CN101560495B - 一种分离单个核细胞的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离单个核细胞的方法和装置，特别是一种分离脐带血、骨髓、外周血单个核细胞的方法和装置，无须在百级净化环境下即可分离单个核细胞，不受样本数量、体积限制，效率高，无污染，不仅可以用于实验室研究，也可以直接用于人体治疗，且结构简单，便于成批生产。

Description

一种分离单个核细胞的方法和装置

技术领域

本发明提供了一种分离单个核细胞的方法和装置，特别是一种分离脐带血、骨髓、外周血单个核细胞的装置

背景技术

脐带血、骨髓、外周血是造血干细胞的三大来源，造血干细胞移植已成为治疗多种血液病、某些恶性实体肿瘤、部分遗传性疾病、重症免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。临床应用已证明造血干细胞移植对于重建或改善骨髓造血功能有良好疗效。单个核细胞(MNC)(包括单核细胞、淋巴细胞、干细胞等)是造血干细胞移植的有效成分，MNC的分离是干细胞移植和进一步研究的关键环节，它直接关系到分离后样本体积、造血干/祖细胞或间质干细胞分离率、细胞活性维持及移植的成败。

目前分离单个核细胞主要有以下几种方法：

(1)Ficoll-Hypaque(d＝1.077，商品名Ficoll液)分层法；即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层法；

(2)3％明胶自然沉降法：

(3)6％羟乙基淀粉(HES)自然沉降法：

其中以Ficoll-Hypaque(d＝1.077)分层法最为经典和常用，其原理是常用来分层液比重是1.077±0.001g/mL的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液，Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。由于MNC与血液中的其它成分存在着密度差异，在作密度梯度离心时，各种血液成分将按照密度梯度重新分布聚集，血浆和血小板由于密度较低，悬浮于分离液层面的上方，红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；单个核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可分离到单个核细胞。

但是目前国内外分离单个核细胞一般为试管法，试管法单次分离脐带血量小(最大量25ml)，分离脐带血量多的样本时，使用的离心管数量多，成本高，工作量大，效率低，重复的开放操作很容易造成微生物污染，不适宜大批量脐血的分离，多用于实验研究。分离外周血等其它样本时也存在类似问题。

目前已有研究者注意这个问题，并展开了一些研究。如申请号为CN200610114475.9的中国专利，提供了一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，包括稀释液、洗涤液，由分离液A和B组成的分离液，所述的稀释液为生理盐水、PBS或Hank’s液，洗涤液为生理盐水、PBS或Hank’s液，分离液A为质量/体积百分比浓度为5.5-6.5％的羟乙基淀粉或0.45-0.55％甲基纤维素溶液；分离液B为密度为1.077g/ml的Ficoll-Hypaque溶液或密度1.073g/ml的Percoll液。该试剂盒具有使用方便、成本低廉、分离效果好的有点。

但上述发明仍然未解决试管法单次分离量小以及多次重复操作带来的污染等问题，因此又有研究者提出用多联袋离心分离单个核细胞。

如《三联袋两次离心法分离脐血有核细胞研究》(临床血液学杂志1999年第1期第12卷)中提到使用三联袋两次离心法分离脐血有核细胞，脐血收集在400ml三联袋(上海血液中心)中，在10℃1800r/min倒置离心15min，弃去下层红细胞层于一转移袋中，然后正向离心3000r/min 15min，弃去部分血浆于另一转移袋中，使白细胞层的体积浓缩为40ml左右。

《多联袋无菌制备脐带血间质干细胞的方法及效果》(中国组织工程研究与临床康复，2007，11(24)：4781-4784)，使用无菌塑料四联袋(山东威高集团公司生产：1个主袋，2个空袋，1个生理盐水袋)，先将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋的主袋内，利用无菌接口机将盛有Ficoll-Hypaque混合溶液的四联袋与脐带血收集袋相连，再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内液面上，保持血液和淋巴细胞分离液的界面清晰。将四联袋平衡后置入大型低温离心机内，1500r/min、22℃离心30min。离心后轻轻取出四联袋，将主袋放在分浆夹上，此时袋内的液体自上而下分为5层：血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层。将血浆血小板层的上2/3液体挤压入四联袋的一空袋内，将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层的上部，挤压入四联袋另一空袋内，即为富含单个核细胞的液体。

但是该方案仍然存在红细胞混入量高等问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离单个核细胞的方法。

本发明的目的在于提供一种分离单个核细胞的装置。

简单的说，本发明提供的一种分离单个核细胞的方法，包括

(1)、前处理

将脐带血、骨髓或外周血离心，将上层富血小板血浆层除去，然后加入适量质量百分比浓度为6％的羟乙基淀粉溶液和生理盐水；使得血液的红细胞比积为50-65％，其中羟乙基淀粉溶液和生理盐水的体积比为1∶4-1∶5；

(2)、加液

将经过步骤(1)前处理过的脐带血、骨髓或外周血倒入淋巴细胞分离液中，保持脐带血、骨髓或外周血和淋巴细胞分离液的界面清晰，前处理过的脐带血、骨髓或外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1∶1-2∶1；

所述淋巴细胞分离液为Ficoll-Hypaque混合溶液；

(3)、离心

将步骤(2)所得的液体离心；此时液体自上而下分为5层，分别为：含有少量血浆血小板的上清层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层；

(4)、分离

将含有少量血浆血小板的上清层层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层的上部取出，即为富含单个核细胞的液体；

(5)洗涤

在富含单个核细胞的液体中加入生理盐水，离心，弃去上清液，再加入生理盐水，同样的条件下离心，弃去上清液；剩下的部分即为单个核细胞液。

其中，步骤(5)最后所得的单个核细胞液中还加入生理盐水，以调整单个核细胞的最终浓度和体积。

所述的步骤(1)中离心条件为2000-2500rpm、22℃下离心5min；步骤(3)中离心条件为1000-1500rpm、22℃下离心30min；步骤(5)中离心条件为2200-2800rpm、22℃下离心7min。

所述的所有步骤在密闭系统中进行。

本发明还提供了一种分离单个核细胞的装置，该装置为由1-4号4个袋组成的四联袋，其中1号袋为主袋，作用是盛放脐带血、骨髓或外周血和淋巴细胞分离液的混合液体，2号袋为空袋，用于收集目的细胞层的液体；3、4号袋为生理盐水袋，已经预充生理盐水，主要用于无菌洗涤后的目的细胞；4个袋用密闭无菌塑料导管相联，其中1号袋与2号袋相联，3、4号袋分别与2号袋相联。

优选的连接方式为所述的塑料导管一端与1号袋相连，从1号袋引出后分流，形成一个三通结构，其中所分流的一路导管与2号袋相连，另一路导管继续分流，再形成另一个三通结构，所分流的两路导管分别与3号袋和4号袋相连。

在塑料导管与每个袋子相连处均设有止流夹，以防止液体在袋子相互流动，但是当打开止流夹后液体可以根据需要流向所设定的袋子。

每个袋子均配有输液头，用于加液或输注；每个袋子还配有与外接袋无菌连接的导管，其作用是可以利用无菌连接技术随时加入制备过程中所需的液体。

优选所述1号袋长18cm，宽9cm，可盛液体200ml左右；所述的2号袋长16cm，宽10cm；所述的3、4号袋长18cm，宽12cm。

以下是本发明的详细描述。

《多联袋无菌制备脐带血间质干细胞的方法及效果》(中国组织工程研究与临床康复，2007，11(24)：4781-4784)提供了一种分离脐带血间质干细胞的方法，本发明实质上是在其基础上的进一步改进，包括以下步骤：

(1)、前处理；

将脐带血、骨髓或外周血离心，将上层富血小板血浆层除去，然后加入适量的羟乙基淀粉溶液和生理盐水；使得血液的红细胞比积为50-65％；以维持血液的整体密度，使得当血液加入到淋巴细胞分离液时不会下沉，破坏液面；

其中，离心条件优选2000-2500rpm、22℃下离心5min；优选的离心转速为2400rpm；羟乙基淀粉溶液的质量百分比浓度为6％，羟乙基淀粉溶液和生理盐水的体积比为1∶4-1∶5；除去的上层富血小板血浆层经进一步处理，使之不含红细胞后可作为最终悬浮液或其它应用。加入羟乙基淀粉还可以加速红细胞沉降，以利于单个核细胞浮出。

前处理先除去富血小板血浆层、并加入羟乙基淀粉可以提高分离后MNC计数、MNC回收率、CD34+细胞数，降低台盼兰拒染率、红细胞混入量，同时可以使分离出的血浆得到充分利用。如果是自体外周血、骨髓采集分离市留取上清层(血浆)，可用于悬浮分离后的干细胞；如果是脐带血的上清层，不仅可以用于悬浮分离后的干细胞，而且由于其中含有比成人高的多的细胞因子，也可用于细胞培养及诱导分化。

(2)、加液

将前处理过的脐带血、骨髓或外周血倒入淋巴细胞分离液中，保持脐带血、骨髓或外周血和淋巴细胞分离液的界面清晰，前处理过的脐带血、骨髓或外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1∶1-2∶1，优选2∶1；

淋巴细胞分离液为Ficoll-Hypaque混合溶液，实质上为比重1.077±0.001g/ml的聚蔗糖-泛影葡胺；其作用是作为密度梯度离心的梯度液。

(3)、离心

将步骤(2)所得的液体离心；此时液体自上而下分为5层，分别为：含有少量血浆血小板的上清层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层；这是由于人血液中各种细胞比重不同。红细胞(RBC)的相对密度约为1.092g/ml左右，多核细胞的相对密度约为1.090g/ml左右，单个核细胞的相对密度为1.070g/ml左右，因此经一定速度离心沉淀，即可按其相应密度梯度分布，将各种血细胞分层。

本步骤离心的条件优选为1000-1500rpm、22℃下离心30min；优选离心转速为1200rpm；

(4)、分离

将含有少量血浆血小板的上清层层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层的上部取出，即为富含单个核细胞的液体；

(5)洗涤

在富含单个核细胞的液体中加入生理盐水，离心，离心条件为2200-2800rpm、22℃下离心7min；优选离心转速为2500rpm；弃去上清液，再加入生理盐水，同样的条件下离心，弃去上清液；剩下的部分即为单个核细胞液。

两次生理盐水洗涤可以显著降低红细胞混入量。

此外，还可以在步骤(5)最后所得的单个核细胞液中加入生理盐水，使MNC悬浮，以调整MNC的最终浓度和体积。

另外，本发明还提供了一种根据上述方法分离单个核细胞的装置，该装置由1-4号4个四联袋构成，如附图图1所示。

其中1号袋为主袋，作用是盛放脐带血、骨髓或外周血和淋巴细胞分离液的混合液体，并作为离心容器，其中，脐带血、骨髓或外周血事先需要经过离心处理，以除去上层富血小板血浆层，降低台盼兰拒染率、红细胞混入量；2号袋为空袋，用于收集目的细胞层的液体；3、4号袋为生理盐水袋，预充生理盐水，主要用于无菌洗涤后的目的细胞。

1-4号4个袋的容量可根据样本体积的大小选择相应的无菌塑料袋，可以从30ml~500ml不等。优选其中1号袋长18cm，宽9cm，可盛液体200ml左右。2号袋为长16cm，宽10cm；3、4号袋为生理盐水袋，长18cm，宽12cm。

4个袋用密闭无菌塑料导管相联，其中1号袋与2号袋相联，3、4号袋分别与2号袋相联，优选的连接方式为塑料导管一端与1号袋相连，从1号袋引出后分流，形成一个三通结构，其中所分流的一路导管与2号袋相连，另一路导管继续分流，再形成另一个三通结构，所分流的两路导管分别与3号袋和4号袋相连，这样可使连接关系最简单，可有效简化成本。

在塑料导管与每个袋子相连处均设有止流夹，以防止液体在袋子相互流动，但是当打开止流夹后液体可以根据需要流向所设定的袋子。同时每个袋子均配有输液头，用于加液或输注。此外，每个袋子还配有与外接袋无菌连接的导管，其作用是可以利用无菌连接技术随时加入制备过程中所需的液体。

本发明四联袋的具体操作步骤可参见实施例。

本发明方法和所用四联袋分离单个核细胞在密闭系统中完成，解决了微生物污染问题，而且不受分离样本体积限制，分离成本低，效率高，单份脐血仅需一套联袋，特别是同时分离多份样本时，效率可以几倍于试管法。分离后MNC计数、MNC回收率、CD34+细胞数均高于试管法(P＜0.05)，台盼兰拒染率、红细胞混入量二者比较差异无统计学意义(P＞0.05)。同时，本发明相对于《多联袋无菌制备脐带血问质干细胞的方法及效果》一文中采用的方法和四联袋，由于采用先将脐带血、骨髓或外周血离心除去大部分的富血小板血浆层，然后再与淋巴分离液混合离心分层，而且用生理盐水洗涤2次，因此分离后的MNC计数、MNC回收率、CD34+细胞数均比该文方法高，台盼兰拒染率、红细胞混入量比其低，效果显著。

在此基础上，对分离的单个核细胞进行培养同时加入促诱导分化的细胞因子，分析了影响增值、分化的几种影响因素，而一般的方法由于非目的细胞含量高，必须有或无血清培养基先进行培养、传代，以进一步纯化目的细胞，然后进行诱导，整个过程甚至需要几个月时间。

目前人们利用间充质干细胞移植治疗脑缺血、心肌梗塞、帕金森病等的动物疾病方面已经取得了良好效果，也有学者采用培养扩增后的人间充质干细胞作为移植物进行骨再生研究，但多限于动物实验，很少直接用于人体，主要是临床应用安全性。

本发明方法利用四联袋无菌连接技术制备单个核细胞静脉输注治疗酒精性股骨头缺血性坏死和脑梗塞后遗症，在发出细胞前24h进行细胞培养，均未发现细菌生长，避免了细菌污染，所分离的单个核细胞是一种原始的免疫缺陷细胞，具有良好的免疫耐受性，同时又因分离过程红细胞混入量很低，不需ABO及HLA配型亦可使用，没有出现发热、感染及过敏等不良反应，从而保证了临床的安全，疗程短且疗效明显，提高了患者的生活质量。

本发明无须在百级净化环境下即可分离单个核细胞，不受样本数量、体积限制，效率高，无污染，不仅可以用于实验室研究，也可以直接用于人体治疗，且结构简单，便于成批生产。

附图说明

图1本发明四联袋结构示意图

1：主袋2：空袋            3、4：生理盐水袋

5、导管6：联接导管的三通  7：输液头

8：与外接袋无菌连接的导管 9：止流夹

具体实施方式

本发明实施方式所用试剂和仪器如下：四联袋(一个主袋，一个空袋，两个0.9％氯化钠液袋，山东威高集团公司)，大容量低温离心机(德国Heraeus公司)，50ml试管(美国BD公司)，流式细胞仪(美国BD公司)，倒置显微镜(日本奥林巴斯)，生物显微镜(重庆奥特光学仪器公司)，人淋巴细胞分离液(密度1.077/cm³，天津灏洋公司)，6％HES(山东华鲁制药公司)，0.5％台盼蓝染液(0.5g的台盼蓝，100ml0.9％氯化钠液)，KX-21型血细胞计数仪(日本东亚公司)，无菌接口机(日本泰尔茂公司)。DMEM/F12(Gibco)，B27(Gibco)，重组人EGF(Sigma)，bFGF(Sigma)，鼠抗人Nestin(Sigma)

实施例1

四联袋如图1所示，由1-4号4个四联袋构成，如附图图1所示。

其中1号袋为主袋，作用是盛放脐带血、骨髓或外周血和淋巴细胞分离液的混合液体，并作为离心容器，其中，脐带血、骨髓或外周血事先需要经过离心处理，以除去上层富血小板血浆层，降低台盼兰拒染率、红细胞混入量；2号袋为空袋，用于收集目的细胞层的液体；3、4号袋为生理盐水袋，预充生理盐水，主要用于无菌洗涤后的目的细胞。

1-4号4个袋的容量可根据样本体积的大小选择相应的无菌塑料袋，可以从30ml~500ml不等。优选其中1号袋长18cm，宽9cm，可盛液体200ml左右。2号袋为长16cm，宽10cm；3、4号袋为生理盐水袋，长18cm，宽12cm。

4个袋用密闭无菌塑料导管5相联，塑料导管5一端与1号袋主袋1相连，从1号袋引出后分流，形成一个三通结构6，其中所分流的一路导管与2号袋空袋2相连，另一路导管继续分流，再形成另一个三通结构6，所分流的两路导管分别与3号袋和4号袋生理盐水袋3、4相连。

在塑料导管5与每个袋子相连处均设有止流夹9，以防止液体在袋子相互流动，但是当打开止流夹9后液体可以根据需要流向所设定的袋子。同时每个袋子均配有输液头7，用于加液或输注。此外，每个袋子还配有与外接袋无菌连接的导管8，其作用是可以利用无菌连接技术随时加入制备过程中所需的液体。

具体操作步骤为：

以盛有无菌条件下采集的脐带血收集袋为样品，在KX-21血球计数仪上检测样本的MNC计数。

1、前处理：将样品收集袋平衡后置入大型低温离心机内，2400rpm、22℃离心5min。离心后轻轻取出塑料收集袋放在分浆夹上，将上层富血小板血浆层挤压到另一空袋，做为最终悬浮液或其他应用。然后将体积比为1∶4的羟乙基淀粉溶液和生理盐水加入收集袋内，使得血液的红细胞比积为50-65％，羟乙基淀粉溶液重量百分比浓度为6％。

2、加液：利用无菌接口机将Ficoll-Hypaque混合溶液(淋巴细胞分离液)的样管与四联袋主袋的与外接袋无菌连接的导管8联接，按照前处理过血液的体积以2∶1的比例，将Ficoll-Hypaque混合溶液(淋巴细胞分离液)加入到四联袋主袋内，使主袋上方保留一些气体，形成一个较大的液面。再将样品收集袋与盛有淋巴细胞分离液的主袋无菌连接，使样本收集袋中血液沿主袋袋袋壁缓慢加入主袋的液面上，保持血液和淋巴细胞分离液的界面清晰。

3、离心：将加液后的四联袋平衡后置入大型低温离心机内，1200rpm、22℃离心30min。离心后轻轻取出塑料袋放在分浆夹上，此时袋内的液体自上而下分为5层，分别为：含有少量血浆血小板的上清层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层。

4、分离：将含有少量血浆血小板的上清层层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层的上部，挤压入2号空袋内，即为富含MNC的液体。此时用止流夹阻断1号袋与2号袋通路。

5、洗涤：打开2号袋与3号袋的止流夹，将3号袋内的生理盐水加入2号袋并加满，然后关闭2号袋与3号袋的止流夹。将四联袋平衡后2500rpm、22℃离心7min，将上清液挤压入1号主袋。然后将3号袋剩余的生理盐水和4号袋的生理盐水再次将2号袋加满，如上条件离心，离心后将上清液挤压入3号袋。

6、悬浮：将4号袋剩余的生理盐水按照临床要求体积加入2号袋，以调整悬浮MNC的最终浓度或体积。断开2号袋与其他袋的联接，即为密闭系统收集的MNC。同时留样检测。

实施例2

样品收集袋中为骨髓，羟乙基淀粉溶液和生理盐水体积比为1∶5，前处理过的脐带血、骨髓或外周血与淋巴细胞分离液的体积比为1∶1，前处理时离心条件为2000rpm、22℃离心5min，步骤(3)中离心条件为1000rpm、22℃下离心30min，洗涤时离心条件为2200rpm、22℃下离心7min，其它步骤和条件同实施例1。

实施例3

样品收集袋中为外周血，前处理时离心条件为2500rpm、22℃离心5min，步骤(3)中离心条件为1500rpm、22℃下离心30min，洗涤时离心条件为2800rpm、22℃下离心7min，其它步骤和条件同实施例1。

实施例4

样品收集袋中为外周血，前处理时离心条件为2200rpm、22℃离心5min，步骤(3)中离心条件为1200rpm、22℃下离心30min，洗涤时离心条件为2600rpm、22℃下离心7min，其它步骤和条件同实施例1。

比较例1

本比较例是从脐带血中分离单个核细胞的几种方法的比较。所采用方法分别是：实施例1方法、试管法和《多联袋无菌制备脐带血间质干细胞的方法及效果》一文中所采用方法(以下简称对比文)；

1、材料和方法

1.1试剂与仪器见实施例1前说明，对比文所用四联袋为无菌塑料四联袋(山东威高集团公司生产：1个主袋，2个空袋，1个生理盐水袋)。

1.2脐血来源脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿脐带血，取标本前征得产妇及家属同意，产妇体健，无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，胎儿无先天性异常，ADA-A抗凝，血量在66～140ml，平均体积86ml。脐血分离前按卫生部血液检测标准进行检测。

1.3实施例1法、试管法、对比文法分离脐血单核细胞方法及分组比较

1.3.1对比文法分离脐血单核细胞方法按照样本的体积以1∶1的比例，先将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋的主袋内，利用无菌接口机将盛有Ficoll-Hypaque混合溶液的四联袋与脐带血收集袋相连，再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内液面上，保持血液和淋巴细胞分离液的界面清晰。将四联袋平衡后置入大型低温离心机内，1500r/min、22℃离心30min。离心后轻轻取出四联袋，将主袋放在分浆夹上，此时袋内的液体自上而下分为5层：血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层。将血浆血小板层的上2/3液体挤压入四联袋的一空袋内，将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层的上部，挤压入四联袋另一空袋内，即为富含单个核细胞的液体。打开无菌生理盐水袋与富含单个核细胞/间质干细胞的袋的通道，将无菌生理盐水加入单个核细胞/间质干细胞袋内，平衡后2500r/min、22℃离心7min，弃去上清液，再重复洗涤1次，根据临床要求用无菌生理盐水或脐带血血浆调整悬浮单个核细胞最终浓度

1.3.2试管法分离脐血单核细胞方法将采集6小时内的脐血倒入50ml试管内，2000r/min，4℃离心10min，移液管吸出上层部分血浆，剩余的红细胞悬液每管加入6％HES液3ml充分混匀，再加入0.9％氯化钠液等倍稀释。将稀释的脐血缓缓加入盛有淋巴细胞分离液的50ml试管内，脐血与淋巴细胞分离液比例为2∶1。1800r/min，20min，4℃离心，移液管吸出单核细胞层，1500r/min，8min，重复洗涤两次。

1.3.3分组将45份脐血采用随机数字表的方法分成两组，每组15份标本。一组采用实施例1法、一组采用对比文法分离MNC(对比文组)，另一组采用试管法分离(试管组)。

1.3.4细胞计数与检测将三种方法制备的单核细胞用KX-21型血细胞计数仪计数，0.5％台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞。流式细胞仪检测分离后CD34+细胞数。

1.4细胞培养

培养方法 将分离的单核细胞以5×10⁶/ml接种于含DMEM/F12培养液的75ml培养瓶中，加入相应细胞因子，5％CO2，37℃及饱和湿度条件下培养，培养7天后倾去全部液体，以后根据细胞生长情况，每周全量换液1～2次，细胞长到80～90％融合传代。分别观察不同细胞因子组合、红细胞混入量、首次换液时间对细胞增殖、分化的影响。

1.5统计分析实验数据用spss10.0软件分析，采用独立样本t检验，检验水准α＝0.05，p＜0.05有统计学意义。

2.结果

2.1三种方法分离脐血单核细胞的比较

2.1.1三组脐血分离前脐血量66～140ml，平均86ml；脐血量、细胞浓度及MNC数相比差异无显著性(p＞0.05)。见表1。

表1分离前三组脐血基本情况

注：试管法组与对比文组比较^*t＝0.057，p＞0.05；^**t＝1.433，p＞0.05；^***t＝1.519，p＞0.05

对比文组与实施例1组比较^*t＝1.102，p＞0.05；^**t＝1.304，p＞0.05；^***t＝0.317，p＞0.05

2.1.2三组方法分离脐血单核细胞的主要指标分离后MNC数、MNC回收率、CD34+细胞数、均高于试管法(p＜0.05)，台盼兰拒染率、红细胞混入量二者比较差异无统计学意义(p＞0.05)，MNC细胞活力相当。见表2

表2三种方法分离脐血后主要指标检测结果

注：试管法组与对比文组比较

◆t＝2.116，p＜0.05；●t＝0.468，p＞0.05；★t＝3.269，p＜0.05；※t＝1.607，p＞0.05；▲t＝2.173，p＜0.05对比文组与实施例1组比较

◆t＝0.254，p＞0.05；●t＝2.513，p＜0.05；★t＝0.269，p＞0.05；※t＝0.607，p＞0.05；▲t＝0.793，p＞0.05

2.1.3细菌培养：三种方法分离的MNC均进行需氧菌、厌氧菌和霉菌培养。实施例1法和对比文法无一例细菌污染，而试管法有1例细菌污染，革兰氏染色为阳性菌；1例真菌污染，肉眼观察有霉菌斑块，倒置显微镜下可发现菌丝。

可见，本发明分离单个核细胞红细胞混入量低，无须在百级净化环境下即可分离单个核细胞，不受样本数量、体积限制，效率高，无污染，不仅可以用于实验室研究，也可以直接用于人体治疗，且结构简单，便于成批生产。

Claims (3)

1.一种分离单个核细胞的方法，其特征在于，包括

(1)、前处理

将脐带血、骨髓或外周血离心，离心条件为2400rpm、22℃下离心5min；将上层富血小板血浆层除去，然后加入适量质量百分比浓度为6％的羟乙基淀粉溶液和生理盐水；使得血液的红细胞比积为50-65％，其中羟乙基淀粉溶液和生理盐水的体积比为1∶4～1∶5；

(2)、加液

将经过步骤(1)前处理过的脐带血、骨髓或外周血倒入淋巴细胞分离液中，保持脐带血、骨髓或外周血和淋巴细胞分离液的界面清晰，前处理过的脐带血、骨髓或外周血与淋巴细胞分离液的体积比为2∶1；所述淋巴细胞分离液为Ficoll-Hypaque混合溶液；

(3)、离心

将步骤(2)所得的液体离心，离心条件为1000-1500rpm、22℃下离心30min；此时液体自上而下分为5层，分别为：含有少量血浆血小板的上清层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层；

(4)、分离

将含有少量血浆血小板的上清层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层的上部取出，即为富含单个核细胞的液体；

(5)洗涤

在富含单个核细胞的液体中加入生理盐水，离心，弃去上清液，再加入生理盐水，同样的条件下离心，弃去上清液；剩下的部分即为单个核细胞液，离心条件为2200--2800rpm、22℃下离心7min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)最后所得的单个核细胞液中还加入生理盐水，以调整单个核细胞的最终浓度和体积。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的所有步骤在密闭系统中进行。 

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