WO2009113480A1 - 脳梗塞治療薬 - Google Patents

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泰治 佐々木
由里 松尾
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Definitions

  • the present invention relates to the suppression of the formation and expansion of cerebral infarction foci formed by cerebral hemorrhage and cerebral ischemia, and further relates to improvement of cerebral infarction prognosis and prevention of recurrence. More specifically, the present invention relates to a cerebral infarction improving drug or a cerebral infarction recurrence preventing drug, and also relates to a screening method for these drugs.
  • Cerebral infarction lesions extend over a wide area. Cerebral infarction is a neurodegenerative disease mainly characterized by central nervous system dysfunction. It is an acute stage of cerebral infarction that leads to infarct formation following degeneration / necrosis of nerve cells, and sub-stages from infarct formation to fixation of central neuropathy. Pathological and histological classification into chronic and chronic cerebral infarction.
  • Acute cerebral infarction is divided into an early stage and late stage after onset, and as an early treatment of cerebral thrombosis / embolism in the acute stage, tissue plasminogen activator (t-PA) is limited to 3 hours or less. Removal of blood clots due to thrombosis and radical scavenging by edaravone up to 24 hours onset.
  • Treatment for acute cerebral infarction and subchronic cerebral infarction mainly consists of maintenance therapy with antiplatelet drugs, and there are currently no drugs to prevent or reduce infarct focus. At present, the details of cerebral infarction formation and enlargement mechanism are unknown, so it does not prevent onset and prevent formation of cerebral infarction.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 1
  • bradykinin is generated and accumulated in the cerebral infarction lesion, it is unclear whether bradykinin is involved in cerebral infarction formation and extension, and which bradykinin receptor is involved.
  • An object of the present invention is to provide a technique that can suppress the expansion of cerebral infarction or prevent recurrence.
  • bradykinin is mainly involved in cerebral infarction formation / expansion through the B1 receptor, and bradykinin It has been found that a B1 receptor antagonist suppresses the formation / expansion of cerebral infarction and reduces neuropathy.
  • bradykinin at a higher concentration was observed in the infarcted region of the rat cerebral ischemia / reperfusion / camilla infarction model than in the normal region, and then the brain of a kininogen-deficient rat lacking bradykinin-producing ability. It was confirmed that the cerebral infarction region in the ischemia / reperfusion / cerebral infarction model was smaller than the cerebral infarction region of normal rats, and the score indicating neuropathy was also reduced.
  • bradykinin B1 receptor is induced to be expressed in nerve cells at the infarcted site at the cerebral infarcted site in the rat cerebral ischemia / reperfusion / cerebral infarction model.
  • bradykinin B1 receptor which is induced and expressed in nerve cells of cerebral infarction lesions during pathological conditions, is one of the factors for formation and expansion of cerebral infarction lesions due to ischemia.
  • cerebral infarction formation was suppressed when a drug having an action of blocking bradykinin B1 receptor was applied to a cerebral ischemia / reperfusion / cerebral infarction model in normal rats. Therefore, it was concluded that a drug having a bradykinin B1 receptor blocking action is useful as a cerebral infarction ameliorating agent and a recurrence preventing agent, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a cerebral infarction ameliorating agent or a cerebral infarction recurrence preventing agent comprising a compound having a bradykinin B1 receptor antagonistic activity as an active ingredient.
  • the compound having the bradykinin B1 receptor antagonistic activity to be used is a peptide represented by D-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic (desArg-HOE140), N-[[4- ( 4,5- dihydro-1H-imidazol-2- yl) phenyl] methyl] -2- [2-[[4- methoxy-2,6- dimethylphenyl) sulfonyl] methylamino] ethoxy] -N-methylacetamide fuma Or (2R) -2-[((3R) -3- (1,3- benzodioxol-5- yl) -3-[[(6- methoxy-2- naphthyl)
  • a medicine for improving or preventing recurrence of cerebral infarction and means for suppressing the formation / expansion of cerebral infarction foci due to cerebral hemorrhage, cerebral thrombosis / cerebral infarction, which have not been effectively prevented or treated so far.
  • this medicine screening method can be provided and is a very useful invention.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the comparison with the kininogen deficiency type
  • A shows a representative example in which the expression of B1 receptor mRNA was analyzed by RT-PCR.
  • B shows the results of quantitative analysis of the expression of B1 receptor mRNA by Real-time PCR method. It is a figure which shows the analysis of the B1 receptor protein expression site after cerebral ischemia.
  • (A) shows representative examples of B1 receptor protein expression sites on the same side (i) and the opposite side (c) ⁇ after cerebral ischemia.
  • (B) shows a representative example of an anti-B1 receptor absorption experiment.
  • (C) shows the results of quantitative analysis of B1 receptor protein expression in the cerebral cortex. It is a figure which shows the influence on infarction formation of a B1B2 receptor antagonist.
  • (A) shows a representative example of TTC staining of intravenous administration of B1 receptor antagonist.
  • (B) shows whole brain
  • (C) shows TTC stained images in the cerebral cortex using Scion Image, and shows the result of calculating infarct volume. It is a figure which shows the influence on brain dysfunction of a B1 receptor antagonist.
  • the active ingredient of the cerebral infarction improving drug or cerebral infarction recurrence preventing drug of the present invention is a compound having a bradykinin B1 receptor antagonistic action.
  • Compound having bradykinin B1 receptor antagonistic activity It was found as follows that bradykinin B1 receptor is involved in the formation and expansion of cerebral infarction foci in the acute phase of cerebral infarction. First, a rat middle cerebral artery occlusion model using wild-type rats and kininogen-deficient rats lacking bradykinin-producing ability was prepared and used as a rat cerebral ischemia / reperfusion / cerebral infarction model.
  • bradykinin A higher concentration of bradykinin was observed in the infarcted part of the wild-type model (infarct right hemisphere) than in the normal part (control left hemisphere), whereas bradykinin due to ischemia was observed in kininogen-deficient rats. Production disappeared and was at the same level as that of sham-treated rats (FIG. 1). Bradykinin, which is a pain-causing substance, is thought to stimulate pain sensory nerves by interacting with prostaglandin E2, which is accumulated at a high concentration in peripheral inflammatory sites, and to increase pain sensation. However, in the central nervous system, it was unclear whether or not the central inflammatory response was triggered or promoted by bradykinin and prostaglandin E2.
  • B Using the above cerebral infarction model of wild-type rats and kininogen-deficient rats, it was shown that bradykinin is involved in cerebral infarct formation (FIGS. 2 to 4).
  • infarct formation and edema were found in a wide range in the cerebral cortex of the infarct-forming right hemisphere formed by vascular occlusion / reperfusion, and significantly increased compared to the left cerebral cortex in the control region. It was. Moreover, the neurological / motor disorder score was significantly worse than that of the pseudo-treated control rats or mice (results not shown). However, the results of cerebral infarction evaluation items in the kininogen-deficient rat model were significantly reduced or reduced compared to the evaluation item results of the wild type rat model (FIGS. 2 to 4).
  • bradykinin B1 receptor mRNA and protein were observed in the cerebral cortex (infarction site) of the right hemisphere of the cerebral infarction, which was significantly higher than that of the pseudo-treated control rat.
  • the mRNA expression level was lower than that of the wild type (FIGS. 5 and 6). Therefore, we concluded that the expression induction of bradykinin B1 receptor at the infarct site is involved in cerebral infarction formation and extension.
  • bradykinin B1 receptor antagonists can suppress the formation and expansion of cerebral infarction and improve neurological symptoms.
  • bradykinin B1 receptor antagonist des-Arg HOE140 100 mg / kg and 300 mg / kg
  • the infarct area was reduced compared with the non-administration group, A decrease in the disability score was observed ( Figures 7 and 8). That is, the present inventors have found that a bradykinin B1 receptor antagonist suppresses the formation / expansion of cerebral infarction and reduces neuropathy.
  • a drug having the ability to inhibit bradykinin B1 receptor antagonist is useful as a cerebral infarction formation / expansion inhibitor.
  • Cerebral infarction remedy, recurrence prevention drug D-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic is a bradykinin B1 receptor antagonist that is used in cerebral infarction remedy and recurrence prevention drugs.
  • Bradykinin B1 receptor antagonists can be formulated into pills, powders, solutions, suspensions, capsules, etc., but are preferably in a form suitable for supply to the brain. If necessary, other additives such as a binder, a disintegrant, a lubricant, an antioxidant, a coloring agent, and a corrigent may be added.
  • the administration method may be either oral or parenteral.
  • the dose of bradykinin B1 receptor antagonists varies depending on the patient's age, symptoms, administration method, etc., but is usually 0.1 to 100 mg / kg intravenously in the case of desArg-HOE140 per day for adults, preferably 1.0 to 10 mg / kg.
  • Compound 1 it is 0.01 to 10 mg / kg for intravenous administration, preferably 0.1 to 5.0 mg / kg. In the case of Compound 2, it is 0.03 to 30 mg / kg for intravenous or oral administration, preferably 1.0 to 10 mg. / kg.
  • bradykinin B1 receptor antagonists by examining whether the test compound has a bradykinin B1 receptor antagonistic activity and selecting a substance that competitively inhibits bradykinin B1 receptor, Infarct ameliorating drugs and recurrence preventing drugs can be screened.
  • Examples of a method for selecting a substance that competitively inhibits bradykinin B1 receptor include, for example, contacting a test compound with a cell expressing bradykinin B1 receptor and examining whether the test compound competitively inhibits bradykinin B1 receptor There is.
  • the rat middle cerebral artery occlusion model was prepared as follows. 8 weeks old, Brown Norway Sea (B / N-Sea; WT), a male and female wild type rat, and Brown Norway Katholiek (B / N-Ka; KNG (-)), a kininogen-deficient rat, Using males with a body weight of 275-310 g and females with a body weight of 170-210 g, maintaining the rectal temperature at 37 ⁇ 0.5 ° C under anesthesia, incising the neck and exposing the bifurcation of the right carotid artery, The internal and external carotid arteries were removed.
  • 4-0 nylon thin thread with the tip rounded with silicon coat reaches and fixes the middle cerebral artery (MCA) starting part through the internal carotid artery, thereby reducing the blood flow in the right middle cerebral artery region Blocked and loaded with ischemia.
  • MCA middle cerebral artery
  • reperfusion was performed by pulling out the nylon thread outside the middle cerebral artery blood vessel.
  • ice-cold physiological saline was perfused and blood was removed under anesthesia, followed by decapitation and removal of the brain.
  • FIG. 1 shows the amounts of BK in the brain of kininogen-deficient rats (KNG ( ⁇ )) and wild-type rats (WT) after cerebral ischemia. Values are shown as mean ⁇ standard error. BK production due to ischemia observed in wild type rats disappeared in kininogen deficient rats.
  • Score table 0 points 1 point / body balance left / right contrast Left side weak / limb movement left / right symmetric Extending left forelimb / extending forelimb left / right symmetric Left side weak / wire mesh gauge walking normal walking stepping out / front arm Pulling force Left / right symmetry Left side weak / responsiveness to stimuli Left / right symmetry No left side reaction Those with a total score of less than 1 for these 6 items were excluded from the data. Also excluded were those with bleeding in the brain or brain floor.
  • FIG. 2 shows infarctions after cerebral ischemia in kininogen-deficient rats (KNG ( ⁇ )) and wild-type rats (WT).
  • KNG kininogen-deficient rats
  • WT wild-type rats
  • A Acupuncture is 1 hour ischemia-24 hours after reperfusion, and the removed brain is subjected to TTC sputum staining using a 2 mm slice, and representative examples of each genotype are shown.
  • (B) shows the infarct volume calculated by the above method in a graph by analyzing the image of TTC staining using Scion Image and setting the area not stained with TTC as the infarct. Values are shown as mean ⁇ standard error. Infarct volume was significantly reduced in kininogen-deficient rats compared to wild-type rats.
  • FIG. 3 shows the cerebral edema rate after cerebral ischemia in kininogen-deficient rats (KNG (-)) and wild-type rats (WT).
  • KNG (-) kininogen-deficient rats
  • WT wild-type rats
  • the image of ⁇ TTC staining was analyzed using Scion Image, and the brain edema rate was calculated by the above method. Values are shown as mean ⁇ standard error.
  • Kininogen-deficient rats had significantly reduced brain edema rates compared to wild-type rats.
  • FIG. 4 shows cerebral dysfunction after cerebral ischemia in kininogen-deficient rats (KNG (-)) and wild-type rats (WT). After 24 hours of reperfusion, symptoms were observed according to the score table. Values are shown as mean ⁇ standard error. At 24 hours after reperfusion, kininogen-deficient rats had significantly improved brain dysfunction compared to wild-type rats.
  • kininogen-deficient rats lacking bradykinin-producing ability significantly decreased infarct volume and brain edema rate compared to wild-type rats, and the degree of brain dysfunction was significantly lower.
  • bradykinin receptor expression induction was investigated whether or not bradykinin receptor expression induction occurred.
  • bradykinin receptors constitutive bradykinin B2 receptors and inducible bradykinin B1 receptors are known. This was observed in peripheral inflammatory tissues, but was unknown in brain and nerve tissues. It is also unclear from the viewpoint of drug discovery that through which receptor bradykinin accumulated in cerebral infarction is involved in cerebral infarction formation is important.
  • RNA was dissolved in DEPC-treated water to a total volume of 8.5 ⁇ l, and 1 ⁇ l of 10 ⁇ DNaseI reaction buffer (200 mM Tris-HCl 20 mM MgCl 2 , 500 mM KCl: pH 8.4) and 0.5 ⁇ l of DNase I (Invitrogen) were added and reacted at room temperature for 15 minutes. The reaction was stopped with 1 ⁇ l of 25 mM EDTA, and DNase I was inactivated by treatment at 65 ° C. for 15 minutes. Using this as a sample, reverse transcription was performed using SUPERSCRIPT TM (Invitrogen).
  • Real-time PCR reaction is performed in 10 ⁇ l reaction solution (dH 2 O 3.6 ⁇ l, SYBR 5 ⁇ l, ROX Reference Dye 0.2 ⁇ l, TAKARA SYBR Premix Ex Taq) using 1 ⁇ l cDNA as template and 0.1 ⁇ l of various 10 ⁇ M primers. It was.
  • PCR reaction was performed in 25 ⁇ l of reaction solution (1 ⁇ PCR buffer, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl 2 ), using 0.5 ⁇ l of cDNA as a template, 0.2 ⁇ M of various primers, and 0.125 ⁇ l of Taq DNA polymerase (Invitrogen). .
  • the PCR product was electrophoresed on a 2% agarose gel (100 V, 30 min) together with a molecular weight marker ( ⁇ X174 / Hae III, NEW ENGLAND BioLabs), and detected after staining with ethidium bromide.
  • the primers used in this experiment are shown in Table 1.
  • Rat brains extracted after 1 hour ischemia 24 hours reperfusion were divided into sites in ice-cold saline. Collected tissues in 200 ⁇ l ice-cold homogenization buffer (0.3 M sucrose, 25 mM imidazole, 1 mM EDTA, pH 7.2, containing 10 ⁇ g / mL leupeptin, 1 mM PMSF, 2 ⁇ g / mL aprotinin, 10 ⁇ g / mL pepstatin) Homogenized. The protein concentration of the supernatant obtained by centrifugation at 4,000 ⁇ g, 4 ° C.
  • TBS-T Tris buffered saline-Tween-20 containing 5% skim milk
  • TBS-T Tris buffered saline-Tween-20 containing 5% skim milk
  • Anti-B1 receptor antibody (Santa Cruz # sc-15045; 1: 250) was used as the primary antibody.
  • HRP-conjugated secondary antibody (1: 10,000) against the primary antibody diluted with TBS-T containing 1% skim milk for 60 minutes.
  • Anti-rabbit IgG Jackson Immuno Reseach # 111-035-003
  • anti-goat IgG Jackson Immuno Reseach # 305-035-003
  • FIG. 5 shows B1 receptor mRNA expression after cerebral ischemia in kininogen deficient rats (KNG ( ⁇ )) and wild type rats (WT). MRNA was extracted from the brain removed 24 hours after ischemia-reperfusion (MCAO) or sham operation (sham).
  • A shows a representative example in which the expression of B1 receptor mRNA was analyzed by RT-PCR.
  • B shows the results of quantitative analysis of B1 receptor mRNA expression by Real-time PCR method. Values are shown as mean ⁇ standard error.
  • kininogen-deficient rats there was no significant difference in the induction of B1 receptor mRNA expression between the ischemic side and the opposite side of the control.
  • wild-type rats B1 receptor mRNA expression was significantly induced on the ischemic side, but induction on the ischemic side of kininogen-deficient rats was significantly lower than that on the wild-type rat. It was.
  • FIG. 6 shows the results of analysis of the B1 receptor protein expression site after cerebral ischemia in wild type rats (WT) and confirmation of specificity by the blocking peptide.
  • A shows representative examples of B1 receptor protein expression sites on the same side (i) and the opposite side (c) ⁇ after cerebral ischemia. B1 receptor protein was up-regulated only in the cerebral cortex.
  • B is a representative example of anti-B1 receptor absorption experiments.
  • C is a quantitative analysis of B1 receptor protein expression in the cerebral cortex. B1 receptor protein expression was significantly induced on the ischemic side. Values are shown as mean ⁇ standard error.
  • bradykinin B1 receptor antagonists inhibit cerebral infarct formation in ischemia / reperfusion models.
  • Bradykinin B1 receptor antagonist (des-Arg10 Hoe140 H-158: Saline containing 100, Sa300 g / kg) was intravenously administered to wild-type rats after ischemia-reperfusion (MCAO) treatment 6 hours and 15 hours after reperfusion did. In the control group, saline was administered twice in the same manner. The measurement of the cerebral infarction region was performed by the method of Example 1.
  • FIG. 7 shows the effect of intravenous administration of B1 receptor antagonist on infarct formation in wild type rats.
  • MCAO treatment was performed and reperfusion was administered 6 and 15 hours later.
  • 2 mm sections were prepared and subjected to TTC staining.
  • (A) shows a representative example of TTC staining image of B1 receptor antagonist intravenous administration. The area not stained with ⁇ TTC was taken as the infarct. Images of TTC staining in whole brain sputum (B) and cortical sputum (C) were analyzed using Scion Image, and infarct volume was calculated. Values are shown as mean ⁇ standard error. Infarct volume was significantly attenuated by a B1 receptor antagonist (des-Arg ⁇ HOE140).
  • FIG. 8 shows the effect of intravenous administration of B1 receptor antagonist on brain dysfunction after ischemia in wild type rats.
  • MCAO treatment was performed and B1 receptor antagonist was administered intravenously 6 and 15 hours after reperfusion.
  • Brain dysfunction was measured 24 hours after reperfusion. Symptoms were observed according to the score table shown in Example 1. Values are shown as mean ⁇ standard error.
  • Intravenous administration of the B1 receptor antagonist improved brain dysfunction in non-treatment rats that received nothing.
  • the infarct volume was significantly attenuated by the B1 receptor antagonist (des-Arg HOE140). Moreover, improvement of brain dysfunction was recognized by intravenous administration of B1 receptor antagonist.
  • SEQ ID NOs: 1-12 show the PCR primer sequences.

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Abstract

　ブラジキニンがブラジキニンB1受容体を介して脳梗塞巣形成・拡大に関与すること、および、ブラジキニンB1受容体拮抗作用を有する化合物が脳梗塞の形成・拡大を抑制することを見出した。本発明は、ブラジキニンB1受容体拮抗作用を有する化合物を有効成分とする脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬を提供する。また、ブラジキニンB1受容体拮抗作用を有する化合物を選択することにより、脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬をスクリーニングする方法も提供する。

Description

脳梗塞治療薬
　本発明は、脳出血、脳虚血にて形成される脳梗塞巣の形成・拡大を抑制し、さらには、脳梗塞の予後の改善、再発防止に関するものである。より詳しくは、本発明は、脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬に関し、またこれらの医薬のスクリーニング方法にも関するものである。
　脳血栓症、脳塞栓症、脳内出血に伴う血管収縮後の虚血等によって生じる脳梗塞部位では、炎症関連物質やサイトカインにより神経細胞やグリア細胞が活性化され、その結果中枢性炎症が増強されて、脳梗塞巣が広範囲に伸展する。脳梗塞は、中枢神経機能障害を主徴とする神経変性疾患であり、神経細胞の変性・壊死に続く梗塞巣形成にいたる急性期脳梗塞と、梗塞巣形成から中枢神経障害の固定にいたる亜慢性期・慢性期脳梗塞とに病理学的・組織学的に分類される。急性期脳梗塞は、発症後の早期と後期に分けられ、急性期の脳血栓・塞栓症の早期の処置としては、発症３時間以内を限度とする組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ-PA)による血栓除去と、発症24時間を限度とするエダラボンによるラジカル消去とがある。急性期脳梗塞後期、および亜慢性期脳梗塞における処置は、もっぱら抗血小板薬による維持療法が主体であり、梗塞巣拡大阻止や縮小を促す薬物は未だないのが現状である。現在は、脳梗塞巣形成と拡大機序の詳細が不明なため、発症予防、脳梗塞形成阻止には至らず、専ら対処療法に終始している。
　四肢等の末梢部の切傷、打撲、または細菌感染による発痛・炎症および疼痛については、その機序はある程度判明している。しかし、中枢神経、殊に脳組織の炎症については、病巣形成・拡大の詳細は末梢炎症ほどは判っていない。出血性脳梗塞、血栓性・塞栓性脳梗塞の病変組織では、末梢炎症部位と同様に、多くの炎症性物質やサイトカインの蓄積と、好中球、マクロファージの浸潤・活性化が生じ、グリア細胞や神経細胞の活性化や変性が起こり、その病巣では、複合的な炎症反応が生じているとされている。梗塞巣の形成・拡大に関わる因子も単独ではなく、複数の因子が関わっていると考えられていた。
　本発明者等は、ラット・マウス脳梗塞病態モデルを用いて、脳梗塞・炎症巣においてシクロオキシゲナーゼ２（COX2）ばかりではなく膜結合型プロスタグランジンＥ2 (PGE2)合成酵素（mPGES-1)の発現誘導が起こり、PGE2の有意な蓄積が起こること、およびPGE2の高濃度蓄積を抑制すると、梗塞巣・炎症巣、および脳梗塞由来の神経・運動障害が抑制されることを示した（非特許文献１）。しかしながら、脳梗塞巣にてブラジキニンが生成し、蓄積するという報告があるものの、ブラジキニンが脳梗塞形成・伸展に関与するのかどうか、またどのブラジキニン受容体が関わるのかは不明であった。
Ikeda-Matsuo Y, Ota A, Fukada T, Uematsu S, Akira S, Sasaki Y. Microsomal prostaglandin E synthase-1 is a critical factor of stroke-reperfusion injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 103(31): 11790-11795 2006
　本発明の目的は、脳梗塞巣拡大を抑制、あるいは再発防止を可能にする技術を提供することである。
　本発明者等は、急性期脳梗塞巣の形成・拡大の機序を解明するための研究の結果、ブラジキニンが主としてＢ１受容体を通して脳梗塞巣形成・拡大に関与していること、および、ブラジキニンＢ１受容体拮抗薬が脳梗塞巣の形成・拡大を抑制し、神経障害を軽減させることを見出した。
  より詳しくは、ラット脳虚血・再灌流/ 脳梗塞モデルの梗塞部位では、正常部位に比べ高濃度のブラジキニンの蓄積が見られることを確認し、次いで、ブラジキニン生成能を欠くキニノーゲン欠損ラットの脳虚血・再灌流／脳梗塞モデルにおける脳梗塞領域は、正常ラットの脳梗塞領域に比し小さいこと、及び、神経障害を示すスコアーも低減していることを確認した。また、ラットの脳虚血・再灌流／脳梗塞モデルの脳梗塞部位において、ブラジキニンＢ１受容体が梗塞部位の神経細胞にて発現誘導されることを見出した。これらの結果より、病態時に脳梗塞巣の神経細胞にて誘導発現するブラジキニンＢ１受容体が虚血による脳梗塞巣形成・拡大因子の１つであるという考えに至り、この考えを確認するために、ブラジキニンB1受容体遮断作用を有する薬物を正常ラットの脳虚血・再灌流／脳梗塞モデルに適用したところ、驚くべきことに、脳梗塞巣形成が抑制された。従って、ブラジキニンB1受容体遮断作用を有する薬物が、脳梗塞改善薬、再発防止薬として有用であるとの結論に達し、本発明を完成するに到った。
　即ち、本発明は、ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物を有効成分とする脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬に関する。使用するブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物は、D-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic で表されるペプチド (desArg-HOE140)、N-[[4-(4,5- ジヒドロ-1H-イミダゾール-2- イル) フェニル] メチル]-2-[2-[[4- メトキシ-2,6- ジメチルフェニル) スルホニル] メチルアミノ] エトキシ]-N-メチルアセトアミドフマレート、または、(2R)-2-[((3R)-3-(1,3- ベンゾジオキソール-5- イル)-3-[[(6- メトキシ-2- ナフチル) スルホニル] アミノ] プロパノイル) アミノ]-3-(4-[[2R,6S)-2,6-ジメチルピペリジニル] メチル〕フェニル)-N-イソプロピル-N- メチルプロパンアミド塩酸塩であるのが好ましい。また、本発明は、ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物を選択することにより、脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬をスクリーニングする方法にも関する。
　本発明により、脳梗塞の改善または再発防止のための医薬を提供でき、これまで有効な予防、治療法がなかった、脳出血、脳血栓・脳梗塞による脳梗塞巣の形成・拡大を抑制する手段を提供できる。また、この医薬のスクリーニング方法も提供でき、極めて有用な発明である。
脳虚血時のブラジキニン量のキニノーゲン欠損型と野生型の比較を示す図である。 脳梗塞形成におけるキニノーゲン欠損型と野生型の比較を示す図である。(A) は１時間虚血－24時間再灌流の後、摘出した脳を２mm切片とし、TTC 染色を行い、それぞれのgenotypeの代表例を示した。(B) はTTC で染色されなかった領域を梗塞巣として算出した梗塞体積を示す。 脳浮腫形成におけるキニノーゲン欠損型と野生型の比較を示す図である。 脳機能障害におけるキニノーゲン欠損型と野生型の比較を示す図である。 脳虚血後のB1受容体mRNA発現におけるキニノーゲン欠損型と野生型の比較を示す図である。(A) は B1 受容体mRNAの発現をRT-PCR法にて解析した代表例を示す。(B) は B1 受容体mRNAの発現を、Real-time PCR 法で定量的に解析した結果を示す。 脳虚血後のB1受容体タンパク質発現部位の解析を示す図である。(A) は脳虚血後の同側(i) 及び反対側(c) のB1受容体タンパク質発現部位の代表例を示す。(B) は抗B1受容体の吸収実験の代表例を示す。(C) は大脳皮質におけるB1受容体タンパク質の発現を定量的に解析した結果を示す。 B1B2受容体アンタゴニストの梗塞巣形成への影響を示す図である。(A) はB1受容体アンタゴニスト静脈内投与のTTC 染色代表例を示す。(B) は全脳、(C) は大脳皮質におけるTTC 染色の画像をScion Image を用いて解析し、梗塞体積を算出した結果を示す。 B1受容体アンタゴニストの脳機能障害への影響を示す図である。
発明を実施するための形態
　本発明の脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬の有効成分は、ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物である。
(1) ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物
　脳梗塞急性期の脳梗塞巣形成・拡大に、ブラジキニンＢ１受容体が関与することは以下のようにして見出された。まず、野生型ラットおよびブラジキニン生成能を欠くキニノーゲン欠損型ラットを用いたラット中大脳動脈閉塞モデルを作製し、ラット脳虚血・再灌流／脳梗塞モデルとして用いた。
（ａ）野生型モデルの梗塞部位（梗塞右脳半球）では、正常部位（対照左脳半球）に比し、高濃度のブラジキニンの蓄積が見られたのに対し、キニノーゲン欠損型ラットでは虚血によるブラジキニン産生は消失し、偽似処置ラットのものと同じレベルであった（図１）。発痛物質であるブラジキニンは、末梢炎症部位に高濃度蓄積されるプロスタグランジンE2との相互作用により知覚神経を刺激して、痛覚増強を引き起こすと考えられている。しかし、中枢神経系において、中枢炎症反応惹起・促進がブラジキニンとプロスタグランジンE2によって引き起こされるか否かは不明であった。
（ｂ）野生型ラットとキニノーゲン欠損ラットの上記脳梗塞モデルを用いて、ブラジキニンが脳梗塞巣形成に関与することを示した（図２～４）。
  具体的には、ナイロン穿刺にて、１時間の野生型ラット右中大脳動脈閉塞後、穿刺跋去・血流再灌流後、24時間後に開頭し、2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC, SIGMA, T8877)染色して、脳梗塞巣面積および浮腫の程度を測定した。更に神経・運動障害の程度を調べた。マウスの場合は、1.0 時間の野生型マウス右中大脳動脈閉塞後、ラットの場合と同様に、脳梗塞評価項目を測定する。
　その結果、梗塞巣の形成と浮腫が、血管閉塞・再灌流にて形成された梗塞巣形成右半球の大脳皮質に広範囲に見られ、対照部位の左大脳半球皮質に比し、有意に増加していた。また、神経・運動障害スコアーは、偽似処置対照ラット、またはマウスのそれに比して、有意な悪化が見られた（結果未記載）。しかしながら、キニノーゲン欠損ラットモデルにおける脳梗塞評価項目の結果は、野生型ラットモデルの評価項目結果に比し、有意に縮小、軽減されていた (図２～４）。
（ｃ）脳梗塞巣にて高濃度蓄積したブラジキニンが脳梗塞巣形成に関与しているのか否かを検討するために、脳梗塞部位におけるブラジキニン受容体の変化を調べた。その結果、脳梗塞巣右半球の大脳皮質（梗塞部位）において、ブラジキニンB1受容体のmRNAおよび蛋白の発現誘導が見られ、偽似処置対照ラットのそれに比して有意に高発現していることを観察した。また、キニノーゲン欠損ラットの場合、mRNA発現量は、野生型のそれに比し、低いものであった（図５、６）。従って、ブラジキニンB1受容体の梗塞部位での発現誘導が、脳梗塞巣形成・伸展に関与していると結論付けた。
（ｄ）上記の検討により、脳梗塞巣で高濃度蓄積するブラジキニンが、脳梗塞巣形成・拡大に寄与していること、および神経障害を引き起こすことが確認され、更に、脳梗塞巣にてブラジキニンB1受容体の誘導発現が見られたことにより、ブラジキニンB1受容体の過剰刺激が脳梗塞巣形成に寄与していると作業仮説を立てた。そこで、ブラジキニンB1受容体拮抗薬による脳梗塞巣形成・拡大の抑制、神経症状の改善が見られるか否かを検討した。ブラジキニンB1受容体拮抗薬des-Arg HOE140（100mg/kg、および300mg/kg) を野生型ラットの脳梗塞モデルに静脈内投与すると、非投与群に比して、梗塞巣面積の縮小と、神経障害スコアーの減少が観察された（図７、８）。即ち、ブラジキニンB1受容体拮抗薬が脳梗塞巣の形成・拡大を抑制し、神経障害を軽減させることを見出した。
　従って、ブラジキニンB1受容体拮抗阻害能を有する薬物は、脳梗塞巣形成・拡大抑制薬として有用であると判定される。
(2) 脳梗塞改善薬、再発防止薬
　脳梗塞改善薬、再発防止薬に用いるブラジキニンB1受容体拮抗阻害薬としては、D-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic で表されるペプチド (以下、desArg-HOE140)、N-[[4-(4,5- ジヒドロ-1H-イミダゾール-2- イル) フェニル] メチル]-2-[2-[[4- メトキシ-2,6- ジメチルフェニル) スルホニル] メチルアミノ] エトキシ]-N-メチルアセトアミドフマレート (以下、化合物１) 、および(2R)-2-[((3R)-3-(1,3- ベンゾジオキソール-5- イル)-3-[[(6- メトキシ-2- ナフチル) スルホニル] アミノ] プロパノイル) アミノ]-3-(4-[[2R,6S)-2,6-ジメチルピペリジニル] メチル] フェニル)-N-イソプロピル-N- メチルプロパンアミド塩酸塩 (以下、化合物２) などが例示されるが、これらに限定されない。後述の実施例における実験結果から実証されるように、ブラジキニンB1受容体を拮抗阻害する物質であれば、脳梗塞改善、再発防止に有効である。
　ブラジキニンB1受容体拮抗阻害薬は、丸剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、カプセル剤などに製剤化することができるが、脳への供給に適した形態とするのが望ましい。必要に応じ、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤、矯味剤などの他の添加剤を加えてもよい。また、投与方法としては経口または非経口のいずれでもよい。ブラジキニンB1受容体拮抗阻害薬の投与量は患者の年齢、症状、投与方法などにより異なるが、通常、成人１日当たり、desArg-HOE140 の場合は静脈内投与として0.1 ～100mg/kgであり、好ましくは1.0 ～10mg/kg である。化合物１の場合は静脈内投与として0.01～10mg/kg であり、好ましくは0.1 ～5.0mg/kg、化合物２の場合は静脈内あるいは経口投与として0.03～30mg/kg であり、好ましくは1.0 ～10mg/kg である。
(3) スクリーニング方法
　上述のように本発明において、ブラジキニンB1受容体を拮抗阻害する物質が、病態モデル動物において脳梗塞改善、再発防止に有効であることが実証された。従って、既知のブラジキニンB1受容体拮抗阻害物質以外の化合物についても、試験化合物がブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有するか否かを調べてブラジキニンB1受容体を拮抗阻害する物質を選択することにより、脳梗塞改善薬、再発防止薬をスクリーニングすることができる。ブラジキニンB1受容体を拮抗阻害する物質を選択する方法としては、例えば、試験化合物をブラジキニンB1受容体を発現する細胞に接触させ、試験化合物がブラジキニンB1受容体を拮抗阻害するか否かを調べる方法がある。
　ラット中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの脳梗塞巣形成に及ぼすブラジキニンの影響の検討
　ラット中大脳動脈閉塞モデルは次のように作成した。即ち、8 週齡、雌雄の野生型ラットであるBrown Norway Sea (B/N-Sea; WT)、および、キニノーゲン欠損型ラットであるBrown Norway Katholiek (B/N-Ka；KNG(-)) 、雄性では体重 275-310 gのものを、雌性では体重 170-210 gのものを用い、麻酔下で直腸温を37±0.5 ℃に維持しつつ、頚部を切開し右頚動脈の分岐部を露出、内外頚動脈を剥離した。その後、外頚動脈より、先端をシリコンコートにて丸めた4-0 ナイロン細糸を、内頚動脈を通じ中大脳動脈(MCA) 起始部に到達・固定することで右側中大脳動脈領域の血流を遮断し、虚血を負荷した。１時間の虚血後、ナイロン細糸を中大脳動脈血管外に引き抜くことで再灌流を施した。再灌流24時間後に麻酔下で氷冷生理食塩水を経心的に灌流し脱血した後、断頭し脳を摘出した。
(1) 脳虚血時のブラジキニン量のキニノーゲン欠損型と野生型の比較
　１時間虚血(MCAO)及び偽手術(sham)の24時間後に脳を摘出し市販のEnzyme Immunoassay kitにて脳内のブラジキニン（BK）量を測定した。脳虚血後のキニノーゲン欠損型ラット(KNG(-))および野生型ラット(WT)の脳内BK量を図１に示す。値は平均値±標準誤差で示す。野生型ラットで見られた虚血によるBK産生が、キニノーゲン欠損型ラットでは消失していた。
(2) 脳梗塞巣領域、脳浮腫の測定
  １時間虚血24時間再灌流後に摘出した脳をbrain matrix(MUROMACHI KIKAI 1 mm)を用いて2 mm厚の切片とした。切片を2 ％ TTC含有生理食塩水に浸け、37℃で30分間染色した。染色された切片はスキャナー(EPSON, GT-7600)で読み取った。TTC で染色されなかった領域を梗塞巣とし、Scion Image を用いて梗塞面積を測定した。その値に切片の厚さを掛け、全ての切片の値を合計したものを梗塞体積とした。同様にして大脳皮質における梗塞体積を測定し、以下の計算式より全脳に対する梗塞巣の割合を算出した。また、左右半球の体積を測定し以下の計算式より脳浮腫率を算出した。
全脳または大脳皮質の梗塞体積 (％) 
  ＝〔全脳または大脳皮質の梗塞体積／全脳体積〕×１００
脳浮腫率（％）
  ＝〔虚血半球－反対側半球〕×１００／反対側半球
(3) 脳機能障害(Neurological Dysfunctions) の判定
  MCAO処置を施し再灌流24時間後に、次に示すスコアに従って脳機能障害を評価した。
スコア表　　　　　　　　　　　０点　　　　　　　１点
・体のバランス　　　　　　　左右対照　　　　　左側が弱い
・四肢の動き　　　　　　　　左右対称　　　　　左前肢を伸ばす
・前肢の伸ばし方　　　　　　左右対称　　　　　左側が弱い
・金網ゲージの歩き方　　　　正常に歩く　　　　踏み外す
・前肢の腕を引く力　　　　　左右対称　　　　　左側が弱い
・刺激に対する反応性　　　　左右対称　　　　　左側反応なし

　これら６項目の合計点数が１点未満のものをデータから除外した。また、脳内もしくは脳底に出血が認められたものも除いた。
　結果を、図２～４に示す。図２は、キニノーゲン欠損型ラット(KNG(-))及び野生型ラット(WT)における脳虚血後の梗塞巣を示す。(A) は１時間虚血－24時間再灌流の後、摘出した脳を2 mm切片としてTTC 染色を行い、それぞれのgenotypeの代表例を示したものである。(B) は、TTC 染色の画像をScion Image を用いて解析し、TTC で染色されなかった領域を梗塞巣として、上記の方法で算出した梗塞体積をグラフに示したものである。値は平均値±標準誤差で示す。キニノーゲン欠損型ラットでは野生型ラットに比べ梗塞体積が有意に減少していた。
　図３は、キニノーゲン欠損型ラット(KNG(-))及び野生型ラット(WT)における脳虚血後の脳浮腫率を示す。 TTC染色の画像をScion Image を用いて解析し、上記方法で脳浮腫率を算出した。値は平均値±標準誤差で示す。キニノーゲン欠損型ラットでは野生型ラットに比べ脳浮腫率が有意に減少していた。
　図４は、キニノーゲン欠損型ラット(KNG(-))及び野生型ラット(WT)における脳虚血後の脳機能障害を示す。再灌流24時間後、スコア表に従い症状を観察した。値は平均値±標準誤差で示す。再灌流24時間後において、キニノーゲン欠損型ラットでは野生型ラットに比べ有意に脳機能障害が改善していた。
　このように、ブラジキニン生成能を欠くキニノーゲン欠損型ラットでは野生型ラットに比べ梗塞体積、脳浮腫率が有意に減少し、脳機能障害の程度は有意に低かった。
　ブラジキニン受容体発現誘導の検討
　上記脳梗塞モデルラットを用いて、ブラジキニン受容体の発現誘導が生ずるか否かを検討した。ブラジキニン受容体は、恒常型ブラジキニンB2受容体と誘導型ブラジキニンB1受容体が知られている。これは、末梢炎症組織において認められてはいるが、脳・神経組織では不明であった。脳梗塞巣で蓄積されたブラジキニンがどの受容体を通して、脳梗塞巣形成に関与しているかは、創薬の観点からも重要であるが、これもまた不明であった。
（１）ブラジキニン受容体のmRNA発現の検討
　１時間虚血24時間再灌流後に摘出したラット脳を氷冷saline中で部位分けし、500 μｌのセパゾール super(Nakalai tasque)中でホモジナイズした。また、海馬切片はPIによる細胞死の判定後、スライスをメンブレンごと切り放し、500 μｌのセパゾール中でホモジナイズした。その後、クロロホルム100 μｌを加えて15秒間激しく混和し、室温で5 分間放置した後、15000 rpm 、4 ℃、15分間遠心分離した。上清を除き、沈殿に氷冷70% ethanol(0.5 mL) を加えて穏やかに2 回転倒混和後、15μｌのDEPC処理水を加え、激しく攪拌して、57℃、10分間インキュベーションしRNA を再度溶解した。260 nmの吸光度よりRNA 量を測定した(OD 1.0 = 40g RNA/mL) 。抽出したtotal RNA 中に混在するDNA を分解するために、3 μg のtotal RNA を全量が8.5 μｌになるようにDEPC処理水に溶解し、1 μｌの10×DNasｅＩ reaction buffer(200 mM Tris-HCl、20 mM MgCl2 、500 mM KCl: pH 8.4) 、0.5 μｌのDNase Ｉ（Ｉnvitrogen)を加え、室温で15分間反応させた。25 mM EDTA 1μｌで反応を停止して、65℃、15分間処理しDNase Ｉを失活させた。これをサンプルとして、SUPERSCRIPT TM (Invitrogen) を用いて逆転写を行った。11μｌのサンプルにrandom hexamer 1μｌを加えて、70℃、10分間熱処理を行った。その後に急冷し、10×PCR buffer 2μｌ、25 mM MgCl2 ２μｌ、25 mM dNTP 1μｌ、0.1 M DDT 2 μｌ、Super script II  1μｌを加えて、42℃ 50 分間反応させた。これを70℃、15分間熱処理を行った後に急冷し、RNase H 0.5 μｌを加えて37℃、20分間加熱した。ここで作られたcDNAを鋳型としてPCR を行った。
　Real-time PCR 反応は10μｌの反応液中(dH2O 3.6 μｌ, SYBR 5μｌ, ROX Reference Dye 0.2 μｌ, TAKARA SYBR Premix Ex Taq)で、鋳型としてcDNA 1μｌを使用し、各種10μM プライマー 0.1μｌで行った。　
　PCR 反応は25μｌの反応液中(1×PCR buffer, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl2)で、鋳型としてcDNA 0.5μｌを使用し、各種プライマー 0.2μM 、Taq DNA ポリメラーゼ (Invitrogen) 0.125 μｌで行った。PCR 産物は分子量マーカー (φX174/Hae　III, NEW ENGLAND BioLabs) と共に２％アガロースゲルにて電気泳動(100 V, 30 min) し、エチジウムブロマイドで染色後検出した。この実験で用いたプライマーは表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）ブラジキニン受容体の蛋白発現の検討
　１時間虚血24時間再灌流後に摘出したラット脳を氷冷saline中で部位分けした。採取した組織は200 μｌの氷冷ホモジナイズバッファー（0.3 M スクロース，25 mM イミダゾール, 1 mM EDTA, pH 7.2, 10 μg/mLロイペプチン含有, 1 mM PMSF, 2μg/mLアプロチニン, 10μｇ/mL ペプスタチン) 中でホモジナイズした。4,000 ×g, 4℃, 15分の遠心分離で得られた上清のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン(BSA, SIGMA)をスタンダードとしてBradford法にて測定した。BSA 換算で20μg のタンパク質をサンプルバッファー (1% SDS, 2%β- メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.7)) 中にて、95℃で5 分間インキュベーションした後、氷冷した。15％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、分子量ごとにタンパク質を分離させた後、semi-dry blotting によりポリフッ化ビニリデン (PVDF) メンブレン(Millipore, immobilon-P)に転写した。5% skim milk含有Tris buffered saline-Tween-20(TBS-T : 137 mM NaCl, 10 mM Tris, 0.1% Tween-20 ; pH 7.4)にてブロッキングした後、1%スキムミルク含有TBS-T で希釈した一次抗体で90分間反応させた。一次抗体には抗-B1 受容体抗体 (Santa Cruz #sc-15045; 1:250)を用いた。反応後TBS-T で５分間６回と10分間３回洗浄し、1%スキムミルク含有TBS-T で希釈した一次抗体に対するHRP 結合二次抗体(1:10,000)で60分間反応させた。二次抗体には抗ウサギ IgG (Jackson Immuno Reseach #111-035-003)、抗ヤギ IgG (Jackson Immuno Reseach #305-035-003)を用いた。反応後TBS-T で５分間６回と10分間３回洗浄し、化学発光(LumiGLOTM Reagent and Peroxide, Cell Signaling)にて検出した。
　結果は図５、６に示す。図５は、キニノーゲン欠損型ラット(KNG(-))及び野生型ラット(WT)における脳虚血後のB1受容体mRNA発現を示す。虚血再灌流(MCAO)或いは偽手術(sham)の24時間後に摘出した脳からmRNAを抽出した。(A) はB1受容体mRNAの発現をRT-PCR法にて解析した代表例を示す。(B) はB1受容体mRNAの発現を、Real-time PCR 法で定量的に解析した結果を示す。値は平均値±標準誤差で示す。キニノーゲン欠損型ラットでは、虚血側と対照反対側でのB1受容体mRNAの発現誘導に有意な差はなかった。一方、野生型ラットでは、虚血側で有意にB1受容体mRNAの発現が誘導していたが、キニノーゲン欠損型ラットの虚血側での誘導は、野生型に比べて有意に低値であった。
　図６は、野生型ラット(WT)における脳虚血後のB1受容体タンパク質発現部位の解析とblocking peptideによる特異性の確認の結果を示す。再灌流24時間後に摘出した脳を部位分けして、B1受容体タンパク質の発現をWestern blotting法にて解析した。(A) は脳虚血後の同側(i) 及び反対側(c) のB1受容体タンパク質発現部位の代表例を示す。大脳皮質でのみB1受容体タンパク質が発現上昇していた。 (B)は抗B1受容体の吸収実験の代表例である。 (C)は大脳皮質におけるB1受容体タンパク質の発現を定量的に解析したものである。B1受容体タンパク質発現は虚血側で有意に誘導されていた。値は平均値±標準誤差で示す。
  以上のように、キニノーゲン欠損型ラットでは、虚血側と対照反対側でのB1受容体mRNAの発現誘導に有意な差はなかった。一方、野生型ラットでは、虚血側で有意にB1受容体mRNAの発現が誘導していたが、キニノーゲン欠損型ラットの虚血側での誘導は、野生型に比べて有意に低値であった。更に、B1受容体タンパク質発現は虚血側で有意に誘導されていた。
　上記実施例１、２の結果から、ブラジキニンが、主としてその受容体、B1受容体を通して脳梗塞巣形成に関与しているという結論に達した。そこで、ブラジキニンB1受容体拮抗薬が、虚血・再灌流モデルの脳梗塞巣形成を抑制するか否かを検討した。
　ブラジキニンB1受容体アンタゴニスト(des-Arg10 Hoe140 H-158 ：100, 300　g/kg含有Saline) を虚血再灌流（MCAO）処置後の野生型ラットに、再灌流６時間、15時間後に静脈内投与した。対照群は同様の方法でsalineを2 回投与した。脳梗塞領域の測定は、実施例１の方法にて行った。
　結果は図７、８に示す。図７は、野生型ラットでの梗塞巣形成に対する B1 受容体アンタゴニスト静脈内投与の影響を示す。MCAO処置を施し再灌流６、15時間後に投与し、24時間後に2 mmの切片を作成しTTC 染色を行った。 (A)はB1受容体アンタゴニスト静脈内投与のTTC 染色像代表例を示す。 TTCで染色されなかった領域を梗塞巣とした。全脳 (B)、大脳皮質 (C)におけるTTC 染色の画像をScion Image を用いて解析し、梗塞体積を算出した。値は平均値±標準誤差で示す。B1受容体アンタゴニスト（des-Arg HOE140）により梗塞体積は有意に減弱していた。
  図８は、野生型ラットでの虚血後の脳機能障害に対するB1受容体アンタゴニスト静脈内投与の影響を示す。MCAO処置を行い、再灌流６、15時間後にB1受容体アンタゴニストを静脈内投与した。再灌流24時間後に脳機能障害の測定を行った。実施例１に示すスコア表に従い症状を観察した。値は平均値±標準誤差で示す。B1受容体アンタゴニスト静脈内投与により、何も投与しないnon-treatment に対して脳機能障害が改善した。
　以上のように、B1受容体アンタゴニスト（des-Arg HOE140）により梗塞体積は有意に減弱していた。また、B1受容体アンタゴニストの静脈内投与により、脳機能障害の改善が認められた。
　実施例１から３の結果から、虚血・再灌流によって生じる梗塞部位形成の抑制、及びその拡大阻止が、ブラジキニンB1受容体を遮断することによって達成され、その結果、梗塞部位形成に関わる神経症状の改善が見られることが判った。即ち、ブラジキニンB1受容体遮断作用を有する化合物を有効成分とする薬物によって、虚血・再灌流によって生じる梗塞部位形成の抑制、及びその拡大阻止が達成される。また、ブラジキニンB1受容体アンタゴニストが、野生型ラットの脳梗塞モデルにて脳梗塞抑制作用を示したので、ブラジキニンB1受容体を遮断しうる化合物を選択することにより脳梗塞治療薬のスクリーニングが可能となる。
　配列番号１－１２はＰＣＲプライマーの配列を示す。

Claims (7)

  1. ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物を有効成分とする脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬。
  2. ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物が、D-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-D-Tic-Oic で表されるペプチド (desArg-HOE140)である、請求項１記載の脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬。
  3. ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物が、N-[[4-(4,5- ジヒドロ-1H-イミダゾール-2- イル) フェニル] メチル]-2-[2-[[4- メトキシ-2,6- ジメチルフェニル) スルホニル] メチルアミノ] エトキシ]-N-メチルアセトアミドフマレートである、請求項１記載の脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬。
  4. ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物が、(2R)-2-[((3R)-3-(1,3- ベンゾジオキソール-5- イル)-3-[[(6- メトキシ-2- ナフチル) スルホニル] アミノ] プロパノイル) アミノ]-3-(4-[[2R,6S)-2,6-ジメチルピペリジニル] メチル〕フェニル)-N-イソプロピル-N- メチルプロパンアミド塩酸塩である、請求項１記載の脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬。
  5. 試験化合物のブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を判定することを含む、脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬をスクリーニングする方法。
  6. 脳梗塞改善薬または脳梗塞再発防止薬の製造のための、ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物の使用。
  7. ブラジキニンＢ１受容体拮抗作用を有する化合物を投与することを含む、脳梗塞を改善または再発防止する方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011512329A (ja) * 2008-02-06 2011-04-21 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 有効な鎮痛剤としてのアリールスルホンアミド

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUSTINAT,M. ET AL.: "Blockade of bradykinin receptor Bl but not bradykinin receptor B2 provides protection from cerebral infarction and brain edema", STROKE, vol. 40, no. 1, January 2009 (2009-01-01), pages 285 - 293 *
BASTIAN,S. ET AL.: "Identification of a key region of kinin Bl receptor for high affinity binding of peptide antagonists", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 9, 2000, pages 6107 - 6113 *
CUI,M. ET AL.: "Neuroprotective effect of bradykinin receptor antagonists in cerebral ischemia/reperfusion rats", SHENJING JIEPOUXUE ZAZHI, vol. 23, no. 1, 2007, pages 7 - 14 *
FERREIRA,J. ET AL.: "Reduced nerve injury-induced neuropathic pain in kinin Bl receptor knock-out mice", THE JOURNAL OF NEUROSCIENCE, vol. 25, no. 9, 2005, pages 2405 - 2412 *
GOUGAT,J. ET AL.: "SSR240612 [(2R)-2-[((3R)-3- (1,3-benzodioxol-5-yl)-3-[[(6-methoxy-2- naphthyl)sulfonyl]amino]propanoyl)amino]-3- (4-[[2R,6S)-2,6-dimethylpiperidinyl]methyl] phenyl)-N-isopropyl-N-methylpropanamide hydrochloride], a new nonpeptide antagonist of the bradykinin Bl receptor: biochemical and pharmacologi", THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, vol. 309, no. 2, 2004, pages 661 - 669 *
HUANG,T.J. ET AL.: "Contribution of bradykinin Bl and B2 receptors in allergen-induced bronchial hyperresponsiveness", AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE, vol. 160, no. 5, 1999, pages 1717 - 1723 *
LUMENTA,D.B. ET AL.: "Neuroprotective effects of a postischemic treatment with a bradykinin B2 receptor antagonist in a rat model of temporary focal cerebral ischemia", BRAIN RESEARCH, vol. 1069, no. 1, 2006, pages 227 - 234 *
PORRECA,F. ET AL.: "Antinociceptive pharmacology of N-[[4-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)phenyl] methyl]-2-[2-[[(4-methoxy-2,6-dimethylphenyl) sulfonyl]methylamino]ethoxy]-N-methylacetamide, fumarate (LF22-0542), a novel nonpeptidic bradykinin Bl receptor antagonist", THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, vol. 318, no. 1, 2006, pages 195 - 205 *
TANG,M. ET AL.: "Roles of bradykinin receptors in neuron damage caused by hypoxia/reoxygenation", SHENJING JIEPOUXUE ZAZHI, vol. 23, no. 5, 2007, pages 511 - 517 *
WANG,P.H. ET AL.: "Influence of bradykinin Bl and B2 receptors in the immune response triggered by renal ischemia-reperfusion injury", INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY, vol. 6, no. 13-14, 2006, pages 1960 - 1965 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011512329A (ja) * 2008-02-06 2011-04-21 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 有効な鎮痛剤としてのアリールスルホンアミド

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