TW201822813A - 腦梗塞的治療藥 - Google Patents

Abstract

本發明之目的係提供一種有效治療腦梗塞的新穎藥物。本發明係提供一種醫藥組成物，係包含肽基脯胺醯基順反異構酶B(PPIB)蛋白質、編碼PPIB蛋白質的核酸或分泌PPIB蛋白質的細胞。

Description

腦梗塞的治療藥

本發明係關於活體內包含蛋白質的腦梗塞治療藥。

腦梗塞係分類為稱為中風的腦血管疾病，於因腦血管疾病而死亡的人當中有6成(每年約7萬人)係因腦梗塞而死(非專利文獻1)。就算可幸運的脫離因腦梗塞所導致的生命危險，然而為了回歸社會，患者難免受到四胺麻痺、言語障礙、記憶障礙等深刻的後遺症所糾纏。因為腦梗塞係由腦血管中的血栓堵塞所引起，故已知血栓溶解法係最好的治療方法，惟由於長時間處於缺血狀態之神經細胞係難以再生，或因副作用的關係，可使用被使用於血栓溶解療法之藥物t-PA(阿替普酶)之患者，係於發病後4.5小時以內進行使用。因此，估計在日本醫療臨床實際上應用t-PA的患者數量係總腦梗塞患者的5至6%(非專利文獻2)，即大多數的患者係處於缺乏有效治療方法之狀態。血栓溶解療法以外的治療，推薦使用抗凝治療(非維生素K抑制口服抗凝藥：達比加群等)、腦保護療法(抗氧化藥：依達拉奉)，惟該等療法無法達到血栓溶解法的同等功 效。因此，仍需要治療腦梗塞有效的新穎藥物。

人類的肽基脯胺醯基順反異構酶B(下述亦稱為PPIB、PPIaseB、肽基脯胺醯基反異構酶B)也可稱為親環素b，並繼肽基脯胺醯基順反異構酶A(下述稱為PPIA)而作為環孢素A結合蛋白質進行轉殖(非專利文獻3及4)。已知PPIB之特徵係具有肽基脯胺醯基順反異構酶活性，且該活性係藉由環孢素A(CsA)抑制。又，PPIB係由216個胺基酸所構成的蛋白質，在某些區域與PPIA有同源性。另一方面，已知與PPIA不同之處係在PPIB的N-末端存在著富含疏水性殘基的區域，係作為內質網轉移(ER-directed)的信號序列，故PPIB有分泌至細胞外的特徵(非專利文獻3及5)。

有報導指出，PPIA及PPIB係形成HIV-1粒子之重要的蛋白質。當HIV-1組合時，PPIA及PPIB與殼體蛋白質結合並併入於病毒內。已明瞭在PPIA及PPIB之抑制劑如CsA等的存在下，PPIA及PPIB與殼體蛋白質的結合受到抑制，宿主細胞的病毒複製亦會受抑制(非專利文獻6)。

在探索乳癌培養細胞之上清液中所含有的骨髓間質性幹細胞遷移活性物質的試驗中，由於發現PPIB，且藉由抗CD147的抗體該PPIB之遷移活性受到抑制，故明瞭骨髓間質性幹細胞表面的CD147係靶受體(非專利文獻7)。

關於PPIB對於炎症的作用，有報導顯示人 類嗜中性球係藉由CD147而有遷移活性(非專利文獻8)。PPIB的配體結合位點具有與PPIA相同的中心核心區域，但其N-末端存在有PPIA所無之與糖胺聚醣(GAGs)的結合位點。雖然PPIB係藉由CD147促進CD4+CD45RO+與T細胞之細胞外基質的附著，然而PPIA並無此種活性，反而是競爭及抑制。因此，可知PPIB為炎症因子係具有與持有趨化介素般活性之PPIA不同的功能(非專利文獻9及10)。

已知PPIA促進巨噬細胞中炎性細胞因子TNF-α的產生，而另一方面已知PPIB並無此種活性，藉由PPIB預處理巨噬細胞可抑制LPS所致之TNF-α的生產亢進(非專利文獻11)。

據此，可知PPIB在其結構、酶活性、靶受體等方面具有與PPIA相同的性質，而另一方面則PPIB亦有獨特的性質，特別係PPIB可給予炎症各種獨特的影響。

又，已知PPIB係藉由上述肽基脯胺醯基順反異構酶活性作為伴護蛋白參與I型膠原蛋白的折疊，故咸認為缺乏PPIB係造成骨形成不全的原因之一(非專利文獻12及13)。

如上所述雖得知PPIB具有多種功效，惟PPIB的給藥對於患特定疾病個體之活體內的影響仍有許多未知點，且亦未知其是否可作為腦梗塞的治療藥。

[先前技術文獻] 非專利文獻

[非專利文獻1]平成27年(2015)人口動態統計(確定人數)概況、第6表、厚生勞動署

[非專利文獻2]腦神經外科、2015年12月號(Vol. 43, No. 12), pp. 1055-1070

[非專利文獻3]Price ER et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 1;88(5):1903-7.

[非專利文獻4]Spik G et al., J Biol Chem. 1991 Jun 15;266(17):10735-8.

[非專利文獻5]Hasel KW et al., Mol Cell Biol. 1991 Jul;11(7):3484-91.

[非專利文獻6]Luban J et al., Cell. 1993 Jun 18;73(6):1067-78.

[非專利文獻7]Lin SY et al., Exp Cell Res. 2008 Oct 15;314(17):3107-17.

[非專利文獻8]Yurchenko V et al., Biochem Biophys Res Commun. 2001 Nov 9;288(4):786-8.

[非專利文獻9]Allain F et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Mar 5;99(5):2714-9.

[非專利文獻10]Yurchenko V et al., J Biol Chem. 2002 Jun 21;277(25):22959-65.

[非專利文獻11]Marcant A et al., J Immunol. 2012 Aug 15;189(4):2023-32.

[非專利文獻12]Smith T et al., J Biol Chem. 1995 Aug 4;270(31):18323-8.

[非專利文獻13]Barnes AM et al., N Engl J Med. 2010 Feb 11;362(6):521-8.

本發明的目的之一係提供一種有效治療腦梗塞的新型藥物。

本發明人等對於各種體內蛋白質生理活性進行測驗，結果發現肽基脯胺醯基異構酶B(下述亦稱為PPIB)在動物模式中顯示治療腦梗塞的效果。因此，本發明之一態樣係提供一種用於治療腦梗塞之含有PPIB蛋白質的醫藥組成物。

亦即，於本發明之一態樣中係提供下列者：(1)一種用於治療腦梗塞之醫藥組成物，係包含肽基脯胺醯基異構酶B(PPIB)蛋白質或分泌PPIB蛋白質的細胞；(2)如(1)之醫藥組成物，其中，該PPIB蛋白質係：a)包含序列編號：3所示之胺基酸序列的蛋白質；b)包含在序列編號：3所示之胺基酸序列中一個或複數個胺基酸經取代、插入、刪除及/或添加而得之胺基酸序列的蛋白質；c)包含與序列編號：3所示之胺基酸序列具有80%以上之序列相同性之胺基酸序列的蛋白質；d)由在嚴苛的條件下與序列編號：4所示之核酸序列 雜交之DNA所編碼的蛋白質；e)由與序列編號：4所示之核酸序列具有70%以上序列相同性之核酸序列所編碼的蛋白質；f)包含從包含序列編號：1所示之胺基酸序列之蛋白質的同系物之胺基酸序列除去信號序列而得之胺基酸序列的蛋白質；或g)包含從包含序列編號：1所示之胺基酸序列之蛋白質的異種同源物之胺基酸序列除去信號序列而得之胺基酸序列的蛋白質，該蛋白質係與序列編號：3所示之胺基酸序列具有80%以上的序列相同性；(3)一種用於治療腦梗塞之醫藥組成物，其包含編碼PPIB蛋白質之核酸；(4)如(3)之醫藥組成物，其中，該編碼PPIB蛋白質之核酸係：i)包含序列編號：4所示之核酸序列的核酸；ii)在嚴苛的條件下與序列編號：4所示之核酸序列雜交的核酸；或iii)與序列編號：4所示之核酸序列具有70%以上序列相同性的核酸。

第1圖顯示各組小鼠體重變化之圖。數據表示平均值±標準誤差(N=8)。

第2圖顯示PPIB蛋白質對於小鼠因短暫性腦缺血引 起之腦梗塞的治療效果之圖。將小鼠右側大腦動脈阻塞60分鐘後再灌注，並於再灌注後第2天取腦，並藉由TTC染色計算腦梗塞體積。於再灌注後6及24小時(共2次)藉由靜脈內給予溶劑或測試物質。數值表示平均值±標準誤差(N=8)。** p<0.01，與溶劑組有顯著性差異(單因子變異數分析(one-way ANOVA))。

本發明之一態樣係提供一種治療腦梗塞用之醫藥組成物，係包含PPIB蛋白質、編碼PPIB蛋白質的核酸或分泌PPIB蛋白質的細胞。

人類PPIB係由總長度為216個胺基酸所構成的蛋白質(序列編號：1)。於活體內，信號序列(序列編號：1的胺基酸位置1至33)在分泌至細胞外的過程中被除去，咸認為係對應於序列編號：1之胺基酸位置34至216的胺基酸序列構成的成熟蛋白質(序列編號：3)所發揮的功能。

PPIB蛋白質可列舉包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質，但不限於此。於一實施方式中，PPIB蛋白質亦包括與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質功能上等同的蛋白質。該等蛋白質可列舉下述者：a)包含序列編號：3所示之胺基酸序列中1個或複數個、例如1個至約40個、1個至約30個、1個至約20個、1個至約10個、1個至約5個，例如1個、2個、3個、4 個或5個、或者1個至4個，例如1個、2個、3個或4個胺基酸經取代、插入、刪除及/或添加而得的胺基酸序列或由該等序列構成而與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質功能上等同的蛋白質；b)包含與序列編號：3所示之胺基酸序列具有約80%以上，例如約85%以上、約90%以上、約91%以上、約92%以上、約93%以上、約94%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上或約99%以上之序列相同性的胺基酸序列或由該等序列構成而與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質功能上等同的蛋白質；c)由在嚴苛的條件下與序列編號：4所示之核酸序列雜交之DNA所編碼的蛋白質，係與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質功能上等同的蛋白質；d)由與序列編號：4所示之核酸序列具有約70%以上，例如約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、約98%以上或約99%以上序列相同性之核酸序列所編碼的蛋白質，係與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質功能上等同的蛋白質；e)包含從包含序列編號：1所示之胺基酸序列或由該序列構成之蛋白質(人類PPIB)的同系物(即，異種同源物或同種同源物)之胺基酸序列除去信號序列而得之胺基酸序 列或由該序列構成的蛋白質，而與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質功能上等同的蛋白質；f)包含從包含序列編號：1所示之胺基酸序列或由該序列構成之蛋白質(人類PPIB)的異種同源物之胺基酸序列除去信號序列後之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質，其中，與序列編號：3所示之胺基酸序列具有約80%以上，例如約85%以上、約90%以上、約91%以上、約92%以上、約93%以上、約94%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上或約99%以上的序列相同性，且係與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質功能上等同的蛋白質。

此外，包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成的蛋白質係具有半胱胺酸殘基。因此，於一實施方式中，例如為了在生產及純化過程中使蛋白質的性質及立體結構安定化及抑制分子間雙硫鍵結合等目的，可使用其他的胺基酸取代半胱胺酸殘基。

編碼PPIB蛋白質之核酸可列舉包含序列編號：4所示之核酸序列或由該序列構成的核酸，但不限於此。於一實施方式中，編碼PPIB蛋白質之核酸亦包括與包含序列編號：4所示之核酸序列或由該序列構成的核酸功能上等同的核酸。該等核酸可列舉下述者：a)在嚴苛的條件下與序列編號：4所示之核酸序列雜交的核酸； b)與序列編號：4所示之核酸序列具有約70%以上，例如約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約97%以上、約98%以上或約99%以上之序列相同性的核酸。

可使用網際網路(例如：於歐洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute，EBI)的網站中，可使用FASTA、BLAST、PSI-BLAST及SSEARCH等同源性檢索：http：//www.ebi.ac.uk/Tools/sss/)確定鹼基序列或胺基酸序列的相同性。又，於國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology，NCBI)中，可使用BLAST進行檢索(例如：於NCBI網站中BLAST的頁面；http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；Altschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.,1990,215(3)：403-10；Altschul,S.F.& Gish,W.,Meth.Enzymol.,1996,266：460-480；Altschul,S.F.et al.,Nucleic Acids Res.,1997,25：3389-3402)。

本說明書中，「核酸」係意指由核苷酸聚合而成的分子，係包括寡核苷酸，多核苷酸等。又，亦包括單鏈或雙鏈DNA等。且除了僅由天然核甘酸形成者之外，亦包括部分包含非天然之鹼基、核苷酸、核苷者或合成核酸。一般而言核酸係DNA。

本說明書中，「嚴苛的條件」係意指，具體言之，可表示例如於6×SSC，40%甲醯胺，25℃之雜交，於1×SSC，55℃洗滌的條件。嚴苛性取決於諸如鹽濃度、甲醯胺濃度或溫度等條件，惟本領域技術人員顯然可設定 此種條件以獲得所需之嚴苛性。例如可參照：Sambrook et al.,「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(1989)等。藉由使用雜交，例如可分離編碼包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成之蛋白質以外之PPIB蛋白質同系物的DNA。

本說明書中與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成之蛋白質的「功能上等同」係意指於腦梗塞動物模式中顯示與上述蛋白質同質之藥效者，本文所述「同質」係意指於定性評價中為相同者。與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成之蛋白質功能上等同的蛋白質之實例，可列舉包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成之蛋白質為同質的藥效(例如，減輕腦梗塞病變的效果)，且於定性評價中與包含序列編號：3所示之胺基酸序列或由該序列構成之蛋白質比較時，顯示至少約10%，例如約10%以上、約20%以上、約30%以上、約40%以上、約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、約95%以上或約100%以上之藥效的蛋白質。

PPIB蛋白質或其功能上等同的蛋白質亦可為經糖鏈等生理學修飾、如螢光或放射性物質的標記或與其他蛋白質融合之各種修飾的蛋白質。又，為了在製造及純化過程中使蛋白質的性質及結構安定化及抑制分子間雙硫鍵結合等之目的，可進行半胱胺酸殘基中-SH基團的氧化(例如，轉化為磺基)、谷胱甘肽化、亞硝基化、烷化、 與馬來醯亞胺的結合等。上述任一者只要功能上等同於PPIB即可作為PPIB蛋白質使用。

獲得PPIB蛋白質的方法，並無特別限定，可列舉重組表現(哺乳動物細胞、酵母、大腸桿菌、昆蟲細胞等)、使用無細胞系的合成、從未轉染細胞的培養上清液提取、購買商業產品等方法。例如，可列舉將編碼對應於宿主之信號序列的核酸序列及具有序列編號：4之核酸序列的核酸導入宿主細胞中，並於重組表現後從培養上清液中回收之方法；將具有序列編號：4之核酸序列的核酸導入宿主細胞中，於重組表現後粉碎細胞並回收之方法；將具有序列編號：4之核酸序列的核酸作為鑄模，並在無細胞系合成等之方法。用於上述方法之細胞並無特別限定，可列舉HEK293細胞。

可從宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離所獲得之PPIB蛋白質，並將其純化為實質上純淨且均一的蛋白質。蛋白質的分離、純化可藉由使用習知蛋白質純化之分離及純化方法來進行，並無任何限制。例如，藉由適當地選擇及/或組合層析管柱、過濾器、超微過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑提取、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳方法，透析、再結晶等，即可分離及純化蛋白質。

層析法可列舉親和層析法、離子交換層析法、疏水性層析法、凝膠過濾法、反相層析法、吸附層析法等(Marshak et al.,Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。該等層析法可使用液相層析法，例如HPLC，FPLC等進行。

又，PPIB蛋白質以實質上經純化的蛋白質為佳。本說明書中，「實質上純化的」係意指PPIB蛋白質的純化度(PPIB蛋白質於總蛋白質成分中的比例)係約50%以上、約60%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、約95%以上、100%或接近100%。接近100%之上限係取決於本領域技術人員的純化技術、分析技術，例如99.999%、99.99%、99.9%、99%等。

又，只要具有上述純化度者，不論藉由任何純化方法進行純化的蛋白質皆包含於實質上純化的蛋白質中。例如，可列舉藉由上述適當地選擇及/或組合之層析管柱、過濾器、超微過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑提取、蒸餾、免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳方法、透析、再結晶等，實質上經純化的蛋白質，但不限於此。

作為本態樣之醫藥組成物有效成分的PPIB蛋白質、編碼PPIB蛋白質之核酸或分泌PPIB蛋白質之細胞的形態並無特別限定，可列舉例如PPIB蛋白質、插入編碼PPIB蛋白質之DNA的載體、導入插入有編碼PPIB蛋白質之DNA的載體的細胞等。

分泌PPIB蛋白質之細胞，舉例言之，將由編碼PPIB蛋白質的DNA與編碼分泌信號的DNA結合而 得之DNA，插入習知的表現載體或基因治療用載體所製造之載體，導入纖維母細胞(例如，正常皮膚纖維母細胞及來自該細胞的己建立細胞系)等哺乳動物細胞、昆蟲細胞、其他細胞即可製成。編碼分泌信號的DNA並無特別限定，可列舉具有序列編號：5之核酸序列的DNA。該等細胞來源的動物種類並無特別限定，較佳係使用投予載體之個體動物種類的細胞、個體自身的細胞或者來自投予載體之個體親屬的細胞。

編碼PPIB蛋白質之DNA只要能編碼PPIB蛋白質即可，可為cDNA、基因組DNA，亦可為天然DNA、人工合成的DNA。一般而言，編碼PPIB蛋白質之DNA係於插入至載體(例如，基因治療用載體)的狀態含於本態樣之醫藥組成物中。

基因治療載體並無特別限定，可列舉質體載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、仙台病毒載體、仙台病毒包膜載體、乳頭腫病毒載體等。該基因治療用載體可包含有效誘導基因表現的啟動子DNA序列、控制基因表現的因子、維持DNA穩定性用之必要的分子。

本態樣之醫藥組成物可依據常規方法配製(參照例如，Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)，並可含有醫藥上可接受的載劑及添加劑。舉例言之，例如界面活性劑、賦形劑、著色劑、調味劑、防腐劑、安定劑、緩衝 劑、懸浮劑、等張化劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、流動促進劑、矯味劑等，並無特別限定，亦可使用其他常用的載劑。具體言之，可列舉輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。

本態樣之醫藥組成物的給藥方法，可舉例口服給藥或腸胃外給藥，此種相關的給藥方法，具體言之包括注射給藥、鼻腔給藥、肺部給藥、皮膚給藥等。注射給藥之實例，可藉由例如，將本態樣之醫藥組成物以靜脈注射、肌內注射、腹腔注射、皮下注射等方法全身或局部(例如，皮下、皮內、皮膚表面、眼或眼瞼結膜、鼻黏膜、口腔內及消化道黏膜、陰道/子宮內黏膜、受損部位等)給藥。

又，可依據患者的年齡、症狀等適當選擇給藥方法。當給藥PPIB蛋白質時，例如可選擇每次約0.0000001mg至約1000mg/kg範圍的給藥劑量。或者，例如可選擇，每個患者於約0.00001至約100000mg/個體範圍的給藥劑量。當給藥插入有分泌PPIB蛋白質的細胞、編碼PPIB蛋白質的DNA之基因治療用載體時，可對損傷的組織以使PPIB蛋白質的量落入上述範圍內之方式給藥。惟本組成物並非受該等給藥量所限制者。

本說明書中使用之術語「患者」或者「個 體」可列舉人類或非人類之動物，例如人類、小鼠、大鼠、猴子、豬、狗、兔、倉鼠、天竺鼠等，但不限於此。

本說明書中使用之術語「治療」係意指例如，任何症狀的緩解、改善及/或消除、減輕及/或安定化(例如不進展到更晚期)。

本發明進一步提供下述之態樣：(1)一種腦梗塞之治療方法，包含對個體給藥PPIB蛋白質、編碼PPIB蛋白質的核酸或分泌PPIB蛋白質的細胞；(2)用於腦梗塞治療使用之PPIB蛋白質、編碼PPIB蛋白質之核酸或分泌PPIB蛋白質之細胞；(3)PPIB蛋白質、編碼PPIB蛋白質之核酸或分泌PPIB蛋白質之細胞之用途，係用於製造治療腦梗塞的藥物。

於該等態樣中，對於PPIB蛋白質、與該蛋白質功能上等同之蛋白質、編碼PPIB蛋白質之核酸、分泌PPIB蛋白質之細胞，該等之形態、製劑化、給藥方法及給藥量的說明、其他實施形態係如上所述。

本說明書中所引用之先前技術文獻係以參照全文的方式併入。若說明書與引用文獻之間有不符之處，則按照本說明書所述進行調整。

下述雖藉由實施例更具體描述本發明，惟不言而喻，本發明並非限於該等實施例。

[實施例] 實施例1：人類PPIB對於小鼠腦梗塞之效果 測驗材料 動物：

雄性7週齡C57BL/6N系小鼠(微生物級SPF)係購自日本CLEA(東京)，並在動物飼養室中適應3天或以上後以23至25g使用。動物係在設定室溫22±2℃，濕度50%±20%，照明時間12小時(上午7點至下午7點)的動物飼養室中飼養。固體飼料CE-2(東方酵母有限公司)及自來水可自由攝取，每籠飼養3隻。

藥物：

使用人類肽基脯胺醯基異構酶B(PPIB)作為測試物質。該人類PPIB係將插入有具有序列編號：2之核酸序列的DNA的載體導入HEK293細胞，並於培養該細胞後從上清液純化而獲得者。以此種方式獲得的人類PPIB係在細胞內合成作由序列編號：1之胺基酸序列構成的蛋白質後，在分泌至細胞外時，除去信號序列而成為成熟蛋白質者，因而該蛋白質係由序列編號：3之胺基酸序列構成的蛋白質。藉由N-末端的肽測序及質量分析(MALDI-TOF/TOF)證實該人類PPIB係由序列編號：3之胺基酸序列構成的蛋白質。使用生理食鹽水(大塚藥典生理食鹽水，大塚製藥)作為溶劑。將測試物質溶解於大塚蒸餾水(大塚製藥)中，使其濃度為1mg/ml，各以50μL分裝，並儲存於-30℃直至使用。在將測試物質給藥於小鼠前，將儲存的測試物質溶解，加入200μL大塚藥典生理食鹽水以稀釋至目標濃度 (0.2mg/mL)。將給藥溶液置於冰上直至給藥。

器具：

栓子係使用烙鐵使總長度為20mm之6號尼龍線(6-0，Nesco縫合尼龍線)端頭成為圓角，並使用矽樹脂(Dow Corning，RTV密封劑732)塗覆尖端7mm使其直徑成為0.21至0.23mm者。

測驗方法 短暫性腦缺血：

使用麻醉機(MK-A110D，室町機械)，在雄性C57BL/6N小鼠於異氟醚(Abbott Japan)的麻醉下(引入時3%，維持2%)，藉由中位切口將右頸動脈剝離，將線穿過頸總動脈及頸外動脈後，頸總動脈及頸外動脈的血流暫時阻斷。從頸外動脈插入栓子，切斷頸外動脈後，從頸外動脈與頸內動脈的分叉處10.5mm插入頸內動脈以閉塞大腦中動脈的起始部，並於其後關閉手術傷口。在製作腦梗塞手術中，使用加熱墊將小鼠的直腸溫度保持在36.5至37.5℃。將缺血的小鼠放回籠中並自由飼養。梗塞60分鐘後，在麻醉下拔出栓子，關閉切口。再灌注期間不調整直腸溫度。手術係於顯微鏡下進行(POM-50 II，Konan Medical)。

體重測量：

於手術前、後1及2天測量體重。

給藥：

在缺血再灌注後6及24小時，總共給藥兩次測試物質或溶劑。將給藥溶液裝入1mL注射器中，並使用27G的注射針從尾靜脈給藥流體量0.2mL。

腦梗塞區域的測定：

在缺血再灌注2天後，於麻醉下藉由切斷腹部主動脈而使小鼠放血致死並取腦。使用小鼠腦切片機(Zivic Instruments)，從大腦與小腦之間的邊界製備4片厚度為2mm的大腦橫切片段。並使用1%之2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)(Sigma)在37℃染色30分鐘。使用顯微鏡(放大率×1.5，Olympus)對腦切片進行攝影，並使用圖像分析軟體(Photoshop CS5，Adobe)分析各腦切片梗塞病變的大小，以求得左側腦面積、右側腦非障礙面積及右側腦損傷面積。腦全體面積係如下述計算：腦全體面積=左側腦面積×2。

腦梗塞的體積係從求得截頭錐體積之方式而藉由下述等式計算：[s+S+√(sS)]×h/3(其中，s：切片1的面積、S：切片2的面積、h：切片之間的距離)。

求得相鄰切片之間的三處體積並合計算出腦梗塞體積之百分比：腦梗塞體積(%)=腦梗塞體積/腦全體體積×100。

統計處理：

測量值係以平均值及標準誤差(平均值±SEM)表示。使用試算表軟體藉由單因子變異數分析對測量值進行統計分析，當p<0.05時，設為有顯著性差異。

測驗結果

將小鼠在腦缺血再灌注後分組，從分別給予溶劑或PPIB的2天後直到取腦前的期間，小鼠皆未死亡。第1圖顯示在此期間各組小鼠體重的變化。用於手術之小鼠的體重在各組之間沒有差異。手術後小鼠的體重減少，兩組的體重相較於手術前，於手術後1天減少約3g、2天後減少約5g。

在短暫性腦缺血的2天後取腦，並測定經TTC染色之腦梗塞體積，結果係示於第2圖。相對於腦全體之體積，在溶劑組中之梗塞體積為20.6%，在PPIB組中之梗塞體積為10.9%，結果顯著減少了47.2%。從上述結果可知，PPIB對於短暫性腦缺血引起的腦梗塞發揮治療效果。

[產業利用性]

血栓溶解劑t-PA係用於腦梗塞治療有效的現有藥物。然而，t-PA於腦梗塞發病後超過4.5小時、於以往有無創傷性顱內出血時、強烈懷疑胸主動脈剝離時、以及於CT、MRI存在廣泛的早期缺血性改變時皆不適用， 故t-PA的使用將受到限制。又，估計實際上在日本醫療臨床實踐中使用t-PA的患者數量係總腦梗塞患者的5至6%，即大多數的患者係處於缺乏有效治療方法之狀態。由於咸認為PPIB係藉由與t-PA不同的機制而發揮腦梗塞的治療效果，因此本申請所提供之包含PPIB的腦梗塞治療藥不僅對於不適用t-PA的患者為有效，除此之外，尚可期望藉由PPIB之單獨給藥或與t-PA併用，而對單獨使用t-PA無法獲得足夠治療效果的患者可帶來甚大的好處。

<110> 吉諾米克斯股份有限公司 國立大學法人大阪大學

<120> 腦梗塞的治療藥

<130> 575974

<150> 日本2016-220805

<151> 2016-11-11

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 216

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 651

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 183

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 552

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 人工合成的核苷酸序列

<400> 5

Claims (4)

1. 一種用於治療腦梗塞之醫藥組成物，包含肽基脯胺醯基異構酶B(PPIB)蛋白質或分泌PPIB蛋白質的細胞。
2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中，該PPIB蛋白質係：a)包含序列編號：3所示之胺基酸序列的蛋白質；b)包含序列編號：3所示之胺基酸序列中一個或複數個胺基酸經取代、插入、刪除及/或添加而得之胺基酸序列的蛋白質；c)包含與序列編號：3所示之胺基酸序列具有80%以上之序列相同性之胺基酸序列的蛋白質；d)由在嚴苛的條件下與序列編號：4所示之核酸序列雜交之DNA所編碼的蛋白質；e)由與序列編號：4所示之核酸序列具有70%以上序列相同性之核酸序列所編碼的蛋白質；f)包含從包含序列編號：1所示之胺基酸序列之蛋白質的同系物之胺基酸序列除去信號序列之胺基酸序列而得的蛋白質；或g)包含從包含序列編號：1所示之胺基酸序列之蛋白質的異種同源物之胺基酸序列除去信號序列而得之胺基酸序列的蛋白質，該蛋白質係與序列編號：3所示之胺基酸序列具有80%以上的序列相同性。
3. 一種用於治療腦梗塞之醫藥組成物，包含編碼PPIB蛋白質之核酸。
4. 如申請專利範圍第3項所述之醫藥組成物，其中，該編碼PPIB蛋白質之核酸係：i)包含序列編號：4所示之核酸序列的核酸；ii)在嚴苛的條件下與序列編號：4所示之核酸序列雜交的核酸；或iii)與序列編號：4所示之核酸序列具有70%以上序列相同性的核酸。