WO2018088464A1 - 脳梗塞の治療薬 - Google Patents

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WO2018088464A1
WO2018088464A1 PCT/JP2017/040395 JP2017040395W WO2018088464A1 WO 2018088464 A1 WO2018088464 A1 WO 2018088464A1 JP 2017040395 W JP2017040395 W JP 2017040395W WO 2018088464 A1 WO2018088464 A1 WO 2018088464A1
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protein
acid sequence
ppib
seq
amino acid
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PCT/JP2017/040395
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克人 玉井
尊彦 山崎
横田　耕一
隆博 青戸
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株式会社ジェノミックス
国立大学法人大阪大学
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    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
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    • C12Y502/01—Cis-trans-Isomerases (5.2.1)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for cerebral infarction containing an in vivo protein.
  • Cerebral infarction is classified as a so-called stroke, and 60% (about 70,000 people a year) of cerebrovascular deaths die from cerebral infarction (Non-patent Document 1). Even if cerebral infarction is fortunate to be out of life, it often requires serious sequelae to rehabilitate, such as paralysis of the extremities, speech impairment, and memory impairment. Because cerebral infarction is caused by clogging of blood vessels in the brain, thrombolytic therapy is known as the best treatment, but nerve cells that have been ischemic for a long time are difficult to regenerate In addition, patients who can use the pharmaceutical t-PA (alteplase) used in thrombolytic therapy are considered to be within 4.5 hours after onset due to the side effects.
  • t-PA alteplase
  • Non-patent Document 2 Japanese medical practice
  • Anti-coagulant therapy non-vitamin K-inhibited oral anticoagulant: dabigatran, etc.
  • cerebral protection therapy antioxidant: edaravone
  • thrombolytic therapy is as effective Not obtained. Therefore, there is a demand for new drugs effective for the treatment of cerebral infarction.
  • PPIB Human peptidyl prolyl cis trans isomerase B
  • PPIA Human peptidyl prolyl cis trans isomerase A
  • PPIB has peptidylprolyl cis-trans isomerase activity, and that the activity is inhibited by cyclosporin A (CsA).
  • CsA cyclosporin A
  • PPIB is secreted extracellularly because there is a region rich in hydrophobic residues on the N-terminal side of PPIB, which is an ER-directed signal sequence. Is known as a feature (Non-Patent Documents 3 and 5).
  • PPIA and PPIB have been reported to be important proteins for HIV-1 particle formation. PPIA and PPIB bind to the capsid protein and are incorporated into the virus when HIV-1 assembles. In the presence of PPIA and PPIB inhibitors such as CsA, it has been shown that PPIA and PPIB binding to capsid proteins is inhibited, and viral replication of host cells is also inhibited (Non-patent Document 6).
  • Non-patent Document 7 In a test for searching for a migration active substance of bone marrow mesenchymal stem cells contained in the supernatant of breast cancer cultured cells, PPIB was found and the migration activity was suppressed by an antibody against CD147, so that the surface of bone marrow mesenchymal stem cells was It has been clarified that CD147 is a target receptor (Non-patent Document 7).
  • Non-patent Document 8 It has been reported that PPIB has a migratory activity of human neutrophils via CD147 as a role for inflammation.
  • the ligand binding site of PPIB has a central core region similar to PPIA, but there is a binding site for glycosaminoglycans (GAGs) not found in PPIA at the N-terminus.
  • GAGs glycosaminoglycans
  • PPIB promotes adherence of CD4 + CD45RO + T cells to the extracellular matrix via CD147, but PPIA does not have this activity, but rather competes and suppresses. It has been clarified that PPIB has a function different from that of PPIA having chemokine-like activity as an inflammatory factor (Non-patent Documents 9 and 10).
  • PPIA is known to promote the production of TNF- ⁇ , an inflammatory cytokine in macrophages, while PPIB not only has such activity, but by pretreating macrophages with PPIB, It has been clarified that suppression of TNF- ⁇ production increase due to urine (Non-patent Document 11).
  • PPIB is known to have PPIB-specific properties while having the same properties as PPIA in its structure, enzyme activity, target receptor, etc., and various effects unique to PPIB, particularly on inflammation, are known. It is thought that has been given.
  • PPIB has been shown to be involved in the folding of collagen I as a chaperone by the above-mentioned peptidylprolyl cis-trans isomerase activity, and PPIB deficiency is considered to be one of the causes of osteogenesis failure ( Non-Patent Documents 12 and 13).
  • PPIB is known to be multifunctional, but there are many unclear points on the effects of PPIB administration on the body in subjects with specific diseases, and whether it can be used as a therapeutic agent for cerebral infarction. It was unknown.
  • Yurchenko V et al. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Nov 9; 288 (4): 786-8. Allain F et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Mar 5; 99 (5): 2714-9. Yurchenko V et al., J Biol Chem. 2002 Jun 21; 277 (25): 22959-65. Marcant A et al., J Immunol. 2012 Aug 15; 189 (4): 2023-32. Smith T et al., J Biol Chem. 1995 Aug 4; 270 (31): 18323-8. Barnes AM et al., N Engl J Med. 2010 Feb 11; 362 (6): 521-8.
  • One of the objects of the present invention is to provide a novel pharmaceutical effective for the treatment of cerebral infarction.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cerebral infarction containing PPIB protein.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of cerebral infarction comprising peptidylprolyl isomerase B (PPIB) protein, or cells secreting PPIB protein;
  • PPIB protein is a) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, inserted, deleted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; c) a protein comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; d) a protein encoded by DNA that hybridizes with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions; e) a protein encoded by a nucleic acid sequence having 70% or more sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; f) a protein comprising an amino acid sequence in which the signal sequence has been removed from the
  • a protein comprising an amino acid sequence from which the signal sequence has been removed from the amino acid sequence, the protein having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • the pharmaceutical composition of (1), (3) A pharmaceutical composition for treating cerebral infarction, comprising a nucleic acid encoding a PPIB protein; (4)
  • the nucleic acid encoding the PPIB protein is i) a nucleic acid comprising the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; ii) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; or iii) a nucleic acid that has 70% or more sequence identity with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4,
  • the pharmaceutical composition according to (3), I will provide a.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of cerebral infarction, comprising a PPIB protein, a nucleic acid encoding a PPIB protein, or a cell secreting a PPIB protein.
  • Human PPIB is a protein consisting of 216 amino acids in total length (SEQ ID NO: 1). In the living body, the signal sequence (amino acid positions 1-33 of SEQ ID NO: 1) is removed in the process of being secreted outside the cell, and a mature protein (sequence) consisting of the amino acid sequence corresponding to amino acid positions 34-216 of SEQ ID NO: 1 Number: 3) is considered to function.
  • the PPIB protein examples include, but are not limited to, a protein comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the PPIB protein also includes a protein that is functionally equivalent to a protein comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • proteins include the following: a) one or more of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, for example, 1 to about 40, 1 to about 30, 1 to about 20, 1 to about 10, 1 to About 5, such as 1, 2, 3, 4 or 5, or 1 to 4, such as 1, 2, 3, or 4 amino acids are substituted, inserted, deleted and / or Or a protein functionally equivalent to a protein comprising or consisting of an added amino acid sequence, comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; b) About 80% or more, for example, about 85% or more, about 90% or more, about 91% or more, about 92% or more, about 93% or more, about 94% or more, about 95 with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the protein comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 has a cysteine residue. Therefore, in certain embodiments, for example, for the purpose of stabilizing properties and steric structure during production and purification of the protein and suppressing intermolecular disulfide bonds, the cysteine residue may be substituted with another amino acid.
  • nucleic acid encoding the PPIB protein examples include, but are not limited to, a nucleic acid containing or consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • a nucleic acid encoding a PPIB protein also includes a nucleic acid that is functionally equivalent to a nucleic acid comprising or consisting of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • nucleic acids examples include the following: a) a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 under stringent conditions; b) about 70% or more, eg, about 75% or more, about 80% or more, about 85% or more, about 90% or more, about 95% or more, about 97% or more, about 98 with the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 % Nucleic acid having a sequence identity of greater than or equal to about 99%.
  • the identity of the base sequence and amino acid sequence can be determined using a homology search site using the Internet (for example, in the website of the European Bioinformatics Institute (EBI), FASTA, BLAST, PSI-BLAST, and Homology searches such as SSEARCH can be used: http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/).
  • a search using BLAST can be performed in National Center for Biotechnology Information (NCBI) (for example, a BLAST page on the NCBI website; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi; Altschul, SF et al., J. Mol.
  • nucleic acid is a molecule in which nucleotides are polymerized, and includes oligonucleotides, polynucleotides, and the like. In addition, it includes single-stranded or double-stranded DNA. Further, those formed only from natural nucleotides, and those that partially contain non-natural bases, nucleotides, nucleosides, or synthetic nucleic acids are also included. Typically, the nucleic acid is DNA.
  • stringent conditions specifically refers to conditions such as 6 ⁇ SSC, 40% formamide, hybridization at 25 ° C., and washing at 1 ⁇ SSC, 55 ° C. it can. Stringency depends on conditions such as salt concentration, formamide concentration, or temperature, but those skilled in the art will readily set these conditions to obtain the required stringency.
  • stringency depends on conditions such as salt concentration, formamide concentration, or temperature, but those skilled in the art will readily set these conditions to obtain the required stringency.
  • Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (1989).
  • “functionally equivalent” to a protein comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 refers to exhibiting a medicinal effect equivalent to that protein in an animal model of cerebral infarction,
  • the term “same quality” means that they are the same in qualitative evaluation.
  • proteins that are functionally equivalent to the protein comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 include the same efficacy as the protein containing or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (for example, An effect of reducing cerebral infarction lesions) and at least about 10%, for example about 10% or more, about 10% compared to a protein comprising or consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 in quantitative evaluation 20% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 95% or more, or about 100% or more Examples include proteins showing medicinal effects.
  • PPIB protein or a functionally equivalent protein may be a protein with various modifications such as physiological modification of sugar chains, labels such as fluorescent or radioactive substances, or fusion with other proteins. Good.
  • oxidation of -SH groups in cysteine residues eg, conversion to sulfo groups
  • glutathioneation eg., glutathioneation
  • nitrosyl e.g., alkylation
  • coupling with maleimide, etc. may be used. Any of these can be used as PPIB proteins as long as they are functionally equivalent to PPIB.
  • the method for obtaining PPIB protein is not particularly limited, recombinant expression (mammalian cells, yeast, E. coli, insect cells, etc.), synthesis using a cell-free system, extraction from the culture supernatant of cells into which no gene has been introduced, Examples include the purchase of commercial products.
  • a method of introducing a nucleic acid sequence encoding a signal sequence according to the host and a nucleic acid having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 into a host cell and recovering it from the culture supernatant after recombinant expression A method of introducing a nucleic acid having a nucleic acid sequence of 4 and crushing and recovering cells after recombinant expression, a method of synthesizing in a cell-free system using a nucleic acid having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 as a template, etc. .
  • the cell used for these is not specifically limited, For example, HEK293 cell is mentioned.
  • the obtained PPIB protein can be isolated from inside or outside the host cell (eg, medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of the protein may be performed using the separation and purification methods used in normal protein purification, and is not limited at all. For example, a chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected and Proteins can be separated and purified by combination.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory). Course Manual.Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography, such as HPLC and FPLC.
  • the PPIB protein is preferably a substantially purified protein.
  • substantially purified means that the degree of purification of PPIB protein (the ratio of PPIB protein in the total protein component) is about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80 % Or more, about 90% or more, about 95% or more, 100% or close to 100%. The upper limit close to 100% depends on the purification technique and analysis technique of those skilled in the art, and is, for example, 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99%, etc.
  • the protein purified by any purification method is included in the substantially purified protein.
  • the protein can be exemplified by, but not limited to, substantially purified protein by selection and / or combination.
  • the form of the PPIB protein, the nucleic acid encoding the PPIB protein, or the cell secreting the PPIB protein as an active ingredient of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited.
  • a PPIB protein or a DNA encoding a PPIB protein is inserted.
  • cells into which a vector into which a DNA encoding PPIB protein has been inserted have been introduced.
  • a cell that secretes a PPIB protein is obtained by, for example, inserting a vector prepared by inserting a DNA encoding a secretory signal into a DNA encoding a PPIB protein into a known expression vector or gene therapy vector, It can be produced by introducing it into mammalian cells such as fibroblasts (for example, normal skin fibroblasts and cell lines derived therefrom), insect cells, and other cells.
  • mammalian cells such as fibroblasts (for example, normal skin fibroblasts and cell lines derived therefrom), insect cells, and other cells.
  • Examples of the DNA encoding the secretion signal include, but are not limited to, DNA having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the DNA encoding the PPIB protein may be cDNA or genomic DNA as long as it encodes the PPIB protein, and may be natural DNA or artificially synthesized DNA. Good.
  • the DNA encoding the PPIB protein is typically contained in the pharmaceutical composition of this embodiment in a state of being inserted into a vector (for example, a gene therapy vector).
  • the vector for gene therapy examples include, but are not limited to, plasmid vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adenoassociate virus vectors, Sendai virus vectors, Sendai virus envelope vectors, papilloma virus vectors, and the like. It is not something.
  • the gene therapy vector may include a promoter DNA sequence that effectively induces gene expression, a factor that controls gene expression, and a molecule necessary to maintain DNA stability.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment can be formulated according to a conventional method (for example, see Remington's Pharmaceutical Science, late edition, Mark Publishing Company, Easton, USA), and a pharmaceutically acceptable carrier. And may contain both additives. For example, surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, tonicity agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity promoters, flavoring agents However, it is not limited to these, and other commonly used carriers can be used as appropriate.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of this embodiment includes oral administration or parenteral administration, and specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • injection administration include, for example, intravenous, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like, and the pharmaceutical composition of this embodiment is systemically or locally (for example, subcutaneous, intradermal, skin surface, eyeball or eyelid).
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age, symptoms, etc. of the patient.
  • the dose can be selected in the range of about 0.0000001 to about 1000 mg per kg body weight per administration.
  • the dose can be selected in the range of about 0.00001 to about 100,000 mg / body per patient.
  • the composition is not limited to these dosages.
  • the term “patient” or “subject” includes human or non-human animals, and examples include humans, mice, rats, monkeys, pigs, dogs, rabbits, hamsters, guinea pigs, and the like. However, it is not limited to these.
  • treatment refers to, for example, any of symptom relief, amelioration, and / or elimination, reduction and / or stabilization (eg, not progressing to a more advanced stage).
  • the present invention further provides the following aspects: (1) A method for treating cerebral infarction, comprising administering to a subject a PPIB protein, a nucleic acid encoding a PPIB protein, or a cell secreting a PPIB protein; (2) PPIB protein, nucleic acid encoding PPIB protein, or cell secreting PPIB protein for use in the treatment of cerebral infarction; (3) Use of PPIB protein, nucleic acid encoding PPIB protein, or cells secreting PPIB protein in the manufacture of a medicament for the treatment of cerebral infarction.
  • PPIB protein functionally equivalent protein thereof, nucleic acid encoding PPIB protein, cells secreting PPIB protein, their form, formulation, method of administration, and description and other implementations
  • the form is as described above.
  • Example 1 Effect of human PPIB on mouse cerebral infarction C57BL / 6N male mice (microbe grade SPF) were purchased from CLEA Japan (Tokyo) at the age of 7 weeks and used at 23-25 g after acclimatization in the animal breeding room for 3 days or more. The animals were kept in an animal breeding room set at room temperature 22 ⁇ 2 ° C., humidity 50% ⁇ 20%, and lighting time 12 hours (7 am to 7 pm). Solid feed CE-2 (Oriental Yeast Co., Ltd.) and tap water were automatically ingested, and 3 animals were raised per cage.
  • Solid feed CE-2 Oriental Yeast Co., Ltd.
  • Human peptidylprolyl isomerase B (PPIB) was used as a test substance.
  • the human PPIB is obtained by introducing a vector into which DNA having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2 has been inserted into HEK293 cells and purifying the supernatant after culturing the cells.
  • the human PPIB thus obtained is synthesized in the cell as a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and then becomes a mature protein by removing the signal sequence when secreted outside the cell. Therefore, it is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the human PPIB was confirmed to be a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 by N-terminal peptide sequencing and mass spectrometry (MALDI-TOF / TOF).
  • Physiological saline Otsuka raw food injection, Otsuka Pharmaceutical
  • Otsuka Pharmaceutical Otsuka Pharmaceutical
  • the test substance was dissolved in Otsuka distilled water (Otsuka Pharmaceutical) to 1 mg / ml, dispensed every 50 ⁇ L, and stored at ⁇ 30 ° C. until use.
  • the stored test substance was dissolved, and 200 ⁇ L of Otsuka raw diet was added to dilute to the target concentration (0.2 mg / mL).
  • the dosing solution was stored on ice until dosing.
  • the embolizer is rounded with a soldering iron at the tip of a nylon 6 thread (6-0, Nescousture nylon thread) with a total length of 20 mm, and the tip 7 mm with silicon resin (Dow Corning, RTV sealant 732) in diameter 0.21-0. What was coated so that it might become 23 mm was used.
  • Test method Transient cerebral ischemia Using an anesthesia machine (MK-A110D, Muromachi Kikai), C57BL / 6N male mice were anesthetized with isoflurane (Abbott Japan) (3% at introduction, maintenance 2%), and the right carotid artery was detached by midline incision. After threading the carotid and external carotid arteries, blood flow in the common and external carotid arteries was temporarily blocked.
  • MK-A110D Muromachi Kikai
  • Weight measurement Body weight was measured before surgery and 1 and 2 days after surgery.
  • Test substance or vehicle was administered twice in total 6 and 24 hours after ischemia reperfusion.
  • the administration solution was filled into a 1 mL syringe, and 0.2 mL of liquid volume was administered from the tail vein using a 27G injection needle.
  • mice Two days after ischemia-reperfusion, the mice were exsanguinated by an abdominal aorta cut under anesthesia and the brain was collected. For the collected brain, four crossed cerebral slices having a thickness of 2 mm from the boundary between the cerebrum and cerebellum were prepared using a mouse slicer (Zivic Instruments). They were stained with 1% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) (Sigma) for 30 minutes at 37 ° C. Brain sections were imaged using a microscope (magnification x1.5, Olympus), and the infarct size was measured using image analysis software (Photoshop CS5, Adobe). Area and right brain injury area were determined.
  • TTC 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride
  • the volume of cerebral infarction was calculated by the following formula from how to determine the volume of the frustum: [S + S + ⁇ (sS)] ⁇ h / 3 (where s is the area of the intercept 1, S is the area of the intercept 2, and h is the distance between the intercepts).
  • the measured value was expressed as an average value and a standard error (mean ⁇ SEM).
  • the measured values were statistically analyzed by a one-way analysis of variance using spreadsheet software, and significant differences were found when p ⁇ 0.05.
  • mice were grouped after cerebral ischemia reperfusion, and none of the mice died in the period from the administration of solvent or PPIB to the removal of the brain 2 days later.
  • the change in mouse body weight of each group during this period is shown in FIG. There was no difference between the groups in the weight of the mice used for the surgery.
  • the body weight of the mice decreased after the operation, and both groups lost about 3 g in the first day after the operation and about 5 g in the second day compared with before the operation.
  • t-PA thrombolytic agent
  • the therapeutic agent for cerebral infarction including PPIB provided by the present application is effective for patients whose t-PA is not indicated.
  • the administration of PPIB alone or in combination with t-PA will greatly benefit patients who cannot obtain a sufficient therapeutic effect with t-PA alone.

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Abstract

本発明は、脳梗塞の治療に有効な新規医薬を提供することを目的とする。本発明は、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）タンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞を含む医薬組成物を提供する。

Description

脳梗塞の治療薬
　本発明は、生体内タンパク質を含む脳梗塞の治療薬に関する。
　脳梗塞はいわゆる脳卒中と呼ばれる脳血管疾患に分類され、脳血管疾患の死亡者のうち６割（年間約７万人）が脳梗塞を原因として死亡している（非特許文献１）。脳梗塞は幸運にも生命の危機を脱したとしても、四肢の麻痺、言語障害、記憶障害など社会復帰をするためには深刻な後遺症をしばしば余儀なくされる。脳梗塞は脳の血管に血栓がつまることが原因であるため、血栓溶解療法が最も優れた治療法として知られているが、長時間にわたり虚血状態になった神経細胞は再生することが困難なことや副作用から血栓溶解療法に使用される医薬品ｔ－ＰＡ（アルテプラーゼ）を使用することが出来る患者は発症後４．５時間以内とされている。そのため、実際に日本の医療現場でｔ－ＰＡが適用されている患者は、脳梗塞患者全体の５～６％であると推定されており（非特許文献２）、大部分の患者に対しては有効な治療方法が無い状況となっている。血栓溶解療法以外の治療法としては、抗凝固療法（非ビタミンＫ阻害経口抗凝固薬：ダビガトラン等）、脳保護療法（抗酸化薬：エダラボン）が推奨されているが血栓溶解療法ほどの効果は得られていない。このため、脳梗塞の治療に有効な新規医薬が求められている。
　ヒトのペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＢ（以下、ＰＰＩＢ、ＰＰＩａｓｅＢ、ペプチジルプロリルトランスイソメラーゼＢとも称する）はシクロフィリンＢとも呼ばれ、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＡ（以下、ＰＰＩＡと称する）に続くシクロスポリンＡ結合タンパク質としてクローニングされている（非特許文献３および４）。ＰＰＩＢの特徴として、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ活性を有すること、さらにその活性はシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）によって阻害されることが知られている。また、ＰＰＩＢは２１６アミノ酸からなるタンパク質であり、一部のドメインにおいてＰＰＩＡと相同性を示す。一方、ＰＰＩＡとは異なり、ＰＰＩＢのＮ末端側には疎水性の残基に富む領域が存在し、小胞体移行（ＥＲ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）シグナル配列となっているため、ＰＰＩＢは細胞外に分泌されることが特徴として知られている（非特許文献３および５）。
　ＰＰＩＡおよびＰＰＩＢはＨＩＶ－１粒子形成に重要なタンパク質であることが報告されている。ＰＰＩＡおよびＰＰＩＢはＨＩＶ－１がアセンブリする際にカプシドタンパク質に結合しウイルス内に取り込まれる。ＣｓＡなどのＰＰＩＡおよびＰＰＩＢ阻害物質存在下では、ＰＰＩＡおよびＰＰＩＢのカプシドタンパク質への結合が阻害され、宿主細胞のウイルスの複製も阻害されることが明らかになっている（非特許文献６）。
　乳がん培養細胞の上清中に含まれる骨髄間葉系幹細胞の遊走活性物質を探索した試験において、ＰＰＩＢが見出され、ＣＤ１４７に対する抗体によって遊走活性が抑制されることから骨髄間葉系幹細胞表面のＣＤ１４７が標的レセプターになっていることが明らかになっている（非特許文献７）。
　炎症に対するＰＰＩＢの役割としては、ＣＤ１４７を介したヒトの好中球の遊走活性があることが報告されている（非特許文献８）。ＰＰＩＢのリガンド結合部位はＰＰＩＡと同様のセントラルコア領域があるが、Ｎ末端にはＰＰＩＡにはないグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）との結合部位が存在する。ＰＰＩＢはＣＤ１４７を介しＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋のＴ細胞の細胞外マトリックスに対する接着を促進するが、ＰＰＩＡにはこの活性はなく、むしろ競合し抑制する。ＰＰＩＢは炎症因子として、ケモカイン様の活性を持つＰＰＩＡとは異なる機能を有することが明らかになっている（非特許文献９および１０）。
　ＰＰＩＡはマクロファージにおいて炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αの生産を促進することが知られているが、一方、ＰＰＩＢはそのような活性を持たないばかりか、マクロファージをＰＰＩＢで前処理することによって、ＬＰＳによるＴＮＦ－αの生産亢進まで抑制することが明らかになっている（非特許文献１１）。
　このように、ＰＰＩＢはその構造、酵素活性、標的レセプター等においてＰＰＩＡと共通する性質を有する一方、ＰＰＩＢ独自の性質を有することも知られており、特に炎症に対してはＰＰＩＢ独自の様々な影響を与えていると考えられる。
　また、ＰＰＩＢは前述のペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ活性によって、シャペロンとしてコラーゲンＩのフォールディングにかかわっていることが明らかになっており、ＰＰＩＢの欠損が骨形成不全の原因のひとつと考えられている（非特許文献１２および１３）。
　上述の通りＰＰＩＢは多機能であることが知られているが、特定の疾患を有する対象においてＰＰＩＢの投与が生体に及ぼす影響は不明な点が多く、脳梗塞の治療薬として使用できるかどうかは不明であった。
平成２７年（２０１５）人口動態統計（確定数）の概況、第６表、厚生労働省 脳神経外科、２０１５年１２月号（Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１２），ｐｐ．１０５５－１０７０ Price ER et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 1;88(5):1903-7. Spik G et al., J Biol Chem. 1991 Jun 15;266(17):10735-8. Hasel KW et al., Mol Cell Biol. 1991 Jul;11(7):3484-91. Luban J et al., Cell. 1993 Jun 18;73(6):1067-78. Lin SY et al., Exp Cell Res. 2008 Oct 15;314(17):3107-17. Yurchenko V et al., Biochem Biophys Res Commun. 2001 Nov 9;288(4):786-8. Allain F et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Mar 5;99(5):2714-9. Yurchenko V et al., J Biol Chem. 2002 Jun 21;277(25):22959-65. Marcant A et al., J Immunol. 2012 Aug 15;189(4):2023-32. Smith T et al., J Biol Chem. 1995 Aug 4;270(31):18323-8. Barnes AM et al., N Engl J Med. 2010 Feb 11;362(6):521-8.
　本発明の目的の一つは、脳梗塞の治療に有効な新規医薬を提供することである。
　本発明者らは、様々な生体内タンパク質の生理活性を試験した結果、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（以下、ＰＰＩＢとも称する）が動物モデルにおいて脳梗塞の治療効果を示すことを見出した。したがって、本発明は一の態様において、ＰＰＩＢタンパク質を含有する脳梗塞の治療のための医薬組成物を提供する。
　すなわち、本発明は、ある態様において、
（１）ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）タンパク質、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞を含む、脳梗塞の治療のための医薬組成物；
（２）ＰＰＩＢタンパク質が、
　ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
　ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質；
　ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
　ｄ）配列番号：４に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質；
　ｅ）配列番号：４に記載の核酸配列と７０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；
　ｆ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のホモログのアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むタンパク質；または
　ｇ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のオルソログのアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するタンパク質、
である、（１）の医薬組成物；
（３）ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸を含む、脳梗塞の治療のための医薬組成物；
（４）ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸が、
　ｉ）配列番号：４に記載の核酸配列を含む核酸；
　ｉｉ）配列番号：４に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；または
　ｉｉｉ）配列番号：４に記載の核酸配列と７０％以上の配列同一性を有する核酸、
である、（３）に記載の医薬組成物、
を提供する。
図１は、各群のマウスの体重変化を示すグラフである。データは平均値±標準誤差（Ｎ＝８）で示す。 図２は、マウスにおける一過性脳虚血による脳梗塞に対するＰＰＩＢタンパク質の治療効果を示すグラフである。マウスの右中大脳動脈を６０分間閉塞後再灌流し、再灌流後２日目に脳を取り出し、脳梗塞体積をＴＴＣ染色より算出した。溶媒または被験物質は再灌流の６および２４時間後に（合計２回）静脈内投与した。値は平均±標準誤差（Ｎ＝８）で示す。＊＊　ｐ＜０．０１で溶媒群と有意差あり（ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）。
　本発明は、一の態様において、ＰＰＩＢタンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞を含む、脳梗塞の治療のための医薬組成物を提供する。
　ヒトＰＰＩＢは全長２１６アミノ酸からなるタンパク質である（配列番号：１）。生体内では細胞外へ分泌される過程でシグナル配列（配列番号：１のアミノ酸位置１－３３）が除去され、配列番号：１のアミノ酸位置３４－２１６に相当するアミノ酸配列からなる成熟タンパク質（配列番号：３）が機能を発揮すると考えられる。
　ＰＰＩＢタンパク質として、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態において、ＰＰＩＢタンパク質には、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質として、例えば以下のものが挙げられる：
　ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加したアミノ酸配列を含み、またはからなり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質；
　ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはからなり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質；
　ｃ）配列番号：４に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質；
　ｄ）配列番号：４に記載の核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質；
　ｅ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質（ヒトＰＰＩＢ）のホモログ（即ちオルソログまたはパラログ）のアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質；
　ｆ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質（ヒトＰＰＩＢ）のオルソログのアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列と約８０％以上、例えば約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有し、且つ、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
　なお、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質は、システイン残基を有している。したがって、ある実施形態において、例えば当該タンパク質の製造および精製時における性質および立体構造の安定化や分子間ジスルフィド結合の抑制等を目的として、システイン残基を別のアミノ酸に置換してもよい。
　ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸として、配列番号：４に記載の核酸配列を含む、またはからなる核酸が例示できるが、これらに限定されるものではない。ある実施形態において、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸には、配列番号：４に記載の核酸配列を含む、またはからなる核酸と機能的に同等な核酸も含まれる。そのような核酸として、例えば以下のようなものが挙げられる：
　ａ）配列番号：４に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
　ｂ）配列番号：４に記載の核酸配列と約７０％以上、例えば約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有する核酸。
　塩基配列やアミノ酸配列の同一性の決定は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）のウェブサイトにおいて、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／）。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトにおけるＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　１９９０，　２１５（３）：４０３－１０；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　＆　Ｇｉｓｈ，　Ｗ．，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９９６，　２６６：４６０－４８０；　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１９９７，　２５：３３８９－３４０２）。
　本明細書において、「核酸」とは、ヌクレオチドが重合した分子であり、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等を含む。また、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ等を含む。さらに、天然のヌクレオチドのみで形成されたもの、および非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むもの、あるいは合成核酸も含む。典型的には、核酸はＤＮＡである。
　本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ、５５℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）等を参照。ハイブリダイゼーションを利用することによって、例えば配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質以外のＰＰＩＢタンパク質のホモログをコードするＤＮＡの単離が可能である。
　本明細書において、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と「機能的に同等」とは、脳梗塞の動物モデルにおいて当該タンパク質と同質の薬効を示すことをいい、ここにいう「同質」とは、定性的評価において同じであることを意味する。配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質の例としては、配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と同質の薬効（例えば脳梗塞巣を縮小させる効果）であって、且つ、定量的評価において配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、またはからなるタンパク質と比較して少なくとも約１０％、例えば約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％以上の薬効を示すタンパク質が挙げられる。
　ＰＰＩＢタンパク質、またはその機能的に同等なタンパク質は、糖鎖等の生理的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加えたタンパク質であってもよい。また、製造および精製時におけるタンパク質の性質および構造の安定化や、分子間ジスルフィド結合の抑制等を目的として、システイン残基における－ＳＨ基の酸化（例えばスルホ基への変換）、グルタチオン化、ニトロシル化、アルキル化、マレイミドとの結合等を行ったものでもよい。これらのいずれも、ＰＰＩＢと機能的に同等である限り、ＰＰＩＢタンパク質として使用できる。
　ＰＰＩＢタンパク質の入手方法は特に限定されず、組換え発現（哺乳類細胞、酵母、大腸菌、昆虫細胞等）、無細胞系を用いた合成、遺伝子導入がされていない細胞の培養上清からの抽出、市販品購入などが例示できる。例えば、宿主に応じたシグナル配列をコードする核酸配列および配列番号：４の核酸配列を有する核酸を宿主細胞に導入し、組換え発現後の培養上清から回収する方法や、宿主細胞に配列番号：４の核酸配列を有する核酸を導入し、組換え発現後に細胞を破砕して回収する方法、配列番号：４の核酸配列を有する核酸を鋳型として無細胞系で合成するなどの方法が挙げられる。これらに使用される細胞は特に限定されず、例えばＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
　得られたＰＰＩＢタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択および／または組み合わせることによりタンパク質を分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｍａｒｓｈａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｏｕｒｓｅ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｅｄ　Ｄａｎｉｅｌ　Ｒ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
　また、ＰＰＩＢタンパク質は、実質的に精製されたタンパク質であることが好ましい。本明細書における、「実質的に精製された」とは、ＰＰＩＢタンパク質の精製度（タンパク質成分全体におけるＰＰＩＢタンパク質の割合）が、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、１００％若しくは１００％に近いことを意味する。１００％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、９９．９９９％、９９．９９％、９９．９％、９９％などである。
　また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製されたものでも、実質的に精製されたタンパク質に含まれる。例えば、上記のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、および／または組み合わせることにより、実質的に精製されたタンパク質を例示できるが、これらに限定されるものではない。
　本態様の医薬組成物の有効成分としてのＰＰＩＢタンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞の形態は特に限定されず、例えば、ＰＰＩＢタンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたベクター、ＰＰＩＢタンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたベクターを導入した細胞などが挙げられる。
　ＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞は、例えば、ＰＰＩＢタンパク質をコードするＤＮＡに分泌シグナルをコードするＤＮＡを結合させたＤＮＡを、公知の発現ベクターや遺伝子治療用ベクターに挿入することで作製されたベクターを、線維芽細胞（例えば正常皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）などの哺乳類細胞や昆虫細胞、その他の細胞に導入することによって作製することができる。分泌シグナルをコードするＤＮＡとしては配列番号：５の核酸配列を有するＤＮＡが例示されるが、これに限定されない。これら細胞が由来する動物種に特に制限はないが、ベクターが投与される対象動物種の細胞、対象自身の細胞、あるいはベクターが投与される対象の血縁にあたる者に由来する細胞を使用することが好ましい。
　ＰＰＩＢタンパク質をコードするＤＮＡは、ＰＰＩＢタンパク質をコードする限り、ｃＤＮＡであっても、ゲノムＤＮＡであってもよく、また、天然のＤＮＡであっても、人工的に合成されたＤＮＡであってもよい。ＰＰＩＢタンパク質をコードするＤＮＡは、典型的には、ベクター（例えば遺伝子治療用ベクター）に挿入された状態で、本態様の医薬組成物に含有される。
　遺伝子治療用ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノアソシエートウイルスベクター、センダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、パピローマウイルスベクター、などが例示できるが、これらに限定されるものではない。該遺伝子治療用ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーターＤＮＡ配列や、遺伝子発現を制御する因子、ＤＮＡの安定性を維持するために必要な分子が含まれてもよい。
　本態様の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　ｌａｔｅｓｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｍａｒｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｅａｓｔｏｎ，　Ｕ．Ｓ．Ａ参照）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
　本態様の医薬組成物の投与方法として、経口投与または非経口投与が挙げられ、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本態様の医薬組成物を全身または局部的（例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、口腔内および消化管粘膜、膣・子宮内粘膜、または損傷部位など）に投与できる。
　また、患者の年齢、症状等により適宜投与方法を選択することができる。ＰＰＩＢタンパク質を投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約０．００００００１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり約０．００００１から約１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量が選択できる。ＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞やＰＰＩＢタンパク質をコードするＤＮＡが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、損傷組織において、ＰＰＩＢタンパク質の量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本明細書において使用される用語、「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに制限されない。
　本明細書で使用される用語、「治療」は、例えば、症状の緩和、改善、および／または除去、軽減および／または安定化（例えばより進んだ段階へと進行しないこと）のいずれかを指す。
　本発明は、さらに以下の態様も提供する：
（１）ＰＰＩＢタンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞を対象に投与することを含む、脳梗塞の治療方法；
（２）脳梗塞の治療における使用のためのＰＰＩＢタンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞；
（３）脳梗塞の治療のための医薬の製造におけるＰＰＩＢタンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞の使用。
　これらの態様における、ＰＰＩＢタンパク質、その機能的に同等なタンパク質、ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸、ＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞、それらの形態、製剤化、投与方法、および投与量についての説明や他の実施形態は上記のとおりである。
　本明細書において引用された先行技術文献は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と引用文献の記載に不一致がある場合、本明細書の記載により調整される。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、これらの実施例は必ずしも本発明を限定する意図ではない。
実施例１：マウス脳梗塞に対するヒトＰＰＩＢの効果
試験材料
動物：
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雄性マウス（微生物グレードＳＰＦ）を７週齢で日本クレア（東京都）より購入し、３日以上動物飼育室で馴化させた後２３～２５ｇで使用した。動物は、室温２２±２℃、湿度５０％±２０％、照明時間１２時間（午前７時から午後７時）に設定された動物飼育室にて飼育した。固形飼料ＣＥ－２（オリエンタル酵母工業）および水道水を自動摂取させ、１ケージ当たり３匹で飼育した。
薬物：
　被験物質としてヒトペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）を用いた。当該ヒトＰＰＩＢは、配列番号：２の核酸配列を有するＤＮＡが挿入されたベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入し、当該細胞を培養した後の上清から精製して得たものである。こうして得られた当該ヒトＰＰＩＢは、配列番号：１のアミノ酸配列からなるタンパク質として細胞内で合成された後、細胞外へ分泌される際にシグナル配列が除去されて成熟タンパク質となったものであるため、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質である。当該ヒトＰＰＩＢが配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質であることは、Ｎ末端側のペプチドシークエンシングおよび質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ）によって確認した。溶媒として生理食塩液（大塚生食注、大塚製薬）を用いた。被験物質は大塚蒸留水（大塚製薬）に１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、５０μＬごとに分注し、使用するまで－３０℃に保存した。被験物質をマウスに投与する前に、保存した被験物質を溶解し、大塚生食注２００μＬを加えて目的の濃度（０．２ｍｇ／ｍＬ）に希釈した。投与溶液は、投与するまで氷上に保管した。
器具：
　塞栓子は、全長２０ｍｍの６号ナイロン糸（６－０、ネスコスーチャーナイロン糸）先端を半田ゴテで丸くし、先端７ｍｍをシリコン樹脂（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＲＴＶシーラント７３２）で直径０．２１～０．２３ｍｍになるようにコーティングしたものを使用した。
試験方法
一過性脳虚血：
　麻酔器（ＭＫ－Ａ１１０Ｄ、室町機械）を用い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雄性マウスをイソフルラン（アボットジャパン）麻酔下（導入時３％、維持２％）で、正中切開により右頸動脈を剥離し、総頸動脈および外頸動脈に糸をかけた後、総頸動脈および外頸動脈の血流を一時的に遮断した。外頸動脈より塞栓子を挿入し、外頸動脈を切断後、外頸動脈と内頸動脈の分岐部より１０．５ｍｍを内頸動脈に挿入し中大脳動脈の起始部を閉塞させた後手術創を閉じた。脳梗塞作製時の手術中はヒートマットを使用して、マウスの直腸温を３６．５～３７．５℃に保持した。虚血中のマウスはケージに戻し、自由飼育させた。梗塞６０分後に麻酔下で塞栓子を引き抜き、切り口を閉じた。再灌流時は直腸温の調節はしなかった。手術は顕微鏡（ＰＯＭ－５０　ＩＩ、Ｋｏｎａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ）下で行った。
体重測定：
　手術前、手術後１および２日に体重測定を行った。
投与：
　被験物質または溶媒の投与は、虚血再灌流の６および２４時間後に合計２回投与した。投与溶液を１ｍＬのシリンジに充填し、２７Ｇの注射針を用いて尾静脈より液量０．２ｍＬ投与した。
脳梗塞領域の測定：
　虚血再灌流の２日後にマウスを麻酔下で腹大動脈切断により放血致死し、脳を採取した。採取した脳は、マウス用脳スライサー（Ｚｉｖｉｃ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、大脳と小脳の境界より厚さ２ｍｍの大脳横断切片を４枚作製した。それらを１％　２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で３０分間染色した。脳切片は顕微鏡（倍率ｘ１．５、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて撮像し、梗塞巣の大きさは、画像解析ソフト（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　ＣＳ５、Ａｄｏｂｅ）を用い、各脳切片について、左側脳面積、右側脳非障害面積および右側脳障害面積を求めた。脳全体面積は次のように算出した：脳全体面積＝左側脳面積×２。
　脳梗塞の体積は、錘台の体積の求め方から次の式により算出した：
［ｓ＋Ｓ＋√（ｓＳ）］×ｈ／３（式中、ｓ：切片１の面積、Ｓ：切片２の面積、ｈ：切片間の距離とする）。
　隣り合う各切片間の３カ所の体積を求めて合計し、脳梗塞体積のパーセンテージを算出した：
脳梗塞体積（％）＝脳梗塞体積／脳全体体積×１００。
統計処理：
　測定値は平均値および標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）で表した。表計算ソフトを用いて測定値を一元配置の分散分析により統計的に解析し、ｐ＜０．０５の場合に有意差ありとした。
試験結果
　マウスを脳虚血再灌流後に群分けし、それぞれ溶媒またはＰＰＩＢを投与してから２日後に脳を摘出するまでの期間で死亡したマウスはいなかった。この期間の各群のマウス体重の変化を図１に示した。手術に用いたマウスの体重は群間で差がなかった。手術後マウスの体重は減少し、両群ともに手術前に比較すると手術後１日で約３ｇ、２日後で約５ｇ減少した。
　一過性脳虚血の２日後に脳を摘出してＴＴＣ染色した脳の梗塞の体積を測定し、結果を図２に示した。脳全体の体積に対する梗塞体積は溶媒群で２０．６％、ＰＰＩＢ群で１０．９％であり、４７．２％の有意な減少を示した。以上の結果より、ＰＰＩＢは一過性脳虚血による脳梗塞に対して治療効果を発揮することが示された。
　脳梗塞の治療において有効性が示されている既存の医薬として、血栓溶解剤ｔ－ＰＡがある。しかし、ｔ－ＰＡは、脳梗塞発症後４．５時間を超える場合、非外傷性頭蓋内出血の既往がある場合、胸部大動脈解離が強く疑われる場合、およびＣＴやＭＲＩでの広汎な早期虚血性変化が存在する場合には適応外となる等、その使用に制限がある。また、実際に日本の医療現場でｔ－ＰＡが適用されている患者は、脳梗塞患者全体の５～６％であると推定されており、大部分の患者に対しては有効な治療方法が無い状況となっている。ＰＰＩＢはｔ－ＰＡとは異なる機序で脳梗塞の治療効果を発揮すると考えられるため、本願により提供されるＰＰＩＢを含む脳梗塞の治療薬は、ｔ－ＰＡが適応外となる患者に対する有効な治療方法を提供するだけでなく、ＰＰＩＢの単独投与またはｔ－ＰＡとの併用によって、ｔ－ＰＡだけでは十分な治療効果が得られない患者にも多大な恩恵をもたらすものと期待される。

Claims (4)

  1. 　ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）タンパク質、またはＰＰＩＢタンパク質を分泌する細胞を含む、脳梗塞の治療のための医薬組成物。
  2. 　ＰＰＩＢタンパク質が、
    　ａ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加したアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質；
    　ｄ）配列番号：４に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるタンパク質；
    　ｅ）配列番号：４に記載の核酸配列と７０％以上の配列同一性を有する核酸配列によりコードされるタンパク質；
    　ｆ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のホモログのアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むタンパク質；または
    　ｇ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のオルソログのアミノ酸配列からシグナル配列が除去されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するタンパク質、
    である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸を含む、脳梗塞の治療のための医薬組成物。
  4. 　ＰＰＩＢタンパク質をコードする核酸が、
    　ｉ）配列番号：４に記載の核酸配列を含む核酸；
    　ｉｉ）配列番号：４に記載の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；または
    　ｉｉｉ）配列番号：４に記載の核酸配列と７０％以上の配列同一性を有する核酸、
    である、請求項３に記載の医薬組成物。
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