostas, e a artéria carótida comum direita e a artéria carótida externa direita foram ligadas com suturas. Um fio de nylon Nº. 4 (êmbolo) pré-revestido com silicone e cortado para um comprimento de 19 mm foi inserido dentro da bifurcação da artéria carótida externa direita com a artéria carótida interna direita para ocluir a artéria cerebral média direita (MCA). Depois de oclusão da artéria cerebral média direita, a pele cervical foi suturada e os ratos foram liberados da anestesia. Trinta minutos depois da oclusão da artéria cerebral média direita, foi confirmada a flexão do membro anterior contralateral ao lado ocluído. Sob anestesia por inalação de isoflurano a 2%, a artéria carótida comum direita, a artéria carótida externa direita, e a artéria carótida interna direita foram expostas novamente, e 90 minutos depois da oclusão da artéria cerebral média direita, o êmbolo foi removido para retomar o fluxo sanguíneo na artéria cerebral média direita. Depois de retomar o fluxo sanguíneo na artéria cerebral média direita, a artéria carótida interna direita foi ligada e a pele cervical foi suturada, e em seguida os animais foram liberados da anestesia. Antes da cirurgia de oclusão da artéria cerebral média direita, benzilpenicilina de potássio foi administrada por via intramuscular em uma dose de 20000 unidades/kg. iii) Administração do peptídeo

[00160] A administração do peptídeo foi realizada injetando dentro da veia da cauda, 2 mL/kg de uma solução do peptídeo 1r10 ajustada para uma concentração de 1 mg/mL usando solução salina fisiológica como um solvente (dose do peptídeo de 2 mg/kg) em 105 minutos e 24 horas depois da oclusão da artéria cerebral média direita. O grupo de controle foi injetado na veia da cauda com 2 mL/kg de solução salina fisiológica 105 minutos e 24 horas depois da oclusão da artéria cerebral média direita. iv) Avaliação do efeito da administração do peptídeo

[00161] Cálculo da proporção de volume do enfarte cerebral

[00162] Quarenta e oito horas depois da oclusão da artéria cerebral média direita, os animais foram decapitados sob anestesia com sódio pentobarbital (50 mg/kg, administração intraperitoneal), e o cérebro inteiro foi excisado para preparar seções cerebrais com uma espessura de 2 mm. As seções cerebrais foram feitas em posições onde foram obtidos planos coronais em 4 mm anterior ao bregma, em 2 mm anterior ao bregma, no bregma, em 2 mm posterior ao bregma, em 4 mm posterior ao bregma e em 6 mm posterior ao bregma, com referência ao atlas cerebral de Paxinos e Watson (Paxinos G. And

Watson C., The rat brain in stereotaxic coordinates, second edition. Academic Press Inc.; 1986). As seções cerebrais foram imersas e coradas em 1 em peso/vol % de solução de cloreto de 2,3,5- trifeniltetrazólio (TTC) em temperatura ambiente e fotografadas. As fotografias resultantes foram submetidas a análise de imagem para obter medições reais da área de enfarte cerebral e da área transversal do cérebro, e foram calculados o volume do enfarte cerebral e o volume cerebral total de 4 mm anterior ao bregma até 6 mm posterior ao bregma usando a fórmula de cálculo abaixo. Além disso, a proporção do volume de enfarte cerebral foi calculada a partir do volume de enfarte cerebral e do volume total do cérebro (proporção do volume de enfarte cerebral (%) = volume de enfarte cerebral/volume cerebral total x 100).

V: Volume do enfarte cerebral ou volume cerebral total (mm3) a: Área do enfarte cerebral ou área transversal do cérebro sobre a seção transversal de 4 mm anterior ao bregma (mm2) b: Área do enfarte cerebral ou área transversal do cérebro sobre a seção transversal de 2 mm anterior ao bregma (mm2) c: Área do enfarte cerebral ou área transversal do cérebro sobre a seção transversal do bregma (mm2) d: Área do enfarte cerebral ou área transversal do cérebro sobre a seção transversal 2 mm posterior ao bregma (mm2) e: Área do enfarte cerebral ou área transversal do cérebro sobre a seção transversal 4 mm posterior ao bregma (mm2) f: Área do enfarte cerebral ou área transversal do cérebro sobre a seção transversal 6 mm posterior ao bregma (mm2) (2) Resultado

[00163] As proporções de volume de enfarte cerebral do grupo de controle e do grupo de administração do peptídeo foram de 34,1 ±

1,1% e de 27,2 ± 1,2% (média ± erro padrão), respectivamente (Figura 12; vide "Controle" para o grupo de controle e "1r10" para o grupo de administração do peptídeo). A proporção de volume de enfarte cerebral no grupo de administração do peptídeo foi menor do que a mesma no grupo de controle, e foi observada uma diferença estatisticamente significativa (teste U de Mann-Whitney, p <0,01).

[00164] Neste Exemplo, foi obtido o efeito de redução da lesão do enfarte cerebral por administração do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento a um rato de modelo de enfarte cerebral. Isto é considerado como sendo um resultado das células tronco mesenquimais serem mobilizadas para dentro do sangue periférico pela ação do peptídeo de sequência artificial do presente requerimento, e as células exercerem um efeito anti-inflamatório, um efeito trófico (secreção de fatores tróficos), um efeito de regeneração tecidual, e similares. [Aplicabilidade Industrial]

[00165] O peptídeo de sequência artificial do presente requerimento pode ser usado como um agente terapêutico para doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças fibróticas, e doenças acompanhadas por dano tecidual/isquemia/necrose.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição para uso na mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

2. Composição para uso no tratamento de uma doença ou condição patológica em um indivíduo por mobilização de células tronco mesenquimais para o sangue periférico, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o tratamento de uma doença ou condição patológica é selecionado entre terapia de supressão de inflamação, terapia imunomoduladora, terapia de indução de regeneração de tecidos, e terapia de supressão de fibrose tecidual.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é selecionada entre uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença acompanhada por dano tecidual, isquemia, ou necrose, e uma doença fibrótica.

5. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é doença intestinal inflamatória.

6. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é colite ulcerativa.

7. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é dermatite atópica.

8. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição patológica é enfarte cerebral.

9. Composição para uso no tratamento de uma doença selecionada entre doença intestinal inflamatória, dermatite atópica, e enfarte cerebral, caracterizada pelo fato que compreende um peptídeo selecionado entre o seguinte: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

10. Peptídeo, caracterizado pelo fato de ser selecionado entre os seguintes: (a) um peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; (b) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos resultante de substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários aminoácidos na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1; e (c) um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos com uma identidade de sequência de cerca de 90% ou superior com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.

Contagem de colônias / camundongo 1/12

Salina

Peso corporal (g) 2/12

Dias

Salina

Pontuação das fezes 3/12

Dias

Salina

Pontuação do Índice de Atividade da Doença 4/12

Dias

Salina

Comprimento do intestino grosso (mm) 5/12

Salina

Controle

Alteração de tumefações da orelha (%) [médias + erro padrão (n=7)] (Orelha Esquerda)

Dia 15 Dia 16 Dia 17 Dia 18 Dia 19

Controle

Controle

Espessura da derme (um)

Controle

Controle

Células imunes CD45+ da derme / (células) HPF

Controle

Proporção do volume do enfarte cerebral (%)

Controle