PT1893253E

PT1893253E - Sistema integrado para recolher, processar e transplantar subconjuntos de células, incluindo células estaminais adultas, para medicina regenerativa

Info

Publication number: PT1893253E
Application number: PT06727718T
Authority: PT
Inventors: Claude Fell
Original assignee: Biosafe Sa
Priority date: 2005-03-23
Filing date: 2006-03-23
Publication date: 2010-08-24
Also published as: US20080171951A1; JP4846782B2; DE602006014399D1; JP2008538514A; BRPI0609573A2; ATE468140T1; RU2410125C2; KR20080020596A; WO2006100651A1; CN101146559B; HK1119094A1; DK1893253T3; CN101146559A; EP1893253A1; EP1893253B1; RU2007136728A; KR101319135B1; ES2345837T3; MX2007011218A

Description

ΕΡ 1 893 253/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Sistema integrado para recolher, processar e transplantar subconjuntos de células, incluindo células estaminais adultas, para medicina regenerativa"

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se à recolha, ao processamento automatizado e ao transplante de subconjuntos de células tal como encontrados na medula óssea, no sangue periférico, no sangue do cordão umbilical ou no tecido adiposo, com o objectivo de reinjectar localmente estas células para reparar os tecidos. Embora os subconjuntos de células sejam normalmente células estaminais adultas ou plaquetas, eles incluem mais geralmente quaisquer subpopulações de células como sejam os glóbulos vermelhos e os glóbulos brancos. Estes procedimentos serão provavelmente efectuados num ambiente hospitalar ou em instalações médicas que não possuem um laboratório de processamento de células e serão provavelmente realizados por técnicos não especializados. 0 invento também descreve um novo tipo de sensor óptico para monitorizar os subconjuntos de células que passam através de um tubo transparente.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As células estaminais são definidas como sendo células que possuem capacidades clonogénicas e de auto-renovação e que se diferenciam em múltiplas linhagens celulares. Enquanto as células estaminais embrionárias são derivadas de embriões de mamíferos na fase de blastocisto e têm a capacidade de gerar qualquer célula terminalmente diferenciada no corpo, as células estaminais adultas fazem parte de células específicas de um tecido do organismo pós-natal nas quais estão destinadas a diferenciar-se. As células estaminais adultas oferecem vantagens práticas relativamente às células estaminais embrionárias. Ao contrário destas últimas, elas não levantam qualquer questão ética e podem ser extraídas do próprio doente. Existem em fornecimento abundante e são intrínsecas a vários tecidos do corpo humano. As fontes mais acessíveis de células estaminais adultas são a medula óssea, o sangue 2 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ periférico, ο sangue do cordão umbilical e, possivelmente, os tecidos adiposos, tal como indicado por estudos recentes. Estas células são capazes de manter, gerar e substituir as células terminalmente diferenciadas dentro do seu próprio tecido especifico em consequência da renovação celular fisiológica ou de danos nos tecidos devido a lesão. Esta capacidade, conhecida por plasticidade celular, conduziu ao desenvolvimento de aplicações terapêuticas visando a regeneração de tecidos defeituosos, com o objectivo de restaurar a fisiologia e a funcionalidade do órgão afectado. Como se sabe há muitas décadas, as células estaminais adultas podem originar células hematopoiéticas; contudo, de acordo com o que foi constatado em anos recentes, elas também podem dar origem a vasos sanguíneos, músculos, osso, cartilagem, pele, neurónios, etc. Estas células são conhecidas como células estaminais mesenquimatosas. Adicionalmente, as plaquetas preparadas sob a forma de concentrado de plaquetas podem ser utilizadas para acelerar a cicatrização de feridas e, consequentemente, podem desempenhar um papel em medicina regenerativa para ajudar na reconstrução de tecidos como o osso, a pele ou outros tecidos.

As células estaminais hematopoiéticas têm sido grandemente utilizadas para transplantar doentes que foram submetidos a quimioterapia, de modo a restaurar a sua hematopoiese. Inicialmente extraídas da medula óssea, mais recentemente elas têm sido obtidas a partir do sangue periférico ou do sangue umbilical, sendo que estas últimas possuem a capacidade de proliferação mais elevada. As células para transplante requerem um processamento especial tal como uma separação de células, por vezes seguida de processos de selecção e/ou expansão. Até agora, estas manipulações têm sido realizadas em laboratórios de processamento de células bem equipados e por técnicos altamente treinados com competências ao nível da biologia celular e da hematologia. Estas manipulações requerem preparações laboratoriais laboralmente intensivas que envolvem a centrifugação em tubos e a separação em gradiente de densidade, frequentemente efectuadas num sistema aberto com o risco de contaminação por bactérias, etc.

As novas perspectivas oferecidas pelas células estaminais no campo da medicina regenerativa são postas à prova por 3 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ questões práticas de manipulação destas células, em ambientes que não estão familiarizados com estas técnicas. Uma das questões principais é a ausência de salas assépticas que permitam um processamento seguro das células. É possível citar como exemplos os campos da cardiologia, da ortopedia e da neurologia, que estão todos a fazer experimentação com a terapia à base de células estaminais, mas que, no entanto, não possuem instalações adequadas para o processamento das células. Por conseguinte, existe a necessidade de dispor de sistemas simples que possam processar as células estaminais adultas, ou de um modo geral quaisquer subconjuntos de células, automaticamente, num sistema fechado e de modo rápido, de forma a proporcionar um sistema de processamento de células em contínuo à cabeceira do doente.

DESCRIÇÃO DO INVENTO 0 invento disponibiliza um sistema que permite a extracção, a recolha, o processamento e o transplante de subconjuntos de células visando a reparação de tecidos em medicina regenerativa. 0 sistema de acordo com o invento, tal como descrito na reivindicação 1, compreende um conjunto de elementos estéreis descartáveis contidos numa embalagem, em que os elementos aí contidos estão pré-ligados ou incluem conectores assépticos ou estão adaptados para estabelecer ligações entre si de modo asséptico para proporcionar um sistema funcionalmente fechado. Este sistema pode ser disponibilizado num suporte, como seja um tabuleiro, que inclui kits individuais para realizar o procedimento. Os kits individuais podem estar pré-ligados ou podem estar equipados com conectores assépticos para estabelecer ligações entre si de modo asséptico, ou podem ser ligados utilizando um dispositivo de ligação estéril, tal como o SCD de Terumo, que opera por meio de soldas. 0 invento disponibiliza um sistema simples para processar/concentrar automaticamente subconjuntos de células num sistema fechado, que pode proporcionar um sistema de processamento de células em contínuo à cabeceira do doente. Concretizações do invento estão descritas nas reivindicações protegidas. 4 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ

Numa concretização, ο recipiente de recolha utilizado para colher os subconjuntos de células a partir do doente pode ser concebido de modo a ser também utilizado como câmara de separação. De forma idêntica, o receptáculo utilizado para recolher as células separadas pode ser concebido de forma a servir de recipiente de reinfusão para devolver as células ao doente. A separação das células pode ter como objectivo uma recolha da camada leucoplaquetária ou ser realizada utilizando um processo de separação em gradiente de densidade, seguido de uma lavagem das células, com base no sistema descrito em EP-B-912 250 (Claude Fell) e em PCT/IB99/020523 (Biosafe) . Outra forma de processamento das células consiste em utilizar microesferas revestidas com anticorpos monoclonais, como descrito em W003/009889 (CellGenix/Biosafe). A utilização combinada de um detector óptico que pode medir a absorção e a reflexão devido às células fluirem num tubo transparente permite recolher com maior precisão um subconjunto particular de células, como as plaquetas, para produzir um concentrado de plaquetas. Este concentrado de plaquetas pode ser obtido num procedimento separado, ou como um produto secundário durante um procedimento que visa um subconjunto de células. O invento também contempla a utilização do sistema descrito para preparar um concentrado de plaquetas destinado a uma utilização separada. O invento proporciona, assim, um sistema totalmente integrado para intervenção à cabeceira do doente, que minimiza os riscos de contaminação mediante a utilização de um sistema fechado. Oferece um óptimo nível de automatização e não conta com qualquer competência especial ao nível do processamento de células. Ele é adequado para manusear qualquer fonte de células (como células estaminais adultas, plaquetas), mas é particularmente adequado para a preparação de células estaminais da medula óssea num ambiente autólogo ou alogénico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS O invento será adicionalmente descrito, a título exemplificativo, fazendo referência às figuras esquemáticas anexas nas quais: 5 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ a Fig. 1 é um diagrama ilustrando a disposição geral de um kit de processamento de medula óssea de acordo com o invento; a Fig. 2 mostra os símbolos utilizados nas Fig. 3-7 para ilustrar os diferentes componentes dos kits representados de acordo com o invento; as Fig. 3A e 3B ilustram duas concretizações de um kit de recolha, um sem e um com uma unidade de filtração; a Fig. 4 mostra um kit de processamento que pode estar ligado por intermédio de um conector asséptico a um kit de recolha, como ilustrado na Fig. 3A ou Fig. 3B, ou a um kit de transplante, como ilustrado na Fig. 5A ou 5B; a Fig. 5A representa os elementos individuais de um kit de transplante, e a Fig. 5B ilustra uma combinação de elementos constituindo um kit de transplante; a Fig. 6 ilustra diferentes combinações de kits para constituir um sistema completo; a Fig. 7 é um diagrama de um conjunto integrado de processamento de medula óssea, no qual uma câmara de processamento rotativa constitui uma seringa de separação que também é utilizada para a recolha e o transplante das células; as Fig. 7A, 7B e 7C representam as configurações operativas dos componentes do conjunto da Fig. 7 para a recolha, o processamento e o transplante, respectivamente; as Fig. 8A, 8B e 8C ilustram o princípio de detecção das células por um sensor de linha óptico, utilizando as propriedades de absorção e de reflexão das células; a Fig. 8D mostra uma perspectiva vertical do sensor de linha óptico com a localização dos LED e dos dispositivos receptores; e a Fig. 9 ilustra os sinais de saída típicos do sensor de linha óptico da Fig. 8. 6 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA Ο invento refere-se a um sistema integrado que permite a recolha de subconjuntos de células, o seu processamento/ concentração e a reinfusão de um produto enriquecido num subconjunto particular de células, com o objectivo de reparar ou regenerar um tecido lesionado ou defeituoso. 0 processo será descrito num ambiente autólogo, o que significa que as células são extraídas de um doente e reinfundidas no mesmo doente. Este tratamento autólogo é geralmente preferido, uma vez que não existe nenhuma reacção imunológica nem efeitos adversos devido a incompatibilidades entre o dador e os receptores. Contudo, o princípio permaneceria o mesmo num ambiente alogénico.

De acordo com o conhecimento actual, as células estaminais, e mais especificamente as células estaminais mesenquimatosas, são encontradas na medula óssea, embora determinados estudos indiquem que as células estaminais mesenquimatosas também existem no sangue do cordão umbilical, no sangue periférico ou mesmo nos tecidos gordos. Se bem que o princípio também se aplicasse a estas várias fontes de células estaminais, o processo aqui descrito refere-se ao processamento de medula óssea. 0 processo consiste primeiro numa extracção de medula óssea a partir da zona pélvica, sob anestesia local. 0 osso é perfurado utilizando um dispositivo de extracção de medula óssea, por exemplo, do tipo Tyco. A medula é aspirada utilizando uma ou várias seringas, que estão pré-cheias com um anticoagulante, geralmente heparina ou uma solução de citrato/fosfato. Normalmente recolhe-se um volume de 50 ml, embora este valor possa ser diferente. A medula óssea aspirada é geralmente transferida para um saco de recolha em PVC, filtrada ou não, e pode ser colocada num agitador. 0 saco de recolha em PVC é depois ligado, utilizando técnicas assépticas, de preferência ao sistema descrito em EP-B-912 250 e em PCT/IB99/02052, e a separação e a concentração das células estaminais são depois realizadas em conformidade. É possível utilizar outras câmaras de processamento centrífugas (por exemplo, em que o eixo de rotação não é paralelo ao eixo 7 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ de uma câmara de processamento cilíndrica) ou recipientes flexíveis. 0 fascículo EP-B-0 912 250 (C. FELL) descreve um sistema para o processamento e a separação de fluidos biológicos nos seus componentes, que compreende um conjunto de recipientes para receber o fluido biológico que se pretende separar e os componentes separados e, opcionalmente, um ou mais recipientes adicionais para as soluções aditivas. Uma câmara de processamento centrífuga oca pode girar à volta de um eixo de rotação por acoplamento da câmara de processamento com uma unidade accionadora rotativa. A câmara de processamento possui uma entrada/saída axial para o fluido biológico que se pretende processar e para os componentes processados do fluido biológico. Esta entrada/saída conduz a um espaço de separação de volume variável, onde tem lugar todo o processamento centrífugo do fluido biológico. A câmara de processamento é definida por uma parede geralmente cilíndrica que se estende a partir de uma parede de extremidade da câmara de processamento, em que esta parede geralmente cilíndrica define aí a câmara de processamento oca que ocupa um espaço cilíndrico aberto e oco coaxial com o eixo de rotação, e em que a entrada/saída axial é instalada na referida parede de extremidade coaxial com a parede geralmente cilíndrica para abrir para dentro da câmara de processamento oca. A câmara de processamento contém no interior da parede geralmente cilíndrica um elemento axialmente móvel, como seja um pistão. 0 espaço de separação de volume variável é definido numa parte superior da câmara de processamento pela parede geralmente cilíndrica e pelo elemento axialmente móvel contido na parede geralmente cilíndrica da câmara de processamento, em que o movimento axial do elemento móvel varia o volume do espaço de separação, e em que o elemento móvel é axialmente móvel no interior da câmara de processamento para admitir uma quantidade seleccionada de fluido biológico a processar no espaço de separação, via a entrada, antes ou durante o processamento centrífugo, e para extrair os componentes do fluido biológico processado do espaço de separação, via a saída, durante ou após o processamento centrífugo. São disponibilizados meios para monitorizar a posição do elemento móvel para, desse modo, controlar a quantidade de fluido biológico admitido e a extracção dos componentes separados. 0 8 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ sistema compreende adicionalmente um arranjo de válvulas de distribuição para estabelecer uma comunicação selectiva entre a câmara de processamento e recipientes seleccionados, ou para cortar a comunicação entre a câmara de processamento e os recipientes.

De acordo com PCT/IB99/02052, um sistema deste tipo está preparado para funcionar num modo de separação e num modo de transferência de não separação, o que proporciona mais possibilidades para a utilização do sistema, incluindo novas aplicações que anteriormente não estavam contempladas, como seja a separação de células estaminais hematopoiéticas e, em geral, o processamento laboratorial. Assim, o sistema pode ser preparado para funcionar da seguinte forma: - no modo de separação, os fluidos podem ser admitidos na câmara de processamento enquanto a câmara está a girar ou está estacionária, o fluido admitido na câmara é centrifugado e separado em componentes, e os componentes separados são extraídos enquanto a câmara está a girar ou, opcionalmente, no caso do último componente separado, enquanto a câmara está estacionária; e - no modo de transferência, a câmara de processamento admite o fluido e extrai o fluido com a câmara estacionária. 0 arranjo das válvulas é accionável para transferir quantidades de fluido de um recipiente para outro, via a câmara de processamento, mediante um deslocamento do elemento, sem centrifugação ou separação do fluido em componentes, e o meio para monitorizar a posição do elemento móvel controla as quantidades transferidas dos fluidos não separados.

No novo pedido de acordo com o presente invento, que utiliza vantajosamente a câmara de separação de acordo com EP-B-912 250 e PCT/IB99/02052, a separação pode ter como objectivo uma recolha da camada leucoplaquetária, que permite a recuperação mais elevada de células estaminais sem que seja visado qualquer subconjunto de células específico. O produto inicial, cujas fontes são aquelas descritas acima, é introduzido na câmara de separação mediante abaixamento do pistão. Uma vez o produto introduzido na câmara de separação -tal é detectado pelo sensor de linha óptico colocado próximo 9 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ da entrada da câmara de separação - um ciclo de sedimentação tipicamente de 5-10 minutos produz um estrato de camada leucoplaquetária entre a camada de plasma e a camada de glóbulos vermelhos. Na extracção, o plasma é extraído primeiro mediante deslocamento do pistão para cima. Um sensor de linha óptico, por exemplo aquele descrito em referência à Fig. 8, detecta as células que pertencem à camada leucoplaquetária e adapta os diferentes parâmetros (velocidade de extracção, volume extraído, velocidade de centrifugação) para optimizar a recuperação das células, dependendo do volume desejado e das limitações de tempo para o processamento. As células da camada leucoplaquetária são extraídas para o saco ou frasco dedicado (dependendo da configuração do kit de processamento). Os restantes glóbulos vermelhos são extraídos para um saco dedicado ou mantidos na câmara (para poupar tempo de processamento). Dependendo de parâmetros optimizados durante a fase de extracção da camada leucoplaquetária, é possível reiniciar ciclo(s) de sedimentação/extracção sucessivo(s) como aquele descrito acima. Isto completará o volume extraído de camada leucoplaquetária, optimizando as suas características consoante a aplicação final do produto celular.

Para seleccionar uma subpopulação de células mais específica, o princípio descrito acima (enchimento/ sedimentação/extracção) pode ser utilizado pelo mesmo tipo de sensor de linha óptico que detecta, por reflexão e absorção, um subconjunto de células mais específico. Durante a extracção do plasma, a absorção e a reflexão do líquido são muito baixas. Quando as células começam a fluir no tubo, tanto a absorção como a reflexão do produto efluente aumentam. A reflexão também está dependente do tipo e do tamanho das células. Esta dependência permite a selecção de um subconjunto particular de células. Finalmente, quando a concentração de células é elevada, a absorção encontra-se no seu nível máximo e a reflexão deixa de ser possível. Este facto pode ser utilizado para detectar subconjuntos de células que possuem diferentes tamanhos, como as plaquetas, e criar um concentrado de plaquetas.

Para obter a selecção de um subconjunto de células, um método preferido consiste em utilizar um meio de gradiente de densidade que visa mais especificamente uma subpopulação 10 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ definida de células. Este procedimento aumentará a pureza do produto, ao reduzir a contaminação com glóbulos vermelhos e outros subconjuntos de células não desejados. O meio de gradiente de densidade é seleccionado de acordo com o subconjunto visado. Por exemplo, quando o objectivo é um subconjunto mononuclear, é possível utilizar um meio à base de Ficoll™. Neste caso, o meio de gradiente de densidade é primeiro introduzido na câmara de separação. A medula óssea é depois introduzida lentamente por meio de abaixamento do pistão, tipicamente a uma velocidade de 5 ml/min, de modo a depositar as células sobre a camada de meio de gradiente de densidade. Os glóbulos vermelhos e os granulócitos terão tendência a atravessar a camada de meio de gradiente de densidade, enquanto as células mononucleares e as plaquetas permanecerão à frente da camada. Quando a totalidade do volume de medula óssea tiver sido introduzido, tal como detectado por um sensor de linha óptico (Fig. 8) no topo da máquina, o

pistão é detido e inicia-se um passo de sedimentação de, por exemplo, 10-20 minutos. Uma diluição adicional poderia ser automaticamente efectuada pelo sistema após a aspiração completa do produto, graças a uma solução isotónica ligada ao sistema. A velocidade de centrifugação pode ser aumentada para reduzir este tempo de sedimentação. Inicia-se, em seguida, a recolha através de deslocamento do pistão para cima. O sobrenadante líquido contém apenas plasma. As primeiras células depois fluem, fazendo com que a tubagem do efluente fique opaca, conforme detectado pelo sensor de linha óptico. Isto desencadeia a recolha das células mononucleares, que compreendem as células estaminais visadas. Após um volume predefinido através do menu do operador, ou quando a linha do efluente ficar novamente límpida, a recolha de células pára, e o restante conteúdo do volume da câmara de separação é recolhido num saco de resíduos até a câmara ficar completamente vazia. Nesta fase, a câmara de separação é lavada de todos os glóbulos vermelhos residuais graças a uma solução isotónica. As células recolhidas são reintroduzidas na câmara de separação, seguidas, ou precedidas, de uma solução de lavagem como seja uma solução salina/solução de albumina (também é possível utilizar alternativas com solução tamponada com fosfato ou outras). As células e a solução de lavagem são misturadas. O pistão parará após um volume predeterminado ou quando a câmara estiver completamente cheia. Um novo passo de 11 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ sedimentação é depois realizado, durante o qual o saco de recolha pode ser lavado, utilizando o sobrenadante produzido durante a sedimentação, para remover os vestígios de meio de gradiente de densidade. 0 sobrenadante (consistindo na solução de lavagem e no meio de gradiente de densidade) é depois extraído. 0 processo é parado quando as primeiras células surgirem novamente na linha do efluente, ou pode ser repetido para se obter uma melhor lavagem. As células são finalmente recolhidas num recipiente de recolha, que pode ser especialmente concebido para facilitar a utilização subsequente das células recolhidas. Quando necessário, a câmara é enxaguada. Estas células estão disponíveis sem demora para reintrodução no órgão visado do doente, ou podem ser subsequentemente manipuladas para fins de selecção ou de expansão. Para este efeito, o sistema poderia ressuspender directamente as células no meio de cultura desejado.

Uma separação mais refinada que a utilização de meio de gradiente de densidade consiste em incubar a medula óssea num meio contendo microesferas revestidas com anticorpos monoclonais. Este método de separação está descrito na publicação WO03/009889 (CellGenix/Biosafe). 0 procedimento é da forma que se segue. Um produto contendo microesferas ligadas a um anticorpo específico é misturado com o produto sanguíneo contendo as células de interesse. Após algum tempo de incubação, as microesferas sofrerão adesão à superfície das células visadas, fazendo com que a sua densidade se modifique. A mistura é depois vertida na câmara de separação, e tem início uma separação estável em densidade como descrito em patentes anteriores. Quando a sedimentação está completa, o sobrenadante é extraído da câmara para o saco de resíduos e, em seguida, os glóbulos vermelhos são também eliminados. As células de interesse, marcadas com as microesferas e, por conseguinte, possuindo a densidade mais elevada, serão as últimas a sair da câmara. Elas podem ser recolhidas num recipiente apropriado e, se necessário, subsequentemente lavadas para remover a solução de anticorpos.

No caso de uma reintrodução imediata após a realização do processamento, as células recolhidas podem ser ligadas, utilizando técnicas assépticas, ao dispositivo que permite o seu transplante para o doente. Para aplicações de cardiologia, este dispositivo pode ser um cateter de balão, tal como usado 12 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ em angiografia, para reinjectar localmente estas células, por exemplo, em associação com tratamentos para o enfarte agudo do miocárdio. Neste caso, reinjecta-se uma quantidade de 10 ml das células estaminais concentradas, em etapas de 3 ml, insuflando o balão a intervalos regulares, o que permite a disseminação das células estaminais. Este método foi descrito por Zeiher et al. num artigo cientifico (TOPCARE Circulation, Outubro 2002).

No caso de recolha de um concentrado de plaquetas, as plaquetas colhidas podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação com a trombina, possivelmente também obtida a partir do plasma do doente, para formar um gel de plaquetas que facilitará a cicatrização de feridas. Este gel de plaquetas contém factores de crescimento que podem estimular vantajosamente a reparação dos tecidos, quer isoladamente quer em associação com as células estaminais. O processo completo pode ser realizado à cabeceira do doente e é, por conseguinte, considerado um processo em continuo, como ilustrado esquematicamente na Fig. 1. Este facto proporciona vantagens significativas em termos de segurança, logística e tempo de resposta e não depende de qualquer competência específica ao nível do processamento de células. A recolha de vários subconjuntos de células visados pode ser efectuada durante o mesmo procedimento de recolha, mas com o objectivo de utilizar estes subconjuntos de células a diferentes intervalos de tempo durante a mesma operação. O invento disponibiliza um sistema ou "embalagem personalizada" que já contém os conjuntos estéreis descartáveis individuais para efectuar a recolha, a separação e o transplante, respectivamente. Esta embalagem pode apresentar-se num formato alveolar ("blister") possuindo 3 compartimentos, em que cada um deles contém um conjunto ou kit descartável: um conjunto para a extracção de medula óssea, um conjunto para a separação de medula óssea, de preferência de um tipo baseado no sistema descrito em EP-B-912 250 e em PCT/IB99/020523, e um conjunto para a reinjecção das células. Cada conjunto pode apresentar algumas variações, sendo que aquele que possui a maior versatilidade é o conjunto para 13 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ transplante, uma vez que depende do tecido que se pretende tratar (por exemplo, osso, músculo, vaso, etc.)· As configurações dos conjuntos individuais estão ilustradas nas Fig. 2-7.

Estes conjuntos podem estar todos pré-ligados, ou dois dos três podem estar pré-ligados caso se pretenda, por exemplo, utilizar um sistema totalmente fechado. Se não estiverem pré-ligados, uma solução prática consiste em utilizar conectores assépticos especialmente concebidos, como seja o sistema Medlock oferecido por PALL (ref. ACD) e descrito nas patentes U.S. 3,650,093; 5,868,433; 6,536,805 e 6,655,655, para garantir que as ligações são realizadas sob condições assépticas, mantendo, assim, os critérios de um sistema fechado. Outra possibilidade seria ligar o conjunto utilizando um dispositivo de ligação estéril. Qualquer uma das configurações acima - pré-ligada ou ligada com um dispositivo de ligação asséptico ou um dispositivo de ligação estéril -proporcionará um sistema funcionalmente fechado. Estes sistemas funcionalmente fechados eliminam a necessidade de salas assépticas ou de sistemas de fluxo laminar, uma vantagem muito importante em ambientes de sala operatória ou de unidade intervencionista, que geralmente não estão equipados para satisfazer estas exigências.

Outro refinamento do invento consiste num recipiente para aspiração da medula óssea que actuará como câmara de separação na segunda fase, designado por câmara de processamento. A sua concepção é idêntica à câmara de separação descrita em PCT/IB99/020523 e pode estar equipado com uma agulha especial para perfurar o osso pélvico. Ele é previamente cheio com anticoagulante ou pode ser submetido a uma sensibilização activa com anticoagulante antes do inicio da recolha. Uma vez o osso perfurado, a medula óssea é aspirada através de deslocamento para baixo do pistão da câmara de processamento, activado por uma fonte de vácuo eléctrica ou manual. A câmara de processamento é depois introduzida na centrífuga do equipamento, e um conjunto compreendendo uma série de linhas de tubagem e de sacos é ligado à câmara. A separação pode, em seguida, ser iniciada de acordo com o processo descrito acima, utilizando, por exemplo, um protocolo de centrifugação da camada leucoplaquetária. Outro refinamento do invento consiste em recolher as células separadas para um recipiente especial 14 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ que pode ser facilmente ligado ou adaptado ao sistema, reinfundindo as células de volta no doente. Este recipiente pode ser uma seringa graduada equipada com um conector em Y, que possui uma extremidade ligada ao conjunto de separação e a outra extremidade equipada com um conector luer-lock para ligação subsequente a um cateter. A Fig. 3A ilustra um kit de recolha sem filtro e a Fig. 3B um kit de recolha com filtro. 0 kit de recolha incorpora tudo aquilo que é necessário para efectuar a aspiração da medula: a. 0 ponto de entrada será, por exemplo, um dispositivo de extracção de medula óssea (por exemplo, do tipo TYCO) e inclui, tipicamente, uma agulha para punção óssea ou uma agulha para punção venosa. Ele pode estar ligado directamente ao resto do kit por intermédio de uma válvula interruptora ou de outra válvula. b. Uma ou mais seringas (l...n) consoante necessário para efectuar a aspiração. c. Um filtro pode ser inserido no kit de recolha para filtrar a medula após a recolha, como ilustrado na Fig. 3B. d. A medula recolhida (filtrada ou não filtrada) é depois armazenada num saco de transferência, antes do processamento. e. Uma seringa adicional pode ser utilizada para adicionar um produto de diluição à medula e/ou enxaguar o filtro se aplicável. f. Um conector asséptico (Pall ACD ou similar) pode ser utilizado. 0 kit de recolha pode, por exemplo, ser configurado da seguinte forma:

Cll Kit de recolha sem o filtro c com a agulha óssea a pré-ligada ao kit de processamento. Quantidade X de seringas b. C12 Kit de recolha sem o filtro com a agulha óssea a sem estar pré-ligada ao kit de processamento. Quantidade X de seringas b. C21 Kit de recolha com o filtro c com a agulha óssea a pré-ligada ao kit de processamento. Quantidade X de seringas b. 15 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ C22 Kit de recolha com o filtro c com a agulha óssea a sem estar pré-ligada ao kit de processamento. Quantidade X de seringas b.

Em todas estas configurações, a agulha óssea pode ser substituída por uma agulha para punção venosa. A Fig. 4 representa um kit de processamento que está adaptado para ser ligado ao kit de recolha previamente descrito por intermédio de uma ligação asséptica. a. A ligação asséptica poderia ser efectuada por intermédio de um conector asséptico (tal como Pall ACD ou outros) ou de um conector com espigão em condições assépticas. b. Uma câmara de gotejamento opcional poderia ser utilizada para evitar a entrada de bolhas no percurso de processamento. c. A direcção do percurso do fluido pode ser seleccionada por meio de uma rampa de válvulas interruptoras, que inclui três válvulas interruptoras neste exemplo, ou de outro tipo de válvula, por exemplo, uma válvula de múltiplas vias. d. Uma câmara de separação, por exemplo como descrita em EP-B-912 250 e em PCT/IB99/02052, é utilizada para o processo de separação. e. 0(s) produto(s) adicionais (solução isotónica, meio de cultura...) é/são introduzido (s) por uma linha equipada com uma ou mais ligações (conectores com espigão, ... l...n) . f. Um saco satélite ou de resíduos é utilizado para o produto eliminado e para a entrada do meio de gradiente de densidade. g. Uma linha de saída com um saco intermédio opcional direcciona o produto para o kit de transplante. h. Um conector asséptico (Pall ACD ou similar) poderia ser utilizado nesta linha.

As variantes principais do kit de processamento incluem: PI kit de processamento sem saco intermédio P2 kit de processamento com saco intermédio. 16 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ A Fig. 5Α ilustra possíveis elementos individuais de um kit de transplante, e a Fig. 5B representa uma combinação possível de elementos constituindo um kit de transplante. 0 kit de transplante está adaptado para ser ligado ao kit de processamento acima descrito, por intermédio de uma ligação asséptica, e conterá o produto final para o transplante. A ligação asséptica poderia ser efectuada por intermédio de um conector asséptico (como Pall ACD ou outros) ou de um conector com espigão em condições assépticas. 0 kit de transplante poderia incluir: TI um saco T2 um frasco de recolha T3 uma seringa T4 um dispositivo específico para o transplante (por exemplo, um cateter para o enfarte do miocárdio) T5 uma combinação de T1-T4.

De um modo geral, o kit de transplante incluirá, no mínimo, pelo menos um dispositivo específico para o transplante T4, que pode ser reunido com várias combinações dos outros componentes, por exemplo, um saco TI ou um frasco de recolha T2 e/ou uma seringa T3. A Fig. 6 ilustra diferentes combinações para formar um sistema completo. 0 sistema completo pode ser constituído, por exemplo, por qualquer combinação de um kit de recolha (Cll a C22), de um kit de processamento (PI ou P2) e de um kit de transplante (T1-T4), como descritos acima. A Fig. 7 é um diagrama de um conjunto integrado de processamento de medula óssea, em que uma câmara de processamento rotativa b3, por exemplo, como descrita em EP-B-912 250 e em PCT/IB99/020523, constitui uma seringa de separação que também é utilizada para a recolha e o transplante das células. O kit de recolha a consiste no ponto de entrada, por exemplo, um dispositivo de extracção de medula óssea (por exemplo, do tipo TYCO) , equipado com um conector asséptico para ligação à câmara de processamento b3. O kit de processamento b compreende uma válvula interruptora bl ligada a um saco de lavagem b2 e a um saco de meio de gradiente de 17 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ densidade/resíduos b4, assim como a câmara de separação/processamento/transplante b3 que pode ser ligada por intermédio de um conector asséptico à válvula interruptora bl, ou ao kit de recolha a ou ao kit de transplante c. O kit de transplante c consiste num dispositivo especifico para o transplante (por exemplo, um cateter para o enfarte do miocárdio) equipado com um conector asséptico para ligação à câmara de processamento b3.

As Fig. 7A, 7B e 7C ilustram as configurações operacionais dos componentes do conjunto da Fig. 7 para a recolha, o processamento e o transplante, respectivamente.

Na Fig. 7A, a câmara de recolha/processamento b3 está ligada por intermédio de um conector asséptico ao ponto de entrada do sistema de recolha a, pelo que a câmara de processamento serve para a recolha das células estaminais extraídas. A admissão das células estaminais é controlada pelo deslocamento do pistão da câmara de processamento b3.

Na Fig. 7B, a câmara de recolha/processamento b3 está ligada por intermédio do seu conector asséptico à válvula interruptora bl, que a liga selectivamente ao saco de lavagem b2 e ao saco de meio de gradiente de densidade/resíduos b4 para as operações de processamento acima descritas, que terminam com as células estaminais processadas/concentradas sendo devolvidas à câmara de processamento b3. Em seguida, a câmara de processamento b3 serve de câmara de reinfusão. A Fig. 7C representa a câmara de processamento b3 após ser desligada da válvula interruptora bl do kit de processamento e ligada ao dispositivo de transplante do kit de transplante c por meio de um conector asséptico. Nesta configuração, a reinfusão das células estaminais processadas no doente pode ser controlada por deslocamento do pistão da câmara de processamento/reinfusão b3.

Isto

Esta concretização assenta na utilização dos conectores assépticos para ligar selectivamente a câmara de processamento b3 ao kit de recolha a, ou à restante porção do kit de processamento por meio da válvula interruptora bl, ou ao kit de transplante c, para realizar as operações sequenciais de recolha, processamento e reinfusão. 18 ΕΡ 1 893 253/ΡΤ proporciona um sistema particularmente compacto, que não inclui quaisquer elementos não utilizados e é conveniente de utilizar.

As Fig. 8Ά, 8B e 8C ilustram o principio de detecção das células por um sensor de linha óptico SL, utilizando as propriedades de absorção e de reflexão das células através de um tubo transparente. A Fig. 8A é a configuração de um tubo contendo liquido límpido, onde a luz do SL não é reflectida e passa directamente para um detector dianteiro R no eixo da luz. A Fig. 8B é a configuração de um tubo contendo células em suspensão num líquido límpido; neste caso, as células reflectem a luz em direcções aleatórias e esta é capturada tanto pelo detector dianteiro R como por um detector lateral R disposto a cerca de 90° em relação ao eixo. A Fig. 8C é a configuração de um tubo contendo líquido opaco, onde nenhuma luz é reflectida. A Fig. 8D ilustra uma perspectiva vertical do sensor de linha óptico com a localização dos LED e dos dispositivos receptores, em particular ilustrando as posições da luz azul dianteira (azulD), luz azul lateral (azulL), luz vermelha dianteira (vermelhaD) e luz vermelha lateral (vermelhaL). A Fig. 9 representa os sinais típicos do sensor de linha óptico, que são registados a partir dos sensores "dianteiros" e "laterais". As informações obtidas a partir dos sinais reflectidos "laterais" podem ser utilizadas como activadores para iniciar ou terminar a recolha. O valor de saída do sensor (eixo YY) é o volume de extracção da camada leucoplaquetária (CL) em percentagem do nível máximo. O eixo XX contém a informação do volume que passa através do tubo (igualmente em percentagem do volume total).

Deve compreender-se que este invento poderá ser concretizado de várias formas diferentes, sem um afastamento do seu espírito ou das suas características essenciais. O âmbito do invento está definido nas reivindicações anexas e não na descrição específica que as precede. Pretende-se, por conseguinte, que todas as concretizações que recaiam dentro do sentido das reivindicações estejam abrangidas pelas reivindicações.

Lisboa, 2010-08-17

Claims

ΕΡ 1 893 253/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Sistema para a extracção, a recolha, o processamento e o transplante de subconjuntos de células, incluindo células estaminais adultas e plaquetas, em particular para a reparação de órgãos em medicina regenerativa, em que o sistema compreende um conjunto de elementos de transporte de fluidos estéreis descartáveis que incluem: - um dispositivo de extracção, por exemplo, incluindo uma agulha para punção óssea ou venosa, para extrair medula óssea ou outras fontes de subconjuntos de células de um doente; - pelo menos uma câmara para a recolha, o processamento e a reinfusão dos subconjuntos de células extraídos do doente, incluindo uma câmara de recolha pré-ligada ou que pode ser ligada ao dispositivo de extracção para colher as células extraídas do doente pelo dispositivo de extracção; uma câmara de processamento adaptada para cooperar com o equipamento de processamento para efectuar as operações de processamento e de transferência nas células colhidas; e uma câmara de reinfusão para armazenar as células processadas que serão devolvidas ao doente; em que as câmaras de recolha, de processamento e de reinfusão são separadas e estão pré-ligadas ou podem ser ligadas entre si, ou em que uma câmara de processamento multiusos proporciona as funções combinadas de uma câmara de recolha-processamento, de uma câmara de processamento-reinfusão ou de uma câmara de recolha-processamento-reinfusão; e - um dispositivo de transplante pré-ligado ou que pode ser ligado à câmara de reinfusão para devolver as células processadas ao doente, caracterizado por o conjunto de elementos estéreis descartáveis estar contido numa embalagem, em que os elementos contidos estão pré-ligados ou incluem conectores assépticos ou estão adaptados para estabelecer ligações entre si de modo asséptico para proporcionar um sistema funcionalmente fechado.
2. Sistema de acordo com a reivindicação 1, em que o conjunto de elementos descartáveis está acondicionado numa embalagem alveolar (blister) sobre um suporte, como seja um tabuleiro, onde a embalagem alveolar possui um compartimento ΕΡ 1 893 253/ΡΤ 2/4 para receber a totalidade do conjunto interligado, ou uma pluralidade de compartimentos em que cada um deles recebe uma parte do conjunto que inclui um conector asséptico para a ligação a outra parte do conjunto.
3. Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o conjunto de elementos descartáveis compreende três kits de elementos descartáveis, um kit de recolha, um kit de processamento e um kit de transplante.
4. Sistema de acordo com a reivindicação 3, em que o kit de recolha compreende um dispositivo de extracção de medula óssea isolado ou em combinação com: pelo menos uma seringa, um saco de transferência que constitui a câmara de recolha e, opcionalmente, um conector asséptico para a ligação ao kit de processamento.
5. Sistema de acordo com a reivindicação 4, em que o kit de recolha compreende adicionalmente um filtro ligado ou que pode ser ligado entre uma seringa e um saco de transferência.
6. Sistema de acordo com a reivindicação 3, 4 ou 5, em que o kit de processamento compreende uma câmara de processamento e pelo menos um recipiente descartável ligado à câmara de processamento por via de pelo menos uma válvula interruptora ou uma válvula de múltiplas vias permitindo uma transferência selectiva de fluidos para a câmara de processamento e a partir dela e para o(s) recipiente (s) descartável(is) e/ou a partir dele(s), em que a câmara de processamento está ligada ao kit de recolha ou possui um conector asséptico para a ligação ao kit de recolha ou está adaptada para estabelecer uma ligação asséptica, e em que a câmara de processamento também está ligada ao kit de transplante ou possui um conector asséptico para a ligação ao kit de transplante ou está adaptada para estabelecer uma ligação asséptica.
7. Sistema de acordo com a reivindicação 6, em que o kit de processamento compreende adicionalmente uma linha equipada com um ou mais conectores para ligar recipientes adicionais à válvula interruptora ou à válvula de múltiplas vias. ΕΡ 1 893 253/ΡΤ 3/4
8. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, em que o kit de transplante compreende pelo menos um dispositivo de transplante ou uma combinação de pelo menos um dispositivo de transplante com pelo menos um elemento entre um saco de recolha, um frasco de recolha e uma seringa.
9. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a câmara de processamento é uma câmara de processamento centrífuga oca possuindo uma entrada/saida para as células a processar e para as células processadas, em que a câmara de processamento contém um elemento móvel que define um espaço de separação de tamanho variável para receber as células, e em que o elemento é móvel para admitir uma quantidade seleccionada de células a processar na câmara de separação, por via da referida entrada, e para extrair as células processadas da câmara de separação, por via da referida saída.
10. Sistema de acordo com a reivindicação 9, em que a câmara de processamento centrífuga é geralmente cilíndrica e pode girar à volta do eixo do cilindro, e o elemento móvel é um pistão estanque aos fluidos montado de forma móvel na câmara de processamento centrífuga.
11. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende: - um dispositivo para extrair medula óssea ou outras fontes de subconjuntos de células de um doente, em que o referido dispositivo pode ser ligado por intermédio de uma ligação asséptica à câmara de processamento para recolher as células estaminais extraídas pelo dispositivo na câmara de processamento; - pelo menos um recipiente descartável ligado à câmara de processamento por via de pelo menos uma válvula interruptora ou uma válvula de múltiplas vias permitindo uma transferência selectiva dos fluidos para a câmara de processamento e a partir dela e para o(s) recipiente (s) descartável(is) e/ou a partir dele(s), em que a câmara de processamento pode ser ligada à válvula interruptora ou à válvula de múltiplas vias por intermédio de um conector asséptico; e ΕΡ 1 893 253/ΡΤ 4/4 - pelo menos um dispositivo de transplante que pode ser ligado à câmara de processamento por intermédio de uma ligação asséptica, para que a câmara de processamento actue como câmara de reinfusão para entregar as células ai processadas ao doente.
12. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a câmara de processamento é preparada para produzir um produto enriquecido em subconjuntos de células particulares (incluindo as células estaminais adultas e as plaquetas).
13. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a câmara de processamento é preparada para separar as células estaminais utilizando um processo baseado num gradiente de densidade, seguido de uma lavagem das células.
14. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, preparado para processar as células estaminais utilizando microesferas revestidas com anticorpos monoclonais.
15. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo um sensor de linha óptico para detectar uma reflexão diferencial de luz por um subconjunto de células passando através de um tubo transparente. Lisboa, 2010-08-17