CN114106139A - 用于诱导组织再生的肽及其应用 - Google Patents

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野口由纪子
远藤真弓
滨渕夏美
内藤佳奈
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Abstract

本发明涉及用于诱导组织再生的肽及其应用，本发明的课题在于提供促进骨髄间充质干细胞等PDGFRα阳性细胞的伴随着刺激的血中动员、向损伤组织的聚集并且诱导体内的组织再生的治疗药。本发明合成了多种肽并尝试地对各肽的迁移活性进行了评价。结果，成功地鉴定出对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系(MSC‑1)显示迁移活性的多种肽。进而确认，鉴定出的肽对属于PDGFRα阳性细胞的皮肤成纤维细胞也具有迁移活性等。

Description

用于诱导组织再生的肽及其应用
本申请是申请日为2012年4月3日、优先权日为2011年4月26日、中国专利申请号为201280031164.X、发明名称为“用于诱导组织再生的肽及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于诱导组织再生的肽及其应用。
背景技术
已经逐渐明确生物体内的各器官、组织中存在有维持其结构、功能的稳态性的组织干细胞。例如，心脏中存在心肌干细胞，脑中存在神经干细胞，皮肤中存在表皮干细胞、毛囊干细胞，贯穿生命始终地供给心肌细胞、神经细胞、表皮细胞、毛囊上皮细胞以维持心脏、脑、皮肤的结构、功能。另一方面，骨髄中存在分化成红细胞、白细胞、血小板等血液细胞的造血干细胞。这些造血干细胞来源的血液细胞通过血流在体内的所有器官和组织中循环，发挥供氧、免疫反应、止血、损伤组织修复等对维持生命来说不可或缺的功能。即，与其说骨髄造血干细胞有助于维持其局部存在的组织即骨髄和骨组织的稳态性，不如可以说其通过末梢循环有助于维持生物体内所有组织的稳态性。
近年来，已经明确骨髄内除了存在造血干细胞，还存在能够分化成骨、软骨、脂肪等中胚层组织、还能进一步分化成神经、表皮等外胚层组织的间充质干细胞，但是其在生物体内的存在意义尚有许多不清楚的地方。但是，既然骨髄内存在通过末梢循环供给血液细胞、由此维持所有组织、器官的稳态性的造血干细胞，则可以预料到同样存在于骨髄内的间充质干细胞也可能通过末梢循环将能够分化成骨、软骨、脂肪、神经、上皮等的细胞提供给需要的生物体内组织、器官，由此有助于维持生物组织的稳态性。
目前，正致力于开发通过骨髄血采血采集骨髄间充质干细胞，通过细胞培养使其增殖后移植到难治性组织损伤部位或末梢循环血中，从而诱导损伤组织的再生的再生医疗。骨髄间充质干细胞移植的临床应用在脑梗塞、心肌梗塞、难治性皮肤溃疡等的再生医疗已得到进展。此外，已经明确移植的骨髄间充质干细胞在生物体内的局部发挥炎症/免疫反应抑制作用、纤维性瘢痕形成抑制作用，作为对骨髄移植或输血后的严重副作用即移植物抗宿主反应(graft versus host disease,GVHD)或自身免疫疾病硬皮病的新的治疗方法，开始进行骨髄间充质干细胞移植疗法的临床试验。但是，含有骨髄间充质干细胞的骨髄血只能通过向髂骨中数次刺入粗针这种创伤性方法来采集。另外，骨髄间充质干细胞在体外持续进行传代培养时，会逐渐丧失增殖能力和多向分化能力。此外，基于保证生物体内移植的安全性的高品质管理的骨髄间充质干细胞培养需要CPC(cell processing center，细胞处理中心)等特殊培养设备，因此，现阶段仅能够在极有限的大学、企业中实施。即，为了使饱受难治性组织损伤之苦的全世界的众多患者受益于使用骨髄间充质干细胞的再生医疗，紧迫的课题是用于能够在所有的医疗机构中实施的间充质干细胞再生医疗的技术开发。
HMGB1(High mobility group box 1；高迁移率族蛋白1)在约30年前被鉴定为通过控制核内染色质结构而控制基因表达和DNA修复的非组蛋白染色质蛋白。HMGB1蛋白的结构主要由两个DNA结合域构成，将位于N端侧的DNA结合域称为A-box，将位于C端侧的DNA结合域称为B-box。根据过去的研究，已经明确HMGB1分子内与TLR结合从而引起炎症反应的结构域存在于B-box内。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/053892
专利文献2：WO2007/015546
专利文献3：WO2009/133939
专利文献4：WO2009/133943
专利文献5：WO2009/133940
专利文献6：日本特表2005-537253
非专利文献
非专利文献1：Bustin等,Mol Cell Biol,19:5237-5246,1999年
非专利文献2：Hori等,J.Biol.Chem.,270,25752-25761,1995年
非专利文献3：Wang等,Science,285:248-251,1999年
非专利文献4：Muller等,EMBO J,20:4337-4340,2001年
非专利文献5：Wang等,Science,285:248-251,1999年
非专利文献6：Germani等,J Leukoc Biol.Jan；81(1):41-5,2007年
非专利文献7：Palumbo等,J.Cell Biol.,164:441-449,2004年
非专利文献8：Merenmies等,J.Biol.Chem.,266:16722-16729,1991年
非专利文献9：Wu Y等,Stem cells,25:2648-2659,2007年
非专利文献10：Tamai等,Proc Natl Acad Sci U S A.2011Apr 4.[Epub aheadof print],108:6609-6614,2011年
非专利文献11：Yang等,J Leukoc Biol.Jan；81(1):59-66,2007年
发明内容
发明所要解决的课题
最近，本发明者们为了阐明由于皮肤基底膜区域的粘附分子基因异常而从出生时起全身皮肤剥离、全身呈现热灼伤样症状的遗传性皮肤难治性病“大疱性表皮松解症”中的剥离表皮的再生机制进行研究，通过使用移植有GFP(green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)转基因骨髄细胞的大疱性表皮松解症模型小鼠，弄清楚了：从剥离表皮释放到血中的HMGB1(High mobility group box 1；高迁移率族蛋白1)刺激骨髄中存在的PDGFRα(platelet-derived growth factor receptor alpha，血小板源性生长因子受体α)阳性细胞而将其动员到血中，并诱导其向剥离表皮部聚集；此外，聚集在剥离表皮部的PDGFRα阳性细胞分化成成纤维细胞或表皮细胞从而强力地有助于损伤皮肤的再生。此外，通过使小鼠发生皮肤溃疡或脑梗塞后从尾静脉施用重组HMGB1蛋白，弄清楚了：PDGFRα阳性细胞从骨髄被动员到血中，进而聚集到皮肤溃疡部或脑梗塞部而强力地诱导皮肤溃疡或脑梗塞的再生。已经报道过骨髄内PDGFRα阳性细胞是能够分化成骨、软骨、脂肪以及神经或上皮的间充质干细胞。即，通过施用HMGB1将骨髄内PDGFRα阳性间充质干细胞动员到末梢循环中，能够在不取出到体外进行特殊培养的情况下在生物体内使大量间充质干细胞聚集到损伤组织中。
通过开发HMGB1作为利用生物体内骨髄间充质干细胞血中动员的损伤组织再生诱导药物，使得利用骨髄间充质干细胞的再生诱导医疗能够在所有医疗机构实施。其结果，使上述目前的使用骨髄间充质干细胞的再生医疗所面临的许多课题得以解决。
如上所述，HMGB1药物是促进骨髄间充质干细胞向血中动员以及向损伤组织聚集、诱导体内的组织再生的划时代的治疗药。在本发明者们迄今为止的研究中，即使对小鼠或大鼠施用高浓度的重组HMGB1蛋白，也完全未观察到副作用。另外，合并考虑除表皮剥离以外无严重症状的大疱性表皮松解症患者末梢血中存在极高浓度的HMGB1这一本发明者们的观察事实，可以推测HMGB1施用的安全性高，但也有HMGB1具有炎性作用的报道。由此可见，虽然关于HMGB1已有较多发现，但关于HMGB1蛋白的片段对间充质干细胞的作用和在组织再生中的作用尚未获得任何发现。
解决课题所采用的手段
本发明者们使由HMGB1蛋白的第1位至第84位氨基酸构成的肽、由第85位至第169位氨基酸构成的肽的各重组蛋白分泌到HEK293细胞的培养基中。通过柱层析法对培养基中的各个目标蛋白进行纯化，并确认了对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系(MSC-1)的迁移活性。结果，本发明者们在由第1位至第84位氨基酸构成的肽中确认到了迁移活性。
接着，本发明者们进一步制作了由对MSC-1确认到迁移活性的由第1位至第84位氨基酸构成的肽中的第1位至第44位氨基酸构成的肽、由第45位至第84位氨基酸构成的肽，并分别考察了迁移活性。其结果确认了，制作的任何一个肽片段对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系(MSC-1)均显示出迁移活性。
因此，化学合成了以各片段部分为主且稍有重叠的各种肽片段，并尝试评价了对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系(MSC-1)的迁移活性。其结果，本发明者们成功地鉴定出显示迁移活性的多种肽。
此外，本发明者们还确认了，鉴定出的肽对属于PDGFRα阳性细胞的皮肤成纤维细胞也具有迁移活性并且具有使脑梗塞模型小鼠的脑梗塞灶的大小缩小的效果。
本发明者们在大肠杆菌中使其表达了由HMGB1蛋白的第2位至第84位氨基酸构成的肽、由第89位至第215位氨基酸构成的肽的各重组蛋白。通过柱层析法对表达的蛋白进行纯化，并确认了对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系(MSC-1)和人骨髄间充质干细胞的迁移活性。结果，本发明者们在由第2位至第84位氨基酸构成的肽、由第89位至第215位氨基酸构成的肽中确认到了迁移活性。
接着，本发明者们进一步制作了由对MSC-1和人骨髄间充质干细胞确认到迁移活性的由第2位至第84位氨基酸构成的肽中的第2位至第44位氨基酸构成的肽、由第45位至第84位氨基酸构成的肽，并分别考察了迁移活性。其结果确认了，制作的任何一个肽片段对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系(MSC-1)和人骨髄间充质干细胞均显示出迁移活性。
接着，本发明者们制作了对MSC-1和人骨髄间充质干细胞确认到迁移活性的由第89位至第215位氨基酸构成的肽中将C端逐渐削短而得到的、由第89位至第205位氨基酸构成的肽、由第89位至第195位氨基酸构成的肽、由第89位至第185位氨基酸构成的肽，并分别考察了迁移活性。其结果，制作的肽片段中C端削得越短，对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系(MSC-1)和人骨髄间充质干细胞的迁移活性越增强。
另外，还制作了在由第2位至第84位氨基酸构成的肽上附加有由C端的天冬氨酸、谷氨酸构成的酸性尾巴(Acidic tail)的全部或一部分(10个或20个或30个氨基酸序列)的3种融合肽，令人惊讶的是，可以看出在任何一种情况下第2-84位的肽的迁移活性均极大地减弱。这表明酸性尾巴的全部或一部分在全长HMGB1中抑制性地控制迁移活性。此次，通过片段化弄清楚了至少3处以上的迁移活性结构域，启示了任何一处结构域在全长状态下被酸性尾巴抑制的可能性。
此外，本发明者们确认了鉴定出的肽对皮肤损伤模型具有治疗效果。
基于该发现，本申请提供以下的发明。
[1]一种用于刺激细胞游走的组合物，其含有以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
[2]一种用于将细胞从骨髄动员到末梢血中的组合物，其含有以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
[3]一种用于使组织再生的组合物，其含有以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的组合物，其中，被刺激游走或被从骨髄动员到末梢血中的细胞为PDGFRα阳性细胞。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的组合物，其中，被刺激游走或被从骨髄动员到末梢血中的细胞为干细胞。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的组合物，其中，被刺激游走或被从骨髄动员到末梢血中的细胞为骨髄细胞。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的组合物，其中，被刺激游走或被从骨髄动员到末梢血中的细胞为骨髄间充质干细胞。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的组合物，其中，具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列或第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽。
[9]如[1]～[7]中任一项所述的组合物，其中，具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽为包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[10]如[1]～[7]中任一项所述的组合物，其中，具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列或第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽，并且为包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[11]一种用于刺激细胞游走的组合物，其含有包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[12]一种用于将细胞从骨髄动员到末梢血中的组合物，其含有包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[13]一种用于使组织再生的组合物，其含有包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[14]如[1]～[13]中任一项所述的组合物，其中，肽为合成的肽。
[15]如[1]～[14]中任一项所述的组合物，其中，肽为使用细胞制造的肽。
[16]如[1]～[15]中任一项所述的组合物，其中，肽为附加有标签(tag)的肽
[17]如[1]～[15]中任一项所述的组合物，其中，肽为附加有来源于标签的肽片段的肽。
[18]一种肽，其具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成。
[19]如[18]所述的肽，其为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列或第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽。
[20]如[18]所述的肽，其为包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[21]如[18]所述的肽，其为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列或第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽，并且为包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[22]一种肽，其包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；和
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
[23]如[18]～[22]中任一项所述的肽，其中，肽为合成的肽。
[24]如[18]～[22]中任一项所述的肽，其中，肽为使用细胞制造的肽。
[25]如[18]～[22]中任一项所述的肽，其中，肽为附加有标签的肽。
[26]如[18]～[22]中任一项所述的肽，其中，肽为附加有来源于标签的肽片段的肽。
[27]一种DNA，其编码[18]～[26]中任一项所述的肽。
[28]一种载体，其含有[27]所述的DNA。
[29]一种转化细胞，其含有[27]所述的DNA或[28]所述的载体。
附图说明
图1是表示用于利用HEK293细胞生产肽和蛋白的表达载体的图。
图2A是表示肽对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。将作为阳性对照的全长HMGB1(1-215)、由第1位至第84位氨基酸构成的肽(1-84)、由第85位至第169位氨基酸构成的肽(85-169)、由第1位至第44位氨基酸构成的肽(1-44)、由第45位至第84位氨基酸构成的肽(45-84)进行了比较。这些肽均利用HEK293进行生产。图2B是通过蛋白免疫印迹(western blot)确认人骨髄间充质干细胞有无PDGFRα表达的图。在人的骨髄间充质干细胞中确认到PDGFRα的表达。
图3是表示肽对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。将由HMGB1的第45位至第215位氨基酸构成的肽(45-215)和由第63位至第215位氨基酸构成的肽(63-215)进行了比较。这些肽均利用HEK293进行生产。
图4是从PDGFRα-GFP小鼠采集骨髄细胞、使用贴壁细胞培养皿培养一定时间后、使用MACS将CD11b阳性细胞与CD11b阴性细胞分离并观察各细胞的GFP荧光而得到的照片。
图5是表示HMGB1_1-44肽对骨髄间充质干细胞的原代培养细胞的迁移活性的照片。
图6是表示骨髄间充质干细胞的原代培养细胞(PDGFRα阳性、Lin阴性、c-kit阴性)的骨分化能力(A)、脂肪细胞分化能力(B)的照片。
图7是表示各种合成肽对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。
图8A是表示各种合成肽对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。图8B是将图8A中左下的照片的迁移活性定量化而得到的图。在显微镜下计测向各合成肽和阴性对照游走的细胞数。将以阴性对照的平均值为100时的各值作成图。图8C是表示各种肽对骨髄间充质干细胞(MSC-1)的迁移活性的结果的照片。图中对照片的斑点计测各自的细胞数并取平均值，以相对于阴性对照的百分比的形式表示。
图9是表示各种合成肽对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。
图10是表示各种肽对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片和图。将利用来源于稳定地分泌肽的HEK293细胞、来源于瞬时性转染质粒而分泌肽的HEK293细胞、来源于大肠杆菌的各个合成肽生产系统制造的各HMGB1_1-44肽(1-44)与作为阳性对照的全长HMGB1进行了比较。
图11是对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的PDGFRα、细胞系标记物(Lineagemarker)、CD44进行FACS分析的图。
图12A是表示HMGB1_1-34肽(1-34)对小鼠角化细胞的迁移活性的照片。图12B是PDGFRα-GFP小鼠的皮肤中的角蛋白5的免疫组化图像照片。作为角蛋白5阳性细胞的角化细胞不表达PDGFRα。
图13A是表示HMGB1_1-34肽(1-34)对小鼠皮肤成纤维细胞的迁移活性的照片。图13B是PDGFRα-GFP小鼠的皮肤中的波形蛋白的免疫组化图像照片。属于波形蛋白阳性细胞的皮肤成纤维细胞的一部分表达PDGFRα。
图14是PDGFRα-GFP小鼠的皮肤成纤维细胞和野生型小鼠(C57/Bl6小鼠)的成纤维细胞的FACS分析的图。几乎98％以上的小鼠皮肤成纤维细胞中表达PDGFRα。
图15是利用FACS表示由合成肽(1-44)将PDGFRα阳性CD44阳性细胞动员到血中的图。
图16是施用了合成肽(1-44)和阴性对照PBS的大鼠脑梗塞模型的脑的截面照片。合成肽(1-44)中观察到脑梗塞大小的缩小。
图17是表示施用了合成肽(1-44)和阴性对照PBS的大鼠脑梗塞模型的脑的脑梗塞灶面积相对于右脑面积的比例的图和照片。由同一脑制作4个截面并计测各自的面积。
图18A是在人HMGB1的N端侧附加有6×His标签和TEV蛋白酶剪切序列的图。新制作表达该蛋白的cDNA并插入到大肠杆菌表达载体中。
图18B是表示HMGB1片段对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。这些片段均利用大肠杆菌进行生产。图18C是将HMGB1片段对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性定量并对各活性的平均值作图而得到的图。图18D是将HMGB1片段对PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞系的迁移活性定量并示出平均值的表。
图19中，图A是使用大肠杆菌生产由第89位氨基酸至第215位氨基酸构成的HMGB1片段、将镍亲和纯化物(I：投入物)用阴离子交换柱进一步纯化并将各级分进行SDS-PAGE而得到的照片。M为分子量标记物。在低盐浓度下15.5kDa的片段(*3)被洗脱，随着盐浓度升高，16kDa(*2)、17kDa(*1)的片段依次被洗脱。推测(*3)和(*2)为(*1)的分解产物。图B是表示图A中分级获得的级分对PDGFRα骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。NC为阴性对照，2-215为阳性对照。被认为是剪切片段的分子量最低的片段(*3)与更长的片段(*1)(*2)相比确认到更强的活性。该活性强于2-215。图C是使用大肠杆菌生产由第89位氨基酸至第205位氨基酸构成的HMGB1片段、将镍亲和纯化物用阴离子交换柱进一步纯化并将各级分进行SDS-PAGE而得到的照片。在低盐浓度下最短的片段(*4)被洗脱，随着盐浓度升高，(*5)、(*6)的长片段被洗脱。推测(*5)和(*6)为(*4)的分解产物。此外，将纯化的HMGB1片段89-195、和89-185同时进行SDS-PAGE。M为分子量标记物。图D是表示图C中分级获得的级分对PDGFRα骨髄间充质干细胞系的迁移活性的照片。NC为阴性对照，被认为是剪切片段的分子量最低的(*4)与更长的片段(*5)或(*6)相比确认到更强的活性。另外，在预先使C端进一步缩短而得到的HMGB1片段89-195和89-185中确认到更强的活性。
图20中，图A是表示HMGB1片段85-169的迁移活性的照片。确认到超出作为阳性对照的HMGB1片段2-215的活性。图B是将图A的迁移活性定量化并对平均值作图而得到的图。图C是示出图B的平均值的表。
图21-1中，图A是表示利用大肠杆菌制作的HMGB1的片段2-215、2-205、2-195、2-185对骨髄间充质干细胞的细胞系(MSC-1)的迁移活性的图。图B是表示利用大肠杆菌生产的HMGB1的片段对人骨髄间充质干细胞的迁移活性的照片。
图21-2中，图C是对在纯化的人HMGB1的片段(2-84)上附加有人HMGB1的酸性尾巴片段(186-215)、(186-205)、(186-195)的融合片段“(2-84)+(186-215)、(2-84)+(186-205)、(2-84)+(186-195)”分别进行SDS-PAGE、再使用CBB对电泳凝胶进行蛋白染色而得到的图。可以确认到纯化的各片段。图D是使用纯化的片段确认对MSC-1的迁移活性的图。在2-84的片段上附加有酸性尾巴序列的融合片段均未显示出迁移活性。另一方面，2-84的片段本身显示出迁移活性。
图22是在大鼠背部制作的皮瓣的1周后的照片。PBS为阴性对照组。此外，将利用HEK293细胞生产的包含全长的HMGB1(1-215(HEK))施用组和合成第1位至第44位氨基酸而得到的肽(1-44(合成肽))施用组进行了比较。箭头为坏死的皮肤组织。
图23是在大鼠背部制作的皮瓣的5周后的照片。PBS为阴性对照组。此外，将利用HEK293细胞生产的包含全长的HMGB1(1-215(HEK))施用组和合成第1位至第44位氨基酸而得到的肽(1-44(合成肽))施用组进行了比较。变成红色的部分为皮肤溃疡形成部分。
图24是在大鼠背部制作的皮瓣的7周后的照片。PBS为阴性对照组。此外，将利用HEK293细胞生产的包含全长的HMGB1(1-215(HEK))施用组和合成第1位至第44位氨基酸而得到的肽(1-44(合成肽))施用组进行了比较。
图25是将在大鼠背部制作的皮瓣上产生的创伤部分(坏死部分)的面积定量化而得到的图。皮瓣制作1至3周后，利用HEK293细胞生产的包含全长的HMGB1(1-215(HEK))施用组和合成第1位至第44位氨基酸而得到的肽(1-44(合成肽))施用组与阴性对照组相比，确认到创伤部分的缩小效果。4周后以后，1-44(合成肽)与其他2组相比进一步确认到缩小效果。
图26是从制作皮肤损伤后的大鼠的尾静脉施用化学合成的HMGB1肽(1-44)和(17-25)并示出制作皮肤损伤后2周后、6周后各皮肤损伤部位的面积相对于皮瓣整体的面积的比率(％)的图。
具体实施方式
本发明提供一种用于刺激细胞游走的组合物，其含有以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
本发明的用于刺激细胞游走的组合物包括试剂组合物和药物组合物。本说明书中，试剂组合物也表述为试剂，药物组合物也表述为药物、药剂或药学组合物。
本发明的用于刺激细胞游走的试剂组合物能够作为用于例如再生医疗、再生诱导医疗开发的基础研究和临床研究所需要的试剂使用。例如，通过使用该试剂组合物，将细胞动员到实验动物的生物组织中，从而能够研究组织修复、组织功能重建的程度。另外例如，通过使用该试剂组合物，能够在试管内进行利用细胞动员的组织再生诱导研究。
另外，本发明的用于刺激细胞游走的药物组合物能够作为例如再生医疗、再生诱导医疗中的药物使用。例如，通过使用该药物组合物，能够使组织再生。另外例如，该药物组合物能够作为所谓的预防药物预防由组织干细胞的减少引起的组织、器官功能的降低，或者能够作为抗衰老药物延缓衰老性变化的进展。
另外，本说明书中，用于刺激细胞游走的组合物也表述为用于刺激细胞游走的剂、细胞游走的刺激剂、用于诱导细胞游走的组合物、用于诱导细胞游走的剂、细胞游走的诱导剂或细胞的诱导剂。
本发明中，细胞游走刺激活性是指刺激细胞游走的活性。本说明书中，细胞游走刺激活性也表述为细胞游走诱导活性或细胞诱导活性。
本发明提供一种用于将骨髄细胞从骨髄动员到末梢血中的组合物，其含有以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
本发明的用于将骨髄细胞从骨髄动员到末梢血中的组合物包括试剂组合物和药物组合物。
本发明的用于使组织再生的试剂组合物能够作为用于例如再生医疗、再生诱导医疗开发的基础研究和临床研究所需要的试剂使用。另外，本发明的用于使组织再生的药物组合物能够作为例如再生医疗、再生诱导医疗中的药物使用。例如，通过使用该药物组合物，能够将骨髄组织干细胞动员到末梢循环中，从而使组织再生。另外例如，也可以将利用该药物组合物动员到末梢血中的细胞回收到体外后浓缩并施用于组织来进行治疗。以往的方法中为了从位于体内深部的骨髄回收细胞，对生物体具有侵袭性，但如果使用本发明的药物组合物，则能够低侵袭性地从末梢血回收骨髄细胞并用于骨髄细胞移植等。另外，本说明书中，用于将骨髄细胞从骨髄动员到末梢血中的组合物也表述为用于将骨髄细胞从骨髄诱导到末梢血中的组合物。
本发明提供一种用于使组织再生的组合物，其含有以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
本发明的用于使组织再生的组合物包括试剂组合物和药物组合物。
本发明的用于使组织再生的试剂组合物能够作为用于例如再生医疗、再生诱导医疗开发的基础研究和临床研究所需要的试剂使用。另外，本发明的用于使组织再生的药物组合物能够作为例如再生医疗、再生诱导医疗中的药物使用。
另外，本说明书中，用于使组织再生的组合物也表述为用于诱导或促进组织再生的组合物、用于诱导或促进组织再生的剂、组织再生诱导剂或组织再生促进剂。另外，组织再生也包括组织修复。
本发明的用于使组织再生的组合物不选择施用/添加部位。即，该组合物施用于需要再生的组织、与需要再生的组织不同的组织、血中等任何组织，均能够发挥其效果。例如，通过施用/添加该组合物，将细胞动员到施用/添加部位或其附近的组织内，从而诱导或促进组织再生。另外例如，通过将该组合物施用/添加到损伤组织部位或其附近，将细胞动员到该损伤组织内，从而诱导或促进组织再生。另外例如，通过将该组合物施用/添加到与需要再生的组织不同的组织内，通过末梢循环将骨髄细胞从骨髄动员到需要再生的组织内，从而诱导或促进组织再生。在此，“末梢循环”也称为“血液循环”、“末梢循环血流”。
作为需要再生的组织，可以例示：损伤的组织、坏死的组织、术后组织、功能降低的组织、纤维化的组织、老化的组织、患病的组织等，例如可以例示：生物体皮肤组织、体内活检(手术)组织(脑、肺、心脏、肝脏、胃、小肠、大肠、胰腺、肾脏、膀胱、脾脏、子宫、睾丸、血液等)。
施用到与需要再生的组织不同的组织是指施用到需要再生的部位以外的部位(与需要再生的部位不同的部位)。因此，“与需要再生的组织不同的组织”也可以表述为与需要再生的组织不同的部位、与需要再生的部位不同的部位、与需要再生的组织分隔的部位、与需要再生的部位分隔的部位、位于需要再生的部位的远隔处的部位、位于需要再生的组织的远隔处的组织、远隔部、远隔组织。即，本发明的组合物有效地用于使难以从体外直接施用药剂的组织(脑、心脏等)再生。
动员到需要再生的组织内的细胞分化成各种细胞，从而有助于需要再生的组织的功能性再生和功能维持、功能强化。本发明中，作为需要再生的组织，可以列举：由起因于缺血、慢性缺血/低氧状态的各种病态、外伤、烫伤、炎症、自身免疫、基因异常等所导致损伤的组织，但并不限定于这些原因。
作为本发明中的组织，只要是骨髄来源的细胞能够分化成的组织，则没有特别限制，可以例示例如：皮肤组织、骨组织、软骨组织、肌组织、脂肪组织、心肌组织、神经系统组织、肺组织、消化道组织、肝/胆/胰组织、泌尿/生殖系统等生物体内的所有组织。另外，通过使用上述组合物，不仅能够治疗难治性皮肤溃疡、皮肤创伤、大疱病、脱发症等皮肤疾病，还能够在脑梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃溃疡、肠炎等的需要再生的组织中进行诱导功能性组织再生的治疗。作为施用上述组合物的动物种类，没有特别限制，可以列举：哺乳类、鸟类、魚类等。作为哺乳类，可以例示人或非人动物，例如人、小鼠、大鼠、猿、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠、马、羊、鲸等，但并不限定于这些。
另外，作为与需要再生的组织不同的组织，可以例示：血液组织、肌肉组织、皮下组织、皮内组织、腹腔等。
作为神经组织，可以列举中枢神经组织，但不限于此。另外，用于使神经组织再生的组合物可以用于例如脑梗塞、脑出血、脑挫伤等的治疗，但不限定于这些。另外，用于使骨组织再生的组合物可以用于例如骨折的治疗，但不限于此。另外，用于使皮肤组织再生的组合物可以用于例如皮肤溃疡、手术创口的缝合缺陷、烫伤、切伤、挫伤、皮肤糜烂、擦伤等的治疗，但不限定于这些。
另外，本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举未分化的细胞、处于各种分化阶段的细胞，但不限定于这些。另外，本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举干细胞、非干细胞等，但不限定于这些。干细胞包括循环性的干细胞或非循环性的干细胞。作为非循环性的干细胞，可以例示常驻在组织中的组织干细胞。作为循环性的干细胞，可以例示血中循环性的干细胞。
另外，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举骨髄来源的细胞或造血系干细胞，但不限定于此。本说明书中，“造血系干细胞”为能够分化成中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等白细胞以及红细胞、血小板、肥大细胞、树突细胞等血细胞系细胞的干细胞，作为标记物，已知对于人而言为CD34阳性、CD133阳性，对于小鼠而言为CD34阴性、c-Kit阳性、Sca-1阳性、细胞系标记物阴性。另外，造血系干细胞的特征在于，在培养皿中培养的情况下，难以单独培养，需要与基质细胞共培养。
本说明书中，“骨髄细胞”是指存在于骨髄内的细胞，另一方面，“骨髄来源的细胞”是指从骨髄动员到骨髄外的“骨髄细胞”。“骨髄细胞”包括包含存在于骨髄中的组织前体细胞集团的细胞。另外，“骨髄来源的细胞”可以是包括成血管干细胞(mesoangioblast)的细胞，也可以是除外成血管干细胞的细胞。
组织前体细胞定义为具有向血液系以外的特定组织细胞分化的单向分化能力的未分化细胞，包括具有向上述的间充质系组织、上皮系组织、神经组织、实体器官、血管内皮分化的能力的未分化细胞。
“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”是以造血系干细胞和来源于造血系干细胞的白细胞、红细胞、血小板、成骨细胞、纤维细胞等分化细胞或者迄今为止被称为骨髄间充质干细胞或骨髄间质多能干细胞或骨髄多能干细胞的细胞为代表的干细胞。本说明书中，“骨髄干细胞”是指存在于骨髄内的干细胞，另一方面，“骨髄来源的干细胞”是指从骨髄动员到骨髄外的“骨髄干细胞”。本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举“骨髄来源的干细胞”，但不限定于此。“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”可以通过骨髄采集(骨髄细胞采集)或末梢血采血来分离。造血系干细胞为非贴壁细胞，但“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”的一部分通过由骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血得到的血液中的单核细胞级分细胞培养，能够以贴壁细胞的形式获得。
另外，“骨髄细胞”、“骨髄来源的细胞”包括间充质干细胞，优选具有向成骨细胞(诱导分化时可以通过确认钙的沉积来确定)、软骨细胞(可以通过阿尔新蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来确定)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性来确定)以及成纤维细胞、平滑肌细胞、基质细胞、腱细胞等间充质系细胞以及神经细胞、上皮细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、血管内皮细胞分化的能力。分化后的细胞不限定于上述细胞，也包括向肝脏、肾脏、胰腺等实体器官细胞分化的能力。
本说明书中，“骨髄间充质干细胞”、“骨髄间质多能细胞”、或“骨髄多能干细胞”为存在于骨髄内的细胞，是具有如下特征的细胞：从骨髄中直接采集或从其他组织(血液或皮肤、脂肪、其他组织)间接地采集，能够作为附着到培养皿(塑料或玻璃制)上的贴壁细胞进行培养、增殖，且具有向骨、软骨、脂肪等间充质系组织(间充质干细胞)或骨骼肌、心肌以及神经组织、上皮组织(多能干细胞)分化的能力，是可以通过骨髄细胞采集而获得的细胞。
另外，另一方面，从骨髄动员到骨髄外的“骨髄来源的骨髄间充质干细胞”、“骨髄来源的骨髄间质多能细胞”或“骨髄来源的骨髄多能干细胞”是可以通过末梢血采血以及从脂肪等间充质组织、皮肤等上皮组织、脑等神经组织中采集而获得的细胞。
另外，这些细胞具有如下特征：通过采集后直接施用到生物体的损伤部或者将暂时附着到培养皿上的细胞施用到生物体的损伤部，还具有向例如构成皮肤的角化细胞等上皮系组织、构成脑的神经系的组织分化的能力。
骨髄间充质干细胞、骨髄间质多能干细胞、骨髄多能干细胞、或从骨髄动员到骨髄外的这些细胞优选除了具有向成骨细胞(诱导分化时可以通过确认钙的沉积来确定)、软骨细胞(可以通过阿尔新蓝染色阳性、番红-O染色阳性等来确定)、脂肪细胞(可以通过苏丹III染色阳性来确定)分化的能力外，还具有例如向成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、基质细胞、腱细胞等间充质系细胞、神经细胞、色素细胞、表皮细胞、毛囊细胞(表达细胞角蛋白家族、毛发角蛋白家族等)、上皮系细胞(例如表皮角化细胞、肠道上皮细胞表达细胞角蛋白家族)、内皮细胞以及肝脏、肾脏、胰腺等实体器官细胞分化的能力，但分化后的细胞并不限定于上述细胞。
作为人骨髄细胞、人骨髄来源的细胞，可以例示通过骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血、脂肪采集而获得、能够通过直接培养或在分离单核细胞级分后进行培养而以贴壁细胞的形式获得的细胞，但并不限定于此。作为人骨髄细胞、人骨髄来源的细胞的标记物，可以例示：PDGFRα阳性、Lin阴性、CD45阴性、CD44阳性、CD90阳性、CD29阳性、Flk-1阴性、CD105阳性、CD73阳性、CD90阳性、CD71阳性、Stro-1阳性、CD106阳性、CD166阳性、CD31阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。
另外，作为小鼠骨髄细胞、小鼠骨髄来源的细胞，可以例示通过骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血、脂肪采集而获得、能够通过直接培养或在分离单核细胞级分后进行培养而以贴壁细胞的形式获得的细胞，但并不限定于此。作为小鼠骨髄细胞、小鼠骨髄来源的细胞的标记物，可以例示：CD44阳性、PDGFRα阳性、PDGFRβ阳性、CD45阴性、Lin阴性、Sca-1阳性、c-kit阴性、CD90阳性、CD29阳性、Flk-1阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。
本发明中，作为被刺激游走的细胞或被从骨髄动员到末梢血中的细胞，可以列举PDGFRα阳性细胞，但不限定于此。另外，作为除PDGFRα以外的标记物，可以例示：CD29阳性、CD44阳性、CD90阳性、CD271阳性、CD11b阴性、Flk-1阴性中的全部或一部分，但并不限定于这些。作为PDGFRα阳性细胞，可以例示：作为PDGFRα阳性的骨髄来源的细胞、PDGFRα阳性的骨髄来源的骨髄间充质干细胞、常驻在PDGFRα阳性的组织内的组织细胞(例如可以例示成纤维细胞等)、PDGFRα阳性的骨髄来源的细胞、能够通过由骨髄采集(骨髄细胞采集)、末梢血采血得到的血液中的单核细胞级分细胞培养以贴壁细胞的形式得到的细胞等，但并不限定于这些。
本发明的组合物中，除了含有上述(a)至(c)所述的物质中的至少一种物质以外，也可以含有其他物质。本发明的组合物中，作为上述(a)至(c)所述的物质中的至少一种物质以外的物质，只要不抑制细胞游走刺激活性、细胞动员活性或组织再生促进活性，则没有特别限制。例如，本发明的组合物中，除了含有上述(a)至(c)所述的物质中的至少一种物质，还可以含有强化上述(a)至(c)所述的物质的功能的相关分子(组)、抑制除上述(a)至(c)所述的物质的期望效果以外的作用的分子(组)、控制细胞的增殖和分化的因子、强化/维持这些因子或细胞的功能的其他因子。
作为本发明中的HMGB1蛋白，可以例示：作为人来源的HMGB1蛋白的包含序列号1所示的氨基酸序列的蛋白、作为编码该蛋白的DNA的包含序列号2所示的碱基序列的DNA，但并不限定于这些。
另外，还可以例示：作为小鼠来源的HMGB1蛋白的包含序列号3所示的氨基酸序列的蛋白、作为编码该蛋白的DNA的包含序列号4所示的碱基序列的DNA，但并不限定于这些。
此外，还可以例示：作为大鼠来源的HMGB1蛋白的包含序列号5所示的氨基酸序列的蛋白、作为编码该蛋白的DNA的包含序列号6所示的碱基序列的DNA，但并不限定于这些。
本发明的组合物含有具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽。作为本发明的由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，只要含有具有细胞游走刺激活性的结构域，则没有特别限制。
由HMGB1蛋白的一部分构成的肽的细胞游走刺激活性可以通过例如实施例中记载的方法以及以下所示的方法来确认，但不限定于此，也可以通过其他的试管内或生物体内细胞游走能力测定方法来测定。
·将插入有HMGB1蛋白或肽的硅胶管埋入皮下等，一定时间后取出并确认游走到管内的细胞的方法。
·将HMGB1蛋白或肽结合在树脂微珠等上、埋入生物组织内，一定时间后取出并确认游走到微珠上的细胞的方法。
·在明胶、透明质酸等具有缓释作用的高分子物质内浸渗HMGB1蛋白或肽并埋入生物组织内，一定时间后取出并确认游走到高分子物质上的细胞的方法。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以例示以下的肽，但不限定以下的肽。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举具有将细胞从骨髄动员到末梢血中的活性或组织再生促进活性的肽。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列或第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽。
另外，本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举至少包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(1)第17位至第25位氨基酸序列、
(2)第45位至第74位氨基酸序列、
(3)第55位至第84位氨基酸序列、
(4)第85位至第169位氨基酸序列、
(5)第89位至第185位氨基酸序列、和
(6)第93位至第215位氨基酸序列。
另外，本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列或第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(1)包含第17位至第25位氨基酸序列的肽、
(2)包含第45位至第74位氨基酸序列的肽、
(3)包含第55位至第84位氨基酸序列的肽、
(4)包含第85位至第169位氨基酸序列的肽、和
(5)包含第89位至第185位氨基酸序列的肽。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。作为这样的肽的例子，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自195以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自185以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第170位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自170以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第84位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自84以下的自然数中的氨基酸数)或由第1位至第44位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自44以下的自然数中的氨基酸数)、并且至少包含该氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽，但不限定于此。
以下，对“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”进行记载，对于该肽中包含的“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”等其他肽也可以同样地记载。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”也可以表述为“作为由选自序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列中的连续的氨基酸序列构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由下述(1)～(60)中任一个氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的下述(1)～(57)和(59)～(61)中任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第17位至第25位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括由下述(1)～(61)中任一个氨基酸序列构成且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(1)第1位至第44位氨基酸序列、
(2)第1位至第25位氨基酸序列、
(3)第1位至第34位氨基酸序列、
(4)第1位至第42位氨基酸序列、
(5)第1位至第43位氨基酸序列、
(6)第1位至第45位氨基酸序列、
(7)第1位至第46位氨基酸序列、
(8)第1位至第47位氨基酸序列、
(9)第1位至第48位氨基酸序列、
(10)第1位至第49位氨基酸序列、
(11)第1位至第50位氨基酸序列、
(12)第1位至第51位氨基酸序列、
(13)第1位至第52位氨基酸序列、
(14)第1位至第62位氨基酸序列、
(15)第1位至第84位氨基酸序列、
(16)第10位至第25位氨基酸序列、
(17)第11位至第25位氨基酸序列、
(18)第11位至第27位氨基酸序列、
(19)第11位至第28位氨基酸序列、
(20)第11位至第29位氨基酸序列、
(21)第11位至第30位氨基酸序列、
(22)第11位至第34位氨基酸序列、
(23)第11位至第44位氨基酸序列、
(24)第12位至第25位氨基酸序列、
(25)第12位至第30位氨基酸序列、
(26)第13位至第25位氨基酸序列、
(27)第13位至第30位氨基酸序列、
(28)第14位至第25位氨基酸序列、
(29)第14位至第30位氨基酸序列、
(30)第15位至第25位氨基酸序列、
(31)第15位至第30位氨基酸序列、
(32)第16位至第25位氨基酸序列、
(33)第16位至第30位氨基酸序列、
(34)第17位至第30位氨基酸序列、
(35)第1位至第70位氨基酸序列、
(36)第1位至第81位氨基酸序列、
(37)第1位至第170位氨基酸序列、
(38)第2位至第25位氨基酸序列、
(39)第2位至第34位氨基酸序列、
(40)第2位至第42位氨基酸序列、
(41)第2位至第43位氨基酸序列、
(42)第2位至第44位氨基酸序列、
(43)第2位至第45位氨基酸序列、
(44)第2位至第46位氨基酸序列、
(45)第2位至第47位氨基酸序列、
(46)第2位至第48位氨基酸序列、
(47)第2位至第49位氨基酸序列、
(48)第2位至第50位氨基酸序列、
(49)第2位至第51位氨基酸序列、
(50)第2位至第52位氨基酸序列、
(51)第2位至第62位氨基酸序列、
(52)第2位至第70位氨基酸序列、
(53)第2位至第81位氨基酸序列、
(54)第2位至第84位氨基酸序列、
(55)第2位至第170位氨基酸序列、
(56)第17位至第44位氨基酸序列、
(57)第1位至第185位氨基酸序列、
(58)第1位至第195位氨基酸序列、
(59)第2位至第185位氨基酸序列、
(60)第2位至第195位氨基酸序列、和
(61)第17位至第25位氨基酸序列。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。作为这样的肽的例子，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自195以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自185以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第170位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自170以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第84位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自84以下的自然数中的氨基酸数)或由第45位至第84位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自40以下的自然数中的氨基酸数)、并且至少包含该氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽，但不限定于此。
以下，对“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”进行记载，对于该肽中包含的“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”等其他肽也可以同样地记载。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”也可以表述为“作为由选自序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列中的连续的氨基酸序列构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由下述(a)～(k)中任一个氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的下述(a)～(h)和(j)～(l)中任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第45位至第74位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括由下述(a)～(l)中任一个氨基酸序列构成且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(a)第1位至第84位氨基酸序列、
(b)第45位至第84位氨基酸序列、
(c)第1位至第81位氨基酸序列、
(d)第1位至第170位氨基酸序列、
(e)第2位至第81位氨基酸序列、
(f)第2位至第84位氨基酸序列、
(g)第2位至第170位氨基酸序列、
(h)第1位至第185位氨基酸序列、
(i)第1位至第195位氨基酸序列、
(j)第2位至第185位氨基酸序列、
(k)第2位至第195位氨基酸序列、和
(l)第45位至第74位氨基酸序列。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
作为这样的肽的例子，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自195以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自185以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第170位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自170以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第84位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自84以下的自然数中的氨基酸数)或由第45位至第84位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自40以下的自然数中的氨基酸数)、并且至少包含该氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽，但不限定于此。
以下，对“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”进行记载，对于该肽中包含的“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”等其他肽也可以同样地记载。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”也可以表述为“作为由选自序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列中的连续的氨基酸序列构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由下述(A)～(J)中任一个氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的下述(A)～(G)和(I)～(K)中任一个氨基酸序列具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第55位至第84位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括由下述(A)～(K)中任一个氨基酸序列构成且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(A)第1位至第84位氨基酸序列、
(B)第45位至第84位氨基酸序列、
(C)第1位至第170位氨基酸序列、
(D)第2位至第84位氨基酸序列、
(F)包含第2位至第170位氨基酸序列的肽、
(G)第1位至第185位氨基酸序列、
(H)第1位至第195位氨基酸序列、
(I)第2位至第185位氨基酸序列、
(J)第2位至第195位氨基酸序列、和
(K)第55位至第84位氨基酸序列。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
作为这样的肽的例子，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自195以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自185以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第170位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自170以下的自然数中的氨基酸数)或由第89位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自101以下的自然数中的氨基酸数)、并且至少包含该氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽，但不限定于此。
以下，对“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”进行记载，对于该肽中包含的“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”等其他肽也可以同样地记载。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”也可以表述为“作为由选自序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列中的连续的氨基酸序列构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由下述(i)～(vi)中任一个氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的下述(i)～(iii)和(v)～(vii)中任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第85位至第169位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括由含下述(i)～(vii)中任一个氨基酸序列构成且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(i)第1位至第170位氨基酸序列、
(ii)第2位至第170位氨基酸序列、
(iii)第1位至第185位氨基酸序列、
(iv)第1位至第195位氨基酸序列、
(v)第2位至第185位氨基酸序列、
(vi)第2位至第195位氨基酸序列、和
(vii)第85位至第169位。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。作为这样的肽的例子，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自195以下的自然数中的氨基酸数)、由第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自185以下的自然数中的氨基酸数)、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽，但不限定于此。
以下，对“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”进行记载，对于该肽中包含的“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第185位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”等其他肽也可以同样地记载。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”也可以表述为“作为由选自序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列中的连续的氨基酸序列构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由下述(i)～(vi)中任一个氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的下述(I)和(III)～(V)中任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第185位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括由下述(I)～(V)中任一个氨基酸序列构成且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(I)第1位至第185位氨基酸序列、
(II)第1位至第195位氨基酸序列、
(III)第2位至第185位氨基酸序列、
(IV)第2位至第195位氨基酸序列、和
(V)第89位至第185位氨基酸序列。
本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分构成且具有细胞游走刺激活性的肽、并且包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第93位至第215位氨基酸序列的肽。
作为这样的肽的例子，可以列举：作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第45位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自171以下的自然数中的氨基酸数)、由第63位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自153以下的自然数中的氨基酸数)、或由第89位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽(该肽的氨基酸数为选自123以下的自然数中的氨基酸数)、并且至少包含该氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽，但不限定于此。
以下，对“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”进行记载，对于该肽中包含的“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第63位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第89位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”等其他肽也可以同样地记载。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”也可以表述为“作为由选自序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第215位氨基酸序列中的连续的氨基酸序列构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由下述(W)～(Y)中任一个氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的下述(X)～(Z)中任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。
本发明中，“作为由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第215位氨基酸序列的全部或一部分构成的肽、并且至少包含该氨基酸序列中第93位至第215位氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽”包括由下述(W)～(Z)中任一个氨基酸序列构成且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，以下的氨基酸序列为序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分。
(W)包含第45位至第215位氨基酸序列的肽、
(X)包含第63位至第215位氨基酸序列的肽、
(Y)包含第89位至第215位氨基酸序列的肽、和
(Z)包含第93位至第215位氨基酸序列的肽。
即，本发明中，作为具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽，可以例示如下的肽，但不限定于这些。
<1>包含第1位至第44位氨基酸序列的肽、
<2>包含第1位至第25位氨基酸序列的肽、
<3>包含第1位至第34位氨基酸序列的肽、
<4>包含第1位至第42位氨基酸序列的肽、
<5>包含第1位至第43位氨基酸序列的肽、
<6>包含第1位至第45位氨基酸序列的肽、
<7>包含第1位至第46位氨基酸序列的肽、
<8>包含第1位至第47位氨基酸序列的肽、
<9>包含第1位至第48位氨基酸序列的肽、
<10>包含第1位至第49位氨基酸序列的肽、
<11>包含第1位至第50位氨基酸序列的肽、
<12>包含第1位至第51位氨基酸序列的肽、
<13>包含第1位至第52位氨基酸序列的肽、
<14>包含第1位至第62位氨基酸序列的肽、
<15>包含第1位至第84位氨基酸序列的肽、
<16>包含第10位至第25位氨基酸序列的肽、
<17>包含第11位至第25位氨基酸序列的肽、
<18>包含第11位至第27位氨基酸序列的肽、
<19>包含第11位至第28位氨基酸序列的肽、
<20>包含第11位至第29位氨基酸序列的肽、
<21>包含第11位至第30位氨基酸序列的肽、
<22>包含第11位至第34位氨基酸序列的肽、
<23>包含第11位至第44位氨基酸序列的肽、
<24>包含第12位至第25位氨基酸序列的肽、
<25>包含第12位至第30位氨基酸序列的肽、
<26>包含第13位至第25位氨基酸序列的肽、
<27>包含第13位至第30位氨基酸序列的肽、
<28>包含第14位至第25位氨基酸序列的肽、
<29>包含第14位至第30位氨基酸序列的肽、
<30>包含第15位至第25位氨基酸序列的肽、
<31>包含第15位至第30位氨基酸序列的肽、
<32>包含第16位至第25位氨基酸序列的肽、
<33>包含第16位至第30位氨基酸序列的肽、
<34>包含第17位至第25位氨基酸序列的肽、
<35>包含第17位至第30位氨基酸序列的肽、
<36>包含第45位至第74位氨基酸序列的肽、
<37>包含第45位至第84位氨基酸序列的肽、
<38>包含第45位至第215位氨基酸序列的肽、
<39>包含第55位至第84位氨基酸序列的肽、
<40>包含第63位至第215位氨基酸序列的肽、
<41>包含第1位至第70位氨基酸序列的肽、
<42>包含第1位至第81位氨基酸序列的肽、
<43>包含第1位至第170位氨基酸序列的肽、
<44>包含第2位至第25位氨基酸序列的肽、
<45>包含第2位至第34位氨基酸序列的肽、
<46>包含第2位至第42位氨基酸序列的肽、
<47>包含第2位至第43位氨基酸序列的肽、
<48>包含第2位至第44位氨基酸序列的肽、
<49>包含第2位至第45位氨基酸序列的肽、
<50>包含第2位至第46位氨基酸序列的肽、
<51>包含第2位至第47位氨基酸序列的肽、
<52>包含第2位至第48位氨基酸序列的肽、
<53>包含第2位至第49位氨基酸序列的肽、
<54>包含第2位至第50位氨基酸序列的肽、
<55>包含第2位至第51位氨基酸序列的肽、
<56>包含第2位至第52位氨基酸序列的肽、
<57>包含第2位至第62位氨基酸序列的肽、
<58>包含第2位至第70位氨基酸序列的肽、
<59>包含第2位至第81位氨基酸序列的肽、
<60>包含第2位至第84位氨基酸序列的肽、
<61>包含第2位至第170位氨基酸序列的肽、
<62>包含第85位至第169位氨基酸序列的肽、
<63>包含第89位至第185位氨基酸序列的肽、
<64>包含第89位至第195位氨基酸序列的肽、
<65>包含第89位至第205位氨基酸序列的肽、
(66)包含第89位至第215位氨基酸序列的肽、
<67>包含第93位至第215位氨基酸序列的肽、
<68>包含第17位至第44位氨基酸序列的肽、
<69>包含第1位至第185位氨基酸序列的肽、
<70>包含第1位至第195位氨基酸序列的肽、
<71>包含第1位至第205位氨基酸序列的肽、
<72>包含第2位至第185位氨基酸序列的肽、
<73>包含第2位至第195位氨基酸序列的肽、和
<74>包含第2位至第205位氨基酸序列的肽。
此外，本发明中，还可以例示如下规定的肽作为具有细胞游走刺激活性的肽：
作为包含序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列的一部分且具有细胞游走刺激活性的肽、并且满足以下条件的肽：从上述<1>至<74>的组中选择2个肽，将短的肽记为A、将长的肽记为B，在此，至少包含A且由B的全部或一部分构成的肽。
另外，本发明还提供至少包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽及其用途。这样的肽包括例如对以下任一个氨基酸序列添加了1个或多个(例如可以列举200个以下、100个以下、50个以下、40个以下、30个以下、20个以下、10个以下、5个以下、3个以下、2个以下，但不限定于这些)氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽。另外，至少包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽不包括由序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列构成的肽。
[1]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列、
[2]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列、
[3]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列、
[4]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列、和
[5]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
小鼠、大鼠和人的HMGB1的第1位至第85位氨基酸序列作为A-box而已知，第86位至第169位氨基酸序列作为B-box而已知。小鼠、大鼠和人的第1位至第169位氨基酸序列全部一致，具有100％同源性。另外，小鼠、大鼠和人的HMGB2中，第14位至第25位氨基酸序列也与HMGB1一致。
本发明提供上述的具有细胞游走刺激活性的肽。另外，本发明提供编码该肽的DNA、插入有该DNA的载体和导入有该载体的转化细胞。本发明的编码肽的DNA、插入有该DNA的载体和导入有该载体的转化细胞使用公知的技术制作。上述DNA只要编码本发明的肽，则也可以为例如人工合成的DNA(例如简并突变体)。
本发明还提供属于本发明的肽且使用细胞制造的肽、属于本发明的肽且人工合成的肽。本发明的肽可以通过将编码该肽的DNA重组到适当的表达系统中而以基因重组体(recombinant)的形式得到，或者也可以人工地合成。为了通过基因工程的方法得到本发明的肽，可以将编码该肽的DNA重组到适当的表达系统中并使其表达。
因此，本发明提供本发明的肽的制造方法，其包含以下(a)和(b)的工序：
(a)将编码本发明的肽的DNA导入细胞中并使该肽进行表达的工序、
(b)从细胞中回收该肽的工序。
另外，本发明提供具有比HMGB1蛋白高的细胞游走刺激活性的本发明的肽的制造方法，其包含以下(a)和(b)的工序：
(a)将编码本发明的肽的DNA导入细胞中并使该肽进行表达的工序、和
(b)从细胞中回收该肽的工序。
该制造方法可以进一步包括如下工序。
(c)选择具有比HMGB1蛋白高的细胞游走刺激活性的该肽的工序。
作为本发明中能够应用的宿主，可以列举原核生物的细胞、真核生物的细胞，但不限定于这些。另外，作为本发明中能够应用的宿主，还可以列举：细菌(例如大肠杆菌)、酵母、动物细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞等哺乳动物细胞、蚕细胞等昆虫细胞)、植物细胞等，但不限定于这些。
作为本发明中能够应用的宿主/载体系统，可以示出例如表达载体pGEX和大肠杆菌。pGEX能够使外来基因以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的形式进行表达(Gene,67:31-40,1988)，因此，通过热休克将重组有编码本发明的肽的DNA的pGEX导入BL21等大肠杆菌株中，在适当的培养时间后，添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)而诱导GST融合肽的表达。本发明的GST会吸附到谷胱甘肽琼脂糖4B上，因此，表达产物可以通过亲和层析容易地分离、纯化。
除此之外，作为用于得到本发明的肽的基因重组体的宿主/载体系统，可以应用如下所述的宿主/载体系统。首先，在利用细菌作为宿主的情况下，市场上有售利用标签等的融合蛋白的表达用载体。另外，本发明的基因重组体也包括附加有标签或其一部分肽的状态的基因重组体。
作为附加在本发明的肽上的标签，只要对本发明的肽的活性没有影响，则没有特别限制，可以列举例如：组氨酸标签(例如6×His、10×His)、HA标签、FLAG标签、GST标签、T7-标签、HSV-标签、E-标签、lck标签、B-标签等。
酵母中，毕赤酵母(Pichia)属酵母对于具备糖链的蛋白的表达有效是公知的。在糖链的附加这一点上，利用以昆虫细胞为宿主的杆状病毒载体的表达系统也是有用的(Bio/Technology,6:47-55,1988)。此外，利用哺乳动物的细胞，进行利用CMV、RSV或SV40等启动子的载体的转染，这些宿主/载体系统均可以作为本发明的肽的表达系统使用。另外，还可以利用质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒包膜载体、乳头瘤病毒载体等病毒载体来导入基因，但并不限定于这些。该载体中可以包含高效地诱导基因表达的启动子DNA序列、控制基因表达的因子、为了维持DNA的稳定性而需要的分子。
所得到的本发明的蛋白可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，纯化为实质上纯粹且均匀的蛋白。蛋白的分离、纯化使用通常的蛋白的纯化中使用的分离、纯化方法即可，没有任何限定。可以适当选择并组合例如层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等而对蛋白进行分离、纯化。
作为层析，可以列举例如：亲和层析、离子交换层析、疏水性层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Marshak et al.,Strategies for Protein Purification andCharacterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Cold Spring HarborLaboratory Press,1996)。这些层析可以使用液相层析例如HPLC、FPLC等液相层析进行。
另外，本发明的肽优选为实质上纯化的肽。在此，“实质上纯化”是指本发明的肽的纯化度(本发明的肽在全部蛋白成分中的比例)为50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％或接近100％。接近100％的上限依赖于本领域技术人员的纯化技术、分析技术，例如为99.999％、99.99％、99.9％、99％等。
另外，只要具有上述的纯化度，则无论是通过何种纯化方法纯化的蛋白，均包含在实质上纯化的蛋白内。例如，可以例示通过适当选择或组合上述的层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等而得到的实质上纯化的蛋白，但并不限定于这些。
作为本发明中的分泌本发明的肽的细胞，也可以通过将在编码该肽的DNA上结合有编码分泌信号的DNA(例如ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTCTGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC；序列号10)的DNA插入到公知的表达载体或基因治疗用载体中来制作载体，然后将该载体导入成纤维细胞(例如正常皮肤成纤维细胞及来源于该细胞的细胞系)等哺乳类细胞、昆虫细胞以及其他细胞中来制作所述细胞。作为编码分泌信号的DNA，可以例示具有上述序列的DNA，但不限于此。另外，这些细胞所来源的动物种没有特别限制，优选使用施用载体的对象动物种的细胞、对象自身的细胞或来源于与施用载体的对象具有亲缘关系的动物的细胞。
另一方面，也可以人工地合成由HMGB1的一部分构成的肽。本发明中的肽合成法中，可以通过肽液相合成法和肽固相合成法中的任何一种方法对肽进行化学合成。本发明中，优选通过肽固相合成法合成的肽。肽固相合成法是化学合成肽时通常使用的方法之一。使用表面用氨基修饰的直径约0.1mm的聚苯乙烯高分子凝胶的微珠等作为固相，利用脱水反应在其上逐个氨基酸地延长氨基酸链。形成目标肽的序列后，从固相表面切下，得到目标物质。通过固相合成法，还能够进行难以在细菌中合成的核糖体肽的合成以及D型异构体、重原子取代体等非天然氨基酸的导入、肽和蛋白主链的修饰等。固相法中，在合成70个至超过100个的长肽链的情况下，可以通过使用自然化学连接法使2个肽链结合而进行合成。
本发明的组合物的施用方法可以列举经口施用或非经口施用，作为非经口施用方法，具体而言，可以列举注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等，但不限定于这些。作为注射施用的例子，例如可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等将本发明的组合物施用于全身或局部(例如皮下、皮内、皮肤表面、眼球或眼睑结膜、鼻腔粘膜、口腔内和消化道粘膜、阴道/子宫内粘膜或损伤部位等)。
另外，作为本发明的组合物的施用方法，可以例示例如：血管内施用(动脉内施用、静脉内施用等)、血液内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、腹腔内施用，但不限定于这些。
另外，对施用部位没有限制，可以例示：需要再生的组织部位或其附近、与需要再生的组织不同的部位或与需要再生的组织远隔且为不同部位的部位。可以列举例如血中(动脉内、静脉内等)、肌肉、皮下、皮内、腹腔内，但不限定于这些。
另外，可以根据患者的年龄、症状适当选择施用方法。在施用本发明的肽的情况下，可以在例如1次施用以每1kg体重计为0.0000001mg至1000mg的范围内选择施用量。或者，可以在例如每一位患者为0.00001至100000mg/body的范围内选择施用量。在施用分泌本发明的肽的细胞或插入有编码该肽的DNA的基因治疗用载体的情况下，也可以以使该肽的量在上述范围内的方式施用。但是，本发明的药物组合物并不限定于这些施用量。
本发明的药物组合物可以按照常规方法制成制剂(例如Remington’sPharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)，可以同时含有药物上容许的载体、添加物。可以列举例如：表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、助悬剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但不限定于这些，可以适当使用其他常用的载体。具体而言，可以列举：轻质硅酸酐、乳糖、微晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
另外，本发明还提供含有以下(a)至(c)中任一项所述的物质的试剂盒。
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
该试剂盒能够用于刺激细胞游走、将骨髄细胞从骨髄动员到末梢血中或者使组织再生。作为该试剂盒，可以例示：包含(1)溶解在纤维蛋白原中的上述物质和(2)凝血酶的试剂盒或包含(1)上述物质、(2)纤维蛋白原和(3)凝血酶的试剂盒。本发明中，可以使用市售的纤维蛋白原、凝血酶。可以列举例如：Fibrinogen HT-Wf(Benesis-Mitsubishi Pharma)、Beriplast(ZLB Behring)、Tisseel(Baxter)、Bolheal(化血研)、TachoComb(ZLBBehring)，但并不限定于这些。
另外，具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽、分泌该肽的细胞、插入有编码该肽的DNA的载体的用途也可以表述为以下(1)～(9)项。
(1)一种刺激细胞游走的方法，其包含施用有效量的以下(a)至(c)中任一项所述的物质的工序：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(2)一种将细胞从骨髄动员到末梢血中的方法，其包含施用有效量的以下(a)至(c)中任一项所述的物质的工序：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(3)一种使组织再生的方法，其包含施用有效量的以下(a)至(c)中任一项所述的物质的工序：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(4)以下(a)至(c)中任一项所述的物质在制造用于刺激细胞游走的组合物中的应用：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(5)以下(a)至(c)中任一项所述的物质在制造用于将细胞从骨髄动员到末梢血中的组合物中的应用：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(6)以下(a)至(c)中任一项所述的物质在制造用于使组织再生的组合物中的应用：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(7)用于在刺激细胞游走的方法中使用的以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(8)用于在将细胞从骨髄动员到末梢血中的方法中使用的以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
(9)用于在使组织再生的方法中使用的以下(a)至(c)中任一项所述的物质：
(a)具有细胞游走刺激活性且由HMGB1蛋白的一部分构成的肽；
(b)分泌(a)所述的肽的细胞；
(c)插入有编码(a)所述的肽的DNA的载体。
另外，关于至少包含以下任一个氨基酸序列且具有细胞游走刺激活性的肽的用途，也可以换成与上述同样的表述。
[1]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第17位至第25位氨基酸序列、
[2]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第74位氨基酸序列、
[3]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列、
[4]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列、和
[5]序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列。
另外，本说明书中引用的所有现有技术文献作为参考并入本说明书中。
通过以下的实施例对本发明进行进一步例示，但并不限定于下述的实施例。
实施例1
利用了HEK293的HMGB1和HMGB1来源的肽的纯化
使用Trizol(invitrogen)从新生小鼠皮肤中提取RNA，使用SuperScript IIIcDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。以该cDNA为模板，使用PCR(聚合酶链式反应)法扩增HMGB1的cDNA。将该cDNA插入到用于在哺乳类细胞中表达蛋白的质粒载体pCAGGS中(图1)，以使其表达附加有作为分泌信号的IgGκ链信号序列、为了进行纯化而在氨基酸序列的N端附加有HA标签、GST标签和6×His标签的序列的蛋白。此外，在His标签与目标蛋白和肽之间插入用HRV3C剪切得到的序列。HRV3C剪切后，在目标蛋白和肽的N端侧附加Gly Pro GlyThy Gln(序列号7)的肽片段。另外，对于全长HMGB1和肽的cDNA，使用PCR法附加限制性酶切位点，并插入到载体的KpnI和EcoRI部分中。
使用聚乙烯亚胺(PEI)将上述中制作的pCAGGS表达载体转染到人胚肾细胞来源的HEK293培养细胞系中，48小时后回收细胞和培养上清。将细胞和培养上清在4℃下进行4400g×5分钟的离心，将上清与细胞分离并分别回收。使回收的上清进一步在具有直径为0.8μm的孔的乙酸纤维素过滤器中通过，接着，使其在具有0.45μm的孔的硝酸纤维素过滤器中通过，由此制备除去不溶级分后的样品。将该样品插入到用含有50mM NaCl的pH为8.0的50mM Tris HCl(50mL)平衡后的5mL HisTrap FF(GE)中，将吸附成分进一步用含有10mM咪唑的pH为8.0的50mM NaCl 50mM Tris HCl洗涤，将非特异性吸附成分除去。用含有100mM咪唑的pH为8.0的50mM NaCl 50mM Tris HCl将特异性吸附成分从柱上洗脱。吸附级分以500μL/管分别分级到硅包覆的塑料管中，并将含有蛋白的级分合并。然后，使用脱盐柱PD10(GE)将咪唑除去，使用pH为7.5的50mM Tris HCl、150mM NaCl洗脱。向洗脱的样品中添加HRV3C(Novagen)，在4℃反应8小时。切掉标签后，使样品结合到用pH为7.5的50mM Tris HCl、150mM NaCl平衡后的1mL的HiTrap肝素柱(GE)上，用pH为7.5的50mM Tris HCl、150mM NaCl洗涤柱内部后，用pH为7.5的50mM Tris HCl、1000mM NaCl将结合蛋白或肽洗脱。
迁移分析
使用胰蛋白酶通过4℃、1200rpm、10分钟的离心从培养皿中回收小鼠骨髄间充质干细胞系(MSC-1细胞、大阪大学玉井等人制作(PDGFRα-positive cells in bone marroware mobilized by high mobility group box 1(HMGB1)to regenerate injuredepithelia.(tamai et.al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2011Apr 4.)))。将团块打散，加入含10％FBS(Fetal bovine serum，胎牛血清)的D-MEM(Dulbecco’s Modified EagleMedium，杜尔贝科改良的伊格尔培养基)并混悬以使细胞浓度为2.0～3.0×106个/ml。将利用HEK293生产的重组蛋白和肽稀释到含10％FBS的D-MEM中。作为阴性对照，使用PBS(Phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲生理盐水)。使用丙烯酸树脂制博伊登室(Boyden chamber)，向上层中加入调节成3×106个/ml的小鼠骨髄间充质干细胞系，向下层中加入稀释后的蛋白或肽。更详细而言，向48孔趋化小室(NEURO PROBE 48孔趋化小室)的底板孔中各加入28μl蛋白或肽溶解液，在底板上放置8μm孔的聚碳酸酯膜(Neuro Probe,Inc，目录号：866-417-0014)，再放置上板并用螺钉紧固地固定。向上板孔中加入50μl完成细胞浓度调节后的小鼠骨髄间充质干细胞系。将小室在37℃、5％CO2的培养箱内静置。4小时后回收小室的膜，使用Diff-Quik(Sysmex，目录号：16920)通过染色检测穿过膜的孔向下层迁移的细胞。
结果
对小鼠全长HMGB1(1-215)和第1位至第84位的肽(1-84)、第85位至第169位的肽(85-169)、第1位至第44位的肽(1-44)、第45位至第84位的肽(45-84)以及阴性对照(PBS)有无迁移活性进行了确认。蛋白和肽分别以50μg/ml的浓度使用。85-169未检测到迁移活性，但其他的1-215、1-84、1-44、45-84显示出迁移活性(图2)。
此外，分别以5、15、25μg/ml的浓度使用第45位至第215位的肽(45-215)、第63位至第215位的肽(63-215)，对迁移活性进行了确认(图3)。
讨论
小鼠、大鼠和人的HMGB1(分别为序列号3、5和1)中，第1位至第85位氨基酸序列作为A-box而已知，第86位至第169位氨基酸序列作为B-box而已知。小鼠、大鼠和人的第1位至第185位氨基酸序列全部一致，具有100％同源性。第186位至第215位氨基酸序列为谷氨酸和天冬氨酸的重复序列，在小鼠与大鼠中100％一致，与人仅有2个氨基酸不同。85-169未检测到迁移活性，认为该片段不具有活性或者活性在此次的实验条件下低于检测限。另一方面，1-84、1-44、45-84均确认到良好的迁移活性，因此，推测在第1位至第44位氨基酸序列之间和在第45位至第84位氨基酸序列之间的至少两处存在具有迁移活性的结构域。已知HMGB1使树突细胞等细胞发生迁移，认为是通过HMGB1刺激称为RAGE的受体而诱发的。已知HMGB1中存在的RAGE结合域存在于与第150位至第181位氨基酸相当的部分。此次令人惊讶的是，使骨髄间充质干细胞迁移的结构域是与RAGE结合域不同的部位，并且至少发现了2处。
45-215、63-215均确认到浓度依赖性的迁移活性。另外，与63-215相比，45-215确认到更强的活性。因此，推测在至少第63位至第84位氨基酸之间存在1处具有迁移活性的结构域。此外，以下的使用HEK293生产的肽也显示出对骨髄间充质干细胞系MSC-1的迁移活性：
包含第1位至第42位氨基酸序列的肽(1-42)、
包含第1位至第43位氨基酸序列的肽(1-43)、
包含第1位至45位氨基酸序列的肽(1-45)、
包含第1位至第46位氨基酸序列的肽(1-46)、
包含第1位至第47位氨基酸序列的肽(1-47)、
包含第1位至第48位氨基酸序列的肽(1-48)、
包含第1位至第49位氨基酸序列的肽(1-49)、
包含第1位至第50位氨基酸序列的肽(1-50)、
包含第1位至第51位氨基酸序列的肽(1-51)、
包含第1位至第52位氨基酸序列的肽(1-52)、
包含第1位至第62位氨基酸序列的肽(1-62)。
实施例2
原代培养PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞的分选和迁移活性的确认
从供体小鼠B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J(PDGFRα-GFP小鼠)上切下股骨和胫骨，去除附着在周围的肌肉及其他组织后，将骨细细破碎，在0.2％胶原酶(Roche，参考号：10103586001)DMEM、2％FBS(filtrated)中在37℃下反应40分钟。从40μm尼龙筛网中通过，进一步将细胞块和肌肉组织除去。以1200rpm离心10分钟，悬浮到含有10％FBS、1％P/S的αMEM培养液中，在37℃、5％CO2培养箱中培养至100％铺满。回收细胞，依照CD11b微珠(Miltenyi Biotec，订购号：130-049-601)附带的操作规程进行以下的实验。将细胞用PBS(-)调节至107个/90μl，每107个细胞各加入10μl CD11b微珠，在4℃下反应15分钟。然后，洗涤2次并混悬到500μl PBS(-)中。将管设置在AutoMACS分选仪上，通过“Depletes”分离程序回收细胞。将回收的细胞接种到贴壁细胞用培养皿中，贴壁后使用荧光显微镜观察GFP的荧光。使用CD11b阴性细胞，考察上述的利用HEK293生产的肽1-44的迁移活性。肽以40μg/ml的浓度使用。
结果
CD11b阳性细胞中几乎未见到PDGFRαGFP细胞，CD11b阴性细胞中确认到多数PDGFRαGFP细胞(图4)。另外，使用HEK293生产的1-44的肽对CD11b阴性、PDGFRα阳性的细胞显示出强迁移活性(图5)。
讨论
认为CD11b阴性、PDGFRα阳性的细胞中包含大量作为骨髄中的多能干细胞之一的骨髄间充质干细胞。认为1-44的肽除了对建系得到的骨髄间充质干细胞系具有迁移活性，对原代培养的骨髄间充质干细胞也具有迁移活性。
人骨髄间充质干细胞中的PDGFRα蛋白的表达的确认
方法
使用人间充质干细胞专用完全合成培养基试剂盒(MSCGM-CD(tm)Bullet试剂盒(tm))(Takarabio株式会社，产品编号B0632)，依照产品手册对人间充质干细胞(hMSC，human Mesenchymal Stem Cell)(Takarabio株式会社，产品编号PT034)进行培养。实验中使用的细胞至少使用传代5次以内的细胞。
为了用于蛋白免疫印迹，回收约5×107个细胞并悬浮到1mL的PBS中。向细胞悬浮液中加入200μL 6×SDS-PAGE上样缓冲液，在95℃下加热5分钟。作为阳性对照，将表达大鼠PDGFRα的大肠杆菌(JM109)的菌体裂解液用上样缓冲液溶解后使用。此外，在7.5％SDS-PAGE凝胶中进行20μL样品和作为分子量标记物的精确分子量双色预染标准品(Bio-Rad(目录号：161-0374)的电泳。电泳结束后回收凝胶，按照常规方法转印到PVDF膜上。将转印有样品的PVDF膜用含有0.1％Tween20(PBS-T)的2％脱脂乳在室温下浸泡1小时而进行封闭。使用PBS-T洗涤附着在膜上的多余的脱脂乳。将作为一次抗体的PDGFRA兔抗人多克隆抗体(Lifespan Bioscience(目录号：LS-C9640)3000倍稀释到含PBS-T的2％脱脂乳中使其溶解，对进行封闭后的膜进行1小时的浸泡。再将膜在PBS-T中浸泡10分钟，总计进行3次洗涤。将作为二次抗体的抗兔IgG、HRP-Linked Whole Ab Donkey(驴HRP偶联的全抗体，GEhealthcare，目录号：NA934)15000倍稀释到含PBS-T的2％脱脂乳中，使膜浸泡1小时。再将膜在PBS-T中浸泡10分钟，总计进行3次洗涤。依照产品手册使用ECL Prime(GE healthcare(目录号：RPN2232)，检测PDGFRα的条带。
结果
作为阳性对照的利用大肠杆菌生产的大鼠PDGFRα在约170kDa的大小确认到条带。另一方面，人骨髄间充质干细胞的PDGFRα在分子量稍大的位置被检测到(图2B)。
讨论
通过蛋白免疫印迹，不仅在小鼠中检测到PDGFRα蛋白的表达，在人的骨髄间充质干细胞中也检测到PDGFRα蛋白的表达。与利用大肠杆菌生产的大鼠PDGFRα相比，大小看起来稍大，认为这可能是由于糖链等的修饰导致的。PDGFRα在人体内也能够在骨髄间充质干细胞中确认到表达。
实施例3
<原代培养PDGFRα阳性骨髄间充质干细胞的多能性的确认>
PDGFRα阳性、Lineage阴性、c-kit阴性细胞的FACS分选
使用异氟烷对C57Bl6小鼠(6周龄、雄性)充分实施深度麻醉，使其吸入二氧化碳而安乐死。取出股骨和胫骨，切除脂肪和肌肉组织，浸泡在EtOH中而将附着在骨上的组织充分去除。使用带有26G针头的注射器取出骨髄组织。向取出的骨髄细胞中加入含有0.2％胶原酶A的DMEM，在37℃下孵育40分钟。加入10％FBS DMEM，使用离心机以1500rpm的速度进行10分钟的离心。弃去上清而回收沉淀的骨髄细胞。
接种到直径10cm的培养皿中，使用5％CO2、37℃的培养箱在含10％FBS的DMEM、1×链霉素-青霉素中培养。每3天更换新的培养基。弃掉附着的细胞的培养基，向细胞中加入10ml的PBS洗涤2次。加入0.25％胰蛋白酶5ml，在37℃下孵育10分钟。回收从培养皿上剥脱的细胞，加入含有10％FBS的DMEM，使胰蛋白酶的反应终止。将细胞用离心机以1200rpm的速度离心3分钟，回收沉淀的细胞。将1×106回收的细胞稀释到100μl含有2％FBS的PBS中并分注到圆底96孔的各孔中。每孔各加入10μl作为一次抗体的APC-小鼠细胞系抗体混合物(BDPhamingen，目录号558074)，分别向各孔中加入PE-小鼠CD140a(PDGFRa)(BD Bioscience，目录号12-1401-81)、FITC-小鼠c-kit(BD Bioscience)各1μl，在4℃下避光反应20分钟。向各孔中各加入200μl含有2％FBS的PBS，使用离心机以1500rpm的速度离心10分钟后弃去上清。再同样地将细胞洗涤2次。对于细胞，使用BD FACSAria细胞分选仪进行细胞的分选。
骨分化诱导
在细胞达到70％铺满的状态下，每2～3天更换成骨分化培养基(Osteogenicdifferentiation培养基，R&D，用SC010对培养基进行了调节)。在37℃、5％CO2培养箱中培养。持续培养约3周。
ALP染色
将骨分化诱导后的细胞用试剂盒的固定液(预先由固定准备液制备)固定10秒钟。使用用固蓝RR盐(Fast Blue RR Salt)和底物原液制作的底物液(武藤化学，目录号1568-2)在37℃下染色3分钟。ALP阳性细胞着色成蓝紫色。
脂肪分化诱导
在细胞达到100％铺满的状态下，每3～4天更换成脂分化培养基(R&D，用SC010对培养基进行了调节)。在37℃、5％CO2培养箱中培养。持续培养约2周。
Oil Red染色
将脂肪分化诱导后的细胞用试剂盒附带的丙二醇固定液固定，然后，使用油红O溶液(oil red O solution，DBS，项目号KT 025)进行脂肪细胞的染色。
结果
在骨分化诱导后的细胞中确认到染成蓝紫色的细胞，表明向成骨细胞分化(图6A)。在脂肪分化诱导下，确认到染成红色的脂肪细胞的油滴，表明向脂肪细胞分化(图6B)。
讨论
认为骨髄中的PDGFRα阳性细胞中至少含有能够进行骨分化、脂肪分化的骨髄间充质干细胞。
实施例4
合成肽的迁移活性的确认
委托MBL(株式会社医学生物学研究所)通过固相法合成以下的肽。另外，基于小鼠HMGB1的序列(序列号3)对肽进行合成。以下的实施例中的合成肽也同样基于小鼠HMGB1的序列来制作。
由HMGB1的第1位至第10位氨基酸序列构成的合成肽(1-10)、
由第1位至第34位氨基酸序列构成的合成肽(1-34)、
由第37位至第62位氨基酸序列构成的合成肽(37-62)、
由第27位至第62位氨基酸序列构成的合成肽(27-62)、
由第56位至第72位氨基酸序列构成的合成肽(56-72)、
由第11位至第20位氨基酸序列构成的合成肽(11-20)、
由第11位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(11-25)、
由第11位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(11-30)、
由第11位至第34位氨基酸序列构成的合成肽(11-34)、
由第11位至第44位氨基酸序列构成的合成肽(11-44)、
由第17位至第44位氨基酸序列构成的合成肽(17-44)、
由第1位至第25位氨基酸序列的合成肽(1-25)，以及
作为阳性对照，将利用HEK293生产的小鼠全长HMGB1(1-215(HEK))调节成100μg/ml，加入到趋化小室的下层中，研究对骨髄间充质干细胞系(MSC-1)的迁移活性。
结果
至少在合成肽(11-34)、(1-34)、(11-44)、(1-44)、(11-30)中确认到与阳性对照同等程度以上的活性(图7)。另外，在合成肽(11-25)、(1-25)中也确认到活性(图7)。
讨论
由实施例1的结果推测，第1位至第44位氨基酸序列、第45位至第84位氨基酸中，各自存在至少1处的迁移活性部分。由此次实施例4的结果可知，合成肽(11-34)也具有强迁移活性，从而推测至少在第11位至第34位氨基酸序列中具有活性中心。另外，虽然合成肽(11-25)的活性稍弱但也确认到活性，推测第11位至第25位氨基酸序列中具有活性中心部分，其前后的氨基酸序列为增强活性的序列。
实施例5
方法
为了进一步确定活性中心部分，如下合成短肽。
由HMGB1的第11位至第27位氨基酸序列构成的合成肽(11-27)、
由第11位至第28位氨基酸序列构成的合成肽(11-28)、
由第11位至第29位氨基酸序列构成的合成肽(11-29)、
由第12位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(12-30)、
由第13位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(13-30)、
由第14位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(14-30)、
由第15位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(15-30)、
由第16位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(16-30)、
由第17位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(17-30)、
由第18位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(18-30)、
由第19位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(19-30)、
由第20位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(20-30)、
由第21位至第30位氨基酸序列构成的合成肽(21-30)、
由第10位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(10-25)、
由第11位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(11-25)、
由第12位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(12-25)、
由第13位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(13-25)、
由第14位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(14-25)、
由第15位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(15-25)、
由第16位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(16-25)、
由第17位至第25位氨基酸序列构成的合成肽(17-25)、
由第186位至第215位氨基酸序列构成的合成肽(186-215)。
作为阳性对照，使用将1日龄小鼠皮肤(1只的量)浸泡在PBS中并在4℃下孵育12小时后的离心上清(皮肤提取液，skin extract)和利用HEK293生产的小鼠全长HMGB 1(HMGB1(HEK_1-215))。向趋化小室的上层中加入骨髄间充质干细胞系(MSC-1)，这些蛋白、合成肽以5μM或10μM的浓度插入到趋化小室的下层中。迁移分析通过与实施例1同样的方法实施。
结果
至少5μM浓度的合成肽(11-27)、(11-28)、(11-29)、(12-30)、(13-30)、(14-30)、(10-25)确认到强迁移活性。另外，合成肽(11-25)、(12-25)、(13-25)、(14-25)、(15-25)、(15-30)、(16-25)、(16-30)、(17-25)、(17-30)确认到弱活性(图8A、图8B)。
讨论
由实施例4的结果推测，在第11位至第25位氨基酸序列中存在具有迁移活性的结构域，因此，认为具有迁移活性的结构域中的一处存在于第17位氨基酸至第25位氨基酸之间(9个氨基酸)。
各HMGB1片段对骨髄间充质干细胞的迁移活性的比较
方法
将由HMGB1的片段构成的合成肽15-30、16-30、17-30、17-44、45-74、55-84各自对骨髄间充质干细胞(MSC-1)的迁移活性的强度与阴性对照(PBS)进行比较。与上述同样地实施博伊登室法。肽分别以10μM插入到小室的下层中。使1.5×106个细胞扩散到1mL含10％FBS的DMEM中并插入到小室的上层中。在上层与下层之间插入具有直径为8μm的孔的聚碳酸酯膜。在37℃、5％CO2的培养箱中孵育4小时后，将膜回收并通过迪夫快速染色(Diff-Quikstain(商标))仅对移动到下层侧的细胞进行染色。染色后风干，利用显微镜计测移动到下层侧的细胞数并计算平均值。
结果
任何一种肽与阴性对照相比均确认到强迁移活性。
讨论
与使用HEK293、大肠杆菌等细菌的制造方法相比，合成肽较为廉价且能够确保稳定的产量，此外，在制造能够预防生物来源的毒素等的污染等药品方面是非常优良的制造方法。另一方面，由于与生物体内的生成不同，不能准确地进行翻译后修饰、折叠，因此，由疏水性高的氨基酸构成的低分子肽对水溶液常常变得极为难溶。本实施例中，也为迁移活性比较弱的肽，因此，使用显微镜准确地检测了相对于阴性对照的活性的强弱。任何一种肽与阴性对照相比均检测到强迁移活性(图8C)。
实施例6
合成肽的迁移活性的确认
与实施例5同样地使用趋化小室对实施例4中使用的合成肽(1-44)、(1-34)、由第45位氨基酸至第74位氨基酸构成的肽(45-74)、由第55位氨基酸至第84位氨基酸构成的肽(55-84)实施迁移分析。分别以10μM和5μM两种浓度同时进行。
结果
虽然迁移活性比合成肽(1-44)、(1-34)弱，但合成肽(45-74)、合成肽(55-84)也确认到迁移活性(图9)。
讨论
在实施例1的结果中，对于利用HEK293生产的肽(1-84)、(1-44)、(45-84)确认到对PDGFRα阳性间充质干细胞的强迁移活性。由实施例4的结果表明，就合成肽而言，在合成肽(1-44)、(1-34)中也保留了强活性。另一方面，在此次的实施例6的结果中，虽然合成肽(45-74)、(55-84)的迁移活性稍稍减弱，但同样确认到迁移活性。
已知在HEK293等真核生物的细胞中合成肽或蛋白时，进行糖链修饰等修饰。而合成的肽不进行修饰。与第45位至第84位氨基酸序列的合成肽“(45-74)和(55-84)”的迁移活性相比，利用HEK293生产的肽(45-84)的迁移活性强，这启示受到了某种修饰的可能性。
另外，在迄今为止使用成血管干细胞的以往的实验(Palumbo等、J.Cell Biol.、164:441-449、2004年)中显示，HMGB1(全长215个氨基酸)对细胞的迁移活性在由切断C端后的第1位至第187位氨基酸构成的序列中保留，但在由第1位至第89位氨基酸构成的序列、第90位至第176位的序列和第1位至第176位的序列中均几乎消失。另外，作为已知为HMGB1的受体之一的RAGE的配体的推测部位为由第150位至第181位氨基酸构成的序列，上述的文献中显示，通过RAGE的显性失活也使迁移活性被抑制。另外，另一报道(Yang等、J LeukocBiol.Jan；81(1):59-66、2007年)中显示，HMGB1使树突细胞迁移时也利用了RAGE受体，迄今为止，关于HMGB1的迁移活性，作为RAGE的配体部分的HMGB1的C端侧的肽受到关注。
本实施例中，成功地在作为迄今为止认为不具有细胞迁移活性的部分的N端侧的肽中鉴定出了2处迁移活性部位。已知过度的炎症在组织再生中成为抑制因子。此次发现的活性部分是与RAGE的配体完全不同的部分，因此，能够避免在动员树突细胞等炎症系细胞的同时动员PDGFRα阳性的干细胞，从而推测能够开发副作用更少的药品。
实施例7
肽(1-44)与全长HMGB1的迁移活性的定量比较
与实施例1同样地使用聚乙烯亚胺将小鼠HMGB1(1-44)表达载体转染到HEK293细胞中，回收分泌到细胞上清中的HMGB1并纯化(HEK293瞬时转染)。另外，同样地进行转染后，向培养液中添加2μg/ml的嘌呤霉素，对稳定地分泌HMGB1(1-44)的细胞进行药剂筛选。对分泌到该细胞上清中的HMGB1进行纯化(HMGB1稳定转染)。
利用大肠杆菌的HMGB1来源的肽的生产
为了利用大肠杆菌制作第1位氨基酸至第44位氨基酸的肽，将附加在用HRV3C剪切后的编码小鼠HMGB1的第1位氨基酸至第44位氨基酸的cDNA的N端侧的、表达嵌合肽的cDNA插入到pENTR载体(invitrogen公司制造)中。进行LR反应，对pDEST17载体进行重组。该表达载体具有T7启动子，能够在大肠杆菌中表达蛋白。另外，在N端侧附加6×His标签。HRV3C剪切后切除6×His标签，在肽的N端侧附加Gly Pro Gly Thy Gln(序列号7)的肽片段。
通过电穿孔法将上述表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。加入SOC培养基，在37℃下利用摇床进行60分钟的培养。接种到含有羧苄青霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下孵育18小时。采集单一菌落并加入含有羧苄青霉素的LB培养基，在37℃下利用摇床进行培养。O.D.600达到0.4-0.5后，以终浓度为0.1mM的方式加入IPTG，之后在30℃下振荡。6小时后回收大肠杆菌，以3500rpm进行30分钟离心，回收沉淀的大肠杆菌。向大肠杆菌中加入pH为8.0的含有6M尿素、50mM NaCl的50mM Tris HCl，进行吹吸、溶菌。插入到用pH为8.0的含有6M尿素、50mM NaCl的50mM Tris HCl平衡后的5mL HisTrap FF(GE)中，再用pH为8.0的含有6M尿素、10mM咪唑的50mM NaCl 50mM Tris HCl洗涤吸附成分，将非特异性吸附成分除去。用pH为8.0的含有6M尿素、300mM咪唑的50mM NaCl 50mM Tris HCl将特异性吸附成分从柱上洗脱。吸附级分以500μL/管分别分级到硅包覆的塑料管中，并将含有蛋白的级分合并。然后，使用脱盐柱PD10(GE)将咪唑除去，使用pH为7.5的50mM Tris HCl、150mM NaCl洗脱。向洗脱的样品中添加HRV3C(Novagen)，在4℃反应8小时。切掉标签后，对样品使用以pH为7.5的50mM Tris HCl、150mM NaCl平衡后的1mL HisTrap FF柱，回收作为非结合级分的肽。
关于合成肽(1-44)，准备与上述相同的肽。以2μM的浓度使用这些肽和蛋白，进行对骨髄间充质干细胞系(MSC-1)的迁移分析。使用图像分析软件计测趋化小室的孔的面积和迁移的细胞的面积。
结果
等摩尔的情况下，相对于全长HMGB1，利用HEK293产生的肽(1-44)、利用大肠杆菌产生的肽(1-44)均显示出约1.6倍高的迁移活性。等质量的情况下，相对于全长HMGB1，利用HEK293产生的肽(1-44)、利用大肠杆菌产生的肽(1-44)均显示出约8倍高的迁移活性。合成肽(1-44)相对于全长HMGB1在等摩尔时显示出0.57倍高的迁移活性，在等质量的情况下显示出2.86倍高的迁移活性(图10)。
讨论
由实施例1和实施例6等可以认为，迁移活性的中心在第1位至第44位氨基酸序列和第45位至第84位氨基酸序列中分别至少存在1处以上，整体上存在2处以上的活性部位。此外，此次实施例7的结果显示，等质量的情况下，利用HEK293生产的肽(1-44)与全长HMGB1相比具有近8倍的迁移活性(等摩尔时为约1.6倍)。此外，利用HEK293生产的肽(45-84)也具有同等的迁移活性(图2)。由以上可知，HMGB1中，至少在第1位至第44位氨基酸序列、第45位至第84位氨基酸序列这2处存在具有超过等摩尔量的全长HMGB1的迁移活性的部位，但全长HMGB1的活性与这2处的活性之和相比极弱。由全长HMGB1的晶体分析的结果推测，第1位至第44位的肽与第45位至第84位的肽彼此相邻，因此可能会抑制相互的活性。认为通过制成肽、解除了抑制而使各自的活性增强。
实施例8
骨髄间充质干细胞系(MSC-1)的PDGFRα、细胞系(Lineage)标记物、CD44的表达 FACS分析
将小鼠来源的骨髄间充质干细胞系MSC-1接种到直径为10cm的培养皿中，在含有10％FBS、1×链霉素-青霉素的DMEM中使用5％CO2、37℃的培养箱进行培养。增殖到80-90％铺满后，弃去培养基，向细胞中加入10ml的PBS，洗涤2次。加入5ml 0.25％胰蛋白酶，在37℃下孵育10分钟。回收从培养皿上剥脱的细胞，加入含有10％FBS的DMEM，使胰蛋白酶的反应终止。将细胞用离心机以1200rpm的速度离心3分钟，回收沉淀的细胞。将1×106回收的细胞稀释到100μl含有2％FBS的PBS中并分注到圆底96孔的各孔中。每孔各加入10μl作为一次抗体的APC-小鼠细胞系抗体混合物(APC-mouse Lineage antibody cocktail，BDPhamingen，目录号558074)，分别向各孔中加入PE-小鼠CD140a(PDGFRa)(BD Bioscience，目录号12-1401-81)、FITC-小鼠CD44(BD Bioscience，目录号553-133)各1μl，在4℃下避光反应20分钟。向各孔中各加入200μl含有2％FBS的PBS，使用离心机以1500rpm的速度离心10分钟，弃去上清。再同样地将细胞洗涤2次。将细胞悬浮到100μl PBS中，使用BDFACSCantTMII进行分析。
结果
骨髄间充质干细胞系(MSC-1)为PDGFRα阳性、Lineage阴性、CD44阳性(图11)。
讨论
迁移活性中使用的所述细胞保持了PDGFRα阳性的骨髄间充质干细胞的性质。
实施例9
合成肽(1-34)对小鼠角化细胞的迁移活性
利用异氟烷和二氧化碳吸入对C57/Bl6新生小鼠实施安乐死后，用EtOH、PBS充分洗涤。连同真皮将皮肤剥离，用PBS冲洗血液。将剥离的皮肤在分散酶I(三光纯药，目录号：GD81060)中在4℃下静置16小时。用镊子剥离表皮与真皮，将表皮在胰蛋白酶(Nacalaitesque，目录号：3554-64)中在37℃下静置10分钟。开始白浊后，用S-MEM(GIBCO，目录号：11380)15％FBS(Ca-)P/S终止反应，以160×G离心5分钟。悬浮到CnT-07培养基(CELLnTEC，目录号：CnT-07BM)中，并接种到10cm培养皿中。在5％CO2、37℃下培养，每3天更换培养基，在80～90％铺满时进行传代。使用胰蛋白酶从培养皿中回收细胞，用含有10％FBS的D-MEM使胰蛋白酶失活。然后，按照上述的迁移分析法考察由第1位至第34位氨基酸序列构成的合成肽(1-34)的迁移活性。
小鼠角化细胞的PDGFRα的表达
用4％PFA对B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J新生小鼠进行灌流固定。切下1.0×1.0cm2的新生小鼠皮肤，在4℃下以4％PFA、12小时+30％蔗糖、12小时进一步进行浸润固定。用PBS(-)洗涤，在OTC化合物(OTC compound)中冷冻包埋。使用冷冻切片机切出8μm的冷冻切片。用PBS洗涤2次，冲洗化合物，用10％山羊血清PBS在室温下封闭1小时。一次抗体使用以10％山羊血清PBS稀释500倍的兔抗-角蛋白5(Covance，目录号：PRB-160P)或兔抗-波形蛋白(Abcam，目录号：ab7783-500)，在4℃下孵育5小时。然后，用PBS洗涤2次。二次抗体使用以10％山羊血清PBS稀释500倍的Alexa Fluor 546山羊抗-兔IgG(H+L)(Invitrogen，目录号：A11035)，在室温下孵育45分钟。然后，用PBS洗涤2次。用2μg/ml的DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)在室温下孵育3分钟。再用PBS洗涤2次，加上含有防荧光体淬灭剂(fluorescence antifade)的封固剂(mounting medium)进行密封。
结果
合成肽(1-34)对小鼠角化细胞未显示出迁移活性(图12A)。另外，在作为小鼠角化细胞标记物的角蛋白5阳性细胞中也未观察到GFP的荧光(图12B)。
讨论
角化细胞不表达PDGFRα。另外，合成肽(1-34)对角化细胞不具有迁移活性。
实施例10
合成肽(1-34)对小鼠皮肤成纤维细胞的迁移活性
利用异氟烷和二氧化碳吸入对C57/Bl6新生小鼠安乐死后，用EtOH、PBS充分洗涤。连同真皮将皮肤剥离，用PBS冲洗血液。将剥离的皮肤用剪刀充分切碎。将切碎的皮肤放入0.2％胶原酶(Roche，参考号：10103586001)DMEM(Nacalai tesque，目录号：08458-45)中，在37℃下振荡30分钟。用DMEM30％FBS/P/S终止反应，以160×G离心5分钟。接种到10cm培养皿中。在5％CO2、37℃下培养，每3天更换培养基，在80～90％铺满时进行传代。使用胰蛋白酶从培养皿中回收细胞，用含有10％FBS的D-MEM使胰蛋白酶失活后，按照上述的迁移分析法考察由第1位至第34位氨基酸序列构成的合成肽(1-34)的迁移活性。
用4％PFA对B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J新生小鼠进行灌流固定。切下1.0×1.0cm2的新生小鼠皮肤，在4℃下以4％PFA、12小时+30％蔗糖进一步进行浸润固定。用PBS(-)洗涤，在OTC化合物中冷冻包埋。使用冷冻切片机切出8μm的冷冻切片。用PBS洗涤2次，冲洗化合物，用10％山羊血清PBS在室温下封闭1小时。一次抗体使用以10％山羊血清PBS稀释500倍的兔抗-波形蛋白(Abcam，目录号：ab7783-500)，在4℃下孵育5小时。然后，用PBS洗涤2次。二次抗体使用以10％山羊血清PBS稀释500倍的Alexa Fluor 546山羊抗-兔IgG(H+L)(Invitrogen，目录号：A11035)，在室温下孵育45分钟。然后，用PBS洗涤2次，用2μg/ml的DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)在室温下孵育3分钟。再用PBS洗涤2次，加上含有防荧光体淬灭剂的封固剂进行密封。
结果
合成肽(1-34)对皮肤成纤维细胞显示出迁移活性(图13A)。另外，在作为成纤维细胞标记物的波形蛋白阳性细胞中观察到GFP的荧光为阳性的细胞(图13B)。
讨论
皮肤成纤维细胞表达PDGFRα。合成肽(1-34)对皮肤成纤维细胞具有迁移活性。骨髄间充质干细胞和新生皮肤成纤维细胞均为PDGFRα阳性，肽(1-34)对两者均具有迁移活性，属于PDGFRα阴性细胞的角化细胞未显示出迁移活性。推测作为含有肽(1-34)的氨基酸序列显示出迁移活性的细胞的标记物，PDGFRα是有用的。
实施例11
利用FACS的小鼠皮肤成纤维细胞中的PDGFRα的表达确认
将B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J新生小鼠用EtOH、PBS充分洗涤。从肌肉上剥离皮肤，制成3mm宽的细片。转移到放有500单位/ml的分散酶的5％FBS-DMEM中，在4℃下孵育18小时。剥离真皮与表皮，将真皮用剪刀充分切碎。将细细切碎的真皮放入含有0.2％胶原酶的DMEM中，在37℃的温浴中振荡30分钟。添加含有30％FBS的DMEM，使用离心机以160×G离心5分钟。将沉淀的细胞接种到10cm培养皿中。在5％CO2、37℃下培养，每3天更换培养基，在80～90％铺满时进行传代。使用胰蛋白酶从培养皿中回收细胞，添加含有10％FBS的D-MEM后，离心回收细胞。使用BD FACSCantTMII检测细胞的GFP荧光并进行分析。
结果
新生小鼠皮肤的成纤维细胞的98％以上为PDGFRα阳性(图14)。
讨论
使用FACS对PDGFRα阳性细胞数进行定量。与免疫组化的结果同样，大部分的成纤维细胞显示为PDGFRα阳性细胞。
实施例12
方法
将10μg的合成肽(第1位氨基酸至第44位氨基酸)稀释到200μl的PBS中，使用带30G针头的注射器从C57Bl6小鼠(8周龄、雌性)的尾静脉施用。对阴性对照施用同量的PBS。12小时后在利用异氟烷的全身麻醉下从左心室采集末梢血液。加入3ml的PBS(Nacalai tesque，目录号14249-95)后，层叠3ml的Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare，目录号17-1440-02)。使用离心机以400G在25℃下进行45分钟的离心。弃去上层的血清，仅回收中间层的看起来为白色条带的细胞。向回收的细胞中加入45ml PBS，使用离心机以800G在25℃下进行20分钟的离心。弃去上清，加入10ml PBS，使用离心机以1500rpm的速度在25℃下进行10分钟的离心。弃去上清，加入1ml HLB(溶血用缓冲液)(免疫生物研究所公司制造)，吹吸后静置5分钟。加入10ml的PBS，以1500rpm的速度在25℃下进行10分钟的离心。回收沉淀的单核细胞。将回收的单核细胞在圆底96孔板中调节到1×106个/100μl(含2％FBS的PBS)。向分别装有单核细胞的孔中各加入1μl PE-小鼠CD140a(PDGFRα)(BD Bioscience，目录号12-1401-81)或FITC-小鼠CD44(BD Bioscience，目录号553-133)，避光在4℃下孵育20分钟。各加入200μl PBS，以1500rpm的速度在4℃下进行10分钟的离心。弃去上清，再次各加入200μl PBS，以1500rpm的速度在4℃下进行10分钟的离心。将细胞悬浮到100μl PBS中后，加入300μl 1％甲醛。另外，使用同型对照用抗体同样地制作对照。使用FACSCantTMII对上述中制备的细胞进行分析。
结果
阴性对照组(PBS施用组)中，末梢血中的PDGFRα阳性且CD44阳性细胞的比例为平均1.33％，与此相对，肽(1-44)施用组中增加到平均4.33％(图15)。
讨论
合成HMGB1的第1位氨基酸至第44位氨基酸的肽，施用到小鼠的静脉内，结果12小时后PDGFRα阳性且CD44阳性的细胞增加。实施例8中确认到在体外对作为PDGFRα阳性且CD44阳性的骨髄间充质干细胞的迁移活性。本实施例中显示出在体内也将PDGFRα阳性且CD44阳性的细胞动员到末梢血中。PDGFRα阳性和CD44阳性均为骨髄间充质干细胞的标记物。已知骨髄间充质干细胞对再生医疗有效，期待本发明肽的静脉内施用对损伤组织的治疗有效。
实施例13
大脑中动脉线栓模型的制作
使用8-10周龄雄性Wister大鼠。在用带体温监测器的发热垫保温的同时利用异氟烷对大鼠实施吸入麻醉。确认充分的麻醉效果后，除去颈部的毛使皮肤露出，对手术部进行酒精消毒。用手术刀切开颈部正中线上的皮肤。结扎右颈外动脉，对右颈总动脉加压使血流暂时中止后，从右颈外动脉向右颈内动脉插入4号尼龙单丝的末端用硅包覆而得到的线栓。放松颈总动脉的压力使血流流过，线栓从颈内动脉前进到大脑中动脉分支部而将血流阻断。此外，结扎系在右颈总动脉上的线而将血流完全阻断50分钟。拔出线栓并松开总颈动脉的线后，缝合皮肤从而结束手术。
治疗药的施用
从尾静脉施用50μg合成肽(1-44)。初次施用在脑梗塞制作后6小时，之后，以24小时的间隔总计投药5回(总计5天)。
脑梗塞大小的确认
在距最终药剂施用14天后对大鼠进行充分深的麻醉，然后，在充满二氧化碳的容器内确认心脏搏动和呼吸的停止。将脑取出，迅速浸泡到10％缓冲福尔马林中进行固定。石蜡包埋后切成薄切片，进行苏木精-伊红染色。在前囟前方1.92mm(1.92)、0.60mm(0.60)和后方1.56mm(-1.56)、3.24mm(-3.24)对各脑制作4片切片，并对面积进行比较。
结果
施用合成肽(1-44)的组(N＝10)中梗塞灶扩大到皮质的只有1只，其余的9只局限于基底核(图16A1(距前囟前方1.92mm)、B1(距前囟前方0.60mm)、C1(距前囟后方1.56mm)、D1(距前囟后方3.24mm))，与此相对，阴性对照组(N＝11)中有8只梗塞灶从基底核扩大到皮质(图16A2(距前囟前方1.92mm)、B2(距前囟前方0.60mm)、C2(距前囟后方1.56mm)、D2(距前囟后方3.24mm))。另外，对制作的4个部位的切片分别测定右脑的脑梗塞部分的面积，计测相对于右脑正常脑面积的百分比。任何一个切片中合成肽施用组的梗塞面积与阴性对照组相比均显著缩小(图17)。
讨论
近年来，在脑梗塞患者中，也有通过静脉内施用自身的骨髄间充质干细胞而改善治疗预后的报道，骨髄内的细胞对脑梗塞的治疗效果逐渐变得明确。另外，通过啮齿类的实验已知骨髄间充质干细胞会分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，而且明确还会分化成上皮细胞、神经细胞等各种细胞。另外，由于骨髄细胞分化成各种生长因子、细胞增殖因子，因此，还可以期待移动到梗塞部的骨髄细胞分泌的物质的神经保护作用。
另外，在大鼠中，已知到缺血48小时后为止脑的脑梗塞大小大致确定为梗塞的大小的80％至90％，在之后的7天内逐渐扩大。另外，已知一旦发生缺血时，存在无论有无治疗都必然发生坏死的称为中心区的部分和通过治疗可能避免坏死的称为半暗带(penumbra)的部分，脑梗塞的治疗的目标在于在梗塞扩大以前使半暗带不会坏死。
大脑主要分为基底核、大脑皮质，特别是基底核比大脑皮质更不耐受低氧，因此脑梗塞时最易受到损害。本结果中，合成肽(1-44)引起的梗塞灶的缩小也主要见于皮质，基底核几乎都发生了坏死。大脑皮质是感觉、运动的中枢，改善这些功能对于脑梗塞治疗后的社会康复极为重要，从脑梗塞的有效治疗药少的现状考虑，对于本发明肽作为药品的必要性有高期待。
本实验中，在脑梗塞制作6小时后进行肽的施用，19天后确认到脑梗塞大小的缩小效果。推测治疗效果缘于骨髄细胞的神经保护作用和分化成神经组织等引起的组织再生。实验强烈地启示：由HMGB1的一部分构成的肽不仅在施用到损伤部位或其附近的情况下能够将细胞动员到损伤部位，而且在施用到与损伤部位远隔且不同部位的静脉内的情况下也能够将细胞动员到损伤部位。另外，实施例4、5、6的肽中，存在迁移活性弱因而看起来检测不到活性的肽，认为这些肽的一部分的活性在本分析方法的检测限以下。通过优化溶解肽的溶剂、迁移活性测定时间、插入小室上层的细胞数，可能会检测出活性。目前，关于脑梗塞的治疗中使用的药品tPA，为了防止梗塞后出血等副作用，严格地规定了必须在脑梗塞发病后4小时以内施用、必须进行影像诊断的判定等的施用基准。由于脑梗塞突发性地发病，因此难以预先推测发病。因此，多数发生脑梗塞的人到医疗机构就诊时已经超过时间限制，大多不适合应用tPA。而本实施例中，通过脑梗塞制作6小时后的施用得到了治疗效果，认为本发明肽不具有抗凝活性，因此在6小时之后也能施用，推测可应用于发生脑梗塞的多数人。另外，本实施例中，对1只大鼠(约250g/个体)以50μg/次进行施用，相当于每千克体重200μg。认为作为经静脉施用于发生脑梗塞的患者的量是适当的量。
实施例14
HMGB1片段的表达载体制作、蛋白/肽的表达、骨髄间充质干细胞的迁移分析方法
删除人HMGB1的N端侧的蛋氨酸(M)，取而代之附加了MKHHHHHHENLYFQ(序列号11)。HHHHHH(序列号12)是用于使用镍柱对表达的蛋白或肽进行纯化的标签(6×His标签)，ENLYFQG(序列号13)是TEV蛋白酶识别的序列(图18A)。另外，构建在T7启动子、lac操纵子的下游插入编码目标蛋白或肽(2-215、2-84、2-44、45-84、2-62、2-70、2-81、2-170、93-215、85-169)的cDNA、此外药剂抗性基因使用卡那霉素抗性基因、复制起点使用pBR322 ori、f1ori的载体。将使用该表达载体制作的蛋白或肽用TEV蛋白酶切除时，能够制作从第2位氨基酸开始的人HMGB1的蛋白或肽。使用制作的质粒转化BL-21(DE3)。将在含有卡那霉素的LB培养基中、在37℃下振荡培养过夜后的菌液5ml转移到100ml的LB培养基中，在37℃下以140rpm振荡培养。使用浊度计测定浊度，达到OD0.5～0.7后以使终浓度为1mM的方式添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。对于2-215、2-84、2-70、2-81、2-170、93-215、85-169，在37℃下振荡培养5小时后集菌，对于2-44、45-84、2-62，在15℃下振荡培养过夜后集菌。进行SDS-PAGE后，通过蛋白染色和利用标签或抗HMGB1抗体的蛋白免疫印迹进行表达的蛋白、肽的确认。
各HMGB1片段的纯化(2-215、2-84、2-44、45-84、2-62、2-70、2-81、2-170、93-215)
向集菌得到的菌体中加入3ml平衡缓冲液(PBS(137mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4)、10mM咪唑；pH为7.4)，进行超声波裂解。在4℃下以15000rpm进行10分钟的离心分离，回收上清。向Micro Bio-Spin柱(Bio-Rad公司)中填充1ml His-Pur(商标)Ni-NTA树脂(Thermo Scientific公司)，用平衡缓冲液平衡。加入蛋白溶液，以2000rpm离心2分钟后，用洗涤缓冲液(PBS、25mM咪唑；pH为7.4)洗涤树脂。用洗脱缓冲液(PBS、250mM或500mM咪唑)阶梯式洗脱，将各级分供于SDS-PAGE(e-PAGEL(注册商标)15％(ATTO))以确认洗脱蛋白。利用镍柱进行亲和纯化后，使用Q sepharose(商标)Fast Flow(GE healthcare公司)对2-215进行离子交换层析，使用Q sepharose(商标)Fast Flow(GEhealthcare公司)和SP sepharose(商标)Fast Flow(GE healthcare公司)对93-215进行离子交换层析，使用SP sepharose(商标)Fast Flow(GE healthcare公司)对其他片段进行离子交换层析。
人HMGB1片段(2-215、2-84、2-44、45-84、2-62、2-70、2-81、2-170)
向Micro Bio-Spin柱中填充各琼脂糖各1ml，用PBS进行琼脂糖的平衡。填充进行亲和纯化后的蛋白溶液后，用PBS洗涤。用洗脱缓冲液(20mM HEPES、1M NaCl；pH为7.5)进行洗脱，通过SDS-PAGE确认各级分。
人HMGB1片段(93-215)
用Q和SP两种琼脂糖对进行亲和纯化后的蛋白溶液分别进行阴离子交换、阳离子交换。此外，将填充SP sepharose(商标)Fast Flow时的通过级分填充到Q sepharose(商标)Fast Flow上进行阴离子交换。通过SDS-PAGE确认各级分。
人HMGB1片段(85-169)
向每0.1g集菌得到的菌体中加入1ml的缓冲液(PBS、10mM咪唑；pH为7.4)，进行超声波裂解。在4℃下以20000rpm进行1小时的离心分离，回收上清。使用BioLogic DuoFlow(Bio-Rad公司)通过柱层析进行纯化。首先，使用5ml HisTrap(商标)FF(GE healthcare公司)，缓冲液A使用菌体裂解溶液(PBS、10mM咪唑(pH为7.4))，缓冲液B使用PBS、500mM咪唑(pH为7.4)，进行亲和纯化。用缓冲液A平衡柱后，填充蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
等度流动相(缓冲液A：97％、缓冲液B：3％、20ml)→线性梯度(缓冲液A：97％→0％、缓冲液B：3％→100％、20ml)→等度流动相(缓冲液B：100％、20ml)→级分收集(20～40ml、2ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE进行确认。
接着，进行离子交换纯化。85-169使用5ml HiTrap(商标)SP HP(GE health care公司)柱，缓冲液A使用PBS(pH为7.4)，缓冲液B使用20mM HEPES、1M NaCl(pH为7.5)的缓冲液。用适量的缓冲液A平衡柱后，填充进行亲和纯化后的蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
等度流动相(缓冲液A：100％、缓冲液B：0％、10ml)→等度流动相(缓冲液A：50％、缓冲液B：50％、2ml)→等度流动相(缓冲液A：0％、缓冲液B：100％、20ml)→级分收集(10～32ml、1ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE进行确认。
浓度测定
各片段的浓度测定通过使用Bradford法(Bio-Rad蛋白分析)的BSA换算进行。
迁移分析
进行上述各肽对骨髄间充质干细胞系MSC-1的迁移活性的确认。将包含各片段的含500mM NaCl的磷酸缓冲液用2倍体积的DMEM稀释至终浓度为2μM，插入到小室的下层中，夹着具有8μm的孔的聚碳酸酯膜，向上层中插入扩散到含有10％FBS的DMEM中的MSC-1。在37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时后，使用迪夫快速染色(Diff-Quik stain(商标))检测从上层迁移到下层侧的细胞。
结果
2-215、2-84、2-44、45-84、2-62、2-70、2-81、2-170、93-215均确认到对骨髄间充质干细胞的迁移活性(图18B)。在将2-215的迁移活性设为1的情况下，以摩尔浓度计，2-84确认到2.37倍的活性，2-44确认到1.82倍的活性，45-84确认到2.04倍的活性，换算成等质量时，分别为5.5倍、7.1倍、8.1倍(图18C、D)。
讨论
通过将利用大肠杆菌制作的人HMGB1(2-215)的N端侧片段化，确认到迁移活性的增强。此外，在N端侧至少在2-44和45-84这2处确认到迁移活性。这是与真核生物的培养细胞(HEK293细胞)中制作的HMGB1片段同样的结果。推测通过片段化可能会使针对MSC-1的受体的表位露出而容易与受体结合。根据蛋白的不同，有通过片段化而失去活性的蛋白，但本发明蛋白通过片段化反而使活性增强。已知蛋白的表达中在HEK293等真核细胞中进行糖链附加等翻译后修饰，对于受体的配体而言，这些修饰的有无有时会影响活性。因此，由不仅在不进行与真核细胞同样的翻译后修饰的利用大肠杆菌制作的蛋白保持了活性、而且利用大肠杆菌生产的片段也保持了活性这一点表明，翻译后修饰对这些片段的活性不是必需的。综上所述，通过HMGB1的片段化，能够开发具有更高活性的骨髄间充质干细胞的动员药。此外，由于翻译后修饰不是必需的，因此，能够利用使用大肠杆菌或化学合成的生产方法，能够更廉价地制作品质稳定的制剂。另外，由本实施例中记载的肽与其他实施例中记载的肽的比较(例如1-44与2-44的比较或1-84与2-84的比较)判明，HMGB1蛋白的第一个蛋氨酸(first methionine)的有无对迁移活性没有影响。因此，在某个肽具有迁移活性的情况下，认为从该肽中除去第一个蛋氨酸后的肽也具有迁移活性。另外，在除去第一个蛋氨酸后的肽具有迁移活性的情况下，认为在该肽上添加第一个蛋氨酸后的肽也具有迁移活性。
实施例15
方法
删除人HMGB1的N端侧的蛋氨酸(M)，取而代之附加了MKHHHHHHENLYFQ(序列号11)。HHHHHH(序列号12)是用于使用镍柱对表达的蛋白或肽进行纯化的标签(6×His标签)，ENLYFQG(序列号13)是TEV蛋白酶识别的序列(图18A)。另外，构建在T7启动子、lac操纵子的下游插入编码目标蛋白或肽(89-215、89-205、89-195、89-185)的cDNA、此外药剂抗性基因使用卡那霉素抗性基因、复制起点使用pBR322ori、f1 ori的载体。将使用该表达载体制作的蛋白或肽用TEV蛋白酶切除时，能够制作从第2位氨基酸开始的人HMGB1的蛋白或肽。
使用制作的质粒转化BL-21(DE3)。将在含有卡那霉素的LB培养基中、在37℃下振荡培养过夜后的菌液5ml转移到100ml的LB培养基中，在37℃下以140rpm振荡培养。使用浊度计测定浊度，达到OD0.5～0.7后以使终浓度为1mM的方式添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。对于人HMGB1片段(89-215、89-205、89-195、89-185)，在15℃下振荡培养过夜后集菌。进行SDS-PAGE后，通过蛋白染色和利用标签或抗HMGB1抗体的蛋白免疫印迹进行表达的蛋白、肽的确认。
各HMGB1片段(89-215、89-205、89-195、89-185)的纯化
向每0.1g集菌得到的菌体中加入2ml的缓冲液(PBS、10mM咪唑；pH为7.4)，进行超声波裂解。在4℃下以20000rpm进行1小时的离心分离，回收上清。使用BioLogic DuoFlow(Bio-Rad公司)通过柱层析进行纯化
人HMGB1片段(89-215)
向每0.1g集菌得到的菌体中加入1ml的缓冲液(PBS、10mM咪唑；pH为7.4)，进行超声波裂解。在4℃下以20000rpm进行1小时的离心分离，回收上清。使用BioLogic DuoFlow(Bio-Rad公司)通过柱层析进行纯化。首先，使用5ml HisTrap(商标)FF(GE healthcare公司)，缓冲液A使用菌体裂解溶液(PBS、10mM咪唑(pH为7.4))，缓冲液B使用PBS、500mM咪唑(pH为7.4)，进行亲和纯化。用缓冲液A平衡柱后，填充蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
等度流动相(缓冲液A：97％、缓冲液B：3％、20ml)→线性梯度(缓冲液A：97％→0％、缓冲液B：3％→100％、20ml)→等度流动相(缓冲液B：100％、20ml)→级分收集(20～40ml、2ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE进行确认。
接着，进行离子交换纯化。89-215使用5ml HiTrap(商标)Q HP(GE healthcare公司)，缓冲液A使用PBS(pH为7.4)，缓冲液B使用20mM HEPES、1M NaCl(pH为7.5)的缓冲液。用适量的缓冲液A平衡柱后，填充进行亲和纯化后的蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
等度流动相(缓冲液A：100％、缓冲液B：0％、10ml)→等度流动相(缓冲液A：50％、缓冲液B：50％、2ml)→等度流动相(缓冲液A：0％、缓冲液B：100％、20ml)→级分收集(10～32ml、1ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE进行确认。
人HMGB1片段(89-205、89-195、89-185)
可溶性蛋白溶液的制备与人HMGB1片段(89-215)同样地进行。然后，利用各柱层析如下进行梯度洗脱。
首先，使用5ml HisTrap(商标)FF、缓冲液A(PBS、10mM咪唑(pH为7.4))、缓冲液B(PBS、500mM咪唑(pH为7.4))进行亲和纯化。用缓冲液A平衡柱后，填充蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
→等度流动相(缓冲液A：97％、缓冲液B：3％、50ml)→线性梯度(缓冲液A：97％→0％、缓冲液B：3％→100％、120ml)→级分收集(50～170ml、5ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE进行确认。
接着，进行离子交换纯化。人HMGB1片段(89-215)、(89-205)使用5ml HiTrap(商标)Q HP柱，除此以外使用5ml HiTrap(商标)SP HP柱。缓冲液A使用PBS(pH为7.4)，缓冲液B使用7×PBS(pH为7.4)。用适量的缓冲液A平衡柱后，填充进行亲和纯化后的蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
等度流动相(缓冲液A：100％、缓冲液B：0％、50ml)→线性梯度(缓冲液A：100％→0％、缓冲液B：0％→100％、50ml)→等度流动相(缓冲液A：0％、缓冲液B：100％、5ml)→级分收集(50～105ml、3ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE进行确认。
浓度测定
各片段的浓度测定通过使用Bradford法(Bio-Rad蛋白分析)的BSA换算进行。
迁移分析
进行上述各肽对骨髄间充质干细胞系MSC-1的迁移活性的确认。将包含各片段的含500mM NaCl的磷酸缓冲液用2倍体积的DMEM稀释至终浓度为2μM，插入到小室的下层中，夹着具有8μm的孔的聚碳酸酯膜，向上层中插入扩散到含有10％FBS的DMEM中的MSC-1。在37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时后，使用迪夫快速染色(Diff-Quik stain(商标))检测从上层迁移到下层侧的细胞。
结果
使用镍柱对人HMGB1片段(89-215)进行亲和纯化后，使用离子交换层析(Q柱)逐渐地提高盐浓度，由此进行梯度洗脱。级分6、7中分收到15.5kDa的肽，级分8、9中分收到15.5kDa、16kDa、17kDa的肽，级分10、11中分收到16kDa、17kDa的肽(图19A)。
考察级分6与7混合而成的样品(6+7)、级分9和10对骨髄间充质干细胞(MSC-1)的迁移活性，结果级分6与7混合而成的样品(6+7)确认到强活性，而级分9和10的活性弱(图19B)。
使用镍柱对人HMGB1片段(89-205)进行亲和纯化后，使用离子交换层析(Q柱)逐渐地提高盐浓度，由此进行梯度洗脱。级分6中从最短的片段(*4)开始先被洗脱，级分7中第二短的片段(*5)、进而最长的片段(*6)被洗脱。另一方面，89-195和89-185通过镍柱亲和纯化能够以单一片段的形式纯化(图19C)。
考察了级分6、7、8对骨髄间充质干细胞(MSC-1)的迁移活性，结果级分6确认到强活性，级分7、8的活性逐渐减弱。另一方面，89-195和89-185确认到比89-215的任何片段都强的活性(图19D)。
讨论
使用大肠杆菌制作人HMGBN1片段(89-215、89-205、89-195、89-185)。89-215、89-205的骨髄间充质干细胞迁移活性弱，但发生了认为由大肠杆菌来源的蛋白酶所致的剪切(图19A、C)，短的剪切片段确认到强活性(图19B、D)。另一方面，89-195、89-185确认到强的骨髄间充质干细胞迁移活性(图19C、D)。HMGB1的C端第186位～第215位氨基酸中存在谷氨酰胺和天冬氨酸的重复序列。据说这些序列有助于蛋白的稳定化。通过本研究，首次明确了：该部分抑制HMGB1片段(89-215)的迁移活性，通过除去该序列，能够增强HMGB1片段(89-215)的迁移活性。另外，有如下见解：存在于HMGB1的C端的谷氨酸和天冬氨酸的重复序列(第186位至第215位氨基酸序列)被称为酸性尾巴，对于与RAGE的结合是必需的。另外，RAGE是树突细胞等由HMGB1引起迁移时的受体，由此推测C端和RAGE配体部分对于发挥迁移活性是必需的，但实际上，令人惊讶地获知，不具有C端时更有利于对骨髄间充质干细胞的迁移活性。这是基于以下的现象首次得到明确的：利用大肠杆菌制作含有C端的HMGB1片段时，被认为是由大肠杆菌来源的蛋白酶所致的分解产物显示出在未分解的HMGB1片段以上的迁移活性，进而制作了缺少C端的HMGB1片段，结果发挥出比具有C端的HMGB1片段更强的活性。通常，对蛋白的特定活性有贡献的部位为1处，但令人惊讶的是，对于HMGB1对骨髄间充质干细胞的迁移活性有贡献的部分存在多个部位，更令人惊讶的是，各个部位的活性在等分子数的情况下具有全长HMGB1的约2倍的活性。另外，通常具有生理活性的肽的长度越短则越不稳定，且活性越低，但令人惊讶的是，存在短片段具有长片段以上的强活性的肽。
实施例16
方法
删除人HMGB1的N端侧的蛋氨酸(M)，取而代之附加了MKHHHHHHENLYFQ(序列号11)。HHHHHH(序列号12)是用于使用镍柱对表达的蛋白或肽进行纯化的标签(6×His标签)，ENLYFQG(序列号13)是TEV蛋白酶识别的序列(图18A)。另外，构建在T7启动子、lac操纵子的下游插入编码目标蛋白或肽(85-169、2-215)的cDNA、此外药剂抗性基因使用卡那霉素抗性基因、复制起点使用pBR322 ori、f1 ori的载体。将使用该表达载体制作的蛋白或肽用TEV蛋白酶切除时，能够制作从第2位氨基酸开始的人HMGB1的蛋白或肽。
使用制作的质粒转化BL-21(DE3)。将在含有卡那霉素的LB培养基中、在37℃下振荡培养过夜后的菌液5ml转移到100ml的LB培养基中，在37℃下以140rpm振荡培养。使用浊度计测定浊度，达到OD0.5～0.7后以使终浓度为1mM的方式添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。对于人HMGB1片段(85-169)，在15℃下振荡培养过夜后集菌。进行SDS-PAGE后，通过蛋白染色和利用标签或抗HMGB1抗体的蛋白免疫印迹进行表达的蛋白、肽的确认。
向每0.1g集菌得到的菌体中加入1ml的缓冲液(PBS、10mM咪唑；pH为7.4)，进行超声波裂解。在4℃下以20000rpm进行1小时的离心分离，回收上清。使用BioLogic DuoFlow(Bio-Rad公司)通过柱层析进行纯化。首先，使用5ml HisTrap(商标)FF(GE healthcare公司)，缓冲液A使用菌体裂解溶液(PBS、10mM咪唑(pH为7.4))，缓冲液B使用PBS、500mM咪唑(pH为7.4)，进行亲和纯化。用缓冲液A平衡柱后，填充蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
等度流动相(缓冲液A：97％、缓冲液B：3％、20ml)→线性梯度(缓冲液A：97％→0％、缓冲液B：3％→100％、20ml)→等度流动相(缓冲液B：100％、20ml)→级分收集(20～40ml、2ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE进行确认。
浓度测定
重组蛋白的浓度测定通过使用Bradford法(Bio-Rad蛋白分析)的BSA换算进行。
迁移分析
进行上述各肽对骨髄间充质干细胞系MSC-1的迁移活性的确认。将包含各片段的含500mM NaCl的磷酸缓冲液用2倍体积的DMEM稀释至终浓度为2μM，插入到小室的下层中，夹着具有8μm的孔的聚碳酸酯膜，向上层中插入扩散到含有10％FBS的DMEM中的MSC-1。在37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时后，使用迪夫快速染色(Diff-Quik stain(商标))检测从上层迁移到下层侧的细胞。
结果
人HMGB1片段(85-169)确认到比人HMGB1片段(2-215)更强的骨髄间充质干细胞迁移活性(图20A)。将迁移活性设为1的情况下，以等浓度计为1.59倍，换算成等质量时为3.6倍(图20B、C)。
讨论
人HMGB1片段(85-169)也与(89-195)、(89-185)同样地确认到比(2-215)强的骨髄间充质干细胞迁移活性。由以上推测，85～185位氨基酸序列中至少存在一处具有骨髄间充质干细胞动员活性的序列。实施例1中，利用HEK293生产的HMGB1片段85-169未确认到迁移活性。本实施例中，利用大肠杆菌生产的HMGB1片段85-169确认到迁移活性。推测该差异是由于生产方法的不同而使迁移活性极为减弱或消失。HEK293等真核生物与大肠杆菌等原核生物中，翻译后修饰、折叠等存在差异，因此，即使生产相同的蛋白或肽，性质也常常不同。
通过本研究明确了：HMGB1的氨基酸序列中至少存在3处骨髄间充质干细胞动员活性序列，它们的活性通过受到C端的谷氨酸、天冬氨酸的重复序列的抑制而被控制。通过制作除去C端的抑制序列后的HMGB1片段，能够制作活性型的具有强骨髄干细胞动员作用的制剂。
实施例17
小鼠间充质干细胞迁移活性1
方法
HMGB1片段的纯化
使用KOD-Plus-ver.2(Toyobo公司)进行反向PCR。将上述的包含人HMGB1的第2位至第215位氨基酸的HMGB1片段用表达载体作为模板质粒。将分别编码第2位至第205位氨基酸、第2位至第195位氨基酸、第2位至第185位氨基酸的cDNA连通存在于N端侧的组氨酸标签、TEV蛋白酶识别序列、质粒的骨架一起用PCR法进行扩增。另外，由该PCR产物制作的基因产物为从N端起随机排列有组氨酸标签、TEV蛋白酶识别序列、人HMGB1片段的蛋白。向PCR产物中添加限制酶DpnI(Toyobo公司)，由此对模板质粒进行消化。接着，使用T4多核苷酸激酶(NEB公司)向PCR产物上附加磷酸基，使用连接酶(2×快速连接酶、NEB公司或LigationConvenience试剂盒、Nippongene公司)进行自身连接。将其转化到大肠杆菌JM109株中，通过利用卡那霉素的筛选得到菌落。使用GenElute质粒小量提取试剂盒(SIGMA-ALDRICH公司)进行质粒提取，通过序列分析确认碱基序列后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)株中，得到菌落。
表达诱导
将各个菌落在含有终浓度为50mg/L的卡那霉素的LB培养基中、在37℃下振荡培养过夜后的菌液5ml转移到100ml的LB培养基中，在37℃下以140rpm振荡培养。使用浊度计测定浊度，达到OD0.5～0.7后以使终浓度为1mM的方式添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。再在15℃下振荡培养过夜，然后集菌。
重组蛋白纯化
向集菌得到的菌体中加入12ml(25-50mg/ml)平衡缓冲液(PBS(137mM NaCl、8.1mMNa2HPO4、2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4)、10mM咪唑；pH为7.4)，并以终浓度为5μg/ml的方式加入亮抑酶肽盐酸盐，进行超声波裂解。在4℃下以15000rpm进行60分钟的离心分离，回收上清。取上清的一部分，进行使用抗人HMGB1抗体的蛋白免疫印迹法，进行目标蛋白的表达的确认。使其余的上清在0.45μm的过滤器中通过而除菌。目标蛋白的纯化使用BioLogicDuoFlow(Bio-Rad公司)通过柱层析进行。
首先，使用5ml HisTrap(商标)FF、缓冲液A(PBS、10mM咪唑(pH为7.4))、缓冲液B(PBS、500mM咪唑(pH为7.4))进行亲和纯化。用缓冲液A平衡柱后，填充蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。
程序：
等度流动相(缓冲液A：97％、缓冲液B：3％、50ml)
线性梯度(缓冲液A：97％→0％、缓冲液B：3％→100％、120ml)
级分收集(50～170ml、5ml/级分)
各级分通过SDS-PAGE(e-PAGEL(注册商标)5-20％(ATTO))进行确认。
接着，进行离子交换纯化。仅GNX-E-022使用5ml HiTrap(商标)Q HP柱，除此以外均使用5ml HiTrap(商标)SP HP柱。缓冲液A使用PBS(pH为7.4)、缓冲液B使用7×PBS(pH为7.4)。用适量的缓冲液A平衡柱后，填充进行亲和纯化后的蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。
程序：
等度流动相(缓冲液A：100％、缓冲液B：0％、50ml、4ml/分钟)
线性梯度(缓冲液A：100％→0％、缓冲液B：0％→100％、50ml、4ml/分钟)
等度流动相(缓冲液A：0％、缓冲液B：100％、5ml、4ml/分钟)
级分收集(50～105ml、3ml/级分)
各级分进行SDS-PAGE，通过进行凝胶的蛋白染色而进行纯化蛋白的确认。
浓度测定
重组蛋白的浓度测定通过使用Bradford法(Bio-Rad蛋白分析)的BSA换算进行。
迁移分析
进行上述各肽对骨髄间充质干细胞系MSC-1的迁移活性的确认。将包含各片段的含500mM NaCl的磷酸缓冲液用2倍体积的DMEM稀释至终浓度为2μM，插入到小室的下层中，夹着具有8μm的孔的聚碳酸酯膜，向上层中插入扩散到含有10％FBS的DMEM中的MSC-1。在37℃、5％CO2培养箱中孵育4小时后，使用迪夫快速染色(Diff-Quik stain(商标))检测从上层迁移到下层侧的细胞。
结果
与2-215的片段、2-205的片段相比，2-195的片段和2-185的片段确认到强迁移活性(图21A)。
讨论
第186位至第215位的片段为天冬氨酸与谷氨酸总计30个氨基酸的重复序列，被称为酸性尾巴。由此次的数据启示：HMGB1的骨髄间充质干细胞的迁移活性由酸性尾巴强烈抑制，特别是C端侧20个氨基酸的序列与抑制相关。根据迄今为止的数据，鉴定出多处HMGB1的骨髄间充质干细胞游走活性作用的活性结构域，是否抑制了所有这些活性结构域的活性需要进行更详细的实验。
人间充质干细胞迁移活性2
方法
对于人HMGB1片段(2-215、2-84、2-44、45-84、85-169、89-185、89-195、89-205)，与上述的实施例14、15、16同样地利用大肠杆菌生产并使用适当的柱进行纯化。但是，对于89-215，通过与实施例15中的89-205同样的方法进行纯化。
浓度测定
各片段的浓度测定通过使用Bradford法(Bio-Rad蛋白分析)的BSA换算进行。
迁移分析
对于各片段，与上述的对小鼠来源的骨髄间充质干细胞(MSC-1)的迁移分析同样地对人来源的骨髄间充质干细胞进行迁移分析。使用终浓度相当于2μM的片段。另外，人来源的骨髄间充质干细胞使用第4代传代的hMSC(人间充质干细胞，Takara公司制造)。增殖用的培养基使用间充质干细胞增殖培养基(MF培养基，TOYOBO公司制造)，在37℃、5％CO2培养箱中培养。每2-4天更换成新鲜的培养基，在达到80％铺满的时刻进行传代。
结果
关于人HMGB1片段(2-215、2-84、2-44、45-84)，HMGB1片段(2-84、2-44、45-84)与实施例14同样地确认到比人HMGB1片段(2-215)更强的活性。关于人HMGB1片段(89-185、89-195、89-205、89-215)，使C端的酸性尾巴变短而得到的活性人HMGB1片段(89-185、89-195)与实施例15同样地确认到强活性。关于人HMGB1片段(85-169)，人HMGB1片段(2-215)与实施例16同样地确认到强活性(图21B)。
讨论
对于人来源的骨髄间充质干细胞，各个片段也确认到与小鼠来源的骨髄间充质干细胞同样的迁移活性。至少在人HMGB1片段(2-44、45-84、85-169)中独立地存在对人骨髄间充质干细胞具有迁移活性的部位。通常蛋白的具有特定活性的部位为1处，因此存在多个活性部位是应当令人惊讶的结果。另外，各个片段的活性比接近全长的序列(2-215)的活性更强也是令人惊讶的。另一方面，RAGE结合部位为第150位至第183位氨基酸序列，但第89位至第169位氨基酸序列也具有活性，由此启示对人骨髄间充质干细胞的迁移活性可能不需要RAGE。关于人HMGB1片段(89-185、89-195、89-205、89-215)，与小鼠来源的细胞的情况同样，由缺少C端的酸性尾巴片段产生了强活性。认为在人骨髄间充质干细胞的迁移中，C端对于迁移活性也发挥抑制性作用，通过使C端的酸性尾巴变短或缺失，能够制作活性更强的HMGB1片段。
在人HMGB1的片段2-84上附加人HMGB1的酸性尾巴片段186-215、186-205、186-195而得到的融合片段的迁移活性的变化
方法
制作以在人HMG1片段2-84的C端同样地附加人HMGB1的片段186-215、186-205或186-195的方式融合而成的cDNA。另外，如上所述，以在大肠杆菌中表达的片段中删除人HMGB1的N端侧的蛋氨酸(M)、取而代之附加MKHHHHHHENLYFQ(序列号11)的方式设计表达载体。另外，HHHHHH(序列号12)是用于使用镍柱对表达的蛋白或肽进行纯化的标签(6×His标签)，ENLYFQG(序列号13)是TEV蛋白酶识别的序列(图18)。另外，构建在T7启动子、lac操纵子的下游插入上述的cDNA、此外药剂抗性基因使用卡那霉素抗性基因、复制起点使用pBR322 ori、f1 ori的载体。将使用该表达载体制作的蛋白或肽用TEV蛋白酶切除时，能够制作从第2位氨基酸开始的人HMGB1的蛋白或肽。
使用制作的质粒转化BL-21(DE3)。将在含有卡那霉素的LB培养基中、在37℃下振荡培养过夜后的菌液5ml转移到100ml的LB培养基中，在37℃下以140rpm振荡培养。使用浊度计测定浊度，达到OD0.5～0.7后以使终浓度为1mM的方式添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在15℃下振荡培养过夜后集菌。
各HMGB1片段(2-84+186-215、2-84+186-205、2-84+186-195)的纯化
以使终浓度为5μg/ml的方式向集菌得到的菌体中加入平衡缓冲液(PBS(137mMNaCl、8.1mM Na2HPO4、2.68mM KCl、1.47mM KH2PO4)、10mM咪唑；pH为7.4)，进行超声波裂解。在4℃下以15000rpm进行60分钟的离心分离，回收上清。使其余的上清在0.45μm的过滤器中通过而除菌。目标蛋白的纯化使用BioLogic DuoFlow(Bio-Rad公司)通过柱层析进行。
接着，进行离子交换纯化。对于2-84+186-215、2-84+186-205、2-84+186-195，使用5ml HiTrap(商标)Q HP(GE healthcare公司)，缓冲液A使用PBS(pH为7.4)，缓冲液B使用7×PBS(pH为7.4)的缓冲液。用适量的缓冲液A平衡柱后，填充进行亲和纯化后的蛋白溶液，按照以下的程序进行洗涤和纯化。程序如下进行：
等度流动相(缓冲液A：100％、缓冲液B：0％、50ml、4ml/分钟)
线性梯度(缓冲液A：100％→0％、缓冲液B：0％→100％、50ml、4ml/分钟)
等度流动相(缓冲液A：0％、缓冲液B：100％、5ml、4ml/分钟)
级分收集(50～105ml、3ml/级分)
各级分进行SDS-PAGE，通过进行凝胶的蛋白染色而进行纯化蛋白的确认。
另外，对于各片段，进行使用识别人HMGB1的抗体进行蛋白免疫印迹而确认其为目的片段的操作。
使用MSC-1的HMGB1片段(2-84)和HMGB1融合片段(2-84+186-215、2-84+186-205、2-84+186-195)迁移分析
使用通过上述的方法制作的片段，进行使用骨髄间充质干细胞系MSC-1的迁移分析。迁移分析与前述同样地进行。
结果
片段2-84显示出迁移活性，但分别附加有酸性尾巴序列的10个氨基酸、20个氨基酸、30个氨基酸的人HMGB1融合片段均未显示出迁移活性(图21C)。
讨论
由上述的实施例表明，人HMGB1片段89-215对间充质干细胞具有极弱的迁移活性，但截去存在于C端侧的酸性尾巴时，迁移活性增强。由本实施例明确，酸性尾巴具有减弱2-84的片段和89-185的片段所具有的迁移活性的功能。另外，2-84的片段中存在多个迁移活性的核心区，但在2-84的片段上融合186-215的片段时，迁移活性几乎消失，由此推测存在于2-84中的所有核心区均被抑制。HMGB1这样的一个分子中存在至少3处以上对骨髄间充质干细胞的迁移活性的核心序列，这是令人惊讶的发现。此外，存在于C端的仅仅30个氨基酸的酸性尾巴几乎完全地抑制了HMGB1的N端侧的2-84的片段中至少存在2处的核心序列的迁移活性，也抑制85-185的片段中存在的核心序列的迁移活性，以致使整个HMGB 1的迁移活性减弱，这也是极其令人惊讶的发现。HMGB1的1-85片段被认为对由LPS(脂多糖)等引起的炎症具有抗炎效果，Wei Gong等人报道了在1-85的片段上融合186-215片段而得到的片段与1-85的片段相比使LPS施用导致的死亡率减少(Journal of Biomedicine andBiotechnology Volume 2010,Article ID 915234,doi:10.1155/2010/915234)。Wei Gong等人的论文中显示，酸性尾巴是为了增强1-85的抗炎效果所需要的，但通过本发明明确了酸性尾巴反而抑制骨髄间充质干细胞的游走。根据本发明，在通过施用骨髄间充质干细胞而观察到治疗效果的疾病中，使酸性尾巴变短或完全削除可望能够进一步改善治疗效果。
实施例18
方法
实验动物使用SD大鼠(雄性、8周龄)。通过利用异氟烷的吸入麻醉实施充分的麻醉后，在背部制作横3cm、纵7cm的长条状皮肤切口。但是，头侧的一边不切除，皮肤自皮下组织充分游离。使用4号丝线将切开的3边与周围的皮肤缝合，使用Tegaderm透明敷料(3M公司制造)进行保护以预防细菌感染。
将利用HEK293制作的小鼠全长HMGB1(100μg/次/天)、化学合成的HMGB1肽(1～44个氨基酸、50μg/次/天)用磷酸缓冲液稀释至200μl，从尾静脉施用于大鼠，将手术后6小时作为初次施用，以后每24小时施用，总计施用5次药剂。对阴性对照施用磷酸缓冲生理盐水。1周后除去Tegaderm，每周观察创伤部位。测定坏死部分、溃疡形成部分的面积。
结果
手术1周后，阴性对照组中，5只中的4只发生了皮肤坏死。全长HMGB1施用组中，5只中的3只发生了皮肤坏死。HMGB1肽(1～44个氨基酸)组中，5只中的1只发生了皮肤坏死。手术7周后，阴性对照组中，5只中的4只发生了皮肤的强挛缩，与此相对，全长HMGB1施用组中，5只中的3只确认到挛缩，HMGB1肽(1～44个氨基酸)组中，5只中的2只确认到挛缩(图24)。
讨论
在包含利用HEK293产生的全长的HMGB1施用组和HMGB1肽(1～44个氨基酸)施用组中，确认到1周后的坏死组织的缩小效果，在HMGB1肽(1～44个氨基酸)组中，进一步确认到缩小效果。1周后、2周后、3周后，创伤面积均缩小到阴性对照组的一半面积。3周后以后，HMGB1肽(1～44个氨基酸)施用组与其他2组相比，创伤面积进一步缩小。在7周的愈合过程中，HMGB1肽(1～44个氨基酸)组也有创伤面积更小的倾向。就7周后的创伤部分的挛缩而言，HMGB1肽(1～44个氨基酸)组的挛缩也是最轻度。已知骨髄间充质干细胞促进低氧状态下的皮肤细胞的增殖，推测由HMGB1动员的骨髄间充质干细胞抑制因皮瓣作成而产生的低营养、低氧所致的皮肤坏死的扩大，促进创伤愈合。这启示这样的效果抑制由皮肤的缺血、外伤、手术引起的损伤的扩大，并且对愈合后的美容面也具有优异的效果。
实施例19
方法
实验动物使用每组15只的SD大鼠(雄性、8周龄)。通过利用异氟烷的吸入麻醉实施充分的麻醉后，在背部制作横3cm、纵7cm的长条状皮肤切口。但是，头侧的一边不切除，皮肤自皮下组织充分游离。使用4号丝线将切开的3边与周围的皮肤缝合，使用Tegaderm透明敷料(3M公司制造)进行保护以预防细菌感染。
将化学合成的HMGB1肽(1～44个氨基酸、50μg/次/天)或HMGB1肽(17～25个氨基酸、50μg/次/天)用磷酸缓冲液稀释至200μl，从尾静脉施用于作成了创伤的大鼠，将手术后6小时作为初次施用，以后每24小时施用，总计施用5次药剂。对阴性对照施用磷酸缓冲生理盐水。1周后除去Tegaderm，观察创伤作成2周后的创伤部位。测定未愈合部分(溃疡、坏死)的面积。
结果
计算皮瓣作成2周后的未愈合部分的面积相对于皮瓣整体的面积的比率(％)。HMGB1肽(1～44个氨基酸)组中，未愈合部分为平均14.1％，与此相对，HMGB1肽(17～25个氨基酸、50μg/次/天)组中，为平均9.1％。此外，计算皮瓣作成6周后的未愈合部分的面积相对于皮瓣整体的面积的比率(％)，结果HMGB1肽(1～44个氨基酸)组中，未愈合部分为平均4.1％，与此相对，HMGB1肽(17～25个氨基酸、50μg/次/天)组中，为平均3.5％(图26)。
讨论
实施例19的皮肤损伤模型的试验中，与包含利用HEK293产生的全长的HMGB1施用组相比，化学合成的HMGB1肽(1～44个氨基酸)施用组中在损伤1周后至7周的愈合过程中HMGB1肽(1～44个氨基酸)组有创伤面积小的倾向。另外，根据化学合成的此次试验，HMGB1肽(17～25个氨基酸)组中，确认到与HMGB1肽(1～44个氨基酸、50μg/次/天)组同等或更高的皮肤损伤改善效果。体外的骨髄间充质干细胞动员活性部位(核心序列)有多处，目前判明的最短序列为由第17位至第25位氨基酸这9个氨基酸构成的序列。另一个间充质干细胞动员活性部位的核心序列的长度需要30个氨基酸的长度或85个氨基酸的长度。此次不仅在体外确认到皮肤损伤的改善效果，而且在体内在仅仅由9个氨基酸构成的HMGB1肽(17～25个氨基酸)组中也确认到皮肤损伤的改善效果，与由HEK293等真核生物来源的培养细胞制作的蛋白制剂相比，包含9个氨基酸作为核心结构域的肽可期待更加廉价且稳定的生产。
工业上的可利用性
根据本发明，提供分子量例如为全长包含约200个氨基酸的HMGB1蛋白的1/10以下的、维持PDGFRα阳性细胞动员活性的肽。这样的肽除了可以通过利用大肠杆菌或真核生物来源的培养细胞的生产方法来生产，还可以通过使用肽合成仪的化学合成来生产，因此，在制造肽作为药品时，可以期待纯化纯度的提高、稳定生产、成本削减。
另外，在大肠杆菌或培养细胞中产生重组肽的情况下，与全长HMGB1相比，确认到以摩尔比计约2倍、以质量比计约6倍程度的活性的提高。因此，在药品的临床应用时，能够抑制施用量，因此可以期待成本的削减，此外还可以期待副作用的抑制效果。
另外，已知全长HMGB1具有与作为内毒素之一的LPS(Lipopolysaccharide，脂多糖)结合的活性。另外，有如下报道：将HMGB1制成第1位至第79位氨基酸序列或第88位至第162位氨基酸序列的HMGB1片段时，与LPS的结合活性丧失(Youn et al,.J Immunol 2008；180；5067-5074)。
药品中即使混入少量的LPS时，也会引起发热等，常常会导致严重的副作用，因此，药品中的LPS的混入受到严格限制。由于HMGB1与LPS具有亲和性，因此难以将混入到药品中的LPS完全除去。但是，通过肽化使与LPS的亲和性降低，因此推测也能够减少LPS向药品中的混入。因此，通过使用本发明中鉴定的由PDGFRα阳性细胞动员部分构成的肽，能够进行更安全的药品的开发。
通过将本发明的肽直接施用于需要再生的组织或其附近组织，能够诱导或促进该组织的再生。此外，通过使用静脉内施用等方法将本发明的肽施用于与需要再生的组织不同的组织，能够诱导或促进需要再生的组织的再生。例如，在治疗脑梗塞等体内深部器官的疾病的情况下，难以将治疗药直接施用于损伤部位(脑)。另一方面，本发明中，可以通过一般诊疗中广泛施行的静脉施用进行治疗，因此，能够以任意的次数、浓度安全且简便地施用治疗药，这是优于以往的治疗方法的效果。
另外，作为最近开发的使用骨髄细胞的脑梗塞的治疗方法，已知从患者本人的骨髄中采集细胞并重新施用到血液循环中的方法是有效的。但是，骨髄细胞采集时需要将粗针刺入到体内深部的骨髄中进行抽吸，因此，不可避免伴有较大的侵袭性。与此相对，本发明中，通过静脉内施用药剂，能够将骨髄细胞直接动员到血液循环中。因此，即使多次对脑梗塞的患者施用，也不会伴随大的侵袭性。
骨髄来源的多能干细胞具有分化成间充质系、上皮系、神经系等多样的细胞的潜在能力，认为其移动到损伤部位后，根据周围的微环境进行分化而诱导组织修复。再生医疗或细胞治疗中，将稀少的骨髄多能干细胞在生物体外进行培养使其增殖后用于治疗，但与以往的药品不同，在培养过程中存在可能会发生细胞的劣化(癌变或细菌、病毒等的污染)的危险，因此需要进行充分的安全管理。与此相对，本发明不将细胞取出到体外而施加人工的操作，因此安全性高。
序 列 表
<110> 斯特姆里姆有限公司
国立大学法人大阪大学
<120> 用于诱导组织再生的肽及其应用
<130> G6-X1001Y1P
<150> JP 2011-098270
<151> 2011-04-26
<150> JP 2011-219454
<151> 2011-10-03
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
20 25 30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
35 40 45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
50 55 60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65 70 75 80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
85 90 95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
100 105 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
115 120 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
130 135 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
165 170 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
180 185 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu
195 200 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
210 215
<210> 2
<211> 648
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt catcatatgc attttttgtg 60
caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120
ttttctaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt 180
gaagatatgg caaaagcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct 240
cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg 300
gccttcttcc tcttctgctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg 360
tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420
aagcagcctt atgaaaagaa ggctgcgaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480
gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540
agcaagaaaa agaaggaaga ggaggaagat gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600
gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648
<210> 3
<211> 215
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 3
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
20 25 30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
35 40 45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
50 55 60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65 70 75 80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
85 90 95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
100 105 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
115 120 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
130 135 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
165 170 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu
180 185 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
195 200 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
210 215
<210> 4
<211> 648
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 4
atgggcaaag gagatcctaa aaagccgaga ggcaaaatgt cctcatatgc attctttgtg 60
caaacttgcc gggaggagca caagaagaag cacccggatg cttctgtcaa cttctcagag 120
ttctccaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagaaaa ggggaaattt 180
gaagatatgg caaaggctga caaggctcgt tatgaaagag aaatgaaaac ctacatcccc 240
cccaaagggg agaccaaaaa gaagttcaag gaccccaatg cacccaagag gcctccttcg 300
gccttcttct tgttctgttc tgagtaccgc cccaaaatca aaggcgagca tcctggctta 360
tccattggtg atgttgcaaa gaaactagga gagatgtgga acaacactgc agcagatgac 420
aagcagccct atgagaagaa agctgccaag ctgaaggaga agtatgagaa ggatattgct 480
gcctacagag ctaaaggaaa acctgatgca gcgaaaaagg gggtggtcaa ggctgaaaag 540
agcaagaaaa agaaggaaga ggaagatgat gaggaggatg aagaggatga ggaagaggag 600
gaagaagagg aagacgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648
<210> 5
<211> 215
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 5
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
20 25 30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
35 40 45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
50 55 60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65 70 75 80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
85 90 95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
100 105 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
115 120 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
130 135 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
165 170 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu
180 185 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
195 200 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
210 215
<210> 6
<211> 648
<212> DNA
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 6
atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt cctcatatgc attctttgtg 60
caaacctgcc gggaggagca caagaagaag cacccggatg cttctgtcaa cttctcagag 120
ttctccaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagaaaa ggggaaattt 180
gaagatatgg caaaggctga caaggctcgt tatgaaagag aaatgaaaac ctacatcccc 240
cccaaagggg agaccaaaaa gaagttcaag gaccccaatg cccccaagag gcctccttcg 300
gccttcttct tgttctgttc tgagtaccgc ccaaaaatca aaggcgagca tcctggctta 360
tccattggtg atgttgcgaa gaaactagga gagatgtgga acaacactgc tgcggatgac 420
aagcagccct atgaaaagaa ggccgccaag ctgaaggaga agtatgagaa ggatattgct 480
gcctacagag ctaaaggaaa acctgatgca gcgaaaaagg gggtggtcaa ggctgagaag 540
agcaagaaaa agaaggaaga ggaagacgac gaggaggatg aagaggatga ggaagaggag 600
gaagaggagg aagacgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 添加到表达蛋白或肽的片段
<400> 7
Gly Pro Gly Tyr Gln
1 5
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(60)
<223> pCAGGS载体克隆位点的核酸序列
<400> 8
cat cac cat cac cat cac tcc gcg gct ctt gaa gtc ctc ttt cag gga 48
His His His His His His Ser Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly
1 5 10 15
ccc ggg tac cag 60
Pro Gly Tyr Gln
20
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> pCAGGS载体克隆位点的氨基酸序列
<400> 9
His His His His His His Ser Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly
1 5 10 15
Pro Gly Tyr Gln
20
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 编码分泌信号序列的人工合成核苷酸序列
<400> 10
atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60
gac 63
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工合成的6xHis标签和TEV蛋白酶识别位点
<400> 11
Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5 10
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 6xHis标签
<400> 12
His His His His His His
1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> TEV蛋白酶识别位点
<400> 13
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
1 5
<210> 14
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 带6xHis标签和TEV蛋白酶识别位点的重组hsHMGB1
<400> 14
Met Lys His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Lys
1 5 10 15
Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe
20 25 30
Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser
35 40 45
Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr
50 55 60
Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp
65 70 75 80
Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly
85 90 95
Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro
100 105 110
Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly
115 120 125
Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu
130 135 140
Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys
145 150 155 160
Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg
165 170 175
Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu
180 185 190
Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu
195 200 205
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp
210 215 220
Asp Asp Asp Glu
225

Claims (9)

1.一种具有PDGFRα阳性细胞游走刺激活性的肽，其由以下任一个氨基酸序列构成：
(1)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第45位至第84位氨基酸序列；
(2)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第55位至第84位氨基酸序列；
(3)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第85位至第169位氨基酸序列；
(4)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第185位氨基酸序列；
(5)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第89位至第195位氨基酸序列；
(6)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第93位至第215位氨基酸序列；
(7)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第170位氨基酸序列；
(8)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第1位至第195位氨基酸序列；
(9)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第2位至第170位氨基酸序列；
(10)序列号1、3、5中任一个序列号所示的氨基酸序列中的第2位至第195位氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的肽，其为合成的肽。
3.根据权利要求1所述的肽，其为使用细胞制造的肽。
4.根据权利要求1所述的肽，其为附加有标签的肽。
5.根据权利要求1所述的肽，其为附加有来源于标签的肽片段的肽。
6.一种DNA，其编码权利要求1所述的肽。
7.一种载体，其含有权利要求6所述的DNA。
8.一种转化细胞，其含有权利要求6所述的DNA，其中，所述转化细胞不为植物细胞。
9.一种转化细胞，其含有权利要求7所述的载体，其中，所述转化细胞不为植物细胞。
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