具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,所述百分比百分比浓度均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例1、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂:
(1)稀释液和洗涤液均为:质量/体积百分比浓度为0.9%的生理盐水;
(2)分离液A为:质量/体积百分比浓度为6.0%的羟乙基淀粉溶液;
(3)分离液B为:比重为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠(ficoll-hypaque)溶液(商品名Ficoll液);
(4)修复组合液:修复液A:高糖DMEM培养基,修复液B:胎牛血清,修复液C:200mM L-谷氨酰氨;使用时,修复组合液的配制方法为:将修复液A与修复液B按照9∶1的体积比充分混合后,再加入体积百分浓度为1%的修复液C,混匀后即可;
(5)分散液:用稀释液和/或洗涤液配制的体积/体积百分比浓度为1%的人血白蛋白液。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒,每盒中各组分的量为:稀释/洗涤液3瓶(250mL/瓶),分离液A1瓶(100mL/瓶),分离液B1瓶(40mL/瓶),修复液A(45mL/瓶),修复液C(1mL/管)和分散液(1mL)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装,包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离
现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离,以检测分离效果,其中,用本发明试剂盒进行分离的具体方法包括以下步骤(所有步骤均在洁净工作台中完成):
1)将采集的患者骨髓分装入50mL无菌离心管中(≤40mL/管),配平后,4℃、2000rpm离心20分钟,吸弃上层血浆;
2)将各离心管中的下层细胞收集于250mL无菌的盐水瓶中,按1∶1的比例加入稀释液,充分混匀,再按总体积比为4∶1的比例加入分离液A,室温静置25min;
3)吸取上清至50mL无菌离心管中,4℃、1500rpm离心10min,弃上清,将所有细胞集中于一个离心管中,再加入洗涤液补足体积至40mL,4℃、1500rpm离心10min,弃上清,将此洗涤过程重复2次,再用20mL或40mL洗涤液重悬细胞;
4)吸取提前预温至室温(25℃)的分离液B20mL于50mL离心管中,将细胞悬液沿管壁按照1∶1的体积比缓慢加入分离液B液面上,室温,1800rpm离心30min;
5)小心吸取中间层细胞,置于另一50mL离心管中,再加入洗涤液补足体积至40mL,4℃、1500rpm离心10min,弃上清,将此洗涤步骤重复3次;
6)先用5mL修复液组合重悬所有细胞,镜下计数,然后按5.0×106个/mL接种于75cm2无菌培养瓶中,每瓶≤15mL,并置CO2培养箱中在37℃、5%CO2下静置培养约3小时;
7)收集所有细胞于50mL离心管中(≤40mL/管),配平后,4℃、1500rpm离心10min,弃上清,再加入洗涤液40mL重悬细胞,4℃、1500rpm离心10min,此步骤重复2次,得到骨髓单个核细胞。将收集的骨髓单个核细胞重悬于添加1%分散液的50mL稀释液中,置于无菌瓶中,4℃备用。
用常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离包括以下步骤:
A、裂解红细胞:取50mL患者骨髓,放入提取管中,往提取管中加入250mL红细胞裂解液(EDTA钠盐20mg,氯化铵4.2g,碳酸氢钾0.5g,加蒸馏水定容至500mL),与骨髓充分混合,室温放置3分钟,1000rpm常温离心3分钟。离心结束,弃去上层液体。
B、观察提取管底层提取的单个核细胞,如其中混有较多红细胞,可重复步骤A1-2次,去除多余红细胞。
C、洗涤裂解液:取250mL 0.9%生理盐水放入提取管中,用吸管吹打底层细胞,使其与0.9%生理盐水充分混合,1000rpm常温离心3分钟,离心结束,弃去上层液体。
D、向提取管中加入少量0.9%生理盐水,用吸管吹打,使其与底层细胞混合,转移至50mL离心管中,4000rpm常温离心5秒钟,弃去上层0.9%生理盐水,得到骨髓单个核细胞,4℃保存备用。
检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量,结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级,而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级,表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例2、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂:
(1)稀释液和洗涤液均为:PBS,配方为:NaCl 0.8克,KCl 0.2克,Na2HPO4·12H2O2.9克,KH2PO4 0.2克,加去离子水定容至1000mL,高压灭菌;
(2)分离液A:质量/体积百分比浓度为0.5%的甲基纤维素溶液,配制方法:将0.5g甲基纤维素加入100mL生理盐水中,高压灭菌后,置于4℃,待完全溶解后即可;
(3)分离液B:比重为1.073g/mL的Percoll液。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒,每盒中各组分的量为:稀释/洗涤液3瓶(250mL/瓶),分离液A1瓶(100mL/瓶),分离液B1瓶(40mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装,包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离
现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离,以检测分离效果,其中,用本发明试剂盒进行分离的具体方法包括以下步骤(所有步骤均在洁净工作台中完成):
1)将采集的患者骨髓分装入50mL无菌离心管中(≤40mL/管),配平后,4℃、2000rpm离心20分钟,吸弃上层血浆;
2)将各离心管中的下层细胞收集于250mL无菌的盐水瓶中,按1∶1的比例加入稀释液,充分混匀,再按总体积比为4∶1(分离液A)的比例加入分离液A,室温静置25min;
3)吸取上清至50mL无菌离心管中,4℃、1500rpm离心10min,弃上清,再加入稀释/洗涤液补足体积至40mL,将所有细胞集中于一个离心管中,4℃、1500rpm离心10min,弃上清,将此洗涤过程重复2次,再用20mL或40mL洗涤液重悬细胞;
4)吸取提前预温至室温(25℃)的分离液B 20mL于50mL离心管中,将细胞悬液沿管壁缓慢按照1∶1的体积比加入分离液B的液面上,室温下、1800rpm离心30min;
5)小心吸取中间层细胞,置于另一50mL离心管中,加入40mL洗涤液,4℃、1500rpm离心10min,弃上清,将此洗涤步骤重复3次,得到骨髓单个核细胞。将收集的细胞重悬于40mL稀释/洗涤液中,置于无菌瓶中,4℃备用。
同时,用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离,然后,检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量,结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级,而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级,表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例3、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂:
(1)稀释液和洗涤液均为:Hank’s液,配制方法为:NaCl 8g,KCl 0.4g,Na2HPO4.H2O0.06g,KH2PO4 0.06g,NaHCO3 0.35g,加去离子水定容为1000mL,高压灭菌后,4℃保存;
(2)分离液A为:质量/体积百分比浓度为6.5%的羟乙基淀粉溶液;
(3)分离液B为:比重为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠(ficoll-hypaque)溶液(商品名Ficoll液);
(4)修复液:修复液A:1640培养基;修复液的使用方法为:将修复液A与自体血浆按照9∶1的体积比充分混匀即可(现用现配)。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒,每盒中各组分的量为:稀释1瓶(250mL/瓶),洗涤液2瓶(250mL/瓶),分离液A1瓶(100mL/瓶),分离液B1瓶(40mL/瓶),修复液A(45mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装,包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离
现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离,以检测分离效果,分离方法如下:
1)将采集的患者骨髓分装入50mL无菌离心管中(≤40mL/管),配平后,4℃、2000rpm离心20分钟,吸取上层血浆,4℃备用;
其余步骤与实施例1相同。
同时,用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离,然后,检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量,结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级,而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级,表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例4、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂:
(1)稀释液为:Hank’s液;
(2)洗涤液为:质量/体积百分比浓度为0.85%的生理盐水;
(3)分离液A为:质量/体积百分比浓度为5.5%的羟乙基淀粉溶液;
(4)分离液B为:比重为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液;
(5)修复组合液:修复液A:IMDM培养基;修复液B:新生牛血清;修复液C;250mM L-谷氨酰氨;使用时,修复组合液的配制方法为:将修复液A与修复液B按照9∶1的体积比充分混匀后,再加入体积百分浓度为1%的修复液C,混匀后即可(现用现配)。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒,每盒中各组分的量为:稀释1瓶(250mL/瓶),洗涤液2瓶(250mL/瓶),分离液A1瓶(100mL/瓶),分离液B1瓶(30mL/瓶),修复液A(45mL/瓶),修复液B(5mL/瓶),修复液C(1mL/管)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装,包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离
现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离,以检测分离效果,分离方法与实施例1相同。
同时,用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离,然后,检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量,结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级,而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级,表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例5、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂:
(1)稀释液为:质量/体积百分比浓度为0.85%的生理盐水;
(2)洗涤液为:PBS;
(3)分离液A为:质量/体积百分比浓度为0.45%的甲基纤维素溶液;
(4)分离液B为:比重为1.073g/mL的Percoll液;
(5)修复组合液:修复液A:IMDM培养基,修复液B:小牛血清;使用时,修复组合液的配制方法为:将修复液A与修复液B按体积体积比9∶1混匀后即可(现用现配)。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒,每盒中各组分的量为:稀释液1瓶(250mL/瓶),洗涤液2瓶(250mL/瓶),分离液A1瓶(100mL/瓶),分离液B1瓶(40mL/瓶),修复液A(45mL/瓶),修复液B(5mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装,包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离
现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离,以检测分离效果,分离方法与实施例1相同。
同时,用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离,然后,检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量,结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级,而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级,表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。
实施例6、用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒包括以下试剂:
(1)稀释液为:PBS;
(2)洗涤液为:Hank’s液;
(3)分离液A为:质量/体积百分比浓度为0.55%的甲基纤维素溶液;
(4)分离液B为:比重为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液;
(5)修复组合液:修复液A:高糖DMEM培养基;修复液C;150mM L-谷氨酰氨;使用时,修复组合液的配制方法为:将修复液A与体积百分浓度为1%的修复液C混匀后即可(现用现配)。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒,每盒中各组分的量为:稀释1瓶(250mL/瓶),洗涤液2瓶(250mL/瓶),分离液A1瓶(100mL/瓶),分离液B1瓶(30mL/瓶),修复液A(50mL/瓶),修复液C(1mL/管)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装,包装后得到用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒。
二、骨髓单个核细胞的分离
现用步骤一制备的试剂盒及常规试剂进行骨髓单个核细胞的分离,以检测分离效果,分离方法与实施例1相同。
同时,用与实施例1相同的常规试剂及方法进行骨髓单个核细胞的分离,然后,检测用本发明试剂盒及常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量,结果用本发明试剂盒中的试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量达107个数量级,而常规试剂组合提取的骨髓单个核细胞的数量仅为106个数量级,表明用本发明的试剂盒可获得较好的分离效果。