CN1193092C - 骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养方法。为了有效提高骨髓间充质干细胞的体外纯化率和扩增能力，在分离骨髓单核细胞的基础上，采用贴壁培养原代细胞后，再采用正、负向免疫分选结合的方法进行免疫抗体分选，纯化骨髓间充质干细胞，并在随后的纯化细胞扩增培养中，建立含有人参皂甙多糖的骨髓间充质干细胞培养体系，可提高骨髓间充质干细胞的体外扩增和继代培养能力，达到建立人骨髓间充质干细胞株系的目的。

Description

骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养方法

所属技术领域

本发明属生物技术方法，涉及一种骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养的新生物技术方法。这种方法能有效地纯化骨髓间充质干细胞和提高其体外的扩增能力。

背景技术

骨髓基质中存在一种具有多分化潜能的干细胞。相关的研究已经表明这种干细胞可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经细胞和心肌细胞等。这种干细胞被称为骨髓间充质干细胞，将在医学上具有组织工程化的重大利用价值。

由于目前还尚未发现骨髓间充质干细胞的特异性标记分子，因此该干细胞的分离纯化采用的还是间接的方法：传统的方法是采用贴附方法，即在分离骨髓单核细胞的基础上，利用间充质干细胞的贴附性在细胞培养瓶内贴壁形成纺锤形的成纤维状细胞，并经过传代贴壁来逐步纯化间充质干细胞。这种方法简单方便，但是这种方法分离的细胞实质是多种细胞的混合物，而非克隆化的间充质干细胞。这种多细胞混合物的继代培养和扩增能力较低，难以形成真正的间充质干细胞株系。另一类方法是在分离骨髓单核细胞的基础上，利用一定的单抗标记的免疫磁珠分离系统纯化间充质干细胞。虽然目前尚不清楚骨髓间充质干细胞的特异性标记分子，但公认为其表现为CD34^-、CD14^-、CD45^-、SH2⁺、SH3⁺、CD29⁺、CD71⁺、CD90⁺、CD106⁺、CD120a⁺和CD124⁺。根据这些特点，也有人在培养前利用抗Stro-1、抗CD105的抗体标记免疫磁珠进行分选，这些方法有效提高了骨髓间充质干细胞的纯化率。但是，这些都是在分离单核细胞的基础上直接进行抗体标记免疫磁珠分选，然后再贴壁培养。这样的分选需要大量的单核细胞，因此分选一次也就需要大量的骨髓，否则分选效果不好，这在今后的临床实际应用中有一定的困难。

在骨髓间充质干细胞的体外培养和扩增方面，目前一般采用的是含有一定比例(如10％等)血清(如胎牛血清FBS等)的培养基[如低糖DMEM(DMEM-LG)、α-20等]进行贴壁培养扩增，也有人发现血小板衍生生长因子(PDGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对大鼠的骨髓间充质干细胞有较强的促增殖作用。

发明内容

为了有效提高骨髓间充质干细胞(CD14^-CD45^-CD34^-CD90⁺CD105⁺)的体外纯化率和扩增能力，本发明的目的是提供一种骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养方法。

本发明的第一个目的通过以下方案实现：

从骨髓中分离单核细胞，先进行细胞原代贴壁培养，再依据骨髓间充质干细胞表面标记抗原对贴壁细胞采用正、负向免疫分选结合的方法进行免疫抗体分选，纯化骨髓间充质干细胞，获得CD14^-CD105⁺细胞，在体外培养体系中继代扩增培养。

本发明对贴壁培养后收获的骨髓间充质干细胞进行纯化，第一步进行阴性免疫筛选。本发明所用的阴性免疫筛选是采用CD14标记磁珠分选，获得CD14^-细胞。

本发明对贴壁培养后收获的骨髓间充质干细胞进行纯化，第二步进行阳性免疫筛选。本发明所用的阳性免疫筛选是采用CD105标记磁珠分选，获得CD14^-CD105⁺细胞。

本发明的另一个目的是在随后的纯化细胞扩增培养中，建立一种体外培养体系，所用的体外培养体系含有人参皂甙多糖，其组成为DMEM-LG：人参皂甙多糖：FBS，其组成比例为DMEM-LG：25μg/mL 98％人参皂甙多糖：10％FBS。

本发明的第三个目的是提供的骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养方法能有效地纯化骨髓间充质干细胞和提高其体外的继代扩增培养能力。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的方法中采用分离单核细胞后，先进行原代细胞的贴壁扩增，然后再行抗体标记免疫磁珠分选，这样每次只需少量(2-3mL)的骨髓就可以达到比较好的分选效果。

(2)采用正、负向免疫分选相结合的方法进一步提高了骨髓间充质干细胞的纯化率。由此方法纯化的骨髓间充质干细胞具有比较高的增殖潜能和分化潜能。与未分选的贴壁纺锤状细胞相比，其对数生长期可以提前2-4天，并且最快可以在6天的时间内完成细胞单层的形成；而未分选的细胞在培养瓶中铺层较慢，细胞生长期可达22天之久。

(3)采用含有人参皂甙多糖的新培养体系也有效地提高了骨髓间充质干细胞的扩增能力，使得骨髓间充质干细胞的扩增效率提高1倍左右。

(4)新分选方法和培养体系不但对骨髓间充质干细胞具有明显的扩增优势，并且扩增的细胞具备分化的潜能。

附图说明

图1为原代MSC培养

图2为分选MSCs的第1代培养

图3为第一代细胞的扩增能力比较

图4为不同世代细胞生长所需的时间

图5为第4代扩增细胞的流式细胞术分析图

图6为不同培养体系下细胞的生长动态

图7为脂肪细胞定向诱导

图8为成骨细胞定向诱导第5天

图9为成骨细胞定向诱导28天的Von Kossa染色

图10为成骨细胞诱导(碱性磷酸酶阳性率)

图11为成骨细胞定向诱导18天的碱性磷酸酶染色

具体实施方式

本发明结合具体实施例作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

本发明方法采取的一个具体实例是：用等量的不含钙镁的PBS洗涤骨髓后，用含10％FBS的等量DMEM-LG培养液悬浮细胞，然后缓慢加入到密度为1.073g/ml的Percoll分离液上离心并收集单核细胞层，用PBS洗涤2-3次后，以5×10⁶/ml的密度接种于10％FBS的DMEM-LG培养液进行贴壁培养。

1、细胞在培养瓶内铺层后，弃去培养液及悬浮的细胞。用Tryspin-EDTA消化并收集贴壁的纺锤状细胞。收获的细胞用PBS洗涤一次后悬浮在PBS中。然后按MACS公司提供的操作说明，用吸附CD14单克隆抗体-磁珠分离系统(MACS，Miltenyi Biotech Inc.)从悬浮细胞中分选CD14^-细胞，进而再用吸附CD105单克隆抗体-磁珠分离系统(MACS，Miltenyi Biotech Inc.)分选CD34^-CD14^-CD105⁺CD90⁺细胞。

2、分选的CD34^-CD14^-CD105⁺CD90⁺细胞在含有人参皂甙多糖的DMEM-LG培养体系(25μg/mL 98％人参皂甙多糖、10％FBS)进行扩增培养。

实施例2

分离纯化效率

用流式细胞术测定不同分离纯化阶段的细胞中不同标记性细胞表面抗原的比例如表1。

表1.不同分离纯化阶段的细胞中不同标记性细胞表面抗原的比例(％)

分离纯化阶段          CD34⁺  CD14⁺   CD105⁺   CD90⁺

单核细胞              4.11     7.94     5.92      4.71

原代贴壁细胞          0.35     8.19     54.51     42.63

CD14^-细胞            0.08     0.42     52.97     63.76

CD14⁺CD105⁺细胞    0.05     0.17     98.24     89.42

初步分离的人骨髓单核细胞中CD34⁺、CD14⁺、CD105⁺和CD90⁺细胞分别平均为4.11％、7.94％、5.29％和4.71％；经过原代贴壁培养成纺锤状细胞后，CD34⁺细胞大大减少，CD105⁺和CD90⁺细胞比例增加，说明原代贴壁纺锤状细胞中大多数为人骨髓基质细胞。但是其中还含有少量CD14⁺细胞；经过CD14单克隆抗体-磁珠系统的分选，CD14⁺细胞基本上被排除；进一步用CD105单克隆抗体-磁珠系统分选，获得的细胞基本上为CD34^-CD14^-CD105⁺CD90⁺细胞。

实施例3

不同培养阶段的细胞形态

参见图1，原代细胞接种后4小时可以见到单核圆形细胞贴壁，细胞集落在接种后2d即可见到集落的形成，每个集落含20～50个细胞，成长梭形，成放射状或同心圆状排列。大量的集落出现在接种4天后，然后逐渐在培养瓶底部铺层。在Teflen-75培养瓶中细胞扩增形成单层需要14-16天时间。但是从图上可见一些悬浮和贴壁的圆形细胞存在。图1显示在倒置显微镜下呈放，细胞呈梭形，10×10倍。

参见图2，经过CD14和CD105单克隆抗体-磁珠系统分选的人骨髓间充质干细胞(CD34^-CD14^-CD105⁺CD90⁺)在本发明提供的培养体系(DMEM-LG：人参皂甙多糖：10％FBS)下进行第1代扩增培养，在Teflen-75培养瓶中经过6-9天形成了细胞单层。图2显示在倒置显微镜下呈放，细胞呈梭形，25×10倍。

分选细胞贴壁扩增后完全表现为细长的纤维状，并且在显微镜下看不见其他任何杂质细胞的存在。

实施例4

扩增能力比较分析

收获原代贴壁细胞，在不作任何筛选的情况下直接进行新培养体系下的第1代扩增能力的测定，同时也在新培养体系下对分选出的人骨髓间充质干细胞进行第1代的扩增培养，比较两者的扩增能力参见图3，其中-◆-表示分选细胞，-■-表示未分选细胞。

从图3的比较结果分析，在培养的第1-7天内，分选后的细胞明显具有生长的优势：分选细胞贴壁后快速生长，在培养的第3天开始出现对数生长期，至第6天基本上在Teflen-75培养瓶中达到铺层；未分选的细胞出现生长快速的时期比较滞后，大约在第5出现对数生长期，至第8天才达到铺层。

因此，分选细胞的这种扩增优势也反映在Teflen-75培养瓶中形成细胞单层的速率上(参见图4)，图4中：-◆-表示分选细胞，-■-表示未分选细胞。

在分选细胞中，第1代铺层的时间平均为6.2天，随后世代生长速率有所降低，至第5代平均需要11.2天时间，但至此以后基本上每代铺层的时间维持在11-13之间；未分选的细胞中，第1代铺层的平均时间为8.7天，而且随后代次铺层所需的时间一直在增加，到第10代平均需要21.1天才能在培养瓶底部形成细胞单层，有的需要27天才形成细胞单层。

此外，未分选的细胞一般传代至9-11代后，细胞逐渐老化，表现为有丝分裂的停止，细胞碎片的增多，细胞形态变为扁平，增殖速度明显减慢直至停止；分选的细胞则一直以每代11-12天的时间形成培养瓶底部的细胞单层直至第20代后收获细胞冻存。

目前已经建立来自分选细胞扩增培养的hMSC-0111、hMSC-0112、hMSC-0113、hMSC-0114和hMSC-0115五个人骨髓间充质干细胞株系。

实施例5

骨髓MSC的表型特征

用流式细胞仪分析了hMSC-0111细胞株系第1代和第10代的细胞表面抗原的标记(表2)。选用的单克隆抗体分别为抗人CD13、CD14、CD29、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117和CD166的单克隆抗体。

表2  细胞表面抗原分子分析

细胞世代    CD13      CD14      CD29      CD34      CD45      CD90       CD105     CD117     CD166

第1代       97.32     0.17      89.71     0.05      1.33      89.42      98.24     4.35      71.41

第10代      99.14     0.13      93.36     0.14      1.17      97.73      99.63     3.24      86.22

其中骨髓间充质干细胞表现阳性的CD13、CD29、CD90、CD105和CD166都具有很高的比率，而骨髓间充质干细胞表现阴性的CD14、CD34和D45概率很低。以下是第4代扩增细胞的部分流式细胞分析图(参见图5)。

参见图6，在增加人参皂甙多糖后，形成细胞单层的时间明显提前，本发明提供的扩增培养体系有效地促进了人骨髓间充质干细胞的扩增效果。图6中：-◆-表示本发明提供的培养体系，-■-表示常规培养体系。

实施例6

人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化

取第4代hMSC-0111株系的人骨髓间充质干细胞，制备制成单细胞悬液，以2×10⁴个/培养皿接种于直径30mm的培养皿进行贴壁培养，待细胞达到铺层80-90％时，用脂肪细胞诱导液(DMEM-LG培养液，10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ug/ml胰岛素，1uM地塞米松，0.5mM 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤，100uM吲哚美辛)进行脂肪细胞的定向诱导分化；同样，用成骨细胞诱导液(DMEM-LG培养液，10％胎牛血清，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，0.1uM地塞米松，10mM β-甘油磷酸钠，50uM 2-磷酸-抗坏血酸)进行成骨细胞定向诱导。

参见图7，在脂肪细胞定向诱导分化实验中，第3天起光镜下可见黄色的圆形脂滴沉着的细胞，外形变为圆形，椭圆形，细胞核被脂滴挤于一侧。油红O染色示胞核呈蓝色，脂滴呈红色。随着诱导时间的延长，脂肪细胞的比例逐渐增高。图7中，a为未染色细胞，b为染色细胞。

在成骨细胞定向诱导分化实验中，一般从第3天开始，可以看到细胞形态转变为立方形，折光性强(参见图8)，随着诱导时间的延长，立方形的细胞比例逐渐增高。细胞继续增殖，形成复层。培养皿底部有明显的矿化物沉着，Von Kossa染色表现为黑色的致密结节，并且矿化物和黑色结节随着诱导时间的延续不断增多(参见图9)。碱性磷酸酶定量测定显示，随着诱导时间的延长，碱性磷酸酶的表达逐渐增加，在第10天至第16天之间成倍增高，第18天达到最高峰(参见图10)。

改良钙钴法碱性磷酸酶染色的诱导细胞胞浆深棕色或深黑色，其中充满致密的黑色沉淀(参见图11)。显示黑色沉淀物密度随着诱导时间增加而逐渐增高，甚至融合呈大片状，细胞间隙难以区分。细胞失去成纤维细胞样外观。

实例总结：

(1)本分选方法有效地富集了人骨髓间充质干细胞：

经原代贴壁培养后进行CD14阴性反应和CD105阳性反应筛选，CD90阳性细胞比例达到89.4％，CD105阳性细胞比例达到98.2％，并且基本上排除了CD14和CD34阳性细胞。

(2)分选的细胞具有扩增和继代培养的优势：

经本分选方法分选的细胞具有显著的扩增能力。分选细胞的对数生长期比未分选细胞要提前2-4天，由此导致分选细胞的快速贴壁和形成细胞单层，并在第5代后基本上维持在11-13天之内完成一个世代的铺层。

分选细胞也表现出显著的继代培养优势，基本上都能扩增20代以上，而未分选的细胞最多仅能传代9-11代。

(3)新扩增培养体系有效促进了人骨髓间充质干细胞的扩增效率：

在继代培养中，增加人参皂甙多糖的新培养体系明显提高了人骨髓间充质干细胞的贴壁和扩增能力。

(4)扩增的分选细胞具有分化多潜能性：

分选细胞经扩增数代后仍具备分化多潜能性，能定向诱导成脂肪细胞和成骨细胞。

本发明涉及的部分参考文献：

1、傅文玉，路艳蒙，朴英杰，2002，人骨髓间充质干细胞的培养及多能性研究，中华血液学杂志，23(4)：202-204.

2、邵君飞，杨亚安，保泽洛等，2002，成纤维细胞生长因子对骨髓基质细胞增殖及分化作用的实验研究，中国血液流变学杂志，12(3)：181-184.

3、席庆，毛天球，曹罡，杨维东，2002，成人骨髓基质干细胞体外培养与鉴定，现代口腔医学杂志，16(5)：385-388.

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本发明提及的所有文献都在申请中引用作为参考，就如同每一篇文献都被单独引用作为参考那样。此外应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1、一种骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，从骨髓中分离单核细胞，先进行细胞原代贴壁培养，再依据骨髓间充质干细胞表面标记抗原对贴壁细胞进行免疫抗体分选，其特征是：采用正、负向免疫分选结合的方法进行免疫抗体分选，纯化骨髓间充质干细胞，获得CD14^-CD105⁺细胞，在体外培养体系中继代扩增培养，进行正、负向免疫分选纯化骨髓间充质干细胞的步骤为：

第一步进行阴性免疫筛选，采用CD14标记磁珠分选，获得CD14^-细胞，

第二步进行阳性免疫筛选，采用CD105标记磁珠分选，获得CD14^-CD105⁺细胞。

2、如权利要求1所述的骨髓间充质干细胞分离和体外扩增培养方法，其特征是：所用的体外培养体系低糖DMEM含有25μg/ml 98％人参皂甙多糖和10％胎牛血清。

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