CN107641614A - 微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途、用于诱导干细胞巨核分化的培养基以及促进干细胞巨核分化的方法。在干细胞向巨核细胞培养分化的体系中添加微囊泡，能够有效提高巨核分化效率和获得的巨核细胞或血小板的细胞活性。

Description

微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途

相关申请

本申请是申请日为2014年06月30日、名称为《微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途》的中国专利申请2014103097723的分案申请。

技术领域

本发明涉及微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途。

背景技术

核辐射，武器伤，大剂量的化疗，异体组织器官移植，免疫系统和血液系统的一些疾病都会导致血小板数量的减少或者功能不良，引起内出血而危及生命。临床上多通过反复输注血小板，预防病人内出血的发生。因此，血小板的需求量巨大。目前常采用的机采血小板却存在着供者舒适度低，供应量少，保存时间短，会产生免疫反应及病原体污染等不利因素，要解决血液来源匮乏的问题，开发新的血源变得尤为迫切，其中干细胞研究为体外制备血小板提供了新的研究方向，包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)及脐带、骨髓、外周血来源的造血干祖细胞都可以作为种子细胞，通过大量诱导扩增生成可用于移植的巨核祖细胞、巨核细胞或者血小板。经研究证实，在体外扩增的造血干细胞，诱导其分化为巨核细胞和血小板，重新回输入体内，也可以发挥相应的凝血功能。健康新生儿的脐带血因具有从临床较易获得、对捐献者无伤害且无伦理学争议等独特优势，已经成为干细胞移植领域中，继骨髓、动员外周血之后的又一种新的造血干/祖细胞来源，成功用于临床上再生障碍性贫血、白血病、急性辐射损伤等病人的造血重建。

虽然诱导干细胞获得巨核细胞和成熟血小板的研究不断见诸报导，但是目前的干细胞的巨核分化效率和细胞活性低，产生的有功能的细胞和血小板的生成量少，不能满足临床应用需要。因而，目前的诱导干细胞巨核分化的方法仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种巨核分化效率高、细胞活性好的诱导干细胞巨核分化的方法。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

生理条件下，造血干细胞向红系定向分化的过程经历了如下过程：pluripotentstem cell(多能干细胞)→committed stem cell(定向干细胞)→CFU-GEMM(colonyforming unit-granulocyte,erythrocyte,monocyte and megakaryocyte：粒细胞，红细胞，单核细胞及巨核细胞集落形成单位；多能造血祖细胞)→BFU-MK(burst forming unit-megakaryocyte：爆式巨核细胞集落形成单位；前巨核细胞系祖细胞)→CFU-MK(colonyforming unit-megakaryocyte：巨核细胞集落形成单位；巨核细胞系祖细胞)→promegakaryoblast(前原始巨核细胞；前成巨核细胞)→megakaryoblast(原始巨核细胞；成巨核细胞)→promegakaryocyte(幼稚巨核细胞)→megakaryocyte(巨核细胞)→platelet(血小板)。

微囊泡是由细胞膜的出芽形成的一种磷脂膜结构包裹的颗粒，直径在100-1000nm，多在200nm左右。血液中70％-90％的微囊泡来自于激活的血小板，因为在膜出芽生成的同时微囊泡还包裹了一些胞质成分，所以其富含细胞因子，趋化因子，酶类，生长因子等各种发挥不同生物学功能的物质。微囊泡通过受体配体连接作用，捕获靶细胞，从而形成特殊的脂质复合物，进而把生物活性物质传递到靶细胞中，更重要的是，微囊泡是在循环血中运送独特MicroRNA的主要载体形式，在细胞间信息传递中发挥了重要作用。而且血小板产生的微囊泡参与了血栓形成、炎症反应和血管再生等过程，在促进内皮细胞和平滑肌细胞生长、促进造血干祖细胞增殖，存活，粘附，趋化性和移植的存活率等方面有着重要作用。

发明人研究发现，特发性血小板减少性紫癜，阵发性血红蛋白尿，肝素诱导的血小板减少这些特发的或者某些药物引起的由自身免疫系统对血小板进行破坏的疾病中，外周血中由血小板产生的微囊泡的数量增加，骨髓也呈现出巨核系的增生象，因而，发明人推测这两者之间可能会存在着某种联系。进而，发明人在无血清无基质细胞的、造血干细胞向巨核细胞的培养分化的体系中添加由血小板生成的微囊泡，结果发现，相对于对照，添加微囊泡后造血干细胞的扩增能力和向巨核细胞分化的能力均显著增加，从而获得了数量更多成熟度更高的巨核细胞。因而，发明人认为，微囊泡能够显著增加造血干细胞或其他干细胞的巨核分化能力。

为此，根据本发明的一个方面，本发明提供了微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途。由此，在干细胞向巨核细胞培养分化的体系(如诱导分化培养基)中添加微囊泡，能够有效提高巨核分化效率和获得的巨核细胞或血小板的细胞活性。

根据本发明的实施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。

根据本发明的实施例，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。即微囊泡对造血干细胞尤其是脐带血单个核细胞的巨核分化促进效果尤其显著。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于诱导干细胞巨核分化的培养基。根据本发明的实施例，该培养基包含微囊泡。由此，利用本发明的培养基能够高效地诱导干细胞向巨核细胞分化，从而能够获得大量细胞活性好的巨核细胞或血小板。

另外，根据本发明上述实施例的用于诱导干细胞巨核分化的培养基还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，利用本发明的用于诱导干细胞巨核分化的培养基诱导干细胞巨核分化时，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。

根据本发明的实施例，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。

根据本发明的实施例，所述培养基中包含1-25×10⁵个/ml微囊泡。由此，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。

根据本发明的实施例，所述培养基为添加了100ng/mL rhTPO、100ng/mL SCF、20ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6和20ng/mL IL-11的Stemspan培养基。由此，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。

根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种促进干细胞巨核分化的方法。根据本发明的实施例，该方法利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干细胞。发明人惊奇地发现，利用该方法能够有效地促进干细胞巨核分化，提高干细胞的巨核分化效率和获得的巨核细胞或血小板的细胞活性。

根据本发明的实施例，所述诱导分化培养基中添加有1-25×10⁵个/ml微囊泡。由此，利用本发明的方法诱导干细胞巨核分化时，能够显著提高干细胞的巨核分化效率和获得的巨核细胞或血小板活性。

根据本发明的实施例，所述添加微囊泡的诱导分化培养基为前面所述的本发明的用于诱导干细胞巨核分化的培养基。由此，能够显著提高干细胞的巨核分化效率和获得的巨核细胞或血小板的细胞活性。进而，根据本发明的另一些实施例，于37摄氏度，5％CO₂条件下，利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干细胞7-15天，其中，隔天半量换液，并使所述诱导分化培养基中各成分浓度不变。由此，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。

根据本发明的实施例，所述微囊泡由血小板形成。由此，干细胞的巨核分化效率高，获得的巨核细胞或血小板活性好。

根据本发明的实施例，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。

此外，需要说明的是，本发明通过添加血小板提取的微囊泡，解决了巨核细胞在无血清无滋养层细胞的条件下，体外分化效率低，增殖能力差，成熟度不高的问题。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了实施例1中获得的血小板生成的微囊泡的免疫表型检测结果，其中，

图1A显示了依据微囊泡的大小划定微囊泡的范围P1的结果，

图1B显示了依据乳糜微粒大小不同，划定的乳糜微粒和微囊泡的范围的结果，

图1C显示了对图1B划定范围的微囊泡进行表面标志分析的结果；

图2显示了实施例1中获得的血小板生成的微囊泡的透射电镜扫描结果；

图3-图8显示了实施例2中，微囊泡是否添加、添加时间点和添加浓度对诱导干细胞巨核分化的影响实验的结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

实施例1微囊泡的制备

按照以下步骤制备微囊泡：

a.血小板的分离

1)取新鲜的经检验合格并经抗凝处理的全血，经过4℃，2000r/min离心20-30分钟，分离出上层血浆。

2)使用1)中获取的血浆，或直接使用新鲜合格的单采血小板以及富血小板血浆，经4℃，2000g/min离心15-20分钟，取下层沉淀，为分离的血小板。

3)并用缓冲盐溶液悬起，重复步骤2)。

b.血小板的激活

4)将分离得到的血小板用缓冲盐溶液悬起，加入血小板的激活剂(如凝血酶、CaCl₂、ADP、A23187等)后37℃，200r震荡15-25分钟，使血小板充分激活。主要激活方法如下表：

激活剂	浓度
		凝血酶	凝血酶1U/ml CaCl2 1mmol/l
ADP	20μmol/l
		A231187	4μmol/l

c.血小板生成的微囊泡的制备

5)经室温3000g/min离心15-20分钟，取上清，并过滤，去除1000nm以上的碎片。

6)经4℃20000r/min离心90-120分钟，取下层沉淀。

7)并用缓冲盐溶液悬起，重复步骤6)，-80℃保存。

d.微囊泡的鉴定

1)免疫表型检测：用缓冲盐溶液将血小板生成的微囊泡悬起，并用特异性结合血小板特有的表面标志(血小板质膜表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和GPIb-IX-V)的荧光抗体(分别为CD41-FITC/CD61-APC，CD42-PE)进行标记，混合以1-2微米的匀质的数量已知的乳糜微粒，进行流式细胞术检测这两种表面标志，并记录结果。

结果见图1。其中，图1A为依据微囊泡的大小划定微囊泡的范围P1，说明提取的微囊泡是大小和颗粒度都较为均一的一群；图1B为依据乳糜微粒大小不同，划定的乳糜微粒和微囊泡的范围，P1为微囊泡，P2为乳糜微粒，通过二者比值，可计算出微囊泡的含量，计算可知本实施例获得的外囊泡数量非常多；图1C是对图1B划定范围的微囊泡进行表面标志分析的结果，结果显示几乎全部微囊泡表面都携带CD41a CD61CD42b等特异性的蛋白，证明所提取的微囊泡纯度高。

2)透射电镜扫描：用缓冲盐溶液将血小板生成的微囊泡悬起，用磷钨酸染色后，滴于铜网上，制片后，置于扫描电镜(H7650扫描电镜，HITACHI公司)下观察，记录图像结果。结果见图2(其标尺为100nm)。由图2可知，磷钨酸负染后，微囊泡大小在200-1000nm之间，形状较为规则，多为圆形。

实施例2

按照以下步骤，体外诱导干细胞巨核分化：

一、自体脐带血血浆的制备：

1、无菌采集足月顺产胎儿断脐后的脐带血一份，将分离完上层血浆的脐带血，按照1:1的比例与PBS溶液混匀，再按4:1的比例与2.3％(w/v)的甲基纤维素，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明，沉降红细胞。

2、吸出上清，置50mL离心管中，25℃、20000rpm离心7分钟。在15mL的离心管中加入5mL Ficoll人淋巴细胞分离液，再缓缓沿管壁加入5mL细胞悬液，25℃、1800rpm离心25分钟，分离出单个核细胞。

3、收集界面单个核细胞，用PBS洗涤。

4、用PBS悬浮细胞计数，备用。

二、巨核细胞的体外诱导：

1、将上述分离得到的单个核细胞接种到6孔板细胞板中，每孔加入2ml密度为1×10⁷个/ml的单个核细胞，加入巨核诱导培养基2mL，然后置于37℃5％CO₂孵箱中培养。

其中，该巨核诱导培养基是通过向Stemspan培养基中添加100ng/mL重组人血小板生成素(TPO)、100ng/mL干细胞生长因子(SCF)、20ng/mL白细胞介素3(IL-3)、50ng/mL白细胞介素6(IL-6)和20ng/mL白细胞介素11(IL-11)而获得的。

2、连续培养7-15天。

其中，在培养过程中，向培养基中添加微囊泡，并进行实验设置，以便确定微囊泡是否添加、添加时间点和添加浓度对诱导干细胞巨核分化的影响，具体如下：

1)、在培养0天时，将实施例1获得的血小板生成的微囊泡分别以5×10⁵个/ml(PMP-5组)，25×10⁵个/ml(PMP-25组)的终浓度添加入培养体系(即上述巨核诱导培养基)中，其中，对照组不添加微囊泡。随着培养天数，对细胞进行计数，并在培养第9天时进行流式细胞分析，结果见图3和图4。其中，图3是对上述三组细胞，每隔3天进行计数，并依据计数结果绘制获得的线形图。由图3可知，在0天时加入5×10⁵个/ml和25×10⁵个/ml的血小板生成微囊泡的培养体系中，巨核细胞的数量均优于空白对照组。从而表明不同浓度的微囊泡均有促增殖的作用，且浓度较高的组的促增殖能力比较强。图4是在培养第九天时，利用流式细胞术检测上述三组培养体系中细胞巨核系相关表面标志CD41的表达量的结果，由图4可知，添加微囊泡组均优于空白对照组，不同浓度的微囊泡均有促进巨核分化的作用，浓度较高的组的促进巨核分化能力比较强。

2)、按照以下实验设置诱导干细胞巨核分化，以确定微囊泡的添加时间对分化的影响：

实验分六组：PMP+0d组、PMP+3d组、PMP+6d组、PMP+9d组、PMP+every3d组以及对照组。针对各组，分别在设定的时间点，将实施例1获得的血小板生成的微囊泡以5×10⁵个/ml的终浓度添加入培养体系(即上述巨核诱导培养基)中，然后继续培养。具体地，对照组不添加微囊泡；PMP+0d组在培养第0天时添加微囊泡；PMP+3d组在培养第3天时添加微囊泡；PMP+6d组在培养第6天时添加微囊泡；PMP+9d组在培养第9天时添加微囊泡；PMP+every 3d组在培养第0、3、6和9天时均添加微囊泡，且每次添加均要保持培养体系中的微囊泡的终浓度为5×10⁵个/ml。

然后，分别在培养第15天和18天时，利用流式细胞仪检测不同时间点加入微囊泡的6组细胞的巨核系特异性表面标志CD41、CD61和CD42的三种细胞因子的阳性比例，经多次重复实验后进行统计并制图，结果见图5。由图5可知，在不同时间点添加5×10⁵个/ml的微囊泡均有促进巨核分化的作用，其中以每隔三天加入微囊泡(即PMP+every 3d组)效果最好。

3)、分别在培养第0、3、6和9天时，将实施例1获得的血小板生成的微囊泡以5×10⁵个/ml的终浓度添加入培养体系(即上述巨核诱导培养基)中，然后继续培养。即每次添加均要保持培养体系中的微囊泡的终浓度为5×10⁵个/ml。其中，将该实验组称为PMP组，实验同时设对照组，对照组不添加微囊泡。

然后，在培养第15天时，分别通过瑞氏吉姆萨染色观察细胞形态，利用流式细胞仪检测细胞多倍体和表面标志的表达情况，结果见图6-图8。其中，图6是通过流式细胞术检测添加微囊泡组与对照组细胞巨核系相关表面标志表达情况的结果，由图6可知，PMP组即添加微囊泡组细胞的巨核系相关表面标志CD41、CD61和CD42的表达情况均优于对照组，即添加微囊泡后CD41+CD61+CD42+的阳性细胞比例增多。图7是通过流式细胞术检测添加微囊泡组与对照组细胞多倍体细胞的比例的结果，由图7可知，相对于对照组，PMP组即添加微囊泡组4倍体细胞(多倍体细胞)比例更高。图8是通过瑞士吉姆萨染色，观察添加微囊泡组与空白对照组细胞形态的结果，由图8可知，相对于对照组，PMP组即添加微囊泡组细胞更大，且多倍体细胞更多，与流式细胞数检测结果相吻合。综合图7和图8的结果可知，添加微囊泡后，细胞中的多倍体比例增加。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。

4.一种用于诱导干细胞巨核分化的培养基，其特征在于，包含微囊泡。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成。

6.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。

7.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包含1-25×10⁵个/ml微囊泡，

任选地，所述培养基为添加了100ng/mL rhTPO、100ng/mL SCF、20ng/mL IL-3、50ng/mLIL-6和20ng/mL IL-11的Stemspan培养基。

8.一种促进干细胞巨核分化的方法，其特征在于，

利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干细胞。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导分化培养基中添加有1-25×10⁵个/ml微囊泡，

任选地，所述添加微囊泡的诱导分化培养基为权利要求4-7任一项所述的培养基，

任选地，于37摄氏度，5％CO₂条件下，利用添加微囊泡的诱导分化培养基培养所述干细胞7-15天，其中，隔天半量换液，并使所述诱导分化培养基中各成分浓度不变。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微囊泡由血小板形成，

任选地，所述干细胞为造血干细胞，优选脐带血单个核细胞。