JPWO2006054448A1 - 細胞培養用ヒト血清 - Google Patents

Abstract

幹細胞の増殖を効率よく促すことができる増殖因子を多く含んだ血清を提供する。採血から２０分以内の血小板残存率が、全血小板量の２０％以下であり、かつ、細胞増殖因子のリリース率が２０％以上である細胞培養用のヒト血清を用いた。

Description

本発明は、細胞培養用ヒト血清に関するものであり、より詳しくは細胞増殖因子を多く含む細胞培養用ヒト血清に関する。

本出願は、２００４年１１月１９日に日本国に出願された特許出願番号２００４‐３３５３４４号に基づく優先権の利益を主張し、当該出願の内容は引用によりここに組み込まれているものとする。

現在、再生医療分野においては、対象者から採取した幹細胞を体外で増殖又は分化させたうえで対象者に移植することで対象者の組織の再生を促進させるという研究が行なわれている。幹細胞は、種々の組織や器官に分化する多分化能を有し、再生医療のカギを握る細胞として注目されている。

幹細胞の体外培養増殖では、培地に対して血清を添加すれば効果的であることが知られているが、ヒトの治療を目的とする場合には、ヒト以外の動物を由来とする血清を用いることは安全上の問題から避けるべきことであり、ヒト由来、特に対象者から採取した血液より調製した血清を用いることが要求される。また、血液検査と比べると再生医療の分野における幹細胞の培養には、比較的より多くの血清が必要となる。

このような血清を調製する方法としては、例えばガラス粉末からなる血液凝固促進個体が収容された採血管を用いるという方法が開示されている（特許文献１参照）。また、血清中に混入するフィブリンなどの凝固物質を迅速に分離させるために、ガラス粉末と血液を接触させ、増殖因子を多種多量に含んだ血清を容易に回収する方法が開示されている（特許文献２参照）。さらに、ヒト血漿を原料として製造する方法が開示されている（特許文献３参照）。さらに、血漿にカルシウム化合物及びガラスビーズを添加して増殖因子を得る方法が開示されている（特許文献４参照）
特開２０００−０００２２８号公報 特開平４−８３１６５号公報 特開２００１−２７５６６２号公報 特開２００４−２６９４０９号公報

しかし、特許文献１及び２に開示されている方法は、血液の検査を目的とする容量の小さな採血管を用いるため、幹細胞の培養に必要な量の血清を調製するためには、何度も調製操作を行なわなければならず、実用に適さない。また、特許文献３に開示されている方法は、抗凝固剤としてトロンビンを用いているので生物由来の製品を用いることによる感染リスクが残存するという面で好ましくない。さらに、特許文献４に記載の方法では、細胞増殖因子を少量しか含有していない血漿を原料としているため、得られた血清は十分な細胞増殖因子を含んでいないため、幹細胞を効率よく培養することができない。

以上の課題に鑑み、本発明は幹細胞の増殖を効率よく促すことができる増殖因子を多く含んだ血清を提供することを目的とする。

より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。

（１） 血液凝固因子を含む血液由来の液性成分と、血小板とを含む流動体から得られる細胞培養用ヒト血清であって、採血から２０分以内の血小板残存率が、全血小板量の０％を越え２０％以下であり、かつ、細胞増殖因子のリリース率が２０％以上１００％以下である細胞培養用ヒト血清。

（１）の発明によれば、採血から２０分以内の血小板残存率を、全血小板量の０％を越え２０％以下としたことによって、細胞増殖因子の放出を迅速に促進することが可能となる。また細胞増殖因子のリリース率を、２０％以上１００％以下としたことによって、幹細胞を効率よく増殖させることが可能となる。また、少なくとも血液由来の液性成分と血小板とを含む流動体を使用したことによって、血漿から調整される量よりも多くの増殖因子を含む血清を生成することが可能となり、ウシ胎児血清と同等の細胞増殖効果を有する血清を製造することができる。

ここで、「血液」とは、血球（赤血球、白血球、血小板）と液体成分である血漿（血清）からなる全血、及びこれらの少なくとも１種を含んだ液体（例えば成分献血で採取された血液）をいう。また、「血清」とは、採取した血液を放置すると流動性が低下し、その後に赤い凝固塊（血餅）から分離される淡黄色の液体をいう。本発明における「血清」とは、血餅から分離されない点で生成方法が一般的な血清とは異なるが、そこに含まれる凝固因子や増殖因子が実質的に一般的な血清と同等である細胞培養に有用な血液中の液性成分をいう。また、「血液由来の液性成分」とは、血球以外の血液成分あるいは、血球以外の血液成分に抗凝固剤等の薬剤を添加した混合液をいう。また「細胞増殖因子」とは、血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）等をいう。

さらに、「細胞増殖因子のリリース率」とは、真空採血管に採った所定量の血液から調製した血清中の細胞増殖因子量を潜在量（１００％リリース）とし、この潜在量に対する細胞増殖因子の割合をいう。

（２） 血液凝固因子を含む血液由来の液性成分と、血小板とを含む流動体から得られる細胞培養用ヒト血清であって、前記細胞増殖因子の含有量は、血漿から調製されたヒト血清よりも多い細胞培養用ヒト血清。

（２）の発明によれば、本発明に係るヒト血清の細胞増殖因子の含有量を、血漿から調製した場合よりも多くしたことによって、幹細胞を効率よく増殖させることが可能となる。ここで「血漿」とは、採取した血液にヘパリンやＣＰＤ等の抗凝固剤を添加した後に遠心分離を行い、得られた上澄み液をいう。「血漿から調製されたヒト血清」とは、対象者から採取した血液を血小板が完全に沈殿する遠心分離条件（例えば、４，４００（ｇ）×５（ｍｉｎ．）以上）の下で血漿を調製し、この血漿に含まれる凝固因子を除去することにより得られたヒト血清をいう。

（３） 血液凝固因子を含む血液由来の液性成分と、血小板とを含む流動体から得られる細胞培養用ヒト血清であって、前記細胞増殖因子の含有量は、放置により調製されたヒト血清よりも多い細胞培養用ヒト血清。

（３）の発明によれば、本発明に係るヒト血清の細胞増殖因子の含有量を、放置により調製した場合よりも多くしたことによって、幹細胞を効率よく増殖させることが可能となる。ここで「放置により調製されたヒト血清」とは、対象者から採取した血液を可撓性の容器内で約１時間室温にて放置した後、遠心分離することにより得られたヒト血清をいう。

（４） 前記細胞増殖因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＴＧＦ−β１の少なくともいずれか一方を含む（１）から（３）いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。

（４）の発明によれば、上述の細胞増殖因子のうち、細胞増殖能がより高いＰＤＧＦ−ＢＢ又はＴＧＦ−β１のいずれか一方を含むこととしたことによって幹細胞をより効率よく増殖させることが可能となる。なお、ＰＤＧＦ−ＢＢは、ＰＤＧＦの３種類ある型（ダイマー）（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ）の一種をいう。

（５） 前記細胞増殖因子は、前記流動体をガラス加工体に接触させることによって得られるものである（１）から（４）いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。

（５）の発明によれば、流動体中の血小板が活性化され、細胞増殖因子を放出するためには、当該流動体を異物と接触させる必要がある。本発明ではこの異物をガラス加工体としたことによって、ポリエチレンペレットの場合よりもより効率よく細胞増殖因子を放出させることが可能となる。ここで「ガラス加工体」とは、ガラス粉末、ガラスビーズ等をいう。このガラス加工体の形状は、赤血球の破壊（溶血）や本発明に係る血清を調製する際に使用する装置の破損を抑制するという面から、略球状としておくことが好ましい。

また、血小板及び血液凝固因子等の被活性化因子を迅速に活性化させるために、ガラス加工体の表面を、二酸化ケイ素化合物からなる層で形成しておくことが好ましい。二酸化ケイ素化合物としては、ガラス、シリカ、珪藻土、カオリン等から選択される少なくとも１種以上を使用することができるが、これらに限られるものではない。

（６） 前記ガラス加工体は、ガラスビーズである（５）に記載の細胞培養用ヒト血清。

（６）の発明によれば、ガラス加工体をガラスビーズにしたことによって、流動体中の血小板をより活性化させることが可能となる。中でも多孔質のガラスビーズは、流動体との接触面積が大きいため、より好ましい。また、ガラスビーズの表面積は、流動体１ｍｌに対して、０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）から２５（ｍｍ^２／ｍｌ）であることが好ましい。

（７） 外気に触れることなく調製されるものである（１）から（６）いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。

（７）の発明によれば、ヒト血清が外気に触れることなく調製されるものとしたことによって、調製された血清が、細菌や微生物等によって汚染される危険性も低くなる。これによって安全性の高い血清を調製することができ、一層の安全性を確保することが可能となる。なお、（７）の発明に係るヒト血清は、外気に触れることがないような態様の装置を用いて調製されることが好ましい。

（８） 再生医療方法に使用する（１）から（７）いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。

（８）の発明によれば、細胞培養用の培地に用いることにより、対象者から採取した幹細胞を播種して培養を行なう際に、細胞をより早く培養することが可能となる。また、自己血清で細胞を培養することが可能であるため、副作用等が起こる可能性は低く、安全面の上でも優れている。

以上説明したように、本発明に係る細胞培養用ヒト血清は、細胞増殖因子を大量に含有するため、従来の血清よりもより効率よく幹細胞を培養することが可能となる。また、このヒト血清を再生医療に用いれば、対象者の組織及び機能を安全、かつ、確実に再生することができる。

本発明に係る細胞培養用ヒト血清を調製する血清調製装置を示した図である。 本発明に係る細胞培養用ヒト血清を調製する手順を示す図である。 血清調製装置の血液貯留部１０を振盪させている図である。 振盪時間と各試料中の血小板残存率を示した図である。 振盪時間と各試料中のＰＤＧＦ−ＢＢのリリース率の関係を示した図である。 振盪時間と各試料中のＴＧＦ−β１のリリース率の関係を示した図である。

発明を実施するための形態

以下本発明をより詳しく説明する。

本発明に係る細胞培養用ヒト血清は、細胞増殖因子を含む血清を調製する血清調製工程と、調製された血清の存在下、細胞を培養する培養工程と、を含む細胞培養方法のための血清を調製する細胞培養用の血清調製装置により調製されることが好ましい。

この血清調製装置は、少なくとも凝固因子を含む血液由来の液性成分と血小板とを含む流動体を貯留する血液貯留部を備え、この血液貯留部は、細胞培養工程に適合する血清を生成する血清生成機能を備える細胞培養用の血清調製装置であることが好ましい。また、この血清調製装置は、閉鎖系、即ち、外気に触れることなく血清を調製することができる装置であることがさらに好ましい。ここで、血清生成機能とは、流動体中の血小板を活性化させることにより、血清中の増殖因子含有量を増加させ、血清の回収能を高める機能をいい、流動体よりも比重が大きい凝固促進個体により付与されている。

具体的には下記に示す血清調製装置によって調製されることが好ましいが、特にこの装置に限定されない。

＜血清調製装置＞
図１に示す血清調製装置１は、血液貯留部１０、成分収容部２０を主な要素として構成されている。このうち、血液貯留部１０及び成分収容部２０は、可撓性を有する樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニルからなる２枚のシートが外縁部１１ａで融着されることで袋状に形成された本体部１１と、本体部１１の内部に挿入されたガラス加工体１２とから構成されている。

本体部１１内において、凝固促進個体となるガラス加工体１２は、本体部１１の内部で遊動可能な状態に設定されており、例えばソーダガラスからなる略球形をしている。なお、ガラス加工体１２の表面積を、０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）以上の関係となる表面積であることが好ましい。このような範囲とすることによって血液中の血小板及び凝固因子の活性化が促進される。

また、貯留可能な血液量に対するガラス加工体１２の表面積を、０．１（ｍｍ^２／ｍｌ）以上２５．０（ｍｍ^２／ｍｌ）以下とした場合には、活性化促進工程及び遠心分離工程における溶血の抑制と、血小板及び凝固因子の活性化促進との両立が可能となる。

また、血液貯留部１０の本体部１１の上縁端には、その接続口に２本のチューブ４１、４２が気密接続されている。そのうちのチューブ４１は血液を導入するための導入路の役割を担っているため他端には、採血針３０あるいは採血針と接続可能な接続部が接続されている。このような構造にしたことによって、採取された血液を外気に触れることなく血清に調製することが可能となる。

血液貯留部１０に気密接続されたもう一方のチューブ４２は、チューブ４３〜４６、５１〜５６及び分岐体６１〜６５を介して各袋体２１〜２６に接続されている。これらは分離された血液成分を導出するための導出路の役割を担っている。これらのチューブ４１〜４６、５１〜５６については、柔軟性を有した樹脂材料、例えば、軟質ポリ塩化ビニルなどの材料から構成されている。ここで、成分収容部２０の袋体２１〜２６と各チューブ５１〜５６とについても、溶剤接着、熱溶着あるいは超音波溶着等により気密接続されている。

＜血清調製工程＞
上記構成を有する血清調製装置１を用いた血清調製工程について、図２及び図３を用いて説明する。

図２に示すように、上記血清調製装置１を用いた血液分離操作は、大別して７つの工程（Ｓ１〜Ｓ７）から構成されている。

まず、操作の第１段階としては、上記図１における採血針３０を対象者（患者）に刺し、血液を採取する。この際、採血針３０から採取された血液は、チューブ４１を介して、下方に位置する血液貯留部１０に貯留される（貯留工程Ｓ１）。ここで、血液貯留部１０に採取された血液が成分収容部２０の方に流れ込まないように、クランプなどを用いて血液貯留部１０の根元側で経路が閉鎖されている。貯留工程Ｓ１は、採血時における患者の体調などを考慮して、所要量を採取し終了される。ここでいう所要量は、患者の体格や体調に問題がない場合には２００（ｍｌ）から６００（ｍｌ）程度をいう。

次に、図２に示すように、貯留工程Ｓ１を開始後、それと並行するように血液貯留部１０を振盪させる（活性化促進工程Ｓ２）。図３に示すように、採取された血液を貯留した血液貯留部１０は、振盪装置１００により緩やかに攪拌され、内部に収納されたガラス加工体１２と接触することになる。そして、血液中に含まれる血小板及び凝固因子がガラス加工体１２の表面で凝固し、凝固の際に活性化された血小板から、これらを由来とする増殖因子が放出される（また、この活性化促進工程を低温下で行うと血小板の凝集促進に効果的である）。貯留工程Ｓ１後、採血対象者から採血針３０を抜針し、採血針３０と血液貯留部１０とを連結しているチューブ４１の一部を溶断し、且つ、同時にその溶断端を溶着する（溶断工程Ｓ３）。

一方、対象者から分離された血液貯留部１０は、成分収容部２０及びこれらの間を連結する各チューブ４２〜４６、５１〜５６、さらには分岐体６１〜６５等とともに活性化促進工程Ｓ２を経て、コンパクトに纏められ、遠心分離機にかけられる（遠心分離工程Ｓ４）。血液貯留部１０に対する遠心分離の条件は、貯留された血液の量及び分離する成分の種類によって設定されるものであるが、例えば２，２５０（ｇ）×１０（ｍｉｎ．）、４（℃）に設定される。なおこのとき、チューブ４２は、貯留工程Ｓ１の際と同様に破断可能な隔壁あるいはクランプにより経路が閉鎖された状態に保たれている。

溶断工程Ｓ３及び遠心分離工程Ｓ４は、抗凝固剤をあらかじめ添加して採血する場合は活性化促進工程Ｓ２の前に行なってもよい。この場合、遠心分離は下記の条件で行なうことが好ましい。
全血の遠心分離：４，４００（ｇ）×４〜６（ｍｉｎ．）、２，２５０ｇ×１０（ｍｉｎ．）
多血小板血漿（ＰＲＰ）の遠心分離：１，１００ｇ×４〜６（ｍｉｎ．）

図２に戻って、活性化促進工程Ｓ２から遠心分離工程Ｓ４で活性化された血球成分を始めとする被活性化因子は、塊状になって血液から分離される（分離工程Ｓ５）。また、分離工程Ｓ５において血液貯留部１０内で分離抽出された血清７１は、血液貯留部１０を加圧することにより、各袋体２１〜２６の全部又は一部に対して順に小分けされていく（導出工程Ｓ６）。

図２に戻って、袋体２１に所要量の血清が充填された後、チューブ５１を溶断及び溶着する（溶断工程Ｓ７）。この溶断及び溶着については、遠心分離工程Ｓ４の前にチューブ４２を溶断及び溶着したのと同様の方法を用いて実施される。また血清が内部に充填された袋体２１については、例えば、冷凍保存などの保存処置が施される。

この導出工程Ｓ６及び溶断工程Ｓ７を、袋体２１〜２６の各々に対して順次実施していき、袋体２１〜２６の全て、あるいは一部に血清が充填された時点で血清調製操作が終了する。さらに必要に応じて、赤血球を生理食塩水、ＣＰＤ液、ＡＣＤ−Ａ液等抗凝固剤やＭＡＰ液等の血液保存液で洗浄希釈し、輸血用血液として保存することもできる。

以下、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
ガラスビーズを５個（φ：４ｍｍ、５０ｍｍ^２）入れた容器に新鮮ヒト血液２０（ｍｌ）を入れ、マルチシェーカー（ＭＭＳ−３００ 東京理科器械製）により振盪した。振盪開始１０、２０、３０、６０分後に血液１（ｍｌ）を抗凝固剤入りサンプリングチューブにサンプリングし、遠心分離により血清を分離した。また、同一対象者よりＣＰＤ加血液を採取し、血漿を分離した。分離した血漿に塩化カルシウムを添加し、３７℃下にてフィブリンを析出させ血清を調製した。ガラスビーズ入り容器より調製された血清と、ＣＰＤ加血液から分離された血漿より調製された血清について増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β１）の測定を行った。その結果を表１に示す。なお、増殖因子の測定は、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製のテストキットとマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて実施した。

ガラスビーズ５個を配した容器により調製される血清においては、ＰＤＧＦ−ＢＢの含有量は振盪時間の経過とともに上昇し、６０分後において血清１（ｍｌ）当たり１６７７．２（ｐｇ）がリリースされた。このとき、同一対象者の血漿由来血清中に含まれていたＰＤＧＦ−ＢＢ量は、検出限界の３２．５（ｐｇ／ｍｌ）未満であった。ＴＧＦ−β１は、ガラスビーズ５個を配した容器により調製される血清において振盪開始１０分で既に血清１（ｍｌ）あたり２１．２（ｎｇ）のＴＧＦ−β１がリリースされており、その後も経時的に緩やかにリリース量は増加し、６０分後で２９．６（ｎｇ／ｍｌ）に達した。一方、同一対象者の血漿由来血清におけるＴＧＦ−β１のリリース量は、血清１（ｍｌ）あたり１．５（ｎｇ）であった。

＜実施例２＞
ガラスビーズを含まない採血容器（試料３）と、ガラスビーズを５個含む採血容器（試料１）と、ポリエチレンペレットを２０個含む採血容器（試料２）の計３種の容器を用意した。各容器に同一対象者由来の新鮮血液を２０（ｍｌ）ずつ入れ、マルチシェーカー（ＭＭＳ−３００ 東京理科器械製）により振盪させた。振盪開始１０、２０、３０、６０分後に血液１（ｍｌ）を抗凝固剤入りサンプリングチューブにサンプリングし、血球カウント装置（多項目自動血球計数装置 Ｋ−４５００ シスメックス製）を用いて血小板数の計測を行った。

また各試料を遠心分離して血清を分離し、血清中の増殖因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β１）の測定を行った。増殖因子の測定は、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製のテストキットとマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＢＩＣＨＲＯＭＡＴＩＣ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて実施した。

また、同一対象者より市販の臨床検査用真空採血管（ベノジェクトＩＩ テルモ社製）に血液を採取し、１時間室温放置後、血清を分離し、同様に増殖因子の定量を行った。血小板数については採血直後の値を１００％としたときの値を血小板残存率として示した。各増殖因子については、この真空採血管にて調製した血清中の増殖因子量を血小板中の増殖因子の潜在量と規定し、各振盪時間で得られた血清中の増殖因子量を前記潜在量に対する比をリリース率として表した。

［血小板数］
図４は、振盪時間と各試料中の血小板残存率を示した図である。振盪開始後２０分以内に試料１中の血小板残存率は、約２％程度まで低下した。一方、試料２に関しては、試料１にやや遅れて、振盪開始後３０分以内に減少した。また、試料３に関して、振盪開始直後は急激に減少したものの、振盪開始後６０分でようやく血小板残存率が２％以下にまで減少することが示された。

［ＰＤＧＦ−ＢＢのリリース率］
図５は、振盪時間と各試料中のＰＤＧＦ−ＢＢのリリース率の関係を示した図である。試料１は、振盪開始後経時的にＰＤＧＦ−ＢＢが急激にリリースされており、１時間振盪後では血清中の潜在量の約９０％をリリースされていた。残る二つの試料においては、血小板数が減少していたにも関わらず、ＰＤＧＦ−ＢＢの放出量は血清中の潜在量の２０％もリリースされていなかった。

［ＴＧＦ−β１のリリース率］
図６は、振盪時間と各試料中のＴＧＦ−β１のリリース率の関係を示した図である。試料１の血清中には、振盪開始１０分後から血清中の潜在量の７０％近い量のＴＧＦ−β１が放出された。残る二つの試料においても、そのリリース量が増加する傾向が認められたが、６０分後においてもそのリリース率は血清中の潜在量の４０％程度に留まった。以上の結果より、血液中の血小板を取り除くには、ポリエチレンペレットもガラスビーズと同様の役割を果たすが、血小板を活性化させることができないことが示された。

Claims (8)

1. 血液凝固因子を含む血液由来の液性成分と、血小板とを含む流動体から得られる細胞培養用ヒト血清であって、
   採血から２０分以内の血小板残存率が、全血小板量の０％を越え２０％以下であり、かつ、細胞増殖因子のリリース率が２０％以上１００％以下である細胞培養用ヒト血清。
2. 血液凝固因子を含む血液由来の液性成分と、血小板とを含む流動体から得られる細胞培養用ヒト血清であって、
   前記細胞増殖因子の含有量は、血漿から調製されたヒト血清よりも多い細胞培養用ヒト血清。
3. 血液凝固因子を含む血液由来の液性成分と、血小板とを含む流動体から得られる細胞培養用ヒト血清であって、
   前記細胞増殖因子の含有量は、放置により調製されたヒト血清よりも多い細胞培養用ヒト血清。
4. 前記細胞増殖因子は、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＴＧＦ−β１の少なくともいずれか一方を含む請求項１から３いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。
5. 前記細胞増殖因子は、前記流動体をガラス加工体に接触させることによって得られるものである請求項１から４いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。
6. 前記ガラス加工体は、ガラスビーズである請求項５に記載の細胞培養用ヒト血清。
7. 外気に触れることなく調製されるものである請求項１から６いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。
8. 再生医療方法に使用する請求項１から７いずれかに記載の細胞培養用ヒト血清。

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