BR112019021230A2 - Peptídeos, composições que os compreende e uso dos mesmos - Google Patents

Peptídeos, composições que os compreende e uso dos mesmos Download PDF

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BR112019021230A2
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Nihashi Yoichiro
Kawachi Tomoyuki
Yamatsu Yukiko
Fumoto Masataka
Yamazaki Takehiko
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Shionogi & Co., Ltd.
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Abstract

a presente invenção refere-se a um peptídeo que pode ser utilizado como um ingrediente ativo em uma composição que pode ser usada para estimular a migração de uma célula pdgfralfa-positiva, uma composição que pode ser usada para mobilizar uma célula-tronco mesenquimal da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico, uma composição que pode ser usada para regeneração de um tecido ou uma composição que pode ser utilizada para estimular a migração de uma célula estromal derivada da medula óssea.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PEPTÍDEOS, COMPOSIÇÕES QUE OS COMPREENDE E USO DOS MESMOS.
CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção refere-se a um peptídeo para induzir a regeneração de tecidos e usos dos mesmos.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[002] Tornou-se ainda mais claro que cada um dos órgãos e tecidos nos corpos vivos possui células-tronco teciduais mantendo sua homeostase estrutural e funcional. Por exemplo, as células-tronco do miocárdio existem no coração, as células-tronco neurais existem no cérebro, e as células-tronco epidérmicas e as células-tronco foliculares existem na pele, que fornecem células do miocárdio, células neurais, células epidérmicas, e células epiteliais foliculares ao longo da vida para manter as estruturas e funções do coração, cérebro e pele. Enquanto isso, as células-tronco hematopoiéticas, que se diferenciam em células sanguíneas, tais como células sanguíneas vermelhas (glóbulos vermelhos), células sanguíneas brancas (glóbulos brancos) e plaquetas, existem na medula óssea.
[003] Estas células sanguíneas derivadas de células-tronco hematopoiéticas circulam em todos os tipos de órgãos e tecidos nos corpos através de correntes sanguíneas e desempenham algumas funções indispensáveis à manutenção da vida, tais como suprimento de oxigênio, respostas imunológicas e hematostáticas ou recuperação de tecidos danificados. Em outras palavras, é justo dizer que as célulastronco hematopoiéticas da medula óssea contribuem para a manutenção da homeostase de todos os tecidos nos corpos vivos através da circulação periférica, em vez da manutenção da homeostase da medula óssea ou dos tecidos ósseos nos quais as células-tronco hematopoiéticas da medula óssea estão localizadas.
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[004] Nos últimos anos, foi esclarecido que, além das célulastronco hematopoiéticas, as células-tronco mesenquimais, que são diferenciáveis não apenas nos tecidos mesodérmicos dos ossos, cartilagens, tecidos adiposos ou similares, porém também nos tecidos ectodérmicos, tais como nervos e epidermes, existem na medula óssea; no entanto, a importância de sua existência nos corpos vivos ainda não foi esclarecida de várias formas. Entretanto, se as células-tronco hematopoiéticas, que mantêm a homeostase de todos os tecidos e órgãos suprindo células sanguíneas através da circulação periférica, existem na medula óssea, há igualmente uma possibilidade esperada de que as células-tronco mesenquimais existentes na medula óssea também contribuem para a manutenção da homeostase dos tecidos nos corpos vivos, fornecendo células que podem se diferenciar em ossos, cartilagens, tecido adiposo, nervos, epitélios ou similares, via circulação periférica, aos tecidos ou órgãos nos corpos vivos com sua necessidade.
[005] Atualmente, a medicina regenerativa tem sido ativamente desenvolvida, na qual as células-tronco mesenquimais da medula óssea são preparadas através de coleta de sangue da medula óssea, expandidas por cultura celular, e enxertadas em um local danificado de tecidos intratáveis ou no sangue de circulação periférica, para induzir a regeneração de tecidos avariados. As aplicações clínicas do transplante de células-tronco mesenquimais da medula óssea já estão em andamento na medicina regenerativa de infarto cerebral, infarto do miocárdio, úlcera de pele intratável ou similares. Além disso, esclareceuse que as células-tronco mesenquimais da medula óssea transplantadas exibem a ação de suprimir inflamações e respostas imunes, e a ação de suprimir a formação de cicatrizes fibrosas localmente nos corpos vivos, de modo que os testes clínicos da terapia de transplante de células-tronco mesenquimais da medula óssea foram iniciados como
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3/68 um novo método terapêutico para a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD), que é uma reação colateral séria após o transplante ou transfusão de medula óssea, ou para esclerodermia, que é uma doença autoimune. No entanto, o sangue da medula óssea contendo as células-tronco mesenquimais da medula óssea é coletado somente por um método invasivo, no qual agulhas grossas são repetidamente perfuradas no osso ilíaco. Além disso, as células-tronco mesenquimais da medula óssea perderíam gradualmente a capacidade de proliferação e pluripotência se a subcultura continuasse ex vivo. Além disso, a cultura das células-tronco mesenquimais da medula óssea, com base no manuseio de alta qualidade que garante a segurança do transplante in vivo, necessitaria de um equipamento de cultura especializado, tal como o CPC (centro de processamento celular), para que a cultura celular seja ativada em universidades ou empresas comerciais muito limitadas no momento. Em outras palavras, a fim de tornar a medicina regenerativa, usando as células-tronco mesenquimais da medula óssea, disponível para muitos pacientes no mundo que sofrem de avarias intratáveis nos tecidos, é uma tarefa urgente o desenvolvimento de técnicas para a medicina regenerativa com as células-tronco mesenquimais sendo habilitadas em todos os tipos de instalações médicas.
[006] HMGB1 (grupo de alta mobilidade box 1: proteína do grupo de alta mobilidade box 1) foi identificada há cerca de 30 anos como uma proteína de cromatina não-histona que controla a expressão gênica ou o reparo de DNA, controlando uma estrutura de cromatina intranuclear. A estrutura da proteína HMGB1 é constituída principalmente por dois domínios de ligação ao DNA, nos quais um domínio de ligação ao DNA no lado terminal-C é chamado de box-A, e um domínio de ligação ao DNA no lado terminal-C é chamado de box-B. De acordo com os estudos anteriores, foi esclarecido que um domínio que se liga ao TLR na molécula de HMGB1 e evoca uma reação inflamatória exis
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4/68 te dentro de box-B.
[007] Foi relatado que as células PDGFRa-positivas são recrutadas no sangue da medula óssea administrando-se camundongos gerados com úlcera de pele ou infarto cerebral com uma proteína HMGB1 recombinante da veia da cauda e, além disso, as células são acumuladas na porção com úlcera de pele ou na porção de infarto cerebral, induzindo assim fortemente a regeneração da úlcera de pele ou infarto cerebral. Já foi relatado que as células PDGFRa-positivas na medula óssea são células-tronco mesenquimais que são diferenciáveis em ossos, cartilagens, tecidos adiposos, e ainda nervos ou epitélios. Em outras palavras, as células-tronco mesenquimais PDGFRa-positivas na medula óssea são recrutadas para circulação periférica pela administração de HMGB1, possibilitando assim acumular muitas das células-tronco mesenquimais nos tecidos danificados nos corpos vivos sem retirar extracorporalmente as células e submetê-las a uma cultura especializada.
[008] A medicina indutora de regeneração pode ser habilitada com as células-tronco mesenquimais da medula óssea em todos os tipos de instalações médicas, desenvolvendo HMGB1 como um medicamento para induzir a regeneração de tecidos danificados pelo recrutamento no sangue das células-tronco mesenquimais da medula óssea nos corpos vivos. Como resultado, muitas desvantagens enfrentadas na presente medicina regenerativa usando as células-tronco mesenquimais da medula óssea seriam superadas.
[009] Como mencionado acima, o medicamento de HMGB1 é um agente terapêutico inovador que promove o recrutamento das célulastronco mesenquimais da medula óssea no sangue ou o acúmulo de tecidos danificados, induzindo assim a regeneração de tecidos no corpo. Referente a HMGB1, já foi relatado que não apenas um comprimento total da proteína HMGB1, mas também fragmentos da proteína
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HMGB1 têm uma ação similar.
REFERÊNCIAS DA TÉCNICA ANTERIOR
PUBLICAÇÕES DE PATENTES
[0010] Publicação de Patente 1: WO 2008/053892
[0011 ] Publicação de Patente 2: WO 2007/015546
[0012] Publicação de Patente 3: WO 2009/133939
[0013] Publicação de Patente 4: WO 2009/133943
[0014] Publicação de Patente 5: WO 2009/133940
[0015] Publicação de Patente 6: Publicação de Patente Não Examinada Japonesa No. 2005-537253
[0016] Publicação de Patente 7: WO 2012/147470
PUBLICAÇÕES DE NÃO PATENTE
[0017] Publicação de Não Patente 1: Bustin et al., Mol Cell Biol, 19:5237-5246, 1999
[0018] Publicação de Não Patente 2: Hori et al., J. Biol. Chem., 270, 25752-25761, 1995
[0019] Publicação de Não Patente 3: Wang et al., Science, 285:248-251, 1999
[0020] Publicação de Não Patente 4: Muller et al., EMBO J, 20:4337-4340, 2001
[0021] Publicação de Não Patente 5: Wang et al., Science, 285:248-251, 1999
[0022] Publicação de Não Patente 6: Germani et al., J Leukoc Biol. Jan; 81(1):41-5, 2007
[0023] Publicação de Não Patente 7: Palumbo et al., J. Cell Biol., 164:441-449, 2004
[0024] Publicação de Não Patente 8: Merenmies et al., J. Biol. Chem., 266:16722-16729, 1991
[0025] Publicação de Não Patente 9: Wu Y et al., Stem cells, 25:2648-2659, 2007
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6/68
[0026] Publicação de Não Patente 10: Tamai et al., Proc Natl Acad Sei USA. 2011 Apr 4. [Epub ahead of print], 108:6609-6614, 2011 [0027] Publicação de Não Patente 11: Yang et al., J Leukoc Biol. Jan; 81(1): 59-66, 2007 SUMÁRIO DA INVENÇÃO
PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO
[0028] Um objetivo a ser resolvido pela presente invenção é prover um peptídeo com atividade de migração de células estromais derivadas da medula óssea, em outras palavras, um peptídeo para induzir a regeneração de tecidos.
MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS
[0029] Como resultado de estudos intensivos, os presentes inventores constataram que um peptídeo tendo substituição de um aminoácido da posição 43 e/ou posição 44, no peptídeo que consiste em aminoácidos da posição 1 à posição 44 da proteína HMGB1, e um peptídeo tendo a substituição de um aminoácido da posição 43 e/ou posição 44, no peptídeo que consiste dos aminoácidos da posição 2 a posição 44 da proteína HMGB1, têm a atividade de migrar células estromais derivadas da medula óssea de roedores, e a presente invenção foi aperfeiçoada desse modo.
[0030] Objetivamente, a presente invenção refere-se a:
um peptídeo selecionado do grupo consistindo em:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de
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7/68 células, um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo;
um peptídeo selecionado do grupo consistindo em:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283, 292 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283, 292 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, e
um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada
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8/68 em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283 e 292, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo;
um peptídeo selecionado do grupo consistindo em:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 167 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 167 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 167, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo;
um peptídeo selecionado do grupo consistindo em:
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9/68 um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo;
uma composição para uso na estimulação da migração de células PDGFRa-positivas, contendo um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, como definido em qualquer um dos itens (1) a (4) acima;
uma composição para uso no recrutamento de célulastronco mesenquimais da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico, contendo um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, conforme definido em qualquer um dos itens (1) a (4) acima;
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10/68 uma composição para uso na regeneração de tecidos, contendo um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, conforme definido em qualquer um dos itens (1) a (4) acima; e uma composição para uso na estimulação da migração de células do estroma derivadas da medula óssea, contendo um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, conforme definido em qualquer um dos itens (1) a (4) acima.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
[0031] O peptídeo da presente invenção pode ser utilizado como um ingrediente ativo de, por exemplo, uma composição para uso na estimulação da migração de células PDGFRa-positivas, uma composição para uso no recrutamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico, uma composição para uso na regeneração de tecidos, ou uma composição para uso na estimulação da migração de células estromais derivadas da medula óssea.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0032] A FIG.1 é um gráfico que mostra os resultados do teste de estabilidade dos peptídeos no plasma para seis tipos de peptídeos (um peptídeo da posição 2 a posição 44 de HMGB1 humana (2-44), e cinco tipos de peptídeos nos quais os aminoácidos na posição 43 e/ou posição 44 são modificados (Peptídeo 1 a 5)). P1 a P5 significam os peptídeos dos Peptídeos 1 a 5. O eixo geométrico das ordenadas é a taxa restante quando o peptídeo imediatamente após a adição de plasma foi calculado como 100, e o eixo geométrico das abcissas é o tempo após a adição de plasma. Aqui, a amostra de 15 minutos ou mais após a adição de plasma do peptídeo 2-44 foi menor do que o limite inferior quantificável (0,5 pg/mL), de modo que a taxa restante não pode ser
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11/68 representada na FIG. 1.
[0033] A FIG. 2 é um gráfico dos resultados das medições da atividade de migração celular de dois tipos de peptídeos (um peptídeo da posição 2 a posição 44 de HMGB1 humana (2-44), e um peptídeo no qual os aminoácidos na posição 43 e posição 44 são modificados (Peptídeo 6)). CN é um controle negativo.
[0034] A FIG. 3 é um gráfico que mostra os resultados do teste de estabilidade no plasma de três tipos de peptídeos (um peptídeo da posição 2 a posição 44 de HMGB1 humana (2-44), e dois tipos de peptídeos nos quais os aminoácidos na posição 43 e posição 44 são modificados (Peptídeo-3 e -6)). O eixo geométrico das ordenadas é a taxa restante quando o peptídeo imediatamente após a adição de plasma foi calculado como 100, e o eixo geométrico das abscissas é o tempo após a adição de plasma.
MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[0035] A presente invenção provê um peptídeo conforme definido em qualquer um dos itens (a) a (c) fornecidos abaixo:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403;
um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células; e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoá
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12/68 cidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células.
[0036] A presente invenção provê uma composição para uso na estimulação da migração de células PDGFRa-positivas ou células do estroma derivadas da medula óssea, contendo um peptídeo conforme definido nos itens (a) a (c) fornecidos abaixo:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403;
um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células; e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células.
[0037] A composição para uso na estimulação da migração de cé
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13/68 lulas PDGFRa-positivas ou células do estroma derivadas da medula óssea da presente invenção inclui uma composição reagente e uma composição farmacêutica. A composição reagente, como usada aqui, também é expressa como um reagente, e a composição farmacêutica também é expressa como um medicamento, um agente farmacêutico, ou uma composição farmacêutica.
[0038] A composição reagente para uso na estimulação da migração de células PDGFRa-positivas ou de células do estroma derivadas da medula óssea da presente invenção pode ser usada como, por exemplo, reagentes que são necessários para pesquisas básicas e pesquisas clínicas no desenvolvimento de medicina regenerativa e medicina indutora de regeneração. Por exemplo, células são recrutadas nos tecidos dos corpos vivos em animais experimentais pelo uso da composição reagente, tornando possível o estudo dos níveis de reparo de tecidos e reconstrução da função tecidual. Também, por exemplo, as pesquisas sobre regeneração de tecidos por indução podem ser realizadas pelo recrutamento das células in vitro pelo uso da composição reagente.
[0039] Além disso, a composição farmacêutica para uso na estimulação da migração de células PDGFRa-positivas ou células do estroma derivadas da medula óssea da presente invenção pode ser utilizada como, por exemplo, um medicamento na medicina regenerativa e na medicina indutora de regeneração. Por exemplo, os tecidos podem ser regenerados pelo uso da composição farmacêutica. Também, por exemplo, a composição farmacêutica pode evitar a diminuição das funções dos tecidos e órgãos pela diminuição das células-tronco teciduais, como o chamado medicamento profilático, ou pode atrasar o progresso das alterações de idade como um medicamento antienveIhecimento.
[0040] Aqui, a composição para uso na estimulação da migração
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14/68 de células PDGFRa-positivas ou células estromais derivadas da medula óssea, como aqui utilizada, também é expressa como um agente para uso na estimulação da migração de células PDGFRa-positivas ou células estromais derivadas da medula óssea, um agente de estimulação para migração celular, uma composição para uso na indução de migração celular, um agente para uso na indução de migração celular, um agente indutor para migração celular, ou um agente indutor de células.
[0041] Na presente invenção, a atividade de estimulação da migração celular significa a atividade de estimular a migração de células. A atividade de estimulação da migração de células, como aqui utilizada, também é expressa como a atividade de indução de migração celular ou a atividade de indução celular.
[0042] A presente invenção provê uma composição para uso no recrutamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico, contendo uma substância conforme definido em qualquer um dos seguintes itens (a) a (c):
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403;
um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células; e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoá
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15/68 cidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células.
[0043] A composição para uso no recrutamento das células-tronco mesenquimais da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico, da presente invenção inclui uma composição reagente e uma composição farmacêutica.
[0044] A composição reagente para uso na regeneração de tecidos da presente invenção pode ser utilizada como, por exemplo, reagentes que são necessários para pesquisas básicas e pesquisas clínicas no desenvolvimento de medicina regenerativa e medicina indutora de regeneração. Além disso, a composição farmacêutica para uso na regeneração de tecidos da presente invenção pode ser utilizada como, por exemplo, um medicamento na medicina regenerativa e na medicina de indução de regeneração. Por exemplo, as células da medula óssea são recrutadas para a circulação periférica pelo uso da composição farmacêutica, de modo que os tecidos possam ser regenerados. Também, por exemplo, é possível que as células que são recrutadas para o sangue periférico utilizando a composição farmacêutica sejam coletadas extracorporalmente, concentradas e administradas aos tecidos para realizar o tratamento. Nos métodos convencionais, uma vez que as células são coletadas a partir da medula óssea na parte profunda do corpo, os corpos vivos são submetidos à invasão. No entanto, quando a composição farmacêutica da presente invenção é utilizada, as células da medula óssea são coletadas do sangue periférico com baixa invasão, o que pode ser utilizado no transplante de células da medula óssea ou similares. Aqui, a composição para uso no recru
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16/68 tamento das células-tronco mesenquimais da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico, também é expressa como uma composição para uso na indução das células-tronco mesenquimais da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico.
[0045] A presente invenção provê uma composição para uso na regeneração de tecidos, contendo uma substância conforme definido em qualquer um dos seguintes itens (a) a (c):
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403;
um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células; e peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células.
[0046] A composição para uso na regeneração de tecidos da presente invenção inclui uma composição reagente e uma composição farmacêutica.
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[0047] A composição reagente para uso na regeneração de tecidos da presente invenção pode ser usada como, por exemplo, reagentes que são necessários para pesquisas básicas e pesquisas clínicas no desenvolvimento de medicina regenerativa e medicina indutora de regeneração. Além disso, a composição farmacêutica para uso na regeneração de tecidos da presente invenção pode ser utilizada como, por exemplo, um medicamento na medicina regenerativa e na medicina de indução de regeneração.
[0048] Aqui, a composição para uso na regeneração de tecidos, como usada aqui, também é expressa como uma composição para uso na indução ou promoção da regeneração de tecidos, um agente para uso na indução ou promoção da regeneração de tecidos, um agente indutor de regeneração de tecidos, ou um agente promotor de regeneração de tecidos. Além disso, a regeneração de tecidos inclui reparo tecidual.
[0049] A composição para uso na regeneração de tecidos da presente invenção pode ser administrada ou adicionada a quaisquer locais. Em outras palavras, a composição pode exibir seus efeitos, mesmo quando administrada a qualquer um dos tecidos, como tecidos com necessidade de regeneração, tecidos diferentes dos tecidos com necessidade de regeneração, no sangue, ou similares. Por exemplo, quando a composição é administrada ou adicionada, as células são recrutadas a um local para serem administradas ou adicionadas, ou a um tecido nas proximidades, induzindo ou promovendo desse modo a regeneração de tecidos. Também, por exemplo, quando a composição é administrada ou adicionada a um local de tecido danificado ou uma vizinhança sua, as células são recrutadas nos tecidos danificados, induzindo ou promovendo desse modo a regeneração dos tecidos. Além disso, por exemplo, quando a composição é administrada ou adicionada a um tecido diferente dos tecidos com necessidade de regenera
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18/68 ção, as células da medula óssea são recrutadas da medula óssea para os tecidos que precisam de regeneração, através da circulação periférica, induzindo ou promovendo desse modo a regeneração de tecidos. Aqui, a circulação periférica também é chamada de circulação sanguínea ou corrente sanguínea de circulação periférica.
[0050] Os tecidos com necessidade de regeneração incluem tecidos danificados, tecidos necróticos, tecidos após cirurgia, tecidos com função reduzida, tecidos fibróticos, tecidos envelhecidos, tecidos doentes, e similares. Os exemplos incluem tecidos epiteliais do corpo vivo, e tecidos de biópsia interna (cirurgia) (cérebro, pulmões, coração, fígado, estômago, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas, rins, bexigas urinárias, baço, útero, testículo, sangue, etc.).
[0051] A administração nos tecidos diferentes dos tecidos com necessidade de regeneração significa a administração em um local que não seja o local que precisa de regeneração (local diferente do local com necessidade de regeneração). Portanto, os diferentes tecidos dos tecidos com necessidade de regeneração podem ser expressos como um local diferente dos tecidos com necessidade de regeneração, um local diferente de um local com necessidade de regeneração, um local distante dos tecidos com necessidade de regeneração, um local distante de um local com necessidade de regeneração, um local distai de um local com necessidade de regeneração, um local distai dos tecidos com necessidade de regeneração, um local distai, ou um tecido distai. Em outras palavras, a composição da presente invenção é eficazmente utilizada na regeneração de tecidos (cérebro, coração, etc.) que são difíceis de serem administrados diretamente com um agente farmacêutico de fora do corpo.
[0052] As células recrutadas aos tecidos com necessidade de regeneração diferenciam-se em várias células para contribuir para a regeneração funcional dos tecidos que necessitam de regeneração e
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19/68 para manutenção de funções ou aprimoramento das funções dos tecidos. Na presente invenção, os tecidos com necessidade de regeneração incluem tecidos danificados por várias patologias causadas por condições isquêmicas, hipoperfusivas ou hipóxicas, trauma, queimadura, inflamação, autoimunidade, anormalidades genéticas, e similares, sem estar limitado a estas causas.
[0053] Os tecidos da presente invenção não são particularmente limitados, desde que sejam tecidos nos quais as células derivadas da medula óssea possam se diferenciar, o que inclui, por exemplo, todos os tecidos dos corpos vivos, tais como tecidos epiteliais, tecidos ósseos, tecidos cartilaginosos, tecidos musculares, tecidos adiposos, tecidos cardiomusculares, tecidos do sistema nervoso, tecidos pulmonares, tecidos do trato digestivo, tecidos hepático, biliar e pancreático, e órgãos urogenitais. Além disso, é possível realizar o tratamento de indução da regeneração tecidual funcional não apenas em uma doença cutânea, como úlceras de pele intratáveis, feridas na pele, doença hidroa/bolhosa, ou alopecia, porém também em tecidos que necessitam de regeneração de infarto cerebral, infarto do miocárdio, fratura óssea, infarto pulmonar, úlcera gástrica, entente, ou similares, pelo uso da composição acima. As espécies animais a serem administradas com a composição acima não são particularmente limitadas e incluem mamíferos, pássaros, peixes e similares. Os mamíferos incluem animais humanos ou não-humanos, incluindo, por exemplo, seres humanos, camundongos, ratos, macacos, porcos, cães, coelhos, hamsters, porquinhos da índia, cavalos, ovelhas, baleias, e similares, porém não particularmente limitados a estes.
[0054] Além disso, os tecidos diferentes dos tecidos com necessidade de regeneração incluem tecidos sanguíneos, tecidos musculares, tecidos subcutâneos, tecidos intradérmicos, cavidade abdominal, e similares.
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[0055] Os tecidos neurais incluem tecidos nervosos centrais, porém não limitados a eles. Também, a composição para uso na regeneração de tecidos neurais pode ser utilizada, por exemplo, no tratamento de infarto cerebral, hemorragia cerebral, contusão cerebral ou similares, porém não se limita a estes. Além disso, a composição para uso na regeneração de tecidos ósseos pode ser utilizada, por exemplo, no tratamento de fratura óssea, porém não se limita a esta. Também, a composição para uso na regeneração de tecidos epiteliais pode ser utilizada, por exemplo, no tratamento de úlceras de pele, fechamento insuficiente da sutura de feridas cirúrgicas, queimaduras, cortes, contusões, desgaste de pele, escoriações, ou similares, porém não se limita a estes.
[0056] Além disso, na presente invenção, as células que são estimuladas a migrar ou as células que são recrutadas da medula óssea para o sangue periférico incluem células indiferenciadas e células em diferentes estágios de diferenciação, porém não se limitam a estas. Também, na presente invenção, as células que são estimuladas a migrar ou as células que são recrutadas da medula óssea para o sangue periférico incluem células-tronco, células não-tronco e similares, porém não se limitam a estas. As células-tronco incluem células-tronco circulatórias ou células-tronco não circulatórias. As células-tronco não circulatórias incluem células-tronco teciduais que residem nos tecidos. As células tronco circulatórias incluem células tronco circulatórias no sangue.
[0057] Além disso, as células que são estimuladas a migrar ou as células que são recrutadas da medula óssea para o sangue periférico incluem células derivadas da medula óssea ou células-tronco hematopoiéticas, porém não se limitam a estas. As células-tronco hematopoiéticas, como aqui utilizado, são células-tronco que podem se diferenciar em células sanguíneas, tais como glóbulos vermelhos, plaque
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21/68 tas, mastócitos, e células dendríticas, bem como glóbulos brancos, como neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos, monócitos e macrófagos. Sabe-se que os seus marcadores são CD34-positivo, CD133positivo em humanos, CD34-negativo, c-Kit-positivo, Sca-1-positivo, marcador de linhagem negativo em camundongos. Além disso, as células-tronco hematopoiéticas têm a característica de que, quando cultivadas em um prato de cultura, é difícil serem cultivadas sozinhas, de modo que é necessário que sejam cocultivadas com células estromais. [0058] O termo células da medula óssea, como utilizado aqui, significa células que estão presentes na medula óssea, enquanto o termo células derivadas da medula óssea significa células da medula óssea recrutadas ou extraídas da medula óssea para o exterior da medula óssea. O termo células da medula óssea inclui células contendo a população de células progenitoras dos tecidos que estão presentes na medula óssea. Além disso, o termo células derivadas da medula óssea pode ser células contendo mesoangioblastos, ou podem ser células que excluem os mesoangioblastos.
[0059] As células progenitoras de tecido são definidas como células indiferenciadas que têm uma diferenciabilidade unidirecional em células teciduais especificadas que não o sistema sanguíneo, e incluem células indiferenciadas com diferenciabilidade em tecidos mesenquimais, tecidos epiteliais, tecidos neurais, órgãos parenquimatosos, e endotélios vasculares mencionados acima.
[0060] Os termos células da medula óssea e células derivadas da medula óssea são células-tronco hematopoiéticas e células diferenciadas derivadas destas, tais como glóbulos brancos, glóbulos vermelhos, plaquetas, osteoblastos, e fibrócitos, ou são células-tronco que são representadas por células que até agora foram chamadas de células-tronco mesenquimais da medula óssea, células estromais mesenquimais da medula óssea, células estromais pluripotentes da mePetição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 27/84
22/68 dula óssea, ou células-tronco pluripotentes da medula óssea. O termo células-tronco da medula óssea, como utilizado aqui, significa células-tronco existentes na medula óssea e, por outro lado, o termo células-tronco derivadas da medula óssea significa células-tronco da medula óssea que são recrutadas ou extraídas da medula óssea para o exterior da medula óssea. Na presente invenção, as células que são estimuladas a migrar ou as células que são recrutadas da medula óssea para o sangue periférico incluem células-tronco derivadas da medula óssea, porém não se limitam a estas. As células da medula óssea e as células derivadas da medula óssea podem ser isoladas por coleta de medula óssea (coleta de células da medula óssea), ou coleta de sangue periférico. As células-tronco hematopoiéticas são células não-aderentes, e algumas células da medula óssea e células derivadas da medula óssea são obtidas como células aderentes por meio de uma cultura celular de uma fração de monócitos no sangue obtida por coleta de medula óssea (coleta de células da medula óssea), ou coleta de sangue periférico.
[0061] Além disso, as células da medula óssea e as células derivadas da medula óssea incluem células-tronco mesenquimais e, preferivelmente, têm potencial para se diferenciar em osteoblastos (que podem ser especificados observando-se a deposição de cálcio ao induzir a diferenciação), condrócitos (que podem ser especificados por coloração com azul alcian positiva, coloração com safranin-0 positiva, etc.), adipócitos (que podem ser especificados por coloração com Sudan III positiva), e outras células mesenquimais, tais como fibroblastos, células musculares lisas, células estromais, células tendíneas, mais células neurais, células epiteliais (por exemplo, queratinócitos epidérmicos e células epiteliais intestinais que expressam a família das Citoqueratinas), e células endoteliais vasculares. As células diferenciadas não se limitam às células acima e também incluem potencial para se
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23/68 diferenciar em células de órgãos parenquimatosos, tais como fígado, rins e pâncreas.
[0062] O termo células estromais da medula óssea, como utilizado aqui, refere-se a células que não as células tronco hematopoiéticas e as células sanguíneas derivadas delas entre as células que existem na medula óssea, que são coletadas da medula óssea e capazes de ser cultivadas e proliferadas como células aderentes em um prato de cultura. As células estromais da medula óssea ou as células estromais derivadas da medula óssea que são extraídas da medula óssea incluem células que têm pluripotência (células estromais pluripotentes da medula óssea ou células estromais pluripotentes derivadas da medula óssea). Além disso, as células estromais derivadas da medula óssea podem ser estabelecidas como uma linhagem celular. Exemplos de células estromais derivadas da medula óssea na linhagem celular incluem células ST2 (Ogawa et al., EMBO J 1988; 7:1337-43) e similares. As células ST2 são linhagens celulares estromais pluripotentes derivadas da medula óssea com uma capacidade diferenciadora em osteoblastos e adipócitos.
[0063] O termo células-tronco mesenquimais da medula óssea, como usado aqui, é usado alternadamente com os termos células estromais mesenquimais da medula óssea, células estromais pluripotentes da medula óssea e células-tronco pluripotentes da medula óssea. As células-tronco mesenquimais da medula óssea, como usado aqui, referem-se às células existentes na medula óssea que são coletadas diretamente da medula óssea ou indiretamente de outros tecidos (sangue, pele, adiposo, e outros tecidos), e podem ser cultivadas e proliferadas como células aderentes em um prato de cultura (feito de plástico ou vidro). As células têm a característica de possuir um potencial para diferenciação em tecidos mesenquimais, como ossos, cartilagens, e tecido adiposo (células-tronco mesenquimais), ou em
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24/68 músculos esqueléticos, músculos cardíacos, e outros tecidos neurais, e tecidos epiteliais (células-tronco pluripotentes), e podem ser obtidas por coleta de células da medula óssea.
[0064] Por outro lado, as células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea, as células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea, as células estromais pluripotentes derivadas da medula óssea, ou as células-tronco pluripotentes derivadas da medula óssea, que são recrutadas a partir da medula óssea para o exterior da medula óssea, são células que podem ser obtidas por coleta de sangue periférico, ou ainda por coleta de tecidos mesenquimais, tais como tecido adiposo, tecidos epiteliais, tais como peles, ou tecidos neurais, como o cérebro.
[0065] Além disso, estas células também têm a característica de ter um potencial para diferenciação em, por exemplo, tecidos epiteliais, tais como queratinócitos que constituem a pele, ou tecidos do sistema nervoso que constituem o cérebro, quando as células são administradas a um local danificado de corpos vivos imediatamente após a coleta ou depois de serem aderidas em um prato de cultura.
[0066] As células-tronco mesenquimais da medula óssea, as células estromais mesenquimais da medula óssea, as células estromais pluripotentes da medula óssea, e as células-tronco pluripotentes da medula óssea, ou aquelas células que são recrutadas a partir da medula óssea para o exterior da medula óssea, têm, preferivelmente, um potencial para diferenciação em osteoblastos (que podem ser especificados observando-se a deposição de cálcio ao induzir a diferenciação), condrócitos (que podem ser especificados por coloração com Azul alcian positiva, coloração com safranin-0 positiva, etc.), adipócitos (que podem ser especificados por coloração com Sudan III positiva) e, por exemplo, células mesenquimais, tais como fibroblastos, células musculares lisas, células musculares esqueléticas, células es
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25/68 tramais e células tendíneas; células neurais, células pigmentares, células epidérmicas, células foliculares capilares (que expressam a família das citoqueratinas, a família da queratina de cabelo, etc.) células epiteliais (por exemplo, queratinócitos epidérmicos e células epiteliais intestinais que expressam a família das citoqueratinas), e células endoteliais, e ainda têm potencial para diferenciação em células de órgãos parenquimatosos, tais como fígado, rins e pâncreas, porém as células diferenciadas não se limitam às células acima.
[0067] As células da medula óssea humana e as células derivadas da medula óssea humana incluem, porém não se limitam às células que podem ser obtidas por coleta de medula óssea (coleta de células da medula óssea), coleta de sangue periférico, ou coleta de tecido adiposo, e podem ser obtidas como células aderentes por cultura direta ou por cultura de uma fração isolada de monócitos. Os marcadores para as células da medula óssea humana ou células derivadas da medula óssea humana (por exemplo, células-tronco mesenquimais da medula óssea) incluem todas ou parte(s) de PDGFRa-positiva, PDGFRp-positiva, Lin-negativa, CD45-negativa, CD44-positiva, CD90-positiva, CD29-positiva, Flk-1-negativa, CD105-positiva, CD73-positiva, CD90-positiva, CD71-positiva, Stro-1-positiva, CD106-positiva, CD166positiva, CD31-negativa, CD271-positiva, e CD11b-negativa, porém não se limitam a estas.
[0068] Além disso, as células da medula óssea de murino e as células derivadas da medula óssea de murino incluem, porém não se limitam a células que podem ser obtidas por coleta de medula óssea (coleta de células da medula óssea), coleta de sangue periférico, ou coleta de tecido adiposo, e podem ser obtidas como células aderentes por cultura direta ou por cultura de uma fração isolada de monócitos. Os marcadores para as células da medula óssea de murino ou células derivadas da medula óssea de murino (por exemplo, células-tronco
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26/68 mesenquimais da medula óssea) incluem todas ou parte(s) de CD44positiva, PDGFRa-positiva, PDGFRp-positiva, CD45-negativa, Linnegativa, Sca-1-positiva, c-kit-negativa, CD90-positiva, CD29-positiva, Flk-1-negativa, CD271-positiva, e CD11b-negativa, porém não se limitam a estas.
[0069] Na presente invenção, as células que são estimuladas a migrar ou as células que são recrutadas da medula óssea para o sangue periférico incluem células PDGFRa-positivas, porém não se limitam a estas. Além disso, os marcadores que não PDGFRa incluem todas ou parte(s) de CD29-positiva, CD44-positiva, CD90-positiva, CD271-positiva, CD11b-negativa, e Flk-1-negativa, porém não se limitam a estas. As células PDGFRa-positivas incluem, porém não se limitam a, células derivadas da medula óssea PDGFRa-positivas, célulastronco mesenquimais derivadas da medula óssea PDGFRa-positivas, células teciduais residindo nos tecidos PDGFRa-positivas (incluindo, por exemplo, fibroblastos, etc.), células derivadas da medula óssea PDGFRa-positivas, obtidas como células aderentes por cultura celular de uma fração de monócitos em sangue obtido por coleta da medula óssea (coleta de células da medula óssea) ou por coleta sanguínea periférica, ou similares.
[0070] A composição da presente invenção pode conter uma substância, exceto pelo menos um membro dos peptídeos, como definido em qualquer um dos itens (a) a (c) acima. Na composição da presente invenção, a substância, exceto pelo menos um membro dos peptídeos, como definido nos itens (a) a (c) acima, não é particularmente limitada, desde que a substância não iniba a atividade de estimular a migração celular, a atividade de recrutar as células, ou a atividade de promover a regeneração tecidual. Por exemplo, a composição da presente invenção pode conter, além de pelo menos um membro dos peptídeos, como definido acima nos itens (a) a (c) acima, molécula(s) relaciona
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27/68 da(s) que aprimora(m) a(s) função(ões) dos peptídeos, como definido nos itens (a) a (c) acima, molécula(s) que suprime(m) as ações que não sejam os efeitos esperados dos peptídeos, como definido nos itens (a) a (c) acima, fatores que controlam a proliferação ou diferenciação de células e outros fatores que melhoram ou mantêm as funções destes fatores ou células.
[0071] A proteína HMGB1 humana na presente invenção significa uma proteína consistindo da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 401 como uma proteína HMGB1 derivada de humanos. Além disso, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos da posição 1 à posição 44 da proteína HMGB1, significa um peptídeo consistindo da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 402.
[0072] A atividade de estimular a migração celular do peptídeo pode ser confirmada, por exemplo, por um método descrito nos Exemplos, ou um método descrito no WO 2012/147470, porém não se limita a este.
[0073] A estabilidade do peptídeo no plasma pode ser confirmada, por exemplo, por um método descrito nos Exemplos, porém não se limita a este.
[0074] O peptídeo da presente invenção pode ser exemplificado pelos peptídeos que consistem nas seguintes sequências de aminoácidos, porém não se limitam as seguintes.
(1) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV FSKP (SEQ ID NO: 1) (2) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV FSPK (SEQ ID NO: 2) (3) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV FSPP (SEQ ID NO: 3) (4) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV
QTCREEHKKK HPDASVNFSE QTCREEHKKK HPDASVNFSE QTCREEHKKK HPDASVNFSE QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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FSKA (SEQ ID NO: 4) (5) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKE (SEQ ID NO: 5) (6) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAA (SEQ ID NO: 6) (7) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAC (SEQ ID NO: 7) (8) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAD (SEQ ID NO: 8) (9) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAE (SEQ ID NO: 9) (10) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAF (SEQ ID NO: 10) (11) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAG (SEQ ID NO: 11) (12) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAH (SEQ ID NO: 12) (13) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSAI (SEQ ID NO: 13) (14) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSAK (SEQ ID NO: 14) (15) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAL (SEQ ID NO: 15) (16) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSAM (SEQ ID NO: 16) (17) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAN (SEQ ID NO: 17) (18) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAP (SEQ ID NO: 18) (19) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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29/68
FSAQ (SEQ ID NO: 19) (20) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAR (SEQ ID NO: 20) (21) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAS (SEQ ID NO: 21) (22) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAT (SEQ ID NO: 22) (23) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAV (SEQ ID NO: 23) (24) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSAW (SEQ ID NO: 24) (25) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSAY (SEQ ID NO: 25) (26) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCA (SEQ ID NO: 26) (27) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCC (SEQ ID NO: 27) (28) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCD (SEQ ID NO: 28) (29) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCE (SEQ ID NO: 29) (30) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCF (SEQ ID NO: 30) (31) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCG (SEQ ID NO: 31) (32) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCH (SEQ ID NO: 32) (33) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCI (SEQ ID NO: 33) (34) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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30/68
FSCK (SEQ ID NO: 34) (35) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCL (SEQ ID NO: 35) (36) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCM (SEQ ID NO: 36) (37) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCN (SEQ ID NO: 37) (38) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCP (SEQ ID NO: 38) (39) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCQ (SEQ ID NO: 39) (40) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCR (SEQ ID NO: 40) (41) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCS (SEQ ID NO: 41) (42) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCT (SEQ ID NO: 42) (43) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCV (SEQ ID NO: 43) (44) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCW (SEQ ID NO: 44) (45) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSCY (SEQ ID NO: 45) (46) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDA (SEQ ID NO: 46) (47) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDC (SEQ ID NO: 47) (48) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDD (SEQ ID NO: 48) (49) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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31/68
FSDE (SEQ ID NO: 49) (50) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDF (SEQ ID NO: 50) (51) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDG (SEQ ID NO: 51) (52) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDH (SEQ ID NO: 52) (53) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSDI (SEQ ID NO: 53) (54) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDK (SEQ ID NO: 54) (55) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDL (SEQ ID NO: 55) (56) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDM (SEQ ID NO: 56) (57) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDN (SEQ ID NO: 57) (58) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDP (SEQ ID NO: 58) (59) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDQ (SEQ ID NO: 59) (60) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDR (SEQ ID NO: 60) (61) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDS (SEQ ID NO: 61) (62) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDT (SEQ ID NO: 62) (63) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDV (SEQ ID NO: 63) (64) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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32/68
FSDW (SEQ ID NO: 64) (65) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSDY (SEQ ID NO: 65) (66) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEA (SEQ ID NO: 66) (67) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEC (SEQ ID NO: 67) (68) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSED (SEQ ID NO: 68) (69) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEE (SEQ ID NO: 69) (70) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEF (SEQ ID NO: 70) (71) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEG (SEQ ID NO: 71) (72) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEH (SEQ ID NO: 72) (73) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSEI (SEQ ID NO: 73) (74) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEK (SEQ ID NO: 74) (75) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEL (SEQ ID NO: 75) (76) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEM (SEQ ID NO: 76) (77) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEN (SEQ ID NO: 77) (78) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEP (SEQ ID NO: 78) (79) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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33/68
FSEQ (SEQ ID NO: 79) (80) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSER (SEQ ID NO: 80) (81) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSES (SEQ ID NO: 81) (82) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSET (SEQ ID NO: 82) (83) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEV (SEQ ID NO: 83) (84) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSEW (SEQ ID NO: 84) (85) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSEY (SEQ ID NO: 85) (86) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFA (SEQ ID NO: 86) (87) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFC (SEQ ID NO: 87) (88) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFD (SEQ ID NO: 88) (89) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFE (SEQ ID NO: 89) (90) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFF (SEQ ID NO: 90) (91) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFG (SEQ ID NO: 91) (92) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFH (SEQ ID NO: 92) (93) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFI (SEQ ID NO: 93) (94) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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34/68
FSFK (SEQ ID NO: 94) (95) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFL (SEQ ID NO: 95) (96) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFM (SEQ ID NO: 96) (97) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFN (SEQ ID NO: 97) (98) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFP (SEQ ID NO: 98) (99) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFQ (SEQ ID NO: 99) (100) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFR (SEQ ID NO: 100) (101) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFS (SEQ ID NO: 101) (102) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFT (SEQ ID NO: 102) (103) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFV (SEQ ID NO: 103) (104) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSFW (SEQ ID NO: 104) (105) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSFY (SEQ ID NO: 105) (106) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGA (SEQ ID NO: 106) (107) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGC (SEQ ID NO: 107) (108) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGD (SEQ ID NO: 108) (109) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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35/68
FSGE (SEQ ID NO: 109) (110) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGF (SEQ ID NO: 110) (111) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGG (SEQ ID NO: 111) (112) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGH (SEQ ID NO: 112) (113) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGI (SEQ ID NO: 113) (114) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGK (SEQ ID NO: 114) (115) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGL (SEQ ID NO: 115) (116) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGM (SEQ ID NO: 116) (117) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGN (SEQ ID NO: 117) (118) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGP (SEQ ID NO: 118) (119) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGQ (SEQ ID NO: 119) (120) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGR (SEQ ID NO: 120) (121) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGS (SEQ ID NO: 121) (122) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGT (SEQ ID NO: 122) (123) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGV (SEQ ID NO: 123) (124) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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36/68
FSGW (SEQ ID NO: 124) (125) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSGY (SEQ ID NO: 125) (126) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHA (SEQ ID NO: 126) (127) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHC (SEQ ID NO: 127) (128) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHD (SEQ ID NO: 128) (129) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHE (SEQ ID NO: 129) (130) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHF (SEQ ID NO: 130) (131) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHG (SEQ ID NO: 131) (132) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHH (SEQ ID NO: 132) (133) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHI (SEQ ID NO: 133) (134) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHK (SEQ ID NO: 134) (135) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHL (SEQ ID NO: 135) (136) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHM (SEQ ID NO: 136) (137) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHN (SEQ ID NO: 137) (138) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHP (SEQ ID NO: 138) (139) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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37/68
FSHQ (SEQ ID NO: 139) (140) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHR (SEQ ID NO: 140) (141) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHS (SEQ ID NO: 141) (142) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHT (SEQ ID NO: 142) (143) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSHV (SEQ ID NO: 143) (144) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSHW (SEQ ID NO: 144) (145) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSHY (SEQ ID NO: 145) (146) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIA (SEQ ID NO: 146) (147) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIC (SEQ ID NO: 147) (148) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSID (SEQ ID NO: 148) (149) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIE (SEQ ID NO: 149) (150) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIF (SEQ ID NO: 150) (151) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIG (SEQ ID NO: 151) (152) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIH (SEQ ID NO: 152) (153) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSII (SEQ ID NO: 153) (154) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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38/68
FSIK (SEQ ID NO: 154) (155) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIL (SEQ ID NO: 155) (156) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIM (SEQ ID NO: 156) (157) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIN (SEQ ID NO: 157) (158) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIP (SEQ ID NO: 158) (159) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIQ (SEQ ID NO: 159) (160) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIR (SEQ ID NO: 160) (161) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIS (SEQ ID NO: 161) (162) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIT (SEQ ID NO: 162) (163) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIV (SEQ ID NO: 163) (164) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIW (SEQ ID NO: 164) (165) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSIY (SEQ ID NO: 165) (166) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKC (SEQ ID NO: 166) (167) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKD (SEQ ID NO: 167) (168) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKF (SEQ ID NO: 168) (169) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 44/84
39/68
FSKG (SEQ ID NO: 169) (170) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKH (SEQ ID NO: 170) (171) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKI (SEQ ID NO: 171) (172) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKL (SEQ ID NO: 172) (173) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKM (SEQ ID NO: 173) (174) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKN (SEQ ID NO: 174) (175) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKQ (SEQ ID NO: 175) (176) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKR (SEQ ID NO: 176) (177) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKS (SEQ ID NO: 177) (178) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKT (SEQ ID NO: 178) (179) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKV (SEQ ID NO: 179) (180) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKW (SEQ ID NO: 180) (181) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSKY (SEQ ID NO: 181) (182) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLA (SEQ ID NO: 182) (183) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLC (SEQ ID NO: 183) (184) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 45/84
40/68
FSLD (SEQ ID NO: 184) (185) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLE (SEQ ID NO: 185) (186) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLF (SEQ ID NO: 186) (187) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLG (SEQ ID NO: 187) (188) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLH (SEQ ID NO: 188) (189) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSLI (SEQ ID NO: 189) (190) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLK (SEQ ID NO: 190) (191) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLL (SEQ ID NO: 191) (192) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLM (SEQ ID NO: 192) (193) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLN (SEQ ID NO: 193) (194) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLP (SEQ ID NO: 194) (195) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLQ (SEQ ID NO: 195) (196) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLR (SEQ ID NO: 196) (197) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLS (SEQ ID NO: 197) (198) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLT (SEQ ID NO: 198) (199) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 46/84
41/68
FSLV (SEQ ID NO: 199) (200) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLW (SEQ ID NO: 200) (201) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSLY (SEQ ID NO: 201) (202) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMA (SEQ ID NO: 202) (203) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMC (SEQ ID NO: 203) (204) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMD (SEQ ID NO: 204) (205) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSME (SEQ ID NO: 205) (206) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMF (SEQ ID NO: 206) (207) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMG (SEQ ID NO: 207) (208) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMH (SEQ ID NO: 208) (209) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMI (SEQ ID NO: 209) (210) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMK (SEQ ID NO: 210) (211) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSML (SEQ ID NO: 211) (212) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMM (SEQ ID NO: 212) (213) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMN (SEQ ID NO: 213) (214) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 47/84
42/68
FSMP (SEQ ID NO: 214) (215) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMQ (SEQ ID NO: 215) (216) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMR (SEQ ID NO: 216) (217) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMS (SEQ ID NO: 217) (218) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMT (SEQ ID NO: 218) (219) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMV (SEQ ID NO: 219) (220) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMW (SEQ ID NO: 220) (221) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSMY (SEQ ID NO: 221) (222) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNA (SEQ ID NO: 222) (223) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNC (SEQ ID NO: 223) (224) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSND (SEQ ID NO: 224) (225) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNE (SEQ ID NO: 225) (226) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNF (SEQ ID NO: 226) (227) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNG (SEQ ID NO: 227) (228) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNH (SEQ ID NO: 228) (229) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 48/84
43/68
FSNI (SEQ ID NO: 229) (230) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNK (SEQ ID NO: 230) (231) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNL (SEQ ID NO: 231) (232) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNM (SEQ ID NO: 232) (233) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNN (SEQ ID NO: 233) (234) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNP (SEQ ID NO: 234) (235) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNQ (SEQ ID NO: 235) (236) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNR (SEQ ID NO: 236) (237) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNS (SEQ ID NO: 237) (238) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNT (SEQ ID NO: 238) (239) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNV (SEQ ID NO: 239) (240) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNW (SEQ ID NO: 240) (241) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSNY (SEQ ID NO: 241) (242) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPA (SEQ ID NO: 242) (243) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPC (SEQ ID NO: 243) (244) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 49/84
44/68
FSPD (SEQ ID NO: 244) (245) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPE (SEQ ID NO: 245) (246) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPF (SEQ ID NO: 246) (247) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPG (SEQ ID NO: 247) (248) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPH (SEQ ID NO: 248) (249) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPI (SEQ ID NO: 249) (250) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPL (SEQ ID NO: 250) (251) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPM (SEQ ID NO: 251) (252) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPN (SEQ ID NO: 252) (253) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPQ (SEQ ID NO: 253) (254) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPR (SEQ ID NO: 254) (255) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPS (SEQ ID NO: 255) (256) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPT (SEQ ID NO: 256) (257) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPV (SEQ ID NO: 257) (258) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSPW (SEQ ID NO: 258) (259) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 50/84
45/68
FSPY (SEQ ID NO: 259) (260) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQA (SEQ ID NO: 260) (261) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQC (SEQ ID NO: 261) (262) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQD (SEQ ID NO: 262) (263) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQE (SEQ ID NO: 263) (264) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQF (SEQ ID NO: 264) (265) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQG (SEQ ID NO: 265) (266) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQH (SEQ ID NO: 266) (267) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQI (SEQ ID NO: 267) (268) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQK (SEQ ID NO: 268) (269) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQL (SEQ ID NO: 269) (270) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQM (SEQ ID NO: 270) (271) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQN (SEQ ID NO: 271) (272) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQP (SEQ ID NO: 272) (273) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQQ (SEQ ID NO: 273) (274) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 51/84
46/68
FSQR (SEQ ID NO: 274) (275) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQS (SEQ ID NO: 275) (276) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQT (SEQ ID NO: 276) (277) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQV (SEQ ID NO: 277) (278) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQW (SEQ ID NO: 278) (279) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSQY (SEQ ID NO: 279) (280) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRA (SEQ ID NO: 280) (281) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRC (SEQ ID NO: 281) (282) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRD (SEQ ID NO: 282) (283) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRE (SEQ ID NO: 283) (284) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRF (SEQ ID NO: 284) (285) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRG (SEQ ID NO: 285) (286) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRH (SEQ ID NO: 286) (287) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRI (SEQ ID NO: 287) (288) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRK (SEQ ID NO: 288) (289) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 52/84
47/68
FSRL (SEQ ID NO: 289) (290) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRM (SEQ ID NO: 290) (291) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRN (SEQ ID NO: 291) (292) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRP (SEQ ID NO: 292) (293) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRQ (SEQ ID NO: 293) (294) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRR (SEQ ID NO: 294) (295) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRS (SEQ ID NO: 295) (296) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRT (SEQ ID NO: 296) (297) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRV (SEQ ID NO: 297) (298) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRW (SEQ ID NO: 298) (299) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSRY (SEQ ID NO: 299) (300) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSA (SEQ ID NO: 300) (301) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSC (SEQ ID NO: 301) (302) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSD (SEQ ID NO: 302) (303) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSE (SEQ ID NO: 303) (304) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 53/84
48/68
FSSF (SEQ ID NO: 304) (305) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSG (SEQ ID NO: 305) (306) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSH (SEQ ID NO: 306) (307) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSI (SEQ ID NO: 307) (308) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSK (SEQ ID NO: 308) (309) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSL (SEQ ID NO: 309) (310) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSM (SEQ ID NO: 310) (311) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSN (SEQ ID NO: 311) (312) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSP (SEQ ID NO: 312) (313) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSQ (SEQ ID NO: 313) (314) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSR (SEQ ID NO: 314) (315) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSS (SEQ ID NO: 315) (316) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSST (SEQ ID NO: 316) (317) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSV (SEQ ID NO: 317) (318) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSSW (SEQ ID NO: 318) (319) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 54/84
49/68
FSSY (SEQ ID NO: 319) (320) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTA (SEQ ID NO: 320) (321) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTC (SEQ ID NO: 321) (322) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTD (SEQ ID NO: 322) (323) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTE (SEQ ID NO: 323) (324) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTF (SEQ ID NO: 324) (325) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTG (SEQ ID NO: 325) (326) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTH (SEQ ID NO: 326) (327) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTI (SEQ ID NO: 327) (328) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTK (SEQ ID NO: 328) (329) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTL (SEQ ID NO: 329) (330) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTM (SEQ ID NO: 330) (331) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTN (SEQ ID NO: 331) (332) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTP (SEQ ID NO: 332) (333) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTQ (SEQ ID NO: 333) (334) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
Petição 870190129051, de 06/12/2019, pág. 55/84
50/68
FSTR (SEQ ID NO: 334) (335) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTS (SEQ ID NO: 335) (336) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTT (SEQ ID NO: 336) (337) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTV (SEQ ID NO: 337) (338) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTW (SEQ ID NO: 338) (339) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSTY (SEQ ID NO: 339) (340) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVA (SEQ ID NO: 340) (341) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVC (SEQ ID NO: 341) (342) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVD (SEQ ID NO: 342) (343) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVE (SEQ ID NO: 343) (344) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVF (SEQ ID NO: 344) (345) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVG (SEQ ID NO: 345) (346) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVH (SEQ ID NO: 346) (347) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVI (SEQ ID NO: 347) (348) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVK (SEQ ID NO: 348) (349) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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FSVL (SEQ ID NO: 349) (350) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVM (SEQ ID NO: 350) (351) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVN (SEQ ID NO: 351) (352) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVP (SEQ ID NO: 352) (353) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVQ (SEQ ID NO: 353) (354) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVR (SEQ ID NO: 354) (355) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVS (SEQ ID NO: 355) (356) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVT (SEQ ID NO: 356) (357) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVV (SEQ ID NO: 357) (358) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVW (SEQ ID NO: 358) (359) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSVY (SEQ ID NO: 359) (360) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWA (SEQ ID NO: 360) (361) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWC (SEQ ID NO: 361) (362) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWD (SEQ ID NO: 362) (363) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWE (SEQ ID NO: 363) (364) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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FSWF (SEQ ID NO: 364) (365) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWG (SEQ ID NO: 365) (366) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWH (SEQ ID NO: 366) (367) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWI (SEQ ID NO: 367) (368) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWK (SEQ ID NO: 368) (369) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWL (SEQ ID NO: 369) (370) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWM (SEQ ID NO: 370) (371) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWN (SEQ ID NO: 371) (372) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWP (SEQ ID NO: 372) (373) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWQ (SEQ ID NO: 373) (374) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWR (SEQ ID NO: 374) (375) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWS (SEQ ID NO: 375) (376) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWT (SEQ ID NO: 376) (377) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWV (SEQ ID NO: 377) (378) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSWW (SEQ ID NO: 378) (379) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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FSWY (SEQ ID NO: 379) (380) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYA (SEQ ID NO: 380) (381) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYC (SEQ ID NO: 381) (382) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYD (SEQ ID NO: 382) (383) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYE (SEQ ID NO: 383) (384) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYF (SEQ ID NO: 384) (385) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYG (SEQ ID NO: 385) (386) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYH (SEQ ID NO: 386) (387) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYI (SEQ ID NO: 387) (388) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYK (SEQ ID NO: 388) (389) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYL (SEQ ID NO: 389) (390) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYM (SEQ ID NO: 390) (391) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYN (SEQ ID NO: 391) (392) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYP (SEQ ID NO: 392) (393) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
FSYQ (SEQ ID NO: 393) (394) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE
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FSYR (SEQ ID NO: 394) (395) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSYS (SEQ ID NO: 395) (396) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSYT (SEQ ID NO: 396) (397) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSYV (SEQ ID NO: 397) (398) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSYW (SEQ ID NO: 398) (399) MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSYY (SEQ ID NO: 399) (400) GKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSPP (SEQ ID NO: 403)
[0075] O peptídeo da presente invenção inclui ainda um peptídeo tendo substituição de um aminoácido da posição 43 e/ou posição 44 do peptídeo mostrado na SEQ ID NOs: 1 a 399 com um aminoácido ocorrendo não-naturalmente, e um peptídeo tendo substituição de um aminoácido da posição 42 e/ou posição 43 do peptídeo mostrado na SEQ ID NO: 403 com um aminoácido ocorrendo não-naturalmente.
[0076] O peptídeo da presente invenção pode ter uma substituição conservadora de um aminoácido ou aminoácidos no peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5. A substituição conservadora refere-se à substituição com outro aminoácido que tenha uma estrutura ou propriedades quimicamente similares àquelas do aminoácido original, sem sofrer alterações substanciais nas funções do peptídeo. Exemplos de substituição conservadora incluem substituições mútuas entre ácido aspártico e ácido glutâmico, que são aminoácidos ácidos; substituições mútuas entre lisina, arginina e histidina, que são aminoácidos básicos; substituições mútuas entre serina, treonina, asparagina e glutamina, que são ami
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55/68 noácidos hidrofílicos; e similares. Por exemplo, um peptídeo da SEQ ID NO: 167 é um produto no qual ácido glutâmico (E) na posição 44 do peptídeo da SEQ ID NO: 5 é substituído por ácido aspártico (D), que se considera ter uma função equivalente àquela do peptídeo da SEQ ID NO: 5. Além disso, os peptídeos mostrados na SEQ ID NOs: 126,
128, 129, 138, 248, 254, 280, 282, 283 e 292 também têm uma substituição conservadora de aminoácido no peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, que são considerados ter a função equivalente àquela de qualquer um dos peptídeos das SEQ ID NOs: 1 a 5. Em uma modalidade, o peptídeo da presente invenção tem a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283, 292 e 403. Em uma modalidade mais preferida, o peptídeo da presente invenção tem a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 167 e 403 e, em uma modalidade ainda mais preferida, o peptídeo da presente invenção tem a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 403, do ponto de vista de que se espera que o peptídeo tenha a função acima com mais segurança.
[0077] Portanto, uma das modalidades preferidas de peptídeo, definida no item (a) acima, é um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128,
129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283, 292 e 403, e uma das mais preferidas modalidades é um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 167 e 403, e uma das modalidades ainda mais preferidas é um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 403.
[0078] Além disso, uma das modalidades preferidas de peptídeo, definida no item (b) acima, é um peptídeo consistindo em uma se
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56/68 quência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283, 292 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, uma das modalidades mais preferidas é um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 167 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, e uma das modalidades ainda mais preferidas é um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células.
[0079] Além disso, uma das modalidades preferidas de peptídeo, como definido no item (c) acima, é um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283 e 292, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mos
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57/68 trada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, uma das modalidades mais preferidas é um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 167, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, e uma das modalidades ainda mais preferida é um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos, por exemplo, 2 a 40 aminoácidos, 2 a 30 aminoácidos, 2 a 20 aminoácidos, 2 a 10 aminoácidos, 2 a 5 aminoácidos, ou 4, 3, ou 2 aminoácidos, em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células.
[0080] O termo derivativo do peptídeo da presente invenção significa um peptídeo com substancialmente a mesma função ou atividade biológica que o peptídeo da presente invenção, em outras palavras, a atividade de estimular a migração celular. O terminal-C do derivativo do peptídeo pode ser qualquer um de um grupo carboxila, um carboxilato, uma amida, ou um éster. Por exemplo, o derivativo inclui um peptídeo modificado obtido pela adição de um grupo modificador, um peptídeo mutante obtido pela alteração de um resíduo de aminoácido, e similares.
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[0081] O grupo modificador inclui grupos funcionais que mostram propriedades fluorescentes, grupos funcionais não envolvidos na formação da conformação de um peptídeo, e similares. Além disso, o grupo modificador pode ser um resíduo de aminoácido (por exemplo, β-alanina, etc.) exceto um resíduo de aminoácido constituindo o peptídeo ocorrendo naturalmente da presente invenção. O grupo funcional que mostra propriedades fluorescentes inclui eosina, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e similares. Os grupos funcionais não envolvidos na formação da conformação de um peptídeo incluem grupos espaçadores representados por resíduos de β-alanina, e similares. É preferível que o grupo funcional esteja presente em um terminal. Além disso, um peptídeo modificado com polietileno glicol (PEG) também é incluído no derivativo.
[0082] O termo sal farmaceuticamente aceitável do peptídeo da presente invenção inclui sais fisiologicamente aceitáveis com ácidos ou bases, e particularmente sais adicionados de ácidos são preferidos. Como o sal, como mencionado acima, um sal com um ácido inorgânico, tal como ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido bromídrico, ou ácido sulfúrico, um sal com um ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido sucínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzóico, ácido metanossulfônico, ou ácido benzenossulfônico, ou similares, é utilizado.
[0083] O termo solvato do peptídeo da presente invenção ou do sal acima inclui aqueles em que qualquer número de moléculas de solvente é coordenado com o peptídeo da presente invenção e, preferivelmente, um hidrato.
[0084] A presente invenção provê o peptídeo como descrito acima. Na síntese do peptídeo da presente invenção, o peptídeo pode ser quimicamente sintetizado de acordo com qualquer um dos métodos
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59/68 dos métodos de síntese da fase líquida do peptídeo e dos métodos de síntese da fase sólida do peptídeo. Na presente invenção, o peptídeo sintetizado de acordo com o método de síntese da fase sólida do peptídeo é preferido. O método de síntese da fase sólida do peptídeo é um dos métodos geralmente empregados quando peptídeos são quimicamente sintetizados, o que pode ser, por exemplo, realizado como a seguir: Usando como uma fase sólida esferas de gel de polímero de poliestireno com 0,1 mm de diâmetro ou mais, cujas superfícies são modificadas com grupos amino, uma cadeia de aminoácidos é prolongada uma a uma por reação de desidratação. Quando uma sequência almejada de peptídeos é preparada, o peptídeo é cortado da superfície da fase sólida, para obtenção de uma substância pretendida.
[0085] De acordo com o método de síntese da fase sólida, é possível realizar a síntese de peptídeos ribossômicos, que é difícil de sintetizar em bactérias, pela introdução de um aminoácido ocorrendo não-naturalmente, tal como a forma-D ou um composto substituído por átomo pesado, modificação da cadeia principal de peptídeos e proteínas, ou similares. Quando uma cadeia peptídica longa de 70 a mais de 100 peptídeos é sintetizada no método de fase sólida, as cadeias peptídicas podem ser sintetizadas através da ligação de duas cadeias peptídicas usando um método de ligação química natural.
[0086] O método para administração de uma composição da presente invenção inclui administração oral ou administração parenteral, e os métodos específicos de administração parenteral incluem a administração injetável, administração transnasal, administração transpulmonar, administração transdérmica, e similares, porém não se limitam a estas. Como exemplos de administração injetável, por exemplo, uma composição da presente invenção pode ser administrada sistêmica ou localmente (por exemplo, subcutaneamente, intradermicamente, epidermicamente, no globo ocular ou conjuntiva palpebral, na mucosa da
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60/68 cavidade nasal, na cavidade oral e mucosa gastrointestinal, na mucosa vaginal ou intrauterina, em um local danificado, etc.) por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea, ou similares.
[0087] Além disso, o método para administração de uma composição da presente invenção inclui, por exemplo, administração intravascular (administração intra-arterial, administração intravenosa, etc.), administração de sangue, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intradérmica, e administração intraperitoneal, porém não se limita a estas.
[0088] Além disso, o local de administração não é limitado, o que inclui um local de tecido com necessidade de regeneração ou sua região vizinha, um local diferente do tecido com necessidade de regeneração, ou um local distai e diferente do tecido com necessidade de regeneração. Por exemplo, o local de administração inclui sangue (intraarterial, intravenoso, etc.), músculos, local subcutâneo, local intradérmico e local intraperitoneal, porém não se limita a estes.
[0089] Além disso, o método para administração pode ser apropriadamente selecionado, dependendo da idade e sintomas dos pacientes. Quando o peptídeo da presente invenção é administrado, por exemplo, uma dose dentro de uma faixa de 0,000000 mg por 1 kg de peso corporal por administração única pode ser selecionada. Alternativamente, por exemplo, uma dose dentro de uma faixa de 0,00001 a 100.000 mg/corpo por paciente pode ser selecionada. Quando células que secretam o peptídeo da presente invenção ou um vetor para terapia genética no qual é inserido um DNA que codifica o peptídeo é administrado, o peptídeo pode ser administrado de modo que a quantidade de peptídeo esteja dentro da faixa acima. Entretanto, a composição farmacêutica da presente invenção não se limita a estas doses.
[0090] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser
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61/68 formulada de acordo com métodos convencionais (por exemplo, Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, EUA), que juntos podem conter um veículo ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de veículos e aditivos incluem, por exemplo, tensoativos, excipientes, corantes, perfumes, preservativos, estabilizantes, tampões, agentes de suspensão, agentes isotônicos, aglutinantes, desintegrantes, lubrificantes, promotores de fluidez, agentes aromatizantes e similares, porém não se limitam a estes, e outros veículos convencionalmente utilizados podem ser apropriadamente usados. Exemplos específicos incluem ácido silícico anidro leve, lactose, celuloses cristalinas, manitol, amidos, carmelose cálcica, carmelose sódica, hidroxipropil celulose, hidroxipropilmetil celulose, polivinil acetal dietilaminoacetato, polivinil pirrolidona, gelatina, triglicerídeo de ácido graxo de cadeia média, óleo de rícino hidrogenado com polioxietileno 60, açúcar branco, carboximetilcelulose, amido de milho, sais inorgânicos e similares.
[0091] Aqui, todas as referências da técnica anterior citadas no presente relatório serão aqui incorporadas por referência.
EXEMPLOS
[0092] A presente invenção será ainda ilustrada por meio dos seguintes Exemplos, sem pretender limitar a presente invenção aos mesmos.
Exemplo 1
Síntese de Vários Tipos de Peptídeos HMB1
[0093] Um peptídeo consistindo em aminoácidos na posição 2 a posição 44 de HMGB1 humana (2-44) e cada um dos cinco tipos de peptídeos tendo substituição de uma sequência de aminoácidos na posição 43 e/ou posição 44 do peptídeo na posição 1 à posição 44 de HMGB1 humana (Peptídeo 1 a 5) foram sintetizados por um método de fase sólida.
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2-44 GKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKK (SEQ ID NO: 400)
Peptídeo-1 MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKP (SEQ ID NO: 1)
Peptideo-2MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSPK (SEQ ID NO: 2)
Peptideo-3MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSPP (SEQ ID NO: 3)
Peptideo-4MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKA (SEQ ID NO: 4)
Peptideo-5MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKE (SEQ ID NO: 5)
Exemplo 2
Medições da Atividade de Migração Celular
[0094] Células da linhagem celular estromal derivadas da medula óssea de murino ST2 (RCB0224, RIKEN BioResource Research Center) foram removidas de um prato usando TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific) e coletadas por centrifugação a 25 °C e 1.500 rpm por 5 minutos. Os péletes de células foram preparados em uma concentração de 7 χ 105 células/mL com RPMI 1640 / FBS 10% / PenStrep 1% (Gibco) e semeados a 70 pL/poço de inserção em uma placa de 24 poços preparada com uma inserção de cultura (Nippon Genetics Co., Ltd.). Após 24 horas, a inserção de cultura foi extraída e as células foram lavadas uma vez com RPMI 1640. Cada uma das amostras de peptídeos (um peptídeo da posição 2 a posição 44 de HMGB1 humana (2-44), e os cinco tipos de peptídeos modificados, Peptídeo 1 a 5 preparados no Exemplo 1), preparada com um meio de ensaio a 10 μΜ (RPMI 1640 / FBS 0,1%), foi adicionada em uma quantidade de 550 pL, e as células foram ainda cultivadas durante a noite. Como controle negativo (CN), somente o meio de ensaio foi adicionado. Após a
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63/68 cultura, as células foram fixadas, coradas com DiffQuik, e fotografadas. O grau de migração celular de cada grupo a partir das imagens fotografadas foi avaliado com cinco níveis de classificação (-, ±, +, ++, +++). Além disso, cada uma das amostras de peptídeos foi submetida a três execuções de teste sob as mesmas condições.
Resultados
[0095] A presença ou ausência da atividade de migração do peptídeo da posição 2 para a posição 44 da HMGB1 humana (2-44), os cinco tipos de peptídeos modificados, Peptídeo 1 a 5 preparados no Exemplo 1, e CN foram determinados. Como resultado, todos os cinco tipos de peptídeos modificados apresentaram atividade de migração (Tabela 1).
Tabela 1
1- execução 2â execução 3â execução
NC - + -
2-44 +++ +++ +++
Peptídeo-1 +++ + +++
Peptídeo-2 +++ ++ +++
Peptídeo-3 + + +
Peptídeo-4 ++ + +++
Peptídeo-5 ++ ++ ++
Exemplo 3
Estabilidade de Peptídeos no Plasma
[0096] O sangue total coletado de ratos Crl:CD (SD) utilizando um anticoagulante EDTA-2K foi centrifugado para obter um plasma em branco. O plasma obtido foi armazenado em gelo e usado somente no dia do teste de estabilidade.
[0097] Cada um dos seis tipos de peptídeos utilizados no Exemplo 2 foi preparado em uma solução a 375 pg/mL com água destilada a partir de uma solução estoque na qual cada peptídeo foi dissolvido em uma solução aquosa de TFA 0,1% a 1 mg/mL. Dezesseis microlitros de solução foram adicionados a 1,184 pl_ do plasma em branco para preparar uma amostra para o teste de estabilidade (concentração do
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64/68 ensaio: 5 pg/mL). A amostra para o teste de estabilidade foi deixada repousar em gelo, e 50 pl_ (em cada ponto do tempo, 3 amostras) foram coletados imediatamente após a adição e 1, 3, 5, 15, 30 e 60 minutos após a adição. À 50 μΙ_ de amostra coletada foram adicionados 250 μΙ_ de solução de ácido cítrico 270 mmol/L / solução aquosa de EDTA-2K 130 mmol/L (4:1, v/v), 25 pL de uma solução aquosa de TFA 0,1%, e 25 μ L de solução IS (4 μg/mL de solução aquosa de TFA 0,1% de um composto no qual nove átomos de carbono e um átomo de nitrogênio da fenilalanina na posição 18, posição 38 e posição 41 no peptídeo da posição 1 à posição 44 da HMGB1 humana são, cada um, substituídos por um isótopo estável), e misturados. À mistura foram adicionados 350 pL de metanol e misturados, e mais 100 pL de acetonitrila foram adicionados e misturados, e a mistura foi congelada uma vez com gelo seco. A mistura congelada foi descongelada à temperatura ambiente e o sobrenadante obtido por centrifugação foi transferido para um recipiente separado e agitado para ser utilizado como uma amostra para a medição.
[0098] As amostras para a medição foram introduzidas no espectrômetro de massa quadripolar em tandem-cromatografia líquida de alta eficiência, para detectar os íons de monitor peculiares para cada um dos peptídeos. A partir de amostras preparadas separadamente, cujas concentrações eram conhecidas, foi traçada uma curva de calibração em uma faixa de concentração de 0,1 a 10 pg/mL, e uma regressão inversa foi obtida das áreas de pico dos cromatogramas obtidos pelas medições de cada amostra para obter uma concentração peptídica nas amostras. Foi calculada a média da concentração de peptídeos em cada ponto do tempo, e uma taxa restante (%), que foi calculada por uma definição imediatamente após a adição como 100, foi representada contra o tempo após a adição (FIG. 1).
Resultados
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[0099] Como resultado do teste de estabilidade no plasma de rato (em gelo) do peptídeo na posição 2 a posição 44 da HMGB1 humana (2-44) e nos cinco tipos de peptídeos nos quais os aminoácidos na posição 43 e posição 44 foram modificados (Peptídeos 1 a 5), 2-44 foram iguais ou inferiores ao limite inferior quantificável (0,5 pg/mL) para a amostra aos 15 minutos ou mais depois da adição. Por outro lado, foi confirmado que os cinco tipos de peptídeos modificados dos Peptídeos 1 a 5 eram todos estáveis em comparação com 2-44 (FIG. 1). Exemplo 4
Síntese de Peptídeo HMGB1
[00100] Um peptídeo consistindo em uma sequência fornecida abaixo, tendo a substituição de dois aminoácidos em um terminal-C no peptídeo da posição 2 a posição 44 da HMGB1 humana (2-44) (Peptídeo 6), foi sintetizado por um método de fase sólida.
Peptídeo 6 GKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKKHPDASVNFSE FSPP (SEQ ID NO: 403)
Exemplo 5
Medições da Atividade de Migração Celular
[00101] Células da linhagem celular estromal derivadas da medula óssea de murino ST2 (RCB0224, RIKEN BioResource Research Center) foram removidas de um prato usando 2,5 g/L - Trypsin/1 mmol/L Solução EDTA (Nacalai tesque) e coletadas por centrifugação a 25°C e 200 g por 3 minutos. Os péletes de células foram preparados em uma concentração de 8,6 x 105 células/mL com RPMI 1640/FBS 10% / PenStrep 1% (Nacalai tesque) e semeados a 70 pL/poço de inserção em uma placa de 24 poços preparada com uma inserção de cultura (Nippon Genetics Co., Ltd.). Após 18 horas, a inserção de cultura foi extraída e as células foram lavadas uma vez com RPMI 1640. Cada uma das amostras de peptídeos (o peptídeo da posição 2 a posição 44 de HMGB1 humana (2-44), e o peptídeo modificado, Peptídeo 6, pre
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66/68 parado no Exemplo 4), preparada com um meio de ensaio a 20 μΜ (RPMI 1640/FBS 0,1%), foi adicionada em uma quantidade de 1.000 pl_, e as células foram cultivadas por mais 20 horas. Como controle negativo (CN), somente o meio de ensaio foi adicionado. Imediatamente após a adição do meio de ensaio e após 20 horas de cultura, as células foram fotografadas. A partir da imagem fotografada, o grau de migração celular de cada grupo foi avaliado como uma proporção (%) da área ocupada pelas células migradas para a região em 20 horas em relação à área da região em branco preparada pela inserção de cultura (região na qual as células não existem no momento da adição do meio de ensaio).
Resultados
[00102] A presença ou ausência da atividade de migração do peptídeo na posição 2 para a posição 44 da HMGB1 humana (2-44), o peptídeo modificado preparado no Exemplo 4 (Peptídeo 6) e o CN foram determinados. Como resultado, o peptídeo modificado (Peptídeo 6) apresentou o mesmo nível de atividade migratória que o peptídeo na posição 2 para a posição 44 da HMGB1 humana (2-44) (FIG. 2). Exemplo 6
Estabilidade dos Peptídeos no Plasma
[00103] Um tubo de 5 mL previamente carregado com 60 μΙ_ de EDTA-2K 10% foi carregado com 3 mL de sangue total coletado de ratos Crl:CD (SD), e o conteúdo foi deixado repousar à temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, centrifugado a 4 °C e a 3.000 rpm (1600 x g) por 10 minutos. O sobrenadante foi coletado para ser usado como um plasma em branco. O plasma obtido foi armazenado em gelo e somente utilizado no dia do teste de estabilidade.
Cada um dos peptídeos da posição 2 a posição 44 da HMGB1 humana (2-44), o peptídeo modificado preparado no Exemplo 1 (Peptídeo 3), e o peptídeo modificado preparado no Exemplo 4 (Peptídeo 6), fo
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67/68 ram preparados em uma solução a 375 pg/mL com água destilada a partir de uma solução estoque na qual cada peptídeo foi dissolvido em uma solução aquosa de TFA 0,1% a 1 mg/mL. Oito microlitros da solução foram adicionados a 592 pl_ do plasma em branco para preparar uma amostra para o teste de estabilidade (concentração do ensaio: 5 pg/mL). A amostra para o teste de estabilidade foi deixada repousar em gelo, e 50 pL foram coletados imediatamente após a adição, e 30 e 60 minutos após a adição. À 50 pL de amostra coletada foram adicionados 250 pL de solução de ácido cítrico 270 mmol/L / solução aquosa de EDTA-2K 130 mmol/L (4:1, v/v), e 50 pL de uma solução aquosa de TFA 0,1 %, e misturados. À mistura foram adicionados 350 pL de metanol e misturados, e mais 100 pL de acetonitrila foram adicionados e misturados, e a mistura foi congelada uma vez com gelo seco. Após 5 a 60 minutos, a amostra congelada foi descongelada à temperatura ambiente, e o sobrenadante obtido por centrifugação a 4 °C e a 14.000 x g por 3 minutos foi coletado em uma quantidade de 400 pL, seco e solidificado com um concentrador centrífugo (Spin Dryer Light VC-36R, fabricado por TAITEC CORPORATION), e dissolvido em 200 pL de um tampão de TFA 1% / ACN 2%, e filtrado com um filtro (0,22 pm) para obter amostras para a medição.
[00104] As amostras para a medição foram introduzidas no espectrômetro de massa quadripolar único-cromatografia líquida de alta eficiência, para detectar os íons de monitor peculiares para cada um dos peptídeos. A partir de amostras preparadas separadamente, cujas concentrações eram conhecidas, foi traçada uma curva de calibração em uma faixa de concentração de 0,1 a 10 pg/mL, e uma regressão inversa foi obtida das áreas de pico dos cromatogramas obtidos pelas medições de cada amostra para obter uma concentração peptídica nas amostras. Quanto à concentração peptídica a cada ponto do tempo, uma taxa restante (%), que foi calculada por uma definição imediata
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68/68 mente após a adição comot 100, foi representada contra o tempo após a adição (FIG. 3).
Resultados
[00105] Como resultado do teste de estabilidade no plasma de rato (em gelo), 2-44 mostraram ser iguais ou inferiores ao limite inferior quantificável (0,5 pg/mL) em um ponto do tempo de 30 minutos após a adição. Por outro lado, foi confirmado que tanto o Peptídeo-3 como o Peptídeo-6 eram estáveis em comparação com 2-44. Além disso, a estabilidade do Peptídeo-3 e Peptídeo-6 apresentou o mesmo nível (FIG. 3).
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[00106] O peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo da presente invenção, é utilizado no campo da medicina regenerativa.

Claims (10)

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção, ou inserção de um ou mais aminoácidos em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 399, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo uma atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo.
2. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283, 292 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283, 292 e 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, e
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2/4 um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 126, 128, 129, 138, 167, 248, 254, 280, 282, 283 e 292, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo.
3. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 167 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, 167 e 403, e tendo uma atividade de estimular a migração de células, e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 167, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo uma atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo.
4. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que é selecionado
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3/4 do grupo consistindo em:
um peptídeo tendo a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma da SEQ ID Nos: 1 a 5 e 403, um peptídeo consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo a adição de um ou mais aminoácidos ao peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5 e 403, e tendo uma atividade de estimular a migração de células, e um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos em um aminoácido da posição 1 à posição 42 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 5, ou em um aminoácido da posição 1 à posição 41 do peptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 403, e tendo a atividade de estimular a migração de células, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo.
5. Composição para uso no estímulo da migração de células PDGFRa-positivas, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. Composição para uso no recrutamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea, a partir da medula óssea para o sangue periférico, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
7. Composição para uso na regeneração de tecidos, carac
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4/4 terizada pelo fato de que compreende um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
8. Composição para uso no estímulo da migração de células estromais derivadas da medula óssea, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
9. Uso de um peptídeo, um derivativo do mesmo, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, ou um solvato do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica e/ou medicamento para:
(a) estímulo da migração de células PDGFRa-positivas, (b) recrutamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea a partir da medula óssea para o sangue periférico, (c) regeneração de tecidos, e/ou (d) estímulo da migração de células estromais derivadas da medula óssea.
10. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.
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