CN1363681A - 源于脐带血的活化淋巴细胞、含有所述淋巴细胞作为主要成分的制剂和制备所述制剂的方法与成套器具 - Google Patents
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Abstract
源于脐带血的活化淋巴细胞对预防和治疗各种类型的肿瘤和各种类型的感染非常有效。用白细胞介素2和/或抗CD3抗体,源于脐带血的淋巴细胞通过从脐带血分离淋巴细胞并在体外直接增殖所分离的淋巴细胞或从脐带血分离单核细胞并在体外增殖该单核细胞而制备。此外,源于脐带血的活化淋巴细胞可以有效地用于预防疾病的复发生和促进干细胞或其它器官的吸收。
Description
技术领域
本发明涉及源于脐带血的活化淋巴细胞、含有前述淋巴细胞作为主要成分的药物制剂和制备前述制剂的方法与成套器具(kit),该制剂用于治疗各种肿瘤和感染疾病并预防这些疾病发生和复发,以及加快各种器官的干细胞吸收等。
背景技术
最近,人们已经对使免疫系统耐受生物防御的淋巴细胞表现出浓厚的兴趣。特别地,T-淋巴细胞是具有有效的细胞免疫性的重要细胞之一,并根据单克隆抗体的反应性被分类为以下组。举例来说,对抗CD3抗体(CD是分化簇(Cluster of differentiation)的缩写)具有反应性的T-淋巴细胞属于CD3阳性细胞。对从这些淋巴细胞显示的抗原与它们的功能之间的关系已经进行了大量的研究。
在CD3阳性细胞中显示CD45 RA-抗原的淋巴细胞是原初T-淋巴细胞,它被视为没有抗肿瘤活性。相反地,在前述CD3阳性细胞中显示CD45 RO-抗原的淋巴细胞是记忆T-淋巴细胞,它被认为具有抗肿瘤活性的作用。发明者之一Sekine已经报道用固相抗CD3抗体和白细胞介素2增殖淋巴细胞是可能的,以使作为增殖结果获得的自身淋巴细胞可以拥有抗肿瘤作用(日本专利公开HEI 03-80076(A))。
已经有一些报道说源于外周血等的淋巴细胞可以通过使用抗CD-3抗体或白细胞介素2被增殖,从而产生具有抗肿瘤作用的自身淋巴细胞。另外,本发明的一些发明者Ito等已经报道用抗CD3抗体和白细胞介素2增殖的自身淋巴细胞对先天性免疫缺陷患者的病毒感染有效(Kimiya Ito和Teruaki Sekine,月刊"Igakunoayumi",Ishiyaku Pub.Inc.,第181卷,(1997),第6期,第426-427页)。
骨髓移植通常在患者和供者白细胞血型(本文以下略作"HLA ")适合的情况下进行。但是,因为有许多类型的HLA,所以患者和供者的HLA彼此相同的情况非常少见。在现有情况下,当患者和供者间仅HLA主要成分相同时就进行骨髓移植。不利的是,患者和供者间HLA的不完全匹配可能在骨髓移植中引起宿主疾病(本文以下略作"GVHD")。
为了治疗将引起严重病情的GVHD疾病,使用免疫抑制剂。给予了免疫抑制剂的患者暂时克服疾病,但大多数发生巨细胞病毒或EB病毒感染的严重局面,导致死亡。因此,Elizabeth等报道了通过从骨髓供者的淋巴细胞诱导特定的CD4阳性细胞可以治疗骨髓移植患者的巨细胞病毒感染,从而预防并治疗在免疫抑制情况下引起的病毒感染(Elizabeth A.Walter.M.D.等,The NewEngland Journal of Medicine,第333卷,第1038-1044页)。
另外,由去除术过程制备的异源淋巴细胞已经在临床上被用于治疗白血病患者,即供者白细胞输血(本文以下略作"DLT")。尽管DLT具有高的治疗价值,但已证实使用DLT的治疗引起50%到80%的白血病患者患急性GVHD和20%的白血病患者患致死的GVHD(Kolb.H.J.等,Blood,第86卷,第2041-2050页,(1995),和Slavin S.等,Experimental Hematology,第23卷,第1553-1562页,(1995))。要花很长时间进行去除术,因此给供者施加沉重的负担。
Giralt等报道了使用不含CD8阳性细胞的白细胞的DLT(Giralt,S.,等,Blood,第86卷,第4338-4343页,(1995))。Ritz等报道了使用由去除术制备的CD4阳性细胞的DLT(ClaretEJ.等,Journal of Clinical Investigation,第100卷,第4期,第855-866页,(1997))。在这两篇报道中都报道产生了GVL(移植物抗白血病("Graft versus leukemia")的缩写)的作用,但GVL作用是弱的,轻微的GVL有利地作用于患者。
最近,已有研究试图使用脐带血中含有的细胞来代替从外周血或髓血制备的细胞,这实际上已被髓骨移植接替。然而,一般来说,脐带血中含有的淋巴细胞是原初淋巴细胞,它们不被抗原刺激,因此通常被视为既没有抗肿瘤活性也没有抗病毒作用。
脐带中含有的脐带血可以在不给供者增加负担的情况下获得,而且几乎没有对HLA的限制。因此,与从骨髓或外周血收集的细胞相比,它对供者是有利的。但是,脐带血接种可能更高频率地使肿瘤复发,并且从病毒感染的可能性和接种细胞的吸收的角度而言是不利的。
发明内容
本发明提供活化淋巴细胞和含有活化淋巴细胞的药物制剂,所述制剂可以接种到受体,而没有肿瘤复发的危险,消除由脐带血移植引起的引起病毒感染和复发肿瘤的可能性。
本发明还提供活化淋巴细胞和从活化淋巴细胞制备的药物制剂,其具有高的吸收所接种的制剂中的细胞的能力。
本发明还提供方法和成套器具,它们可以制备这样的药物制剂,该制剂能被接种到受体,而没有肿瘤复发的危险,消除由脐带血移植引起的引起病毒感染和复发肿瘤的可能性。
根据本发明,提供了源于脐带血并经增殖的活化淋巴细胞。这种源于脐带血的淋巴细胞通过从脐带血分离淋巴细胞并在体外直接增殖所分离的淋巴细胞而制备或者通过从脐带血分离单核细胞并在体外增殖单核细胞而制备。分离的淋巴细胞或单核细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体活化并增殖。
根据本发明的源于脐带血的淋巴细胞可以接种到受体或患者,而没有肿瘤复发的危险,消除由脐带血移植引起的引起病毒感染疾病,即病毒感染和复发肿瘤的可能性。
根据本发明的药物制剂通过从脐带血分离单核细胞,用白细胞介素2和/或抗CD3抗体活化并增殖这样分离的单核细胞以获得活化并增殖的淋巴细胞,并且将活化并增殖的淋巴细胞作为主要成分添加其中而制备。
根据本发明的药物制剂用于治疗肿瘤和感染疾病并预防这些疾病的发生和复发。
另外,本发明提供制备源于脐带血的活化淋巴细胞的方法和成套器具,其包括从脐带血分离单核细胞,和用白细胞介素2和/或抗CD3抗体活化并增殖这样分离的单核细胞以获得活化并增殖的淋巴细胞的过程。
根据本发明的方法和成套器具,可以得到所期望的高能力活化淋巴细胞和药物制剂,其可以接种到受体,而没有肿瘤复发的危险,消除由脐带血移植引起的引起病毒感染和复发肿瘤的可能性。
在理解本文以下描述的实施方案的基础上,本发明的其它和进一步的目的将变得明显,或将在所附的权利要求中指明,而且本领域技术人员在实践中将会发现本文没有提及的许多优点。
具体实施方式
根据本发明的制备源于脐带血的活化淋巴细胞和含有活化淋巴细胞作为主要成分的药物制剂的方法将在本文以下详细描述。[脐带血收集]
本发明中源于脐带血的活化淋巴细胞可以通过活化并增殖从脐带收集的脐带血而获得。从脐带的血管抽取脐带血是可取的。另外,可以将肝素或柠檬酸添加到所收集的脐带血中,以防止所收集的脐带血凝固。可以使用在脐带血库中为移植而保存的脐带血的一部分。根据本发明的源于脐带血的活化淋巴细胞可以从0.001ml到100ml脐带血制备。[源于脐带血的活化淋巴细胞]
源于脐带血的活化淋巴细胞的增殖通过公知的淋巴细胞培养方法实现。本发明对培养方法没有任何限制。举例来说,可以在存在白细胞介素2和抗CD3抗体之一或二者都存在下增殖本发明的活化淋巴细胞。从增殖效率的角度而言,在白细胞介素2和抗CD3抗体都存在下进行增殖是可取的。
在本发明的实施方案中的增殖的情况中,使用市售白细胞介素2。优选使用培养基来培养淋巴细胞以使这样获得的活化淋巴细胞浓度为1000到2000U/ml。使用中,这个实施方案中的白细胞介素2可以溶解于培养细胞的普通培养基中。也就是说,根据本发明的方法可以采用培养基如水、生理盐水、Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水溶液、RPMI-1640、DMEM、IMDM和AIM-V,它们都广泛地用于该领域。为了防止白细胞介素2活性降低,一将其溶解就冷藏是可取的。
这些培养基的类型在本发明中没有特别的限制,与要培养的淋巴细胞同质(congenial)的任何类型的培养基都可以在本发明中使用。举例来说,可以使用通过向生物学上源于血清等的培养液或平衡盐水溶液中添加氨基酸、维生素和/或核酸碱基而获得的合成培养基。RPMI-1640、AIM-V、DMEM、IMDM等可以用作培养基。这些培养基中,RPMI-1640是最可取被使用的。特别地,正常人血清具有极好的增殖作用,并且因此可以适合用作培养淋巴细胞的培养基。本文所述的培养基在市场上均有售。
举例来说,淋巴细胞的培养可以通过普通细胞培养方法在培养箱中实现。在30℃到40℃,优选在37℃,在二氧化碳浓度为1%到10%,优选为5%的条件下进行培养是适当的。培养所需的天数在本发明中没有限制,但培养淋巴细胞2到20天,更优选为3到14天是可取的,以使抗CD3抗体的刺激信息传递至细胞。向培养基中加入适量的培养液是可取的,同时在显微镜下观察细胞的状态以在培养过程中计数细胞的数目。
在培养开始后几天中,培养的细胞没有明显的改变,但是通常在三天后开始增殖。在这一阶段,令人满意的培养引起培养液从桔黄色变为黄色。为了防止培养液变质和白细胞介素2降低,每一至七天向培养基中加入培养液。
在抗CD3抗体存在下的培养完成后,培养可以进一步在没有抗CD3抗体存在下继续进行。也就是说,淋巴细胞可以在不含抗CD3抗体的容器中继续培养,容器如培养瓶、滚瓶和透气性培养袋。培养可以继续直至将淋巴细胞给予患者。尽管淋巴细胞的培养在这里所述的条件下进行,但建议在与上述在抗CD3抗体的存在下的培养相同的条件下进行淋巴细胞的培养。也就是说,在淋巴细胞的培养中使用适当浓度的人血清和无血清培养基从花费、可使用性和安全性的角度而言是十分有利的。
举例来说,在开始培养淋巴细胞时,可以将脐带血或单核细胞悬浮在含白细胞介素2的培养液中,将培养液置于含有固相抗CD3抗体的培养容器中。另外,可以使用各种类型的细胞因子、增殖活化因子、促细胞分裂原等以增殖并活化源于脐带血的淋巴细胞。
刺激淋巴细胞的抗CD3抗体可以通过使用纯化的CD3分子而在植物或动物中得到,而且使用商品化的OKT-3抗体(由OrthoPharmaceutical Corp.制备)是方便的,OKT-3抗体在稳定性和花费上是有利的。但是,本发明对抗体没有任何限制,并且可以采用能够促进淋巴细胞增殖和活化的任何其它抗体。
从淋巴细胞的增殖效率和处理特性的角度而言,使用固相抗CD3抗体是可取的。可以使用将抗体变为固相的器具,由玻璃、聚氨酯、聚烯烃、聚苯乙烯等制成的增殖容器。另外,可以使用用于增殖细胞的灭菌塑料瓶。可以选择增殖容器的适当大小。
使抗CD3抗体变为固相的固化通过向特定的器皿中加入抗CD3抗体的稀溶液并让其在某个温度,如4到37℃静置2到24小时而进行。在本发明的实施方案中,使用用生理Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水溶液稀释到0.1到30μg/ml的固相抗CD3抗体是可取的。
固化后,这样获得的固相抗CD3抗体被贮藏在冷冻室或冰箱(4℃)中直到使用。使用时,除去溶液。如果需要,抗CD3抗体可以用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水溶液等在室温下淋洗。
这样获得的源于脐带血的淋巴细胞被进一步加工成制剂,如下描述。从源于脐带血的淋巴细胞制备的制剂在治疗、预防或减轻诸如肿瘤或感染的各种疾病中被广泛有效地使用。
本文所用的术语“制剂”意指具有生物防御作用的含有源于脐带血的淋巴细胞作为主要成分的所有物质。即,可以使用任何含有源于脐带血的淋巴细胞的制剂。举例来说,可以使用悬浮在适当溶液中的源于脐带血的淋巴细胞。尽管可以可取地使用以下形式,其中源于脐带血的淋巴细胞为了流体治疗而悬浮于生理盐水中,该形式含有人血清,但是,本发明并没有特定地限制其形式。
在本发明的实施方案中,通过在试管中直接增殖脐带血,或从脐带血分离单核细胞并用白细胞介素2和/或抗CD3抗体活化并增殖这样分离的单核细胞,可以制备如上所述的含有源于脐带血的淋巴细胞作为主要成分的制剂。
根据本发明的制剂中源于脐带血的淋巴细胞可以用各种基因或者固有(intrinsic)基因的缺省(default)或修饰基因制备。通过使用缺乏人免疫缺陷病毒感染的必需辅因子的源于脐带血的淋巴细胞,可能预防并治疗人免疫缺陷病毒感染或者由人免疫缺陷病毒在免疫缺陷症状中引起的各种感染。此外,尽管根据本发明的制剂可以被用于供者和患者的HLA彼此匹配的情况是理所当然的事,但是,甚至当供者和患者的HLA不匹配时,也可以使用本发明的制剂。
含有根据本发明的源于脐带血的淋巴细胞作为主要成分的制剂可以应用于治疗和预防癌症、免疫缺陷、自身免疫疾病的疾病,要经受脐带血干细胞移植的变应性疾病的患者以及各种感染疾病。
根据本发明的制剂不仅可以有效地用于治疗和预防如上所述的各种肿瘤,而且可以有效地用于治疗和预防白血病和其它实体癌。
可以用本发明的制剂治疗的癌症列举如下:肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、前列腺癌、白血病、肉瘤、脑肿瘤等。免疫缺陷综合征分为获得性免疫缺陷和先天性免疫缺陷。根据本发明的制剂对其有效的获得性免疫缺陷包括恶性复合免疫缺陷(SCID)、维-奥综合征、腺苷脱氨酶缺损和嘌呤核苷磷酸化酶缺损。但是,本发明不仅限于这些综合征。
根据本发明的制剂对其有效的先天性免疫缺陷包括由使用制癌制剂、免疫抑制制剂或类固醇引起的继发免疫缺陷,以及由人免疫缺陷病毒感染引起的AIDS。但是,本发明并不限于这些疾病。根据本发明的制剂对其有效的自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、慢性风湿、斯舍格伦综合征、重症肌无力、恶性贫血和桥本氏病,但是,本发明并不限于这些疾病。
此外,根据本发明的制剂在治疗和预防中不仅可以提供给免疫性减退的患者,而且可以提供给对特定病毒没有免疫性的患者。根据本发明的制剂对其有效的变应性疾病包括支气管性气喘、日本雪松花粉病、荨麻疹、风疹等。但是,本发明并不限于这些疾病。根据本发明的制剂可以用于治疗、预防和减轻各种类型的变应性疾病。
根据本发明的制剂对其有效的感染包括病毒感染、微生物感染、真菌感染、原生动物干染、衣原体感染病、支原体感染等。在病毒感染中有由巨细胞病毒和EB病毒引起的感染。但是,本发明并不限于这些感染。也就是说,根据本发明的制剂在治疗和预防由疱疹病毒,如单纯疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒,以及逆转录病毒,如人白血病病毒和人免疫缺陷病毒引起的病毒感染有效。
根据本发明的制剂对其有效的前述微生物感染包括由绿脓杆菌溶血素、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)和其它致病杆菌引起的感染。根据本发明的制剂甚至可以用于由未知或难以识别的病原体引起的感染和它们的偶见疾病。[制备含有源于脐带血的活化淋巴细胞作为主要成分的制剂的成套器具]
尽管根据本发明的源于脐带血的活化淋巴细胞成分可以单独用作试剂,但是,源于脐带血的淋巴细胞、培养液和固化抗CD3抗体的瓶的组合组成了制备根据本发明的的源于脐带血的活化淋巴细胞的成套器具。用该成套器具,容易确定地制备根据本发明的制剂。
在本发明的成套器具中使用的培养液可以被预先放入固化抗CD3抗体的瓶中。贮存在瓶中的源于脐带血的活化淋巴细胞可以冷藏。这样,通过制备至少由两种成分作为多个试剂组成的成套器具,可以容易地制备根据本发明的制剂并将其用于预防和治疗上述各种病毒感染和各种疾病。
根据本发明的含有源于脐带血的活化淋巴细胞的制剂可以以冷冻状态保存并根据需要用于预防和治疗各种疾病。[剂量]
由本发明的方法所制备的含有前述活化淋巴细胞作为主要成分的制剂的量,可以根据要给予本发明制剂的患者的症状与状态任意确定。一般来说,每1千克患者体重可以适当地给予1×103到1×108数量级的淋巴细胞。优选地,在预期制剂的效率下可以给予患者1×103到1×108个淋巴细胞。[给药]
根据本发明的制剂以注射或静脉滴注的方式给予患者是可取的。更优选的是使用含有向其中加入前述细胞的生理盐水的注射剂或静脉滴注剂,生理盐水使人血清白蛋白的浓度为0.01%到5%。根据本发明的制剂的给药可以适当地通过静脉滴注或注射入静脉、动脉或局部而进行。尽管要给予制剂的量取决于给药方法或部位,但是,给予1到500ml制剂是可取的。使用期望量的含有上述规定量细胞的制剂是更加可取的。推荐给予患者本发明的制剂的频率为每天一次到每月一次,而且制剂的给予次数至少为一次。[实验实施方案1]1、培养瓶的配置:
用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水溶液(Nipro MedicalCorporation销售)将3ml OKT3溶液(由OrthoPharmaceutical Corp.生产并由Janssen-Kyowa Co.,Ltd.进口)稀释到5μg/ml,并注入培养瓶(由Sumitomo BakeliteCompany Ltd.生产的MS-200)中,以使瓶的底部浸入溶液中。
将培养瓶中含有的溶液在冰箱中保存过夜,之后,用排出器吸出OKT3。然后,向瓶中倒入10ml生理盐水,盖上瓶并剧烈摇动,然后,打开瓶并取出溶液。再向瓶中加入01ml生理盐水(HikariParmaceutical Co.Ltd.)。再用塞子盖上瓶并剧烈摇动瓶。此后,打开瓶并将剩余液体内容物从瓶和塞子中小心移走。
在瓶中,将43.5ml培养基(RPMI1640+7,由Nikken BioMedical Laboratory Inc.生产)和35000U/ml的IL-2(由Cetus Corporation生产)、0.5ml两性霉素B(由LifeTechnologies Oriental Inc.进口并销售),以及0.5ml人血清的混合物混合以获得培养基。准备三只同样的瓶。瓶在使用前被保存在冰箱中。2、血液收集
从三个供者的脐带收集5到20ml脐带血,并添加肝素。3、所收集的脐带血的培养
最初,从冰箱中取出在上述过程1中准备的瓶并让其静置10分钟。确证每一个瓶中的培养基都完全溶解后,向三个瓶的每一个中倒入100μl在上述过程2中获得的脐带血,并轻轻搅拌以使每一个瓶中的脐带血均匀分散。此后,在湿度为95%,CO2浓度为5%(第一天)的培养箱(Sanyo Electric Biomedical Co.,Ltd.生产的MIP-3033)中开始培养。4、用提尔克氏溶液(Turk′solution)测量细胞数目
10μl在上述过程2中收集的脐带血与40μl提尔克氏溶液(由Muto Kagaku Yakuhin生产)混合。将10μl混合物施加于血细胞计数器(Perkin Elmer Corporation生产,产品号9731),并在显微镜(由Olympus Optical Co.,Ltd.生产的211320型)下测量以计数细胞数目。获得的结果是三个瓶中的细胞的总数目分另为1.3×105、1.5×105、1.4×105。5、用于分析细胞表面抗原的脐带血单核细胞的分离
在净化台(Showa Science Co.,Ltd.生产的S-1100型)上,从含有这样收集的脐带血的注射器无菌地取下皮下注射针头,不接触注射器和针头的连接部分,并且换上另一个皮下注射针头(19G×1·1/2”针头,Nipro Medical Corporation生产)。然后,将5ml淋洗培养基(Nikken Bio Medical LaboratoryInc.生产)放入体积为15ml的离心沉降管(Iwaki Glass Co.,Ltd.生产,产品号为2327-015)中,进一步,将收集的脐带血慢慢加入离心沉降管中。此后,用塞子将离心沉降管紧紧盖住,然后上下翻转几次使之混合。
接下来,通过使用容量为10ml的移液管(移液管4105,Corning International进口并销售)向体积为15ml的离心沉降管中注入15ml Lymphosepar-1(Immuno-BiologicalLaboratories Co.,Ltd.生产)。然后,将10ml用淋洗培养基稀释的脐带血倒入离心沉降管中,其后,用制动关闭的离心分离机在20℃的离心分离温度以相对低的1800rpm速度离心15分钟,以不扰动试管中的溶液表面(使用由Kokusan Co.,Ltd生产的离心沉降器H-700R)。
离心沉降后,将试管中离心的液体内容物的上清液用抽吸器在无菌条件下慢慢吸出,直到离心沉降在试管中的淋巴细胞层以上约1cm的深度,以不吸入淋巴细胞。然后,通过使用容量为5ml的移液管吸出试管中的淋巴细胞层,以不吸入血块,并且用容量为15ml的离心沉降管收集,该管中预先含有10ml淋洗培养基(RPMI1640+6)。之后,用塞子将离心沉降管盖上并上下翻转几次以混合。其后,离心沉降管在20℃的离心分离温度于1800rpm下离心10分钟。
在离心沉降管被进一步离心后,除去试管中的上清液,通过使用涡流混合器完全分散细胞沉淀。最后,向其中加入10ml淋洗培养基,试管被再次上下翻转以充分混合悬浮液。然后,取出500μl试管中的悬浮液到三个1.5ml的微管(K.K.Asist进口并销售)中以形成三个悬浮液样品,用于测量CD3、HLA-DR和CD4、CD8的百分含量以及分析细胞的表面抗原。6、细胞表面抗原的分析
为了沉降细胞,通过使用离心沉降器(Sakuma Seisakjo Inc.生产的M-150型),将上面过程5中所制备的三个悬浮液样品在4℃的离心分离温度下以6000rpm离心分离5分钟。吸出每个样品的上清液后,将8μl PBS(-)和8μl CD3/HLA-DR抗体(NipponBecton Dickinson Company,Ltd.进口并销售,产品号为340048)加入到第一个样品管中,将8μl CD4/CD8抗体(NipponBecton Dickinson Company,Ltd.进口并销售)加入到第二个样品管中。然后,这些样品反应30分钟。
为了控制样品的非特异性反应,向第三个样品管中加入8μl的PBS(-)。反应后将鞘流体(ISOTON-2,Bectman Coulter Inc.生产)加入到各样品管中。然后,在搅拌后,将各管中的内容物用涡流混合器搅拌并在4℃于6000rpm离心5分钟,以沉降细胞。吸出各管中的上清液后,加入800μl鞘流体。然后彻底搅拌管中的悬浮液并将其分别注入到FACS测量管(Nippon BectonDickinson Company,Ltd.进口并销售)中。
通过使用测量装置FCAScan(Nippon Becton DickinsonCompany,Ltd.进口并销售)根据装置所附的说明书进行FACS测量。其结果表明CD3、HLA-DR、CD4和CD8阳性细胞的百分含量在第一个样品中是28%、3%、39%和7%,在第二个样品中是18%、1%、17%和3%,在第三三个样品中是15%、4%、16%和8%。7、用提尔克氏溶液测量细胞数目
制备10μl上述过程3中培养了7天的细胞和40μl提尔克氏溶液(Muto Kagawa Yakuhin生产)的混合物。
将10μl这样获得的混合物施加于血细胞计数器(PerkinElmer Corporation生产,产品号9731),并在显微镜(由Olympus Optical Co.,Ltd.生产的211320型)下测量计数细胞的数目。测量的结果表明瓶中的细胞总数目分别为1.7×107、1.9×107、1.7×107。8、七天时细胞表面抗原的分析
进行了在前述过程3和4中培养开始七天后的细胞的FACS上,细胞的表面抗原分析。分析结果表明CD3、HLA-DR、CD4和CD8的比率在第一个样品中是98%、10%、79%和20%,在第二个样品中是98%、22%、78%和20%,在第三个样品中是97%、56%、72%和27%。
同样,在过程3和4中培养开始七天后,进行了CD45RA抗体(Nippon Becton Dickinson Company,Ltd.进口并销售,产品号为347723)和CD45RO抗体(Nippon Becton DickinsonCompany,Ltd.进口并销售,产品号为347967)的阳性分析。分析结果表明CD45RA和CD45RO的比率分别为7%和73%。因为源于脐带血的活化淋巴细胞实际上有阳性CD45RO,所以认为他们实现了优越的抗肿瘤作用和抗感染保护作用。[实验实施方案2]脐带血单核细胞的培养
将在上述过程5中分离的脐带血单核细胞在上述过程1中准备的培养瓶中培养。结果可以发现细胞的增殖。[实验实施方案3]促进血原干细胞吸收的研究
将所增殖的源于脐带血的活化淋巴细胞给予患者,这些细胞源于以过程1中所述方式移植给接受脐带血的患者的脐带血的一部分。但是,抗体并不立即在患者体内产生。从这个事实可以明显地看出源于脐带血的活化淋巴细胞具有促进血原干细胞吸收的作用。
从前面的描述中可以明显看出源于脐带血并增殖的活化淋巴细胞或含有根据本发明方法的源于脐带血的活化淋巴细胞的制剂对预防和治疗各种类型的肿瘤和各种类型的感染非常有效。此外,源于脐带血的活化淋巴细胞及其制剂不仅可以有效地用于预防上述疾病的复发,无论是否进行了移植,而且促进干细胞或其它器官的吸收。
Claims (19)
1、源于脐带血的活化淋巴细胞,其通过从所述脐带血分离淋巴细胞并在体外直接增殖并活化所述分离的淋巴细胞而制备。
2、如权利要求1所述的源于脐带血的活化淋巴细胞,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
3、源于脐带血的活化淋巴细胞,其通过从脐带血分离单核细胞并在体外增殖所述分离的单核细胞而制备。
4、如权利要求3所述的源于脐带血的活化淋巴细胞,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
5、预防或治疗肿瘤和感染疾的制剂,其含有源于脐带血的活化淋巴细胞,所述活化淋巴细胞通过从所述脐带血分离淋巴细胞并在体外直接增殖并活化所述分离的淋巴细胞而制备。
6、如权利要求5所述的制剂,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
7、如权利要求5所述的制剂,其中所述感染疾病是病毒感染。
8、预防或治疗肿瘤和感染疾病的制剂,其含有源于脐带血的活化淋巴细胞,所述活化淋巴细胞通过从脐带血分离单核细胞并在体外增殖所述分离的单核细胞而制备。
9、如权利要求8所述的制剂,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
10、促进器官干细胞吸收的制剂,其含有源于脐带血的活化淋巴细胞,所述活化淋巴细胞通过从所述脐带血分离淋巴细胞并在体外直接增殖并活化所述分离的淋巴细胞而制备。
11、如权利要求10所述的制剂,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
12、用于制备预防或治疗肿瘤和感染疾病的制剂的成套器具,所述制剂含有源于脐带血的活化淋巴细胞,所述活化淋巴细胞通过从所述脐带血分离淋巴细胞并在体外直接增殖并活化所述分离的淋巴细胞而制备。
13、如权利要求12所述的成套器具,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
14、用于制备预防或治疗肿瘤和感染疾病的制剂的成套器具,所述制剂含有源于脐带血的活化淋巴细胞,所述活化淋巴细胞通过从脐带血分离单核细胞并在体外增殖所述分离的单核细胞而制备。
15、如权利要求14所述的成套器具,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
16、制备预防或治疗肿瘤和感染疾病的制剂的方法,所述制剂含有源于脐带血的活化淋巴细胞,所述活化淋巴细胞通过从所述脐带血分离淋巴细胞并在体外直接增殖并活化所述分离的淋巴细胞而制备。
17、如权利要求16所述的方法,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
18、制备预防或治疗肿瘤和感染疾病的制剂的方法,所述制剂含有源于脐带血的活化淋巴细胞,所述活化淋巴细胞通过从脐带血分离单核细胞并在体外增殖所述分离的单核细胞而制备。
19、如权利要求18所述的方法,其中所述源于脐带血的淋巴细胞用白细胞介素2和/或抗CD3抗体增殖并活化。
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