KR20170013621A

KR20170013621A - Ｍｉｌｋｆａｔｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦｆａｃｔｏｒ（ＭＦＧ－Ｅ８）을 이용한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170013621A
Application number: KR1020150106523A
Authority: KR
Inventors: 김종훈; 안수연; 장유진
Original assignee: (주) 넥셀
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2017-02-07
Also published as: CN106794223A; WO2017018698A1; CN106794223B

Abstract

본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8)을 이용한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 MFG-E8 단백질이 TGFβ/Smad 신호전달을 통해 유도된 콜라겐의 발현을 억제하고, 간성상세포의 활성을 억제하여 간섬유화를 호전시키는 역할을 하며, 간섬유화 질환을 가진 마우스 모델에서 섬유화 정도를 감소시키고, 체외 배양된 간성상세포에 처리하면 활성화를 억제시켜 조직섬유화의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

Ｍｉｌｋｆａｔｇｌｏｂｕｌｅ－ＥＧＦｆａｃｔｏｒ（ＭＦＧ－Ｅ８）을 이용한 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating tissue fibrosis by using milk fat globule-EGF factor 8}

본 발명은 중간엽 줄기세포에서 분비된 단백질인 Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8)의 섬유화 감소 효과를 통해 조직섬유화의 예방 또는 치료에 사용하는 MFG-E8의 용도에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에서 간세포로의 분화에 대한 연구의 경우, 초반에는 중배엽성 중간엽 줄기세포가 배엽의 발생학적 한계성을 넘어 내배엽성 간세포로 교차분화(transdifferentiation) 할 가능성이 있다고 보고되었으나, 최근 축적되는 연구결과에 의하면 이는 교차분화의 결과가 아니라 중간엽 줄기세포가 이식된 후 분비하는 활성인자에 의해 호스트 조직 내의 간세포의 사멸이 억제되고 손상된 호스트 간조직 자체의 재생이 촉진(paracrine effects) 될 수 있다는 가능성이 제시되고 있다.

줄기세포를 이용한 세포치료의 적응증 중 간 기능의 저해를 초래하는 원인으로는 C형 간염(hepatitis C)을 포함한 바이러스성 간염, 지방간, 알코올성 간 질환, 간암, 급성·만성 간경화, 선천성 대사 이상(inherited metabolic diseases) 및 담관질환(bile duct disease) 또는 유전적 간 기능 손상 등의 다양한 질병이 이에 해당된다.

최근 줄기세포에서 분비되는 단백질이 각종 조직의 재생 및 면역조절에 관여한다는 증거가 축적되고 있다. 현재 단백질 의약품 시장은 생명공학 분야에서 대표적인 유망사업으로 급부상하고 있으며 소화기를 통한 흡수로 온몸에 영향을 주는 화학합성 의약품보다 치료효과가 높고 부작용이 적으며 기존 화학합성 의약품에 비해 개발기간이 짧으면서 가격은 높게 유지되는 시장가치적 강점이 있다. 따라서 세포치료제와 더불어 줄기세포 및 분화된 세포로부터 분비되어 조직재생 및 재건에 중요한 역할을 하는 분비단백질의 신규기능을 발굴할 경우 기능성 및 안정성 강화를 위한 단백질 공학적 공정을 거쳐 고부가가치의 단백질의약품으로 개발될 가능성이 있다.

다양한 조직에서 중간엽 줄기세포의 파라크린(paracrine) 효과에 대해 보고가 이루어지고 있다. 그러나 분비된 물질에 대한 자세한 메커니즘이 알려져 있지 않고, 중간엽 줄기세포에서 분화된 세포의 특성에 대해 논란이 여전히 존재하기에 중간엽 줄기세포나 분화된 세포를 직접적으로 치료제로 사용하기는 제약이 따른다. 따라서 직접적인 세포를 이용한 치료제보다는 그로부터 분비된 물질을 이용한 치료제 발굴이 각광받고 있는 추세이다.

간섬유화는 ECM이 비정상적으로 축적되어 생기는 질병으로 간경변이나 간암으로 발전할 수 있다. 간섬유화가 일어나면 손상된 간세포나 혈관세포에서 분비된 케모카인(chemokine)이 대식세포를 모이게 하고, 더불어 분비된 TGFβ로 인해 간조직내 존재하는 간성상세포(hepatic stellate cell)가 근섬유모세포 유사 세포(myofibroblast-like cell)이 되어 ECM 생산을 하게 되나, 이를 예방 및 치료하는 물질이나 방법에 대해서는 많이 알려진 바가 없다.

또한, 신장섬유화는 신장의 조직 및/또는 혈관이 단단하게 굳어지는 증상을 의미하며, 폐섬유화 또는 폐섬유증은 폐포벽에 미만성 섬유 증식을 특징으로 하는 건성 기침이나 노동 시 호흡 곤란을 주 증상으로 하는 질환으로 알려져 있다.

줄기세포 혹은 줄기세포에서 분화된 세포들이 이식된 후, 세포대체효과(repopulation by donor cells)와 더불어 손상된 조직주변을 다양한 분비성 인자들로서 자극함으로써 숙주조직 자체의 재생 및 복구(regeneration of host tissue)에 기여할 가능성을 시사하고 있으나 이에 관련된 연구는 현재까지 매우 미미한 실정이다. 나아가 현재까지 근본적으로 질병 자체를 치료할 수 있는 섬유화에 대한 알려진 치료제가 없다.

MFG-E8 단백질은 포유동물에서 발견되는 단백질로, 아르기닌-글리신-아스파르트산 모티프뿐만 아니라 포스파티딜세린 결합 도메인을 포함하고 있어 인터그린과 결합할 수 있다. MFG-E8은 세포사멸 세포의 표면에 노출된 포스파티딜세린과 결합하여 세포사멸 세포의 옵소닌 작용과 식세포의 표면에 있는 인터그린과의 결합을 통해 죽은 세포의 포식을 매개하는 기능이 있고, 축적된 콜라겐을 제거하는 데 기여한다고 알려져 있다. 또한, 장내 상피세포의 사멸을 억제하고, 손상을 줄여줌과 더불어 신생혈관 형성에 관여한다는 것에 대해 연구된 바 있다. 또한, 인간 배아줄기세포에서 유도 분화된 간세포에서 높은 발현율을 높이며, 간세포 증식 및 혈관 재생을 촉진하여 간재생 및 간질환 개선에 사용할 수 있다고 보고되어 있다(특허문헌 1 참조). 그러나 간조직 내 간섬유화 또는 이외의 다른 조직 내 섬유화 단계에서 어떤 영향을 끼치는지 보고된 바가 없는 실정이다.

대한민국 등록 특허 제10-1486114호 (2015.01.19)

본 발명의 목적은 유도 분화된 중간엽 줄기세포에서 분비된 세크레톰의 단백질의 섬유화에 미치는 효과를 규명하여 상기 세크레톰 단백질 중 하나인 MFG-E8의 섬유화 억제 효과를 기반으로 조직섬유화 예방 또는 치료에 사용하는 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 MFG-E8과 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포의 조직섬유화 치료용 세포치료제로서의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) 단백질을 포함하는 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한

Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) 단백질; 및

간세포를 포함하는 조직섬유화 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명은 TGFβ/Smad 신호전달경로을 통해 유도된 콜라겐의 발현을 감소하고, 특히, 간성상세포의 활성을 억제하여 간섬유화를 호전시키는 역할을 하며, 간섬유화 질환 모델에서 간섬유화 정도를 감소시키고, 체외 배양된 간성상세포에 처리하면 활성화를 억제시키는 MFG-E8 단백질의 특성을 기반으로 하여 간, 폐, 신장, 뇌, 심장 또는 횡경막 등의 조직섬유화의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.

또한, 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포는 상기 MFG-E8과 함께 조직섬유화 치료용 세포치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 (a) 만성 간질환 마우스 모델에 hpUCMSC 세크레톰, hpUCMSC 세크레톰에 MFG-E8 항체를 처리한 세크레톰 및 MFG-E8 합성 단백질을 각각 처리하여 H&E, 씨리어스 레드 및 MT 염색을 통해 간조직의 구조 및 섬유화 정도를 비교한 사진도, (b) 상기 (a)에서 확인한 결과를 그래프로 나타낸 도면, (c) 만성 간질환 마우스 모델에서 MFG-E8 단백질을 농도별로 처리하여 씨리어스 레드로 콜라겐 축적을 확인한 결과, (d) 간섬유화 마우스 모델에서 상기 (c)와 같은 실험을 수행한 결과, (e) 상기 (d)의 결과를 광학현미경으로 관찰한 사진도를 나타낸 것이다.
도 2는 (a) 간성상세포주인 hTert-HSCs를 TGFβ1으로 활성화시킨 후 데코린, PEDF 및 MFG-E8의 3가지 합성 단백질을 처리하여 α-SMA의 발현을 보여주는 사진도, (b) 상기 (a)의 결과를 웨스턴 블랏으로 보여주는 사진도, (c) hpUCMSC 세크레톰에 3가지 단백질의 항체를 처리하여 단백질의 활성을 감소시킨 후 간성상세포(HSCs)의 활성을 확인한 결과, (d) 사람의 초대 배양된 HSCs(Human primary HSCs)에서 3가지 단백질을 처리하여 α-SMA의 발현을 확인한 결과, (e) hTert-HSCs에 MFG-E8을 농도별로 처리한 결과, (f) 사람의 초대 배양된 HSCs에 MFG-E8을 농도별로 처리한 결과, (g) 다양한 중간엽 줄기세포 세크레톰에서 MFG-E8 단백질의 발현을 확인한 결과, (h) 상기 (g)의 결과를 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) 단백질을 포함하는 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 조직섬유화는 폐, 신장, 간, 뇌, 심장 또는 횡경막 조직 등에서 TGFβ/Smad 신호전달경로를 통한 세포외기질(ECM)의 축적으로 인해 생기는 것으로, MFG-E8이 TGFβ/Smad 신호전달경로를 통해 유도된 콜라겐의 발현을 억제하거나, 간성상세포의 활성화를 억제하여 간섬유화를 감소시키는 특징이 있다.

더 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포의 세크레톰을 만성 간질환 마우스 모델에 투여한 결과, 간조직의 마커인 α-SMA(Smooth Muscle Actin)의 발현이 감소되고 섬유화가 감소되었다. 상기 간세포의 세크레톰의 간섬유화 억제 효과를 확인하기 위해 MFG-E8 단백질에 대한 항체를 세크레톰에 처리하여 만성 간질환 마우스 모델에 투여한 결과, α-SMA 발현 감소 효과가 일어나지 않았다. 이를 기반으로 MFG-E8 합성 단백질을 만성 간질환 마우스 모델에 투여한 결과, 간세포의 세크레톰과 유사한 α-SMA 발현 감소 효과를 확인할 수 있었다. 또한, MFG-E8 단백질 투여는 콜라겐의 축적을 감소시키며, 이러한 감소 효과는 MFG-E8의 농도 의존적 방식으로 나타난다. 아울러, MFG-E8 단백질은 간섬유화 마우스 모델에서도 섬유화 감소 효과를 나타냈다.

다음으로, 간성상세포주를 TGFβ1으로 활성화시킨 후 데코린, PEDF(Pigment Epithelium-Derived Factor) 및 MFG-E8 단백질을 처리한 결과 α-SMA의 발현이 감소되었고, 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포의 세크레톰에 MFG-E8 단백질에 대한 항체를 처리하여 단백질의 활성을 감소시킨 후 간성상세포(HSC)에 처리하여 HSC의 활성화를 확인한 결과, α-SMA의 발현이 높아졌고, MFG-E8 단백질을 처리한 경우에는 HSC에서 α-SMA의 발현이 농도 의존적 방식으로 감소됨을 통해 MFG-E8 단백질은 간섬유화를 억제함으로 알 수 있다.

또한, MFG-E8 단백질은 다양한 중간엽 줄기세포, 예컨대, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell; UCMSC), 탈락유치 줄기세포(Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth; SHED), 골수 유래 줄기세포(Bone Marrow Stem Cell; BMSC) 등의 세크레톰에서 발현되나, 인간 배아줄기세포에서는 발현되지 않았다.

따라서, MFG-E8 단백질은 섬유화 억제 기능을 통해 조직섬유화의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.

상기 MFG-E8은 천연형 또는 재조합 MFG-E8, 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 MFG-E8과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.

상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 MFG-E8과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.

"기능적 유도체"는 상기 MFG-E8 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 MFG-E8과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 MFG-E8는 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포(hepatocytes)에서 분비되는 세크레톰에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하지는 않는다.

상기 "분화"란 줄기세포로부터 특정 세포로 구조와 형태를 변화시키는 과정을 총칭하는데, 각각의 기능을 수행하기에 알맞은 구조와 형태를 변화시키는 과정을 말한다. 상기 분화는 자연발생적 분화 및 유도 분화를 포함한다. 상기 줄기세포로부터 특정 세포로의 유도 분화는 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용 또는 이를 응용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 MFG-E8는 예컨대, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포(hepatocytes)의 세크레톰에서 분리한 것으로 분화된 간세포의 세크레톰을 얻기 위해 혈청이 첨가된 기초 배지 IMDM에서 분화된 중간엽 줄기세포(또는 간세포)를 일정 시간 배양한 후 농축하여 얻을 수 있다.

또한, 상기 MFG-E8는 공지의 서열, 예컨대 GenBank NM_005928에 공개된 사람 MFG-E8의 서열로부터 당업자에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다.

재조합 MFG-E8는 통상의 컬럼 크로마토그래피 방법 등을 통해 분리할 수 있고, 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE))등으로 확인할 수 있다.

본 발명의 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. MFG-E8은 식염수 또는 완충용액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 MFG-E8을 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 성인에게 1일에 0.1 내지 1000 mg/㎏의 양을, 바람직하게는 10 내지 100 mg/㎏의 용량을, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 약학적 유효량의 MFG-E8을 포함하는 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조직섬유화 치료방법을 제공한다.

상기 조직섬유화 치료방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

한편, 상기 조직섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.

상기 조직은 폐, 신장, 간, 뇌, 심장 또는 횡경막 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명은 또한 Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) 또는 이와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질; 및

간세포를 포함하는 조직섬유화 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, MFG-E8 단백질은 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포에서 분비되는 단백질로서 조직섬유화를 억제하는 특징이 있으므로 간세포의 세포이식을 통한 조직섬유화 치료 시 치료적 효과를 더욱 높일 수 있다.

이러한 측면에서, 상기 간세포는 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포는 "간세포-유사 세포" 또는 "유사 간세포"라는 용어와 혼용되어 사용될 수 있다.

따라서, MFG-E8 단백질과 간세포를 이용한 세포 치료 요법을 통한 간, 폐 또는 신장의 섬유화 치료용 세포치료제로 사용할 수 있다.

또한, 상기 MFG-E8 단백질과 간세포를 이용한 간, 폐 또는 신장의 섬유화 치료용 세포치료제는 간, 폐 또는 신장의 섬유화 외에도, 뇌, 심장, 횡격막 등에서 발생하는 섬유화증 역시 TGF-β에 의해 활성화된 성상세포(myofibroblast, 근섬유아세포)가 원인이므로 상기 MFG-E8 단백질과 간세포를 이용한 세포 치료 요법을 통해 뇌, 심장, 횡격막 등의 섬유화 치료에도 사용할 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 중간엽 줄기세포에서 분화된 간세포의 배양액 제조

본 실험에서 사용된 중간엽 줄기세포는 제대혈에서 유래된 것으로 간세포로의 분화를 위해 콜라겐이 코팅된 배양접시에 3×10⁴ cell/cm²로 부착하였다.

기본 배양배지로는 MesenPro RSTM medium(Gibco)를 사용하였다. 배양접시에 70-80%이 채워지면 첫 번째 분화배지인 기초 배지 Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 Epidermal growth factor(EGF; Peprotech EC Ltd, London, England, 20 ng/mL)와 basic fibroblast growth factor(bFGF; Peprotech EC Ltd, 10 ng/mL)를 넣고 2일간 배양하였다.

이후 두 번째 분화배지인 기초 배지 IMDM에 hepatocyte growth factor(HGF; Peprotech EC Ltd, 20 ng/mL), bFGF(10 ng/mL), nicotinamide(Sigma, 0.61 g/L), 1% insulin-transferrin-selenium(ITS) premix(Invitrogen)를 첨가하여 10일 동안 배양하였다.

마지막으로 기초 배지 IMDM에 oncostatin M(Peprotech EC Ltd, 20 ng/mL), dexamethasone(Sigma, 1 μmol/L), 1% ITS를 넣고 다시 10일 동안 배양하였다.

분화된 중간엽 줄기세포의 세크레톰을 얻기 위해 기초 배지 IMDM에 0.05%의 FBS를 첨가하여 24시간동안 배양 후 3-kDa cutoff filter ultrafiltration units(Millipore)으로 25배 농축하였다.

< 실시예 2> 만성 간질환 모델 및 간섬유화 모델에서 MFG -E8의 효과 실험

만성 간질환 유발을 위해 5~6주령 마우스(C57BL/C)에 Thioacetamide(TAA)를 200mg/kg body weight이 되도록 식염수에 희석하여 복강 주사하였다. 일주일에 3번 총 8주간 복강 주사를 반복하였다. 8주가 지난 후 농축시킨 세크레톰의 단백질을 브래포드 분석(Bradford assay)로 정량한 뒤 500㎍이 되는 양을 복강 주사하였다. 세크레톰 주입 이후, 3일 또한 7일이 지난 후 마우스의 간섬유화 정도를 분석하였다. MFG-E8 단백질(R&D systems)은 160㎍/kg body weight을 기본으로 투여하고, 농도별 효과를 확인하기 위해서는 32㎍/kg body weight을 낮은 농도, 160㎍/kg body weight을 중간 농도, 800㎍/kg body weight을 높은 농도로 설정하여 복강에 투여하였다. MFG-E8 단백질 투여 후 3일 뒤 간섬유화 정도를 분석하였다.

다음으로, 간섬유화 유발을 위해 5~6주령 마우스(BALB/c)에 사염화탄소(CCl₄)를 올리브오일에 10%로 희석한 뒤 100㎕/20g body weight으로 복강 주사하였다. 일주일에 2번 총 6주간 복강 주사를 반복한다. 이후 세크레톰 주입과 MFG-E8 단백질 투여는 TAA를 통해 확립한 만성 간질환 모델과 같은 방법으로 시행하였다.

또한, 간조직의 섬유화 정도를 확인하기 위해 간조직을 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 이 간조직을 파라핀에 고정하여 조직절편으로 얻은 후 H&E, Masson's trichrome, 씨리어스 레드 염색을 시행하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.

Masson's trichrome 염색을 위해, 파라핀 고정으로 얻은 조직절편을 탈파라핀 과정을 거쳐 Bouin 액에 다시 고정 후, Weigert hematoxylin/Biebrich scarlet-acid fuchsin-aniline blue 액 또는 2% 라이트 그린(light green)에 염색 후 관찰하였다. 섬유화된 조직은 청색으로 나타나고, 세포질, 근육, 케라틴은 적색으로 나타나며, 세포핵은 흑갈색으로 나타난다.

씨리어스 레드 염색을 위해서는, 파라핀 고정으로 얻은 조직절편을 탈파라핀 과정을 거쳐 헤마톡실린(hematoxylin)으로 핵을 염색한 뒤 피크로-씨리어스 picro-sirius red 염색약으로 1시간 염색하였다. 간섬유화가 유발된 부분은 붉은색으로 나타난다.

면역형광염색을 위해서는, 파라핀 고정으로 얻은 조직절편을 탈파라핀 과정을 거쳐 10% donkey serum으로 블로킹을 진행한 후 α-SMA와 F4/80 항체를 넣어 반응시켰다. 이후 형광 표지가 붙어있는 2차 항체를 넣어 반응 후 형광현미경으로 관찰하였다.

염색 결과, 콜라겐 축적으로 인한 섬유화를 조직에서 확인할 수 있었다.

또한, TAA를 이용하여 만든 만성 간질환 마우스 모델에 hpUCMSC 세크레톰, hpUCMSC 세크레톰에 MFG-E8 항체를 처리한 세크레톰 및 MFG-E8 합성단백질을 각각 처리하고, H&E, 씨리어스 레드, MT로 염색하여 간조직의 구조 및 섬유화 정도를 비교한 결과, hpUCMSC 세크레톰과 MFG-E8 단백질을 처리한 그룹에서 섬유화가 확연히 감소하였다. MFG-E8 항체를 처리한 그룹은 sham보다 더 심한 섬유화가 진행되었다. α-SMA의 발현 또한 sham보다 hpUCMSC 세크레톰과 MFG-E8 단백질을 처리한 그룹에서 감소되었다(도 1a 및 1b). 이때 대조군으로 대식세포의 마커인 F4/80을 확인하였으나, 그룹별 차이가 나타나지 않았다.

상기 만성 간질환 마우스 모델에 MFG-E8 단백질을 농도별로 처리하여 씨리어스 레드로 콜라겐 축적을 확인한 결과, sham에 비해 섬유화가 감소하였다(도 1c).

그리고, 간섬유화 마우스 모델에서 세크레톰과 MFG-E8 단백질 투여 실험 결과, 도 1d 및 1e에 나타난 바와 같이, sham에 비해 섬유화가 감소하였다.

< 실시예 3> 간성상세포주 ( hTert - HSCs ) 및 초대 배양된 간성상세포(primary HSCs)에서 MFG -E8의 효과 실험

간성상세포주 및 초대 배양된 간성상세포를 이용하여 세크레톰의 인 비트로 효과를 실험하였다. 이를 위해, 간성상세포주는 기초 배지 DMEM에 10% FBS와 100unit의 페니실린, 100㎍의 스트렙토마이신을 첨가한 배양액에 배양하였다. 실험 진행 시 비활성화된 간성상세포주를 만들기 위해 기초 배지 DMEM에 0.2% FBS를 첨가한 배양액에서 24시간 동안 배양 후 동일한 배지에 TGFβ1 단백질을 10ng/mL로 처리하여 간성상세포주를 활성화시켰다. 실험에 사용한 MFG-E8 단백질은 기본적으로 500ng/mL 이 되도록 TGFβ1 단백질과 함께 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 농도별로 처리할 경우, 100ng/mL, 250ng/mL, 500ng/mL, 1㎍/mL, 5㎍/mL이 되도록 배양하였다. 세크레톰 내 단백질을 중화시키기 위해 항체의 농도는 20㎍/mL이 되도록 세크레톰과 섞은 후 상온에서 1시간 방치 후 사용하였다.

초대 배양된 간성상세포의 경우 SteCM(ScienCell) 배양액에서 기본 배양을 진행하고, 이후 실험 진행은 간성상세포주와 동일한 조건에서 배양하였다.

도 2a는 hTert-HSCs를 TGFβ1으로 활성화시킨 후 3가지 합성 단백질을 처리한 결과로, 무혈청 상태에서는 간성상세포주가 비활성화되어 세포가 얇고 가는 모양으로 관찰되나, TGFβ1을 처리하면 넓적한 모양으로 활성화되어 α-SMA 발현이 높아진다. 이때, 데코린, PEDF 및 MFG-E8 처리 시 모두 α-SMA의 발현을 감소시켰다. 웨스턴 블랏 결과에서도 유사한 결과를 확인하였다(도 2b).

또한, hpUCMSC 세크레톰에 각 단백질의 항체를 처리하여 단백질의 활성을 감소시킨 후 HSCs의 활성을 확인한 결과, 항체를 처리하지 않은 hpUCMSC 세크레톰에 비해 α-SMA의 발현이 높아졌다(도 2c). 사람의 초대 배양된 HSCs에서도 3가지 단백질이 같은 효과를 나타내는지 확인한 결과 MFG-E8을 처리한 그룹에서 α-SMA의 발현이 확연히 감소하였다(도 2d).

hTert-HSCs에 MFG-E8을 농도별로 처리한 결과 농도 의존적인 감소가 일어났으며(도 2e), 사람의 초대 배양된 HSCs에 MFG-E8을 농도별로 처리한 결과 농도 의존적인 감소가 일어남을 확인하였다(도 2f).

< 실시예 4> 웨스턴 블랏 및 ELISA를 이용한 MFG -E8 단백질 발현 확인

간성상세포주의 활성화 정도를 확인하기 위해 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 진행하였다. 단백질분해효소 억제제가 포함된 RIPA 버퍼를 이용하여 세포의 단백질을 추출하였다. SDS-PAGE 젤을 이용하여 각 그룹의 40㎍의 단백질을 분리한 뒤 폴리비닐리덴 플루오라이드 트랜스퍼 멤브레인(polyvinylidene fluoride transfer membrane)에 옮겼다. Ponceau S 용액을 이용하여 단백질이 멤브레인에 잘 옮겨졌는지 확인하였다. 이후 TBS-T 버퍼에 5% 스킴 밀크(skim milk)를 첨가한 용액에 상온에서 블로킹한 뒤 멤브레인을 α-SMA 및 MFG-E8, GAPDH의 각 항체가 있는 용액에서 하룻밤 동안 냉장에서 방치하였다. 이후 각 항체에 맞는 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 화학발광 키트(chemiluminescence kit)를 이용하여 해당 단백질의 발현을 확인하였다.

MFG-E8 단백질의 ELISA 실험의 경우, Cusabio에서 판매하는 사람 MFG-E8 ELISA 키트를 사용하였다.

도 2g에 나타난 바와 같이, MFG-E8 단백질은 다양한 줄기세포(제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCMSC), 탈락유치 줄기세포(SHED), 골수 유래 줄기세포(BMSC))와 이들 줄기세포에서 유도 분화된 간세포(hpUCMSCs, hpSHEDs, hpBMSCs)의 세크레톰에서 발현되고 있으나, 배아줄기세포에서는 발현되지 않았다. ELISA 분석 결과 역시 이와 동일한 결과를 나타내었다(도 2h).

Claims

Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) 단백질을 포함하는 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
조직섬유화는 TGFβ/Smad 신호전달경로를 통한 세포외기질(ECM)의 축적으로 인해 생기는 것인, 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
조직은 폐, 신장, 간, 뇌, 심장 또는 횡경막 중 어느 하나인, 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
MFG-E8 단백질은 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 간세포 유래인, 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는, 조직섬유화 예방 또는 치료용 조성물.
Milk fat globule-EGF factor 8 (MFG-E8) 단백질; 및
간세포를 포함하는 조직섬유화 치료용 세포치료제.
제6항에 있어서,
간세포는 중간엽 줄기세포에서 유도 분화된 것인, 조직섬유화 치료용 세포치료제.
제6항에 있어서,
조직은 폐, 신장, 간, 뇌, 심장 또는 횡경막 중 어느 하나인, 조직섬유화 치료용 세포치료제.