CN113952475A - 淋巴细胞和介导crispr系统的纳米复合物联合在制备治疗宫颈癌药物中的应用 - Google Patents

淋巴细胞和介导crispr系统的纳米复合物联合在制备治疗宫颈癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及淋巴细胞联合介导CRISPR系统的基因编辑纳米复合物在制备宫颈癌治疗药物中的应用，属于医药技术领域。本发明采取Cas9 mRNA和向导RNA同时递送策略，成功构建了具有较好转染效能的CRISPR/Cas9纳米递送系统，为非病毒载体的研发提供了一种新的尝试，并且所构建的pH响应性环糊精纳米复合物存在的低pH值靶向特性及内生逃逸机制，有利于其在肿瘤局部释放纳米颗粒，最大效能发挥体内运输作用。同时，因宫颈癌的免疫抑制微环境复杂，淋巴细胞联合基因编辑纳米复合物进行宫颈癌的治疗，两者的联合应用可在肿瘤局部重塑局部免疫环境，最大限度发挥抗肿瘤作用。

Description

淋巴细胞和介导CRISPR系统的纳米复合物联合在制备治疗宫 颈癌药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及淋巴细胞联合介导CRISPR/Case9纳米基因编辑系统在制备治疗宫颈癌药物中的应用。
背景技术
宫颈癌筛查技术在我国推行多年，国家层面也推行行了免费普查等措施，但中国宫颈癌近几年每年的新发病例仍近11万，死亡病例近6万，分别约占全球发病和死亡总数的18.3％和17.6％，我国宫颈癌患者约占全球的1/5，防控的压力很大。人乳头状瘤病毒(HPV)是该病发生的最主要危险因素和致病元凶。局部晚期宫颈癌复发率较高，晚期生存率堪忧。晚期复发转移及持续宫颈癌存在放化疗耐受，生存期短，无有效的治疗措施。免疫及基因治疗为患者带来新的希望。宫颈癌局部免疫微环境复杂，众多因素参与其中。重塑宫颈癌局部免疫微环境也是未来研究的热点。
HPV作为外源性病毒DNA，可整合到宿主DNA。众所周知，促进宫颈癌发生发展的致病基因主要是E6/E7。研究表明敲除致病基因E6/E7后肿瘤细胞出现凋亡，此为宫颈癌的基因治疗提供了支撑。针对HPV的基因治疗不损害人体正常基因，在最大限度减少脱靶率的前提下，宫颈癌的基因治疗具有广阔的前景。作为有效荷载CRISPR/Cas9系统的运送工具，载体分为病毒和非病毒两大类。病毒基因的融合可能会破坏人体重要基因的表达。鉴于病毒载体存在安全性、免疫原性及潜在的致瘤性风险，非病毒载导的临床应用亟待兴起。目前，非病毒性递送方法及载体材料成为研究热点，但该方法递送及优化仍有待深入研究。我校成功研发了pH响应性环糊精纳米材料，拥有专利技术。既往研究显示该纳米粒通过优化制备，在药物递送体内实验中显示了良好的缓释及靶向作用，并具有良好的组织相容性。此外，前期合作团队应用纳米粒递送CRISPR/Cas9基因编辑复合物，实验证明可在低氧低pH值的组织和细胞内靶向降解释放，并具有高效的转染率、稳定和低毒等特性。在宫颈癌中可有效靶向敲除E6/E7基因，并具有较强的抗肿瘤活性。鉴于pH响应性环糊精纳米的性能优势，我们对应用该材料载导CRISPR/Cas9系统产生了兴趣，采用mRNA同步递送策略，最大限度减少脱靶及使用的便利性。
此外，尽管应用CRISPR/Cas9基因编辑的新型纳米复合物可有效靶向敲除肿瘤的致癌基因，消减肿瘤癌蛋白的作用，从而遏制肿瘤生物学恶性行为；但单一的靶向敲除技术可存在不具备持久性，加之肿瘤的异质性以及此消彼长及免疫逃逸机制，不能最大限度达到消灭肿瘤的目的。因此，基因治疗联合其他治疗方法可作为新的策略。宫颈癌免疫治疗为晚期复发转移宫颈癌提供了契机，但PD1，CTLA-4等免疫治疗反应率不足30％。如何重塑免疫微环境是临床研究的方向。目前，CAR-T治疗，自身淋巴细胞过继治疗，联合或不联合放化疗等治疗策略也在不断探索中。
如何让T淋巴细胞迁移至肿瘤组织，如何有效激活CD8+T细胞，是重塑肿瘤免疫微环境的重要环节。基于前期采用pH响应性环糊精同时递送CRISPR/Cas9 mRNA，特异靶向敲除E6/E7致癌基因，具有较高的体内外转染效率，而脐血淋巴细胞具有干细胞特性及免疫治疗作用，故而，本研究采用基因治疗和淋巴细胞联合治疗策略，旨在提供靶向HPV基因治疗联合淋巴细胞或干细胞细胞治疗的可行性，观察其抗肿瘤的协同作用，为宫颈癌基因治疗开辟新的路径。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种淋巴细胞和介导CRISPR/Cas9基因编辑系统的纳米复合物联合在制备宫颈癌治疗药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、淋巴细胞和介导CRISPR系统的纳米复合物联合在制备治疗宫颈癌药物中的应用，所述介导CRISPR系统的纳米复合物包含根据宫颈癌靶标基因设计的向导RNA、Cas9的mRNA和缩醛化β-环糊精。
作为优选的技术特征之一，所述介导CRISPR系统的pH响应性环糊精纳米复合物的构建方法为：
A、根据宫颈癌靶标基因，设计向导RNA序列，合成Cas9的mRNA和向导RNA；
B、将Cas9的mRNA和向导RNA混合得到内水相，加入有机相溶液中混合均匀，形成油包水初乳，所述有机相溶液中包括枝化聚乙烯亚胺和缩醛化β-环糊精；
C、再向油包水初乳中加入聚乙烯醇溶液，混合后得到水包油包水复乳，搅拌挥发有机溶剂后，经过固化、高速离心、洗涤，得到pH响应性环糊精纳米复合物。
作为优选的技术特征之一，步骤B中，所述缩醛化β-环糊精的制备方法为，
将二乙氧基丙烯和对甲苯磺酸吡啶盐加入β-环糊精溶液中，搅拌溶解后，再加入甲氧基丙烯，反应小时，再向反应液中加入三乙胺，终止反应，加水沉淀，离心，水洗至溶液变清，真空干燥，得到缩醛化β-环糊精。
作为优选的技术特征之一，所述二乙氧基丙烯、对甲苯磺酸吡啶盐、β-环糊精、甲氧基丙烯和三乙胺的质量体积比为4.5:16.3:1：4:0.5，mL：mg：g：mL：mL。
作为优选的技术特征之一，步骤B具体为，将Cas9的mRNA和向导RNA混合得到内水相，缩醛化β-环糊精和枝化聚乙烯亚胺混合得到有机相；将有机相和内水相缓慢混合，在磁力搅拌的同时，有机相以1mL/min的速度缓慢滴入到内水相中，超声，形成油包水初乳。
作为优选的技术特征之一，步骤B中，所述有机相中枝化聚乙烯亚胺和缩醛化β-环糊精的质量比为1:6。
作为优选的技术特征之一，步骤C具体为，向油包水初乳中加入聚乙烯醇溶液，超声混合后得到水包油包水复乳，磁力搅拌下3小时，室温下静置至固化，26000rpm高速离心，去离子水洗涤4-5次，得到pH响应性环糊精纳米复合物。
作为优选的技术特征之一，所述聚乙烯醇溶液的浓度为1％。
作为优选的技术特征之一，所述宫颈癌靶标基因为宫颈癌E6和E7基因。
作为优选的技术特征之一，所述淋巴细胞来源于低免疫原性的脐血淋巴细胞，在CRISPR系统的纳米复合物应用后，再联合淋巴细胞的免疫治疗，可提高肿瘤局部T细胞浸润，协同抗肿瘤。
本发明的有益效果在于：
本发明构建了采取Cas9 mRNA和sgRNA同时递送策略，构建了具有较好转染效能的CRISPR/Cas9新型纳米复合物，本发明提供的CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米颗粒存在的低pH值靶向特性及内生逃逸机制，有利于其在肿瘤局部释放纳米颗粒，最大效能发挥体内运输作用。应用CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米颗粒治疗显著逆转了HeLa异种移植中的免疫抑制微环境，和脐血淋巴细胞联合治疗，产生协同抗肿瘤作用，具有良好的应用前景。研究结果表明，联合治疗可重塑宫颈免疫微环境，为宫颈癌基因治疗联合免疫治疗提供新的策略。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为体外转录mRNA化学修饰示意图。
图2为mRNA体外转录后电泳条带，103nt和4521nt gRNA和Cas9 mRNA电泳条带。
图3为含Cas9 mRNA和E6或E7 gRNA的pH响应纳米颗粒的制备示意图。
图4为负载CRISPR/Cas9 mRNA和gRNA的pH响应纳米颗粒的制备、表征和体外评价结果。a、b为包含Cas9 mRNA和E6/E7 gRNA的ACD NP的SEM图像(左)、TEM图像(中)和粒径分布图(右)，比例尺，200nm。C为荧光图像结果，孵育6h后HeLa细胞摄取cy5标记的ACD NP。d、e为Cy5/ACD NP在不同剂量和不同孵育时间后的转染效率的流式细胞结果(d)和定量数据结果(e)。f、g为以0.5、1、2μg/mL Cas9 mRNA作用于E6/ACD NP后6h HeLa细胞中Cas9表达的荧光图像(f)和定量结果(g)，比例尺，20μm。
图5为HeLa异种移植小鼠肿瘤微环境的免疫抑制。(a)治疗方案示意图。(b-c)采用ACD NP或ACD NP+淋巴细胞(ACD NP+LC)治疗HeLa肿瘤后CD45+T细胞的典型流式细胞仪分析(b)和定量分析(c)。(d-e)不同治疗后HeLa肿瘤中CD8+T细胞的流式细胞仪分析(d)和定量分析(e)。(c,e)中的数据以平均值±s.d表示(n＝3).ns，无显著性。LC,淋巴细胞。
图6为体内基因编辑E6/ACD NP通过逆转移植HeLa小鼠的肿瘤免疫抑制微环境，促进CD8+T细胞分化。(a)治疗方案示意图。(b-c)流式细胞分析显示，使用E6/ACD NP进行局部基因编辑后，HeLa肿瘤中淋巴细胞的存活率提高。ACD NP+LC，瘤内注射ACD NP+淋巴细胞治疗小鼠；E6/ACD NP+LC，瘤内注射E6/ACD NP+淋巴细胞的小鼠。(d-e)瘤内注射ACD NP+淋巴细胞(ACD NP+LC)或E6/ACD NP+淋巴细胞(E6/ACD NP+LC)治疗后肿瘤中CD8+T细胞的流式细胞仪检测(c)和定量分析(d)。(e)ACD NP+LC或E6/ACD NP+LC治疗后肿瘤切片CD8表达的免疫组化分析。比例尺，100μm。数据以平均值±s.d表示(n＝3)。***P<0.001。ns,没有意义。LC,淋巴细胞。
图7为基因编辑与淋巴细胞联合在HeLa异种移植小鼠中的协同抗肿瘤作用。(a)治疗方案示意图。(b)不同治疗期间的肿瘤生长曲线。(c)在不同治疗后第29天定量肿瘤体积。(d)不同组肿瘤的数码照片。(e)不同治疗后的肿瘤重量。E6/ACD NP，单独瘤内注射E6/ACDNP小鼠；E6/ACD NP+LC，瘤内同时注射E6/ACD NP和淋巴细胞的小鼠；ACD NP+LC,ACD NP与淋巴细胞同时瘤内注射小鼠；ACD NP，肿瘤内注射ACD NP单独治疗的小鼠。比例尺(d)，1厘米。数据以均数±s.d表示(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns,没有意义。LC,淋巴细胞。
具体实施方式
下面结合具体的优选实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
CRISPR/Cas9载体构建及mRNA体外转录
针对靶基因序列，设计sgRNA，由美国cyagen公司合成单链oligo。构建sgRNA+CRISPR/Cas9过表达质粒，以及相应的sgRNA和P330X质粒的体外转录mRNA的载体。将sgRNA+CRISPR/Cas9过表达质粒转染HeLa细胞，将Sanger测序验证质粒HPVE6/E7基因切割效果，验证后再进行体外转录mRNA。sgRNA如下：
E6:GAAGCTACCTGATCTGTGCA
E7:GGAGCAATTAAGCGACTCAG
体外转录mRNA化学修饰如图1所示，采用The MessageMAXTMT7 ARCA-CappedMessage Transcription Kit转录试剂盒，将Cas和sgRNA体外转录为mRNA。使用T7 RNA聚合酶和抗反转帽类似物(ARCA)m27,3'-OG[5']ppp[5']进行化学修饰。
结果如图2所示，体外转录并化学修饰mRNA成功，具备活性。
实施例2
pH响应性纳米颗粒(ACD NP)的制备及及表征
(1)制备ACD(缩醛化β-环糊精)
1gβ-CD超声溶解在10mL无水DMSO中，25℃条件下磁力搅拌5min。接着加入4.5mL二乙氧基丙烯、16.3mg对甲苯磺酸吡啶盐(PTS)，室温下磁力搅拌让PTS充分溶解后，再加入4mL甲氧基丙烯(MP)，室温下反应3小时，加入0.2mL三乙胺终止反应。200mL纯水倒入所得溶液中，经去离子水沉淀，析出反应产物，14000rpm离心水洗5次，直到溶液变清亮，得到ACD溶液，将获得产物在真空冻干机进行冻干备用。
(2)pH响应性纳米颗粒的制备
将CRISPR-Cas9和sgRNA(E6)/sgRNA(E7)按1:1比例配置成CRISPR-sgRNA-Cas9小分子复合物溶液，并定容至100μL水中得到内水相。
将1mL二氯甲烷溶解在15mg ACD和2.5mg分子量为1.8kDa的枝化聚乙烯亚胺中得到有机相；在磁力搅拌的同时，将有机相以1mL/min的速度缓慢滴入到内水相中，缓慢混合，超声处理，65℃磁力搅拌30min,充分混匀将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳。
6mL聚乙烯醇(PVA)加入PBS中得到质量百分浓度为1％的PVA水溶液(分子量8.8kDa，水解度88％)，将所得PVA水溶液混于上述油包水初乳中，超声处理，得到水包油包水复乳。将所得复乳在室温下磁力搅拌3小时以挥发去除有机相的有机溶剂，室温条件下静置反应2小时，得到固化纳米微粒，26000rpm离心，去离子水洗涤4-5次得到纳米复合物。
制备CY5标记纳米时，先将ACD和0.1mg CY5一起混合，使CY5先负载于ACD，再加入2mL乙晴，超声乳化溶解。按上述步骤将有机相和内水相混合制备CY5标记的纳米复合物。
将所得纳米复合物CRISPR/Cas9 mRNA负载pH响应性纳米(缩写为pH-NPA)重悬于纯水混匀，取少量均匀涂抹于云母片和铜网上，自然挥发晾干水分，室温放置，再上机检测粒径大小及电荷。
如图3所示，pH响应性纳米颗粒(ACD NP)基于pH响应性环糊精材料，其中Cas9mRNA和E6或E7 gRNA通过形成低分子量PEI(Mw,1800)的复合物负载，分别得到基因组编辑纳米治疗E6/ACD NP和E7/ACD NP。在低pH条件下，E6/ACD NP或E7/ACD NP均可通过响应性水解ACD NP释放包裹的复合物。
通过缩醛化β-环糊精，添加酸响应基团，合成pH响应性缩醛化β环糊精。再将CRISPR小分子复合物制备为内水相。将水相乳化于前述有机相中得到油包水初乳封装CRISPR小分子复合物。之后再得到水包油包水复乳，完成主客体自组装，CY5标记步骤为有机相ACD和CY5荧光染料络合纳米粒，与CRISPR小分子复合物混合包裹后再封装。
透射电镜和马尔文粒径检测结果如图4中a-b所示，各组纳米大小均在150-200nm之间，纳米形态大小基本均一，圆形饱满，分散均匀。
实施例3
E6/ACD NP在小鼠HeLa异种移植中的免疫调节作用
使用Ficoll-Paque Premium公司(Pharmacia Ltd.，Sweden)从新鲜的人脐带血中分离淋巴细胞，计数后与PBS混合。裸鼠皮下注射HeLa细胞(2×107)建立HeLa异种移植瘤。为了检测免疫抑制肿瘤微环境的存在，在注射HeLa细胞后第15天对小鼠进行肿瘤内注射ACD NP。然后将小鼠随机分成两组。一组小鼠注射生理盐水，另一组小鼠每3d注射新鲜分离的淋巴细胞(1.5～2×107)。末次治疗后5天，切除肿瘤，流式细胞术检测CD45+或CD8+T细胞计数。
为了研究E6/ACD NP治疗对肿瘤微环境的影响。在这种情况下，移植了HeLa的小鼠在皮下注射HeLa细胞后第15天局部注射ACD NP或E6/ACD NP。3d后，ACD NP处理的小鼠分为两组:一组(ACD NP)给予生理盐水，另一组(ACD NP+LC)给予淋巴细胞。E6/ACD NP预处理组每3天局部注射淋巴细胞(1.5-2×107)。同样，末次治疗5天后，用流式细胞术分析肿瘤中的CD8+T细胞和CD45+T细胞。同时，对肿瘤切片进行免疫组化检测CD8的表达。
由于HPV癌蛋白E6/E7与宫颈癌的免疫抑制有关，我们认为敲除E6/E7基因可能会改变这种不良的肿瘤微环境。考虑到BALB/c裸鼠免疫缺陷，首先，在HeLa异种移植中进行了从新鲜脐带血中分离的人淋巴细胞的瘤内注射(图5中a)。流式细胞术分析显示，与单独使用ACD NP治疗的对照组小鼠相比，在不同治疗后第14天，同时使用ACD NP空纳米和淋巴细胞的小鼠肿瘤中CD45+或CD8+T细胞水平没有显著升高(图5中b)。这些结果表明，局部注射的淋巴细胞不能在HPV阳性肿瘤中存活，因为免疫抑制作用强，导致分化的CD8+T细胞比例低。
进一步探讨E6/ACD NP基因编辑是否可以逆转免疫抑制的肿瘤微环境，采用不同分组，观察HeLa移植小鼠局部注射淋巴细胞后T细胞的存活和活化(图6中a)。ACD NP+淋巴细胞治疗的小鼠肿瘤中CD45+或CD8+T细胞数量较低，而同时注射E6/ACD NP和淋巴细胞的肿瘤中CD45+或CD8+T细胞水平显著升高(图6中b-e)。与流式细胞术的结果一致，进一步的肿瘤切片免疫组化分析也显示了E6/ACD NP和淋巴细胞治疗后CD8的显著高表达(图6中f)。这些结果表明，E6/ACD NP治疗可显著促进局部淋巴细胞的存活和CD8+T细胞分化，主要是通过敲除E6调节免疫抑制微环境。
实施例4
E6/ACD NP联合淋巴细胞的抗肿瘤作用
为了观察E6/ACD NP联合淋巴细胞移植的治疗效果，还采用皮下注射肿瘤细胞的方法建立了HeLa裸鼠移植瘤。注射后第15天，小鼠随机分为4组:瘤内注射ACD NP组和瘤内注射E6/ACD NP组。3天后，ACD NP或E6/ACD NP处理小鼠每3天注射生理盐水或新鲜分离的淋巴细胞(1.5-2×107)。在不同的治疗过程中，测量肿瘤体积。在最后一次治疗后的第五天，老鼠被安乐死。肿瘤被切除并称重。
基于以上结果，进一步研究了E6/ACD NP与淋巴细胞联合治疗HeLa异种移植裸鼠是否能实现协同抗肿瘤作用。结果如图7中a～e所示，与单独注射ACD NP或ACD NP+淋巴细胞的小鼠相比，E6/ACD NP或E6/ACD NP+淋巴细胞(即E6/ACD NP+LC)处理的小鼠肿瘤生长速率明显降低(图7中b-c)，其中，E6/ACD NP+淋巴细胞联合治疗的小鼠肿瘤生长最慢。经过不同的治疗后，切除小鼠肿瘤，测量肿瘤大小，观察到E6/ACD NP+LC组肿瘤最小，肿瘤重量最低(图7中d、e)。E6/ACD NP组与E6/ACD NP+LC组间差异显著。综上试验结果说明，将纳米介导的癌基因编辑系统与淋巴细胞治疗相结合，可以实现协同抗肿瘤作用。

Claims (10)

1.淋巴细胞和介导CRISPR/Cas9基因编辑系统的纳米复合物联合在制备宫颈癌治疗药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述介导CRISPR系统的纳米复合物包含根据宫颈癌靶标基因设计的向导RNA、Cas9的mRNA和缩醛化β-环糊精。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述介导CRISPR系统的pH响应性环糊精纳米复合物的构建方法为：
A、根据宫颈癌靶标基因，设计向导RNA序列，合成Cas9的mRNA和向导RNA；
B、将Cas9的mRNA和向导RNA混合得到内水相，加入有机相溶液中混合均匀，形成油包水初乳，所述有机相溶液中包括枝化聚乙烯亚胺和缩醛化β-环糊精；
C、再向油包水初乳中加入聚乙烯醇溶液，混合后得到水包油包水复乳，搅拌挥发有机溶剂后，经过固化、高速离心、洗涤，得到pH响应性环糊精纳米复合物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤B中，所述缩醛化β-环糊精的制备方法为，
将二乙氧基丙烯和对甲苯磺酸吡啶盐加入β-环糊精溶液中，搅拌溶解后，再加入甲氧基丙烯，反应小时，再向反应液中加入三乙胺，终止反应，加水沉淀，离心，水洗至溶液变清，真空干燥，得到缩醛化β-环糊精。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述二乙氧基丙烯、对甲苯磺酸吡啶盐、β-环糊精、甲氧基丙烯和三乙胺的质量体积比为4.5：16.3：1：4：0.5，mL：mg：g：mL：mL。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤B具体为，将Cas9的mRNA和向导RNA混合得到内水相，缩醛化β-环糊精和枝化聚乙烯亚胺混合得到有机相；将有机相和内水相缓慢混合，在磁力搅拌的同时，有机相以1mL/min的速度缓慢滴入到内水相中，超声，形成油包水初乳。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤B中，所述有机相中枝化聚乙烯亚胺和缩醛化β-环糊精的质量比为1:6。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤C具体为，向油包水初乳中加入聚乙烯醇溶液，超声混合后得到水包油包水复乳，磁力搅拌下3小时，室温下静置至固化，26000rpm高速离心，去离子水洗涤4-5次，得到pH响应性环糊精纳米复合物，所述聚乙烯醇溶液的浓度为1％。
9.如权利要求1～9任一项所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌靶标基因为宫颈癌E6和E7基因。
10.如权利要求1～9任一项所述的应用，其特征在于，所述淋巴细胞来源于低免疫原性的脐血淋巴细胞，在CRISPR系统的纳米复合物应用后，再联合淋巴细胞的免疫治疗，可提高肿瘤局部T细胞浸润，协同抗肿瘤。
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