CN111868231A - 外胚层间充质干细胞及其产生方法 - Google Patents

外胚层间充质干细胞及其产生方法 Download PDF

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Abstract

本发明人发现由坏死组织损伤诱导的外周血中循环的外胚层间充质干细胞有助于损伤组织的再生。基于该发现，提供了外胚层间充质干细胞、其产生方法以及具有多能干细胞诱导活性的物质的筛选方法，所述筛选方法使用外周血中的由坏死组织损伤诱导的细胞作为指标。

Description

外胚层间充质干细胞及其产生方法
技术领域
本发明涉及外胚层间充质干细胞及其产生方法。本发明还涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法。
背景技术
骨髓液等中含有的间充质干细胞(MSC)具有分化为各种组织(诸如骨、软骨、脂肪、肌肉、神经和上皮)的效力(多谱系分化效力)。因此，近年来，使用MSC提供再生医学(细胞移植疗法)的尝试已经变得广泛。然而，已知的是，先前在再生医学中使用的MSC当它们在体外连续传代时逐渐丢失其增殖能力和多谱系分化效力。因此，需要找到具有比普通MSC更高的促进组织再生的能力的细胞或具有体内活化/诱导细胞的作用的物质，并提供比常规再生医学更有效的治疗方法。
引文列表
专利文献
专利文献1：WO 2012/147470
非专利文献
非专利文献1：PNAS 2011 Apr 19; 108(16): 6609-14。
发明概述
技术问题
本发明的一个目标是提供外胚层间充质干细胞及其产生方法。本发明的另一个目标是提供用于筛选多能干细胞诱导剂的方法。
问题的解决方案
本发明人已经发现，由坏死组织损伤诱导并在外周血中循环的外胚层间充质干细胞(EMSC)有助于损伤组织的再生。该发现基于本发明人先前报道的以下机制的发现(PNAS2011 Apr 19; 108(16):6609-14)，其中“从大疱性表皮松解中剥落的表皮中的坏死组织释放的HMGB1引起骨髓间充质干细胞经由外周血循环积聚在剥落的表皮部位，以诱导受损皮肤的再生”，并且进一步基于这次获得的结果，即“当将大疱性表皮松解小鼠的皮肤移植在异种共生模型的一侧并将HMGB1的片段肽移植在另一侧时，PDGFRα谱系-阳性细胞积聚在皮肤移植部位以再生表皮”和“当在小鼠中产生软骨损伤并且施用HMGB1的片段肽时，P0谱系-阳性细胞经由外周血循环积聚在软骨损伤部位，以再生软骨组织”等。本发明人还获得了实验结果，表明外周血中的EMSC的来源可能是骨髓中的某种PDGFRα-阳性细胞，并且外周血中的EMSC可能是其胚胎起源是从颅神经折叠的表皮侧生成的外胚层间充质的细胞。基于此类发现，本发明人已经使用由坏死组织损伤诱导的外周血中的细胞作为指标完成了外胚层间充质干细胞的发明、其产生方法以及用于筛选具有多能干细胞诱导活性的物质的方法。
本发明人先前已经发现，由HMGB1蛋白的A-盒的N-末端的位置1-44的氨基酸序列(MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKK)组成的肽(下文中被称为“HA1-44肽”)将多能干细胞诸如间充质干细胞(MSC)从骨髓动员至外周血中，以在各种疾病模型中发挥治疗作用。这次，本发明人已经新发现，HA1-44肽的施用引起生物体中的反应((i)外周血中的PDGFRα-阳性细胞群的构型变化，(ii)外周血中的PDGFRα-阳性细胞数增加，以及(iii)椎骨骨髓中的PDGFRα-阳性细胞的基因表达变化)。然后，本发明人已经发现了使用这些反应作为指标来筛选与HA1-44肽具有类似活性的物质、即多能干细胞诱导剂的方法，并且完成了本发明。即，本发明提供了基于与以上(i)至(iii)中任一项相同的反应是否通过将测试物质施用于受试者诸如动物发生而确定测试物质是否具有与HA1-44肽相似的活性(促进多能干细胞的诱导和/或动员和/或促进组织再生的活性)的方法。
本发明人还已经分析了由HA1-44肽动员至外周血和受损组织中并有助于组织的再生的细胞的细节。作为结果，本发明人已经发现(i)通过HA1-44肽有助于促进组织再生的外周血中的细胞是源自椎骨骨髓的PDGFRα-阳性细胞，(ii)与源自其他骨骼的骨髓的PDGFRα-阳性细胞相比，源自椎骨骨髓的PDGFRα-阳性细胞具有更大的分化为骨、软骨和/或脂肪的效力，并且(iii)少量具有与源自椎骨骨髓的PDGFRα-阳性细胞相同的发育谱系(Prx1谱系-阴性)的PDGFRα-阳性细胞也存在于来自其他骨骼的骨髓中。基于这些发现，本发明人已经发现，通过在皿上培养源自含有MSC的生物组织、诸如骨髓或外周血的细胞群以形成集落，亚克隆各集落，和选择表现出向骨、软骨和/或脂肪的高分化效力的细胞克隆，可以获得比通过常规方法(其收集骨髓并在皿上培养)获得的MSC具有更高的促进组织再生的能力的多能干细胞，并且已经完成了本发明。
具体地，本发明涉及以下内容：
A)外胚层间充质干细胞。
B)用于产生外胚层间充质干细胞的方法。
C)通过根据项目B)所述的方法获得的细胞。
D)由MSC血液中动员物质诱导的外周血中的细胞或细胞群。
E)椎骨骨髓中的细胞或细胞群，其通过由高迁移率族盒1 (HMGB1)蛋白的A-框的N-末端的位置1-44的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)组成的肽(下文也称为“HA1-44肽”)诱导。
F)用于产生根据项目D)或E)所述的细胞或细胞群的方法。
G)用于从含有间充质干细胞(MSC)的生物组织获得、分离和/或富集具有与椎骨骨髓中的PDGFRα-阳性细胞类似的高组织再生促进能力的细胞的方法。
H)通过根据项目G)所述的方法获得的细胞或细胞群。
I)用于促进组织再生的组合物，其含有外胚层间充质干细胞。
J)用于筛选具有多能干细胞的诱导活性的物质的方法，其使用由坏死组织损伤诱导的外周血中的细胞作为指标。
K)用于筛选具有多能干细胞的诱导活性的物质的方法，其使用HA1-44肽作为阳性对照和有助于体内组织再生的多能干细胞的反应作为指标。
L)用于确定已经向其施用MSC血液中动员物质的受试者中预期的组织再生促进作用的方法，其使用外周血中的集落形成Pα细胞作为指标。
更具体地，本发明涉及以下内容。
a)集落形成PDGFR-阳性细胞，其具有以下特征i)和特征ii)和/或iii)：
i)具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力；
ii)具有分化为表皮细胞的效力；
iii)是P0谱系-阳性的。
b)根据项目a)所述的细胞，其中所述细胞是PDGFRα-阳性的。
c)根据项目a)或b)所述的细胞，其中所述细胞具有选自以下的一种或多种特征：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
d)椎骨骨髓来源的细胞，其为PDGFRα-阳性、CD34-阳性和Sca1-阴性的。
e)用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血；
2)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，在固相上培养所述外周血，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
3)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，和从所述外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
4)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，从所述外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-，和在固相上培养所述细胞。
f)用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)在固相上培养从具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血；
2)在固相上培养从具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
3)从由具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
4)从由具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-，和在固相上培养所述细胞。
g)用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)从受试者收集椎骨骨髓，和在固相上培养所述椎骨骨髓；
2)从受试者收集椎骨骨髓，在固相上培养所述椎骨骨髓，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
3)从受试者收集椎骨骨髓，和从所述椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
4)从受试者收集椎骨骨髓，从所述椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-，和在固相上培养所述细胞。
h)用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)在固相上培养从受试者收集的椎骨骨髓；
2)在固相上培养从受试者收集的椎骨骨髓，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
3)从由受试者收集的椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
4)从由受试者收集的椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-，和在固相上培养所述细胞。
i)通过如下获得的细胞群：将MSC血液中动员物质施用于受试者，从所述受试者收集外周血，和在固相上培养收集的外周血。
j)根据项目i)所述的细胞群，其中所述MSC血液中动员物质是HA1-44肽。
k)用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：将MSC血液中动员物质施用于受试者，从所述受试者收集外周血，和在固相上培养收集的外周血。
l)用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：在固相上培养从已经向其施用MSC血液中动员物质的受试者收集的外周血。
m)根据项目k)或1)所述的方法，其中所述MSC血液中动员物质是HA1-44肽。
n)通过如下获得的细胞群：1)将HA1-44肽施用于受试者，2)从所述受试者收集椎骨骨髓，和3)在固相上培养收集的骨髓或从收集的骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
o)用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：1)将HA1-44肽施用于受试者，2)从所述受试者收集椎骨骨髓，和3)在固相上培养收集的骨髓或从收集的骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
p)用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：在固相上培养从已经向其施用HA1-44肽的受试者收集的椎骨骨髓，或从收集的骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
q)用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养来自含有MSC的生物组织的细胞群；
2)亚克隆步骤1)中获得的集落；
3)在诱导分化为骨、软骨和/或脂肪的培养基中培养通过亚克隆获得的细胞中的一部分，和测量骨、软骨和/或脂肪的分化标志物的表达水平；和
4)选择细胞克隆，所述细胞克隆显示与在以下情况下骨、软骨和/或脂肪的分化标志物的表达水平相比的高表达水平：在诱导分化为骨、软骨和/或脂肪的培养基中培养通过在固相上培养股骨骨髓获得的MSC。
r)用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养源自含有MSC的生物组织的细胞群；和
2)选择具有选自以下的一种或多种特征的集落：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
s)根据项目r)所述的方法，其中步骤2)是选择Prx1谱系-阴性集落的步骤。
t)用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：从源自含有MSC的生物组织的细胞群选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
u)用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)从源自含有MSC的生物组织的细胞群选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
2)在固相上培养在步骤1)中回收的细胞。
v)通过根据权利要求*至*所述的方法获得的细胞或细胞群。
w)用于促进组织再生的组合物，其包含集落形成PDGFR-阳性细胞，所述集落形成PDGFR-阳性细胞具有以下特征i)和特征ii)和/或iii)：
i)具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力；
ii)具有分化为表皮细胞的效力；
iii)是P0谱系-阳性的。
x)根据权利要求*所述的组合物，其用于促进源自中胚层或外胚层的组织的再生。
y)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和计数所述外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
2)从已经向其施用测试物质的受试者收集外周血，和计数所述外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
3)当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
z)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)计数从受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
2)计数从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
3)当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
aa)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽(HA1-44肽)施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)将测试物质施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
6)基于集落或单细胞，对步骤5中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
7)合并步骤2和4中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；
8)合并步骤2和6中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；和
9)将步骤7的分析结果与步骤8的分析结果进行比较，和当步骤5中获得的细胞群(测试物质施用组)具有与步骤3中获得的细胞群(HA1-44肽施用组)相同的聚类构型时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
ab)根据项目aa)所述的方法，其中在步骤3中施用所述测试物质替代HA1-44肽，且在步骤5中施用所述HA1-44肽替代所述测试物质。
ac)根据项目aa)或ab)所述的方法，其中所述详尽的基因表达分析是RNA测序(RNA-seq)。
ad)根据项目aa)至ac)中任一项所述的方法，其中使用迭代聚类和引导基因选择(ICGS)算法来进行聚类分析。
ae)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养从受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)在固相上培养从已经向其施用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽(HA1-44肽)的受试者收集的外周血，以获得粘附细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)在固相上培养从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
6)基于集落或单细胞，对步骤5)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
7)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；
8)合并步骤2)和6)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；和
9)将步骤7)的分析结果与步骤8)的分析结果进行比较，和当步骤5)中获得的细胞群具有与步骤3)中获得的细胞群相同的聚类构型时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
af)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
2)计数步骤1)中获得的集落数；
3)将测试物质施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
4)计数步骤3)中获得的集落数；和
5)当步骤4)中计数的集落数大于步骤2)中计数的集落数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
ag)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养从受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
2)计数步骤1)中获得的集落数；
3)在固相上培养从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
4)计数步骤3)中获得的集落数；和
5)当步骤4)中计数的集落数大于步骤2)中计数的集落数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
ah)根据项目ae)或af)所述的筛选方法，其中步骤2)和4)中计数的集落是具有选自以下的一种或多种特征的集落：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
ai)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者的椎骨收集骨髓，和通过在固相上培养或细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)将测试物质施用于受试者，从椎骨收集骨髓，和通过在固相上培养或细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)合并步骤2和4中获得的基因表达数据，和进行途径分析；和
6)当作为步骤5的分析的结果，与步骤1中获得的细胞群(未处理组)相比，步骤3中获得的细胞群(测试物质施用组)中的(i)与EIF2信号传导、eIF4和p70S6K信号传导的调节和/或mTOR信号传导相关的途径被活化或(ii)细胞死亡相关基因的表达被抑制时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
aj)用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)通过在固相上培养由受试者的椎骨收集的骨髓或从由受试者的椎骨收集的骨髓进行细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)通过在固相上培养由已经向其施用测试物质的受试者的椎骨收集的骨髓或从由已经向其施用测试物质的受试者的椎骨收集的骨髓进行细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行途径分析；和
6)当作为步骤5)的分析的结果，与步骤1)中获得的细胞群相比，步骤3)中获得的细胞群中的(i)与EIF2信号传导、eIF4和p70S6K信号传导的调节和/或mTOR信号传导相关的途径被活化或(ii)细胞死亡相关基因的表达被抑制时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
ak)根据项目ai)或aj)所述的方法，其中所述详尽的基因表达分析是RNA测序(RNA-seq)。
al)用于确定MSC血液中动员物质的组织再生促进作用的方法，其包括以下步骤：
1)在施用MSC血液中动员物质之前，计数从受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
2)在施用MSC血液中动员物质之后，计数从所述受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-，
其中当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，表明在受试者中促进组织再生。
本发明的有利效果
根据本发明，可以提供外胚层间充质干细胞及其产生方法。此外，可以提供用于筛选多能干细胞诱导剂的方法。
附图简述
[图1]图1是绘制皮肤瓣产生的小鼠和皮肤瓣未产生的小鼠各自的外周血中的Pα细胞数量和HMGB1浓度的图。
[图2]图2是通过培养小鼠的外周血获得的集落的照片，以及显示每mL外周血转化的CFU活性的图。
[图3]图3是显示从小鼠外周血获得的iCFPα细胞诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和表达角蛋白-5的细胞的结果的照片。通过ALP染色检测成骨细胞，通过油红-O染色检测脂肪细胞，通过甲苯胺蓝染色检测软骨细胞，且通过报告蛋白tdTomato的荧光检测表达角蛋白-5的细胞。
[图4]图4是显示对iCFPα细胞进行单细胞转录组分析并基于获得的数据进行聚类分析的结果的图。左侧显示的细胞类型是基于基因表达概况(诸如特定基因集合的高表达)预测的细胞类型。
[图5]图5是显示基于集落对iCFPα细胞进行转录组分析并进行聚类分析的结果的图。左侧显示的细胞类型是基于基因表达概况(诸如特定基因集合的高表达)预测的细胞类型。在图中，一列对应于一个集落。
[图6]图6是通过培养Pα-H2B-GFP小鼠的外周血而获得的集落形成细胞的照片。
[图7]图7是显示检查iCFPα细胞的Pα谱系、P0谱系、Prx1谱系、Sox1谱系和LepR谱系的阴性/阳性率的结果的图。
[图8]图8是显示皮肤瓣产生的小鼠和皮肤瓣未产生的小鼠各自的通过Prx1谱系评价的从外周血获得的集落形成细胞的CFU活性的结果的图。
[图9]图9是显示检测Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠的股骨、椎骨、胸骨、髂骨、髋关节(股骨头和腰椎盖(lumbar lid))和头骨的骨髓组织中存在的细胞的Pα表达和Prx1谱系的结果的照片。
[图10]图10是显示对Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠的股骨、椎骨、胸骨和髂骨的骨髓细胞的FACS分析的结果的图。
[图11]图11是显示检查源自椎骨骨髓的CFPα细胞的P0谱系、Prx1谱系、Sox1谱系和LepR谱系的结果的图。
[图12]图12是显示检查源自股骨骨髓的CFPα细胞的P0谱系、Prx1谱系、Sox1谱系和LepR谱系的结果的图。
[图13]图13显示椎骨和股骨骨髓来源的CFPα细胞的(a)集落的照片、(b)集落数和(c)生长曲线。(c)的横轴指示代数(P0 = 原代培养物)。
[图14]图14是显示在诱导分化为脂肪细胞的条件下培养椎骨和股骨骨髓来源的CFPα细胞和检查脂肪细胞的分化标志物的表达的结果的图。
[图15]图15是显示在诱导分化为成骨细胞的条件下培养椎骨和股骨骨髓来源的CFPα细胞和检查成骨细胞的分化标志物的表达的结果的图。
[图16]图16是(a)显示在诱导分化为软骨细胞的条件下培养椎骨和股骨骨髓来源的CFPα细胞和检查软骨细胞的分化标志物的表达的结果的图，和显示(b)形成的软骨小球(chondropellet)的照片以及(c)软骨小球的重量的图。
[图17]图17是通过在诱导分化为角质形成细胞的条件下培养椎骨骨髓来源的CFPα细胞而获得的表达K5的细胞的照片。
[图18]图18是通过在诱导分化为角质形成细胞的条件下培养股骨骨髓来源的CFPα细胞而获得的表达K5的细胞的照片。
[图19]图19是显示对椎骨和股骨骨髓中的Pα细胞进行单细胞转录组分析并基于获得的数据进行聚类分析的结果的图。
[图20]图20是显示使用Sca1和CD34表达作为指标用FACS将椎骨骨髓中的Pα细胞分离为四个群体并对该四个群体进行CFU测定的结果的图。
[图21]图21是显示使外周血中的iCFPα细胞与椎骨和股骨Pα细胞进行聚类分析的结果的图。
[图22]图22是显示骨髓中的S34-MSC聚类的细胞中的Procr的表达的图。
[图23]图23是显示Pα-H2B-GFP小鼠的颈椎、胸椎、腰椎和股骨的骨髓中存在的Sca1+CD34+细胞的量(作为相对于PDGFRα+CD45-活细胞的百分比)的图。
[图24]图24是(a)通过培养外周血获得的集落形成细胞的照片，以及(b)显示每mL外周血转化的细胞的CFU活性的图。
[图25]图25是(a)显示异种共生模型的示意图的图，和(b)显示在施用HA1-44肽后移植的皮肤组织的观察结果的照片。用YFP荧光检测Pα细胞，并用抗体检测7型胶原蛋白。
[图26]图26是(a)显示异种共生模型的示意图的图，(b)显示在施用HA1-44肽后移植的皮肤组织的观察结果的照片，以及(c)显示移植的皮肤组织中的PDGFRα+细胞的百分比的图。通过GFP的荧光检测PDGFRα表达，并通过报告蛋白tdTomato的荧光检测Prx1谱系。
[图27]图27是(a)显示异种共生模型的示意图的图，和(b)显示对照组(盐水施用)和HA1-44肽施用组中的膝软骨损伤部位的组织观察结果的照片。用报告蛋白tdTomato的荧光检测P0lin+的细胞。
[图28]图28是显示在膝软骨缺损产生后2、4、8和12周对照组(盐水施用)和HA1-44肽施用组中膝软骨损伤部位的组织观察结果(番红精O染色)的照片。箭头指示其中观察到透明质软骨的再生的部分。
[图29]图29是显示基于集落对通过培养小鼠的外周血而获得的细胞进行转录组分析并进行聚类分析的结果的图。左侧显示的细胞类型是基于基因表达概况(诸如特定基因集合的高表达)预测的细胞类型。一列对应于一个集落。在对应于HA1-44肽施用组中的小鼠来源的集落的列下展示正方形。
[图30]图30是简化源自小鼠外周血的集落的聚类分析结果的表。
[图31]图31是显示基于HA1-44肽施用组和盐水施用组中的小鼠的椎骨Pα细胞的转录组分析数据进行的途径分析的结果的图。
[图32]图32是显示基于HA1-44肽施用组和盐水施用组中的小鼠的椎骨Pα细胞的转录组分析数据进行的途径分析(功能分析)的结果的图。
[图33]图33是显示在施用HA1-44肽前、施用HA1-44肽后8小时和24小时收集的人外周血单核细胞级分中的CD45阴性、TER-119-阴性和PDGFRβ-阳性细胞的百分比的图。
实施方案的描述
如本文所用，根据上下文，“细胞”意指一个细胞或多个细胞。例如，本申请中的细胞可以是由一种类型的细胞组成的细胞群或含有多种类型的细胞的细胞群。例如，表述“具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力的细胞”不仅包括其中一个细胞/一种类型的细胞(或源自该细胞的同质细胞群)具有分化为这三种细胞类型的效力的情况，而且包括其中含有多个细胞的细胞群作为整个细胞群发挥分化为三种细胞类型的效力的情况。
在本申请中，外胚层间充质干细胞(EMSC)意指具有集落形成能力和分化为三个间充质谱系(成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞)并被认为是外胚层来源的细胞的PDGFR-阳性细胞。当例如所述细胞是P0lin+时，表明所述细胞是外胚层来源的细胞。在一个方面，EMSC还具有分化为表皮细胞(特别是K5-阳性角质形成细胞)的效力。EMSC可以分化为的表皮细胞的实例包括，但不限于，角质形成细胞，表达角蛋白5(K5)的细胞(K5-阳性细胞)和表达K5的角质形成细胞(K5-阳性角质形成细胞)。例如，可以通过当在诱导分化为角质形成细胞的条件下培养细胞时所述细胞是否可以分化为表达K5的细胞，来确定所述细胞是否具有分化为K5-阳性角质形成细胞的效力。
表征EMSC的标志物(包括细胞谱系标志物)的实例包括Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
EMSC的实例包括：
(a)其在外周血中的存在量响应于坏死组织损伤(诸如皮肤瓣)增加的集落形成Pα细胞，换句话说，坏死损伤诱导的集落形成Pα细胞(在下文中，所述细胞也被称为“iCFPα细胞”)；和
(b)椎骨骨髓中含有的集落形成Pα细胞(在下文中，所述细胞也被称为“椎骨CFPα细胞”或“椎骨来源的CFPα细胞”)。
iCFPα细胞具有i)集落形成能力和ii)分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力。因此，可以说iCFPα细胞具有间充质干细胞的特性。此外，iCFPα细胞具有分化为表皮细胞(K5-阳性角质形成细胞)的效力，并且是P0lin+。因此，可以说iCFPα细胞是外胚层间充质干细胞。
表征iCFPα细胞的标志物的实例包括Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
椎骨来源的CFPα细胞具有i)集落形成能力和ii)分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力。因此，可以说椎骨来源的CFPα细胞具有间充质干细胞的特性。此外，椎骨来源的CFPα细胞具有分化为表皮细胞(K5-阳性角质形成细胞)的效力，并且是P0lin+。因此，可以说椎骨来源的CFPα细胞是外胚层间充质干细胞。
表征椎骨来源的CFPα细胞的标志物的实例包括Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-。另外，椎骨来源的CFPα细胞包括LepRlin+细胞和LepRlin-细胞。这些中，LepRlin-细胞被认为在外周血中表现出更接近于iCFPα细胞的特性。
作为EMSC的一个方面，本申请提供了集落形成PDGFR-阳性细胞，其具有以下特征i)和特征ii)和/或iii)：
i)具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力；
ii)具有分化为表皮细胞的效力；
iii)是P0谱系-阳性的。
在一个实施方案中，所述集落形成PDGFR-阳性细胞是PDGFRα-阳性细胞。在另一个实施方案中，所述集落形成PDGFR-阳性细胞是具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
集落形成PDGFR-阳性细胞的另外特征的实例包括以下：
- 是Pα+；
- 是CD34+；
- 是Sca1-；
- 是CD34+和Sca1-；
- 是CD34+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是CD34+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是P0lin+和Prx1lin-；
- 是P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
- 是P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-；
- 是P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pαlin+、P0lin+和Prx1lin-；
- 是Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
- 是Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-；
- 是Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和CD34+；
- 是Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和Sca1-；
- 是Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
- 是Pα+和CD34+；
- 是Pα+和Sca1-；
- 是Pα+、CD34+和Sca1-；
- 是Pα+和CD34+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+、CD34+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+、P0lin+和Prx1lin-；
- 是Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
- 是Pα+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+、Pαlin+、P0lin+和Prx1lin-；
- 是Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
- 是Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-；
- 是Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和CD34+；
- 是Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和Sca1-；
- 是Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
在一个实施方案中，本发明涉及椎骨骨髓来源的细胞，其为PDGFRα-阳性、CD34-阳性和Sca1-阴性的。由于标志物共有性，推测所述细胞为与外周血中的iCFPα细胞等效的细胞。因此，预期椎骨骨髓来源的细胞表现出与iCFPα细胞的特性类似的特性。椎骨骨髓来源的细胞可以例如通过如下获得：从受试者收集椎骨骨髓和选择性回收Pα+、CD34+和Sca1-的细胞。
本申请还提供了骨髓来源的Pα+CD34+Sca1+细胞。此外，本申请提供了用于产生细胞的方法，其包括从骨髓选择性回收Pα+、CD34+和Sca1+的细胞的步骤。
可用作Pα+CD34+Sca1+细胞的来源的骨髓的实例包括椎骨(颈椎、胸椎或腰椎)和股骨的骨髓。在一个方面，可用作Pα+CD34+Sca1+细胞的来源的骨髓是椎骨的骨髓。在另一个方面，可用作Pα+CD34+Sca1+细胞的来源的骨髓是颈椎的骨髓。
本发明人也已经发现，在其胚胎起源是外胚层间充质的骨的骨髓中也存在许多Pα+CD34+Sca1+细胞。因此，本申请提供了源自其胚胎起源是外胚层间充质的骨的骨髓的Pα+CD34+Sca1+细胞。本申请还提供了用于产生细胞的方法，其包括从其胚胎起源是外胚层间充质的骨的骨髓选择性回收Pα+、CD34+和Sca1+的细胞的步骤。其胚胎起源是外胚层间充质的骨的实例包括额头骨、鼻骨、颧骨、上颌骨、上颚骨和下颌骨。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血；
2)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
3)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，和从所述外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
4)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，从所述外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-，和在固相上培养所述细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)在固相上培养从具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血；
2)在固相上培养从具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
3)从由具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
4)从由具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-，和在固相上培养所述细胞。
坏死组织损伤的实例包括，但不限于，皮肤瓣，和大疱表皮松解中的表皮剥落。在皮肤瓣中，向该瓣的尖端部分的血液供应不足，导致缺血状态，导致细胞/组织的坏死。在大疱表皮松解中，坏死发生在剥落的表皮组织中。
当在固相上培养外周血时，可以在培养前从外周血除去红血细胞。红血细胞的除去可以通过使用本领域技术人员已知的溶血试剂的方法、用羟乙基淀粉处理外周血和回收含有核细胞的上清液的方法等来实施。
在用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法的步骤2)、3)或4)中待选择性回收的细胞的实例包括以下：
- 细胞，其为Pα+
- 细胞，其为CD34+
- 细胞，其为Sca1-
- 细胞，其为CD34+和Sca1-
- 细胞，其为CD34+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为CD34+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和CD34+
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和Sca1-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-
- 细胞，其为Pα+和CD34+
- 细胞，其为Pα+和Sca1-
- 细胞，其为Pα+、CD34+和Sca1-
- 细胞，其为Pα+和CD34+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、CD34+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和CD34+
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和Sca1-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
在本文中，用于“选择性回收”细胞的方法的实例包括以下：
(1)用于用细胞分选仪等“分选”表达期望的标志物分子的细胞的方法；
(2) 目视或基于基因表达分析的结果“回收”、“选择”、“分开”、“分离”或“富集”表达期望的标志物分子的细胞/集落的方法。
标志物分子的实例包括表面标志物(细胞表面抗原)和谱系标志物基因的报告蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)从受试者收集椎骨骨髓，和在固相上培养所述椎骨骨髓；
2)从受试者收集椎骨骨髓，在固相上培养所述椎骨骨髓，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-;
3)从受试者收集椎骨骨髓，和从所述椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
4)从受试者收集椎骨骨髓，从所述椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-，和在固相上培养所述细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)在固相上培养从受试者收集的椎骨骨髓；
2)在固相上培养从受试者收集的椎骨骨髓，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
3)从由受试者收集的椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-；
4)从由受试者收集的椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-，和在固相上培养所述细胞。
在一个实施方案中，在用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法的步骤2)、3)或4)中，可以选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-。
在用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法的步骤2)、3)或4)中待选择性回收的细胞的实例包括以下：
- 细胞，其为P0lin+
- 细胞，其为Prx1lin-
- 细胞，其为Sox1lin-
- 细胞，其为P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为P0lin+和Sox1lin-
- 细胞，其为Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+和P0lin+
- 细胞，其为Pα+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pα+和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+和LepRlin-
- 细胞，其为Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-。
可用作集落形成PDGFR-阳性细胞的来源的椎骨包括颈椎、胸椎和腰椎。在一个方面，用作集落形成PDGFR-阳性细胞的来源的椎骨是颈椎。
另外，本发明人在迄今为止进行的实验中已经证实，通过在固相上培养椎骨骨髓而获得的集落都是PDGFR-阳性的。
如本文所用，从受试者收集的“骨髓”意指含有各种骨髓细胞的骨髓组织。
在一个方面，本发明涉及用于筛选具有多能干细胞的诱导活性的物质的方法，其使用由坏死组织损伤诱导的外周血中的细胞作为指标。
本发明人已经发现，外周血中的iCFPα细胞通过坏死组织损伤(例如，皮肤瓣)而增加，并且外周血中的Pα+P0lin+Prx1lin-细胞(即，含有iCFPα细胞的细胞群)通过施用HA1-44肽而增加。因此，使用外周血中的iCFPα细胞的增加作为指标，可以筛选具有增加外周血中的多能干细胞(例如，MSC)的存在量的作用的物质，所述多能干细胞(例如，MSC)具有增殖能力(集落形成能力)和多谱系分化效力(在下文中，该物质也被称为多能干细胞动员物质或多能干细胞诱导剂)。
在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和计数所述外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
2)从已经向其施用测试物质的受试者收集外周血，和计数所述外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
3)当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)计数从受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；
2)计数从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
3)当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
对于上述筛选方法中待计数的细胞的特征，可以使用抗体等检测表面标志物(Pα、CD34、Sca1)。或者，当使用其中在表面标志物基因的启动子的下游并入报告基因的实验动物时，可以检测报告基因的产物(诸如荧光蛋白)作为指标。可以通过使用具有允许目标基因的谱系追踪的DNA结构/构建体(诸如Cre-loxP系统)的转基因动物来检测谱系标志物(Pα、P0、Prx1、Sox1、LepR)。
上述筛选方法的步骤1)和2)中待计数的细胞的实例包括以下：
- 细胞，其为Pα+
- 细胞，其为CD34+
- 细胞，其为Sca1-
- 细胞，其为CD34+和Sca1-
- 细胞，其为CD34+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为CD34+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和CD34+
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和Sca1-
- 细胞，其为Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-
- 细胞，其为Pα+和CD34+
- 细胞，其为Pα+和Sca1-
- 细胞，其为Pα+、CD34+和Sca1-
- 细胞，其为Pα+和CD34+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、CD34+和Sca1-，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+，且具有选自以下的一种或多种特征：Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+和Prx1lin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-和LepRlin-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和CD34+
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-和Sca1-
- 细胞，其为Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
在一个方面，本发明涉及用于筛选具有多能干细胞的诱导活性的物质的方法，其使用HA1-44肽作为阳性对照，且使用有助于体内组织再生的多能干细胞的反应作为指标。
在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽(HA1-44肽)施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)将测试物质施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
6)基于集落或单细胞，对步骤5中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
7)合并步骤2和4中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；
8)合并步骤2和6中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；和
9)将步骤7的分析结果与步骤8的分析结果进行比较，和当步骤5中获得的细胞群(测试物质施用组)具有与步骤3中获得的细胞群(HA1-44肽施用组)相同的聚类构型时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
在其他实施方案中，在步骤3中施用所述测试物质替代HA1-44肽，且在步骤5中施用所述HA1-44肽替代所述测试物质。也就是说，可以首先将HA1-44肽或测试物质施用于受试者。步骤1、3和5中的受试者可以是同一个体或另一个体。例如，所述方法可以通过如下进行：准备三只相同品系的动物，和不向一只施用任何物质(或仅施用溶剂)，将HA1-44肽施用于另一只，和将测试物质施用于剩余的一只，且然后从每个个体收集外周血以获得粘附细胞群，和进行详尽的基因表达分析和聚类分析。步骤1中的受试者可以是仅已经向其施用溶剂的受试者，所述溶剂与步骤3和5中分别施用HA1-44肽和测试物质中使用的溶剂相同。
在另一个实施方案中，使用HA1-44肽或标记的HA1-44肽的变体或修饰物来替代HA1-44肽。所述变体具有这样的氨基酸序列，其中在所述HA1-44肽的氨基酸序列中取代、插入、缺失和/或添加几个，例如1至5个，优选1至4个，1至3个，更优选1至2个，甚至更优选1个氨基酸。例如，所述变体是具有这样的氨基酸序列的肽，当进行局部比对时，所述氨基酸序列与所述HA1-44肽的氨基酸序列具有50%或更高，优选60%或更高，进一步优选70%或更高，更优选80%或更高，更优选85%或更高，且特别优选90%或更高(例如，91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%)同源性。氨基酸序列的同源性可以例如使用FASTA、BLAST、DNASIS (由Hitachi Software Engineering Co., Ltd.制造)或GENETYX (由GENETYX CORPORATION制造)测量。或者，可以简单地比较和计算序列。修饰物具有这样的氨基酸序列，其中所述HA1-44肽的氨基酸序列中的几个，例如，1至5个，优选1至4个，1至3个，进一步优选1至2个，更优选1个氨基酸的氨基酸残基被修饰。当使用标记的HA1-44肽时，标签的实例包括但不限于His6-标签、FLAG标签、myc标签和GST标签。可以将标签添加至所述氨基酸序列的N-末端或C-末端。
在筛选方法中，所述详尽的基因表达分析可以是RNA测序(RNA-seq)。在筛选方法中，可以使用迭代聚类和引导基因选择(ICGS)算法来进行聚类分析。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养从受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)在固相上培养从已经向其施用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽(HA1-44肽)的受试者收集的外周血，以获得粘附细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)在固相上培养从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
6)基于集落或单细胞，对步骤5)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
7)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；
8)合并步骤2)和6)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；和
9)将步骤7)的分析结果与步骤8)的分析结果进行比较，和当步骤5)中获得的细胞群具有与步骤3)中获得的细胞群相同的聚类构型时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
2)计数步骤1)中获得的集落数；
3)将测试物质施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
4)计数步骤3)中获得的集落数；和
5)当步骤4)中计数的集落数大于步骤2)中计数的集落数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
步骤1)中的受试者可以是仅已经向其施用溶剂的受试者，所述溶剂与步骤3)中施用测试物质中使用的溶剂相同。
步骤2)和4)中计数的集落可以是具有选自以下的一种或多种特征的集落：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养从受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
2)计数步骤1)中获得的集落数；
3)在固相上培养从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
4)计数步骤3)中获得的集落数；和
5)当步骤4)中计数的集落数大于步骤2)中计数的集落数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
步骤1)中的受试者可以是仅已经向其施用溶剂的受试者，所述溶剂与步骤3)中施用测试物质中使用的溶剂相同。
步骤2)和4)中计数的集落可以是具有选自以下的一种或多种特征的集落：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者的椎骨收集骨髓，和通过在固相上培养或细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)将测试物质施用于受试者，从椎骨收集骨髓，和通过在固相上培养或细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)合并步骤2和4中获得的基因表达数据，和进行途径分析；和
6)当作为步骤5的分析的结果，与步骤1中获得的细胞群(未处理组)相比，步骤3中获得的细胞群(测试物质施用组)中的(i)与EIF2信号传导、eIF4和p70S6K信号传导的调节和/或mTOR信号传导相关的途径被活化或(ii)细胞死亡相关基因的表达被抑制时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
步骤1中的受试者可以是仅已经向其施用溶剂的受试者，所述溶剂与步骤3中施用测试物质中使用的溶剂相同。
在筛选方法中，所述详尽的基因表达分析可以是RNA测序(RNA-seq)。在筛选方法中，可以使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件(https://www.qiagenbioinformatics.com)进行途径分析。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)通过在固相上培养由受试者的椎骨收集的骨髓或从由受试者的椎骨收集的骨髓进行细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)通过在固相上培养由已经向其施用测试物质的受试者的椎骨收集的骨髓或从由已经向其施用测试物质的受试者的椎骨收集的骨髓进行细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行途径分析；和
6)当作为步骤5)的分析的结果，与步骤1)中获得的细胞群相比，步骤3)中获得的细胞群中的(i)与EIF2信号传导、eIF4和p70S6K信号传导的调节和/或mTOR信号传导相关的途径被活化或(ii)细胞死亡相关基因的表达被抑制时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
在筛选方法中，所述详尽的基因表达分析可以是RNA测序(RNA-seq)。在筛选方法中，可以使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件(https://www.qiagenbioinformatics.com)进行途径分析。
在其他方面，本发明涉及由MSC血液中动员物质诱导的外周血中的细胞或细胞群。本发明还涉及由HA1-44肽诱导的椎骨骨髓中的细胞或细胞群。
如本文所用，“MSC血液中动员物质”意指具有将间充质干细胞(MSC)动员至外周血中或增加外周血中存在的MSC的量的活性的物质。MSC血液中动员物质的实例包括，但不限于，HMGB1蛋白，HMGB2蛋白，和HMGB3蛋白(例如，WO 2008/053892和WO 2009/133939中描述的那些)，S100A8蛋白和S100A9蛋白(例如，WO 2009/133940和WO 2011/052668中描述的那些)和本发明人在国际申请WO 2012/147470中描述的各种HMGB1肽(例如，由HMGB1蛋白的氨基酸残基1-44组成的肽(本申请中的HA1-44肽))。
在一个实施方案中，本发明涉及通过如下获得的细胞群：将MSC血液中动员物质施用于受试者，从所述受试者收集外周血，和在固相上培养收集的外周血。在一个实施方案中，所述MSC血液中动员物质可以是HA1-44肽。
在其他实施方案中，本发明涉及通过如下获得的细胞群：1)将HA1-44肽施用于受试者，2)从所述受试者收集椎骨骨髓，和3)在固相上培养收集的骨髓或从收集的骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
在另一个方面，本发明涉及用于产生上述细胞或细胞群的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：将MSC血液中动员物质施用于受试者，从所述受试者收集外周血，和在固相上培养收集的外周血。在其他实施方案中，本发明涉及用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：在固相上培养从已经向其施用MSC血液中动员物质的受试者收集的外周血。在这些产生方法的一个实施方案中，所述MSC血液中动员物质可以是HA1-44肽。
在其他实施方案中，本发明涉及用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：1)将HA1-44肽施用于受试者，2)从所述受试者收集椎骨骨髓，和3)在固相上培养收集的骨髓或从收集的骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
在又另一个方面，本发明涉及用于从含有间充质干细胞(MSC)的生物组织获得、分离和/或富集具有与椎骨骨髓中的PDGFRα-阳性细胞类似的高组织再生促进能力的细胞的方法。在又另一个方面，本发明涉及通过上述用于获得、分离和/或富集的方法获得的细胞或细胞群。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养来自含有间充质干细胞(MSC)的生物组织的细胞群；
2)亚克隆步骤1)中获得的集落；
3)在诱导分化为骨、软骨和/或脂肪的培养基中培养通过亚克隆获得的细胞中的一部分，和测量骨、软骨和/或脂肪的分化标志物的表达水平；和
4)选择细胞克隆，所述细胞克隆显示与在以下情况下骨、软骨和/或脂肪的分化标志物的表达水平相比的高表达水平：在诱导分化为骨、软骨和/或脂肪的培养基中培养通过在固相上培养股骨骨髓获得的MSC。
在其他实施方案中，本发明涉及用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养源自含有MSC的生物组织的细胞群；和
2)选择具有选自以下的一种或多种特征的集落：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。在一个实施方案中，步骤2可以是选择Prx1谱系-阴性集落的步骤。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：从源自含有MSC的生物组织的细胞群选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-。
在其他实施方案中，本发明涉及用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)从源自含有MSC的生物组织的细胞群选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
2)在固相上培养在步骤1)中回收的细胞。
在本申请的用于产生细胞群的方法中，含有MSC的生物组织包括，但不限于，骨髓、脐带、脐带血、胎盘、脂肪组织、牙索、骨膜、滑膜、卵巢膜和外周血。骨髓的实例包括，但不限于，股骨、椎骨、胸骨、髂骨和头骨的骨髓。
在又另一个方面，本发明涉及用于促进组织再生的组合物，其含有外胚层间充质干细胞。在一个实施方案中，本发明涉及用于促进组织再生的组合物，其含有具有以下特征i)和特征ii)和/或iii)的集落形成PDGFR-阳性细胞：
i)具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力；
ii)具有分化为表皮细胞的效力；
iii)是P0谱系-阳性的。
在一个实施方案中，所述组合物是用于促进源自中胚层或外胚层的组织的再生的组合物。源自中胚层的组织的实例包括，但不限于，骨、软骨、肌肉和血管内皮。源自外胚层的组织的实例包括，但不限于，上皮组织(例如，表皮)和神经组织。
本发明的用于促进组织再生的组合物可以含有药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。在本发明的用于促进组织再生的组合物中，含有的外胚层间充质干细胞的量、组合物的剂型、施用频率等可以根据条件诸如待再生的组织的类型和/或待施用的受试者的病况而适当地选择。
在又另一个方面，本发明涉及用于促进受试者中的组织再生的方法，其包括施用外胚层间充质干细胞。在一个实施方案中，本发明涉及用于促进受试者中的组织再生的方法，其包括向所述受试者施用具有以下特征i)和特征ii)和/或iii)的集落形成PDGFR-阳性细胞：
i)具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力；
ii)具有分化为表皮细胞的效力；
iii)是P0谱系-阳性的。
可以根据条件诸如具有再生促进的组织的类型和/或待施用的受试者的病况来适当地选择用于施用于细胞的方法。用于施用细胞的方法的实例包括，但不限于，皮内施用、皮下施用、肌肉内施用、静脉内施用、经鼻施用、经口施用和栓剂。
在又另一个方面，本发明涉及用于在受试者中促进组织再生的外胚层间充质干细胞。
在又另一个方面，本发明涉及外胚层间充质干细胞用于制备用于促进受试者中的组织再生的药物的用途。
据信，在其中生成坏死组织损伤的情况下，外周血中的iCFPα细胞可以是用于评价EMSC-介导的组织再生活性的有益生物标志物。因此，本申请提供了用于确定已经向其施用MSC血液中动员物质的受试者中预期的组织再生促进作用的方法，其使用外周血中的iCFPα细胞作为指标。
在一个实施方案中，本发明涉及用于确定MSC血液中动员物质的组织再生促进作用的方法，其包括以下步骤：
1)在施用MSC血液中动员物质之前，计数从受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-；和
2)在施用MSC血液中动员物质之后，计数从所述受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+和Sca1-，
其中当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，表明在受试者中促进组织再生。
在本申请中，“受试者”可以是人或非人动物。在一个方面，所述受试者是非人动物。所述非人动物的实例包括，但不限于，小鼠、大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠、豚鼠、马和绵羊。
关于由本申请提供的用于产生细胞(或细胞群)的方法、用于筛选的方法和用于确定MSC血液中动员物质的组织再生促进作用的方法，从受试者收集外周血的时机没有特别限制。当人工产生坏死组织损伤或施用MSC血液中动员物质时，可以包括其中例如在产生坏死组织损伤或施用MSC血液中动员物质后2至24小时收集外周血的方法。在一个方面，从受试者收集外周血的时机可以是在产生坏死组织损伤或施用MSC血液中动员物质后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在另一个方面，从受试者收集外周血的时机可以是在产生坏死组织损伤或施用MSC血液中动员物质后4至24小时、8至24小时、8至16小时或10至14小时。
在本文提供的细胞、用于产生细胞(或细胞群)的方法、包含所述细胞的组合物和筛选方法的一个方面，所述PDGFR-阳性细胞是PDGFRα-阳性细胞。
应当注意的是，本文引用的所有现有技术文献都通过引用并入本文。本申请还要求基于2017年12月1日向美国专利商标局提交的美国临时专利申请号62/593310(其内容通过引用并入本文)的优先权。
在下文中，将进一步详细地描述本发明。注意，下面将进一步详细地描述本发明，但本发明不限于以下描述的方面。
实施例
材料和方法
1. 小鼠
能够用GFP荧光证实PDGFRα表达的Pα-H2B-GFP小鼠(The Jackson Laboratory，库存号：007669)和利用Cre-loxP系统的各种细胞谱系追踪小鼠用于实验。利用Cre-loxP系统的细胞谱系追踪小鼠可以通过将Cre驱动小鼠与Cre报告子小鼠杂交而制成。Cre驱动子小鼠是具有DNA结构的转基因小鼠，在所述DNA结构中，在期望基因的启动子序列的下游引入Cre重组酶的编码序列。Cre报告子小鼠是这样的转基因小鼠，其中在基因座诸如ROSA26处引入具有结构“启动子(诸如CAG启动子)-loxP-终止盒-loxP-期望的报告基因(在本申请的实施例中的EYFP或tdTomato)”的DNA序列。
在本文的实施例中，将以下小鼠制备为Cre驱动子小鼠。
- Pα-Cre小鼠(The Jackson Laboratory，库存号：013148)
- P0-Cre小鼠(The Jackson Laboratory，库存号：017927)
- Prx1-Cre小鼠(The Jackson Laboratory，库存号：005584)
- Sox1-Cre小鼠(RIKEN BioResource Research Center，登录号CDB0525K)
- LepR-Cre小鼠(The Jackson Laboratory，库存号：008320)
- Krt5-Cre小鼠(MGI ID：1926815，Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jul 8;94(14):7400-5中描述的K5 Cre转基因小鼠)
将以下小鼠制备为Cre报告子小鼠。
- Rosa26-EYFP小鼠(The Jackson Laboratory，库存号：006148)
- Rosa26-tdTomato小鼠(The Jackson Laboratory，库存号：007909)
通过将六只描述的驱动子小鼠各自与Rosa26-tdTomato报告子小鼠杂交，生成以下细胞谱系追踪小鼠。
- Pα-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠
- P0-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠
- Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠
- Sox1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠
- LepR-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠
- Krt5-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠
此外，还通过将Pα-Cre驱动子小鼠与Rosa26-EYFP报告子小鼠杂交来生成Pα-Cre::Rosa26-EYFP小鼠。
Pα-H2B-GFP小鼠是这样的小鼠，其中在PDGFRα基因的启动子的下游已敲除编码组蛋白H2B和eGFP的融合蛋白的序列。将Pα-H2B-GFP小鼠与Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠杂交以产生Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠。
2. 皮肤瓣的产生
在本申请的实施例中，产生皮肤瓣作为引起坏死组织损伤的方法。具体地，用于产生皮肤瓣的方法如下。
在1.5-2.0% (v/v)异氟烷吸入麻醉下，将8-10周龄的雄性小鼠(20-25 g)在背部剃毛。用剃刀产生跨背部中央的2.0 cm宽 x 4.0 cm长的皮肤瓣，使得仅在尾侧维持皮肤连续性(这导致远离瓣根的尖端部分的缺血状态，导致引起对皮肤组织的坏死损伤)。用足够大小的绷带保护皮肤瓣产生后的患处。在各自的皮肤瓣产生后12小时，进行心脏血液收集、椎骨和股骨骨髓细胞的分离以及椎骨和股骨的冷冻切片的产生。
3. 异种共生的产生
参考Kamran P等人J Vis Exp.2013 Oct 6;(80)，使用6周龄雄性野生型小鼠和6周龄雄性细胞谱系追踪小鼠产生异种共生模型。两只小鼠同时进行用异氟烷的全身麻醉诱导，并置于热垫上。将两只小鼠彼此相对的体侧表面剃毛，并且从肘关节至膝关节移取近似5mm宽的皮肤。用5-0 VICRYL连续缝合背部皮肤。用3-0 VICRYL缝合各自彼此相对的肘关节和膝关节。还用5-0 VICRYL连续缝合腹部皮肤。将小鼠放在热垫上，直到从麻醉中苏醒。为了避免限制活动，每个笼子饲养最多一对，并提供零散的食物。
4. 组织染色和观察
在收集椎骨和股骨后，用4%多聚甲醛固定，用0.5 M EDTA溶液脱灰，并用30%蔗糖溶液置换，然后使用用于Kawamoto方法的冷冻包埋剂Super Cryoembedding Medium (SCEM)(Leica)产生冷冻块。将该块用10 μm的厚度的Cryofilm 2C(9)型(Leica)切片，并用每种抗体进行免疫染色(在4℃下用一抗过夜，并且在4℃下用二抗1小时)。共聚焦显微镜用于组织观察。
5. 外周血、椎骨和股骨中的细胞的采集和培养
使用以下方法从外周血回收细胞。在全身麻醉下从心脏收集近似800至1000 µL的外周血(使用含有肝素的1 mL注射器)。为了除去红血细胞，添加收集的血液等量的Hetasep(STEMCELL Technologies, Inc., 目录号ST-07906)，将混合物以100 G离心2分钟，并在室温下孵育15分钟，然后回收上清液。将上清液作为含有外周血中的核细胞的样品进行下一实验。
使用以下方法从骨髓回收细胞。将在全身麻醉下收集的椎骨和股骨浸入0.2%胶原酶A溶液(Sigma-Aldrich Corp., 目录号10103578001)中，并在37℃下孵育1小时。将骨髓细胞挤出于乳钵中，通过移液回收并通过40 μm细胞过滤器。将上清液以300 G离心5分钟用于除去，并用RBC裂解缓冲液(BioLegend, Inc., 目录号420301)进行溶血以除去红血细胞，然后将所得物作为骨髓细胞进行以下实验。
6. 外周血的集落测定
将通过上述程序获得的上清液(含有外周血中的有核细胞的样品)接种于用胶原蛋白I包被的6-孔板(Corning Incorporated, 目录号356400)中，并在37℃、5% CO2、5% O2的条件下使用培养基中培养10天，所述培养基在扩增试剂盒中含有1% L-谷氨酰胺(NACALAITESQUE, INC.)、10 μM ROCK抑制剂(Y27632, Tocris Bioscience)和1%青霉素/链霉素(NACALAI TESQUE, INC.)，所述扩增培养基根据试剂盒的手册使用MesenCult扩增试剂盒(STEMCELL Technologies, Inc., 目录号ST-05513)进行(所述所有浓度均为最终浓度)。在培养时段期间，培养基每周两次用新鲜培养基替换。在培养的第10天，将板上的细胞用Differential Quik Stain Kit (Sysmex Corporation, 目录号16920)染色，并计数含有不少于50个细胞的集落数。
7. 诱导分化为成骨细胞/脂肪细胞/软骨细胞
将第3-5代的活细胞以50,000个细胞/孔接种在12-孔板中，并用10% FBS/DMEM培养，直至亚汇合。随后，使用含有100 nM地塞米松(Sigma-Aldrich Corp.)、0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤(Sigma-Aldrich Corp.)、50 mM茚甲新(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)和10 µg/ml胰岛素(Sigma-Aldrich Corp.)的10% FBS/DMEM进行脂肪分化诱导14天，用于分化为脂肪细胞。
使用包含1 nM地塞米松、20 mM β-甘油磷酸酯(Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.)和50 μg/ml抗坏血酸-2-磷酸酯(Sigma-Aldrich Corp.)的10% FBS/DMEM进行成骨细胞分化诱导21天，用于分化为成骨细胞。每次分化诱导后，用4% PFA进行固定，然后将脂肪细胞用油红-O染色，并将成骨细胞用ALP活性测定试剂盒(TAKARA BIOInc., Kusatsu, Japan)进行ALP染色，并用显微镜观察。
在软骨分化诱导中，首先将300,000个细胞在15 ml试管中以300 g离心5分钟。使用含有40 ng/ml脯氨酸(Sigma-Aldrich Corp.)、50 μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯，x100 ITS混合物(BD Biosciences)、2 μg/ml氟轻松(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo,Japan)、5 ng/ml转化生长因子-b3 (R&D Systems, Minneapolis, MN)和100 nM地塞米松(Sigma-Aldrich Corp.)的10% FBS/DMEM进行软骨分化诱导21天。将完全的软骨小球石蜡包埋，以6 μm的厚度薄切，并用甲苯胺蓝染色。
8. 诱导分化为角质形成细胞
- 动物
饲养Krt5-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠，直到它们为8-10周龄，并用于实验。
- 材料的收集
在收集材料的前一天在小鼠的背部产生皮肤瓣，并且在产生后12小时，在麻醉下通过心脏血液收集来收集外周血。还以相同的方式从其中没有产生皮肤瓣的小鼠收集外周血。在血液收集后收集股骨和椎骨。
-细胞调理
用HetaSep从外周血除去红血细胞，并将对应于一只小鼠的血液的一部分接种至用胶原蛋白I包被的6-孔板的一个孔中，并在5%O2、5%CO2和37℃的条件下培养。使用的培养基是MesenCult或20% FBS/MEMα(两者均含有Rock抑制剂和1%青霉素-链霉素)。
在切出两个骨头末端后，将收集的股骨分为纵向两半。将收集的椎骨分为纵向两半。然后将两者均用0.2%胶原酶A/DMEM (10 mM HEPES, 1%青霉素-链霉素)处理(37℃水浴，持续1小时)。在胶原酶A处理后，将骨髓细胞回收在乳钵中，用40 um细胞过滤器分散成单细胞，用1 x RBC裂解液溶血，然后接种，并在5%O2、5%CO2和37℃的条件下培养。使用的培养基是MesenCult或20% FBS/MEMα(两者均含有Rock抑制剂和1%青霉素-链霉素)。
- 诱导分化
在证实集落形成后，将含有1 uM视黄酸(Sigma-Aldrich Corp.)和25 ng/mL BMP4 (R&D Systems)的培养基添加至孔中，并在5%CO2、37℃下培养，以诱导分化为角质形成细胞。使用多合一显微镜(KEYENCE CORPORATION)来观察Tomato-阳性/阴性细胞。
9. 转录组分析(细胞群的RNA-seq)
从细胞群提取RNA，并根据Smart-seq2方案产生RNA-seq文库(Nature Protocols 9,171-181 (2014) doi: 10.1038/nprot.2014.006)。使用nextseq高输出试剂盒(37 bp对末端读数)，用Nextseq 500 (Illumina, Inc.)对获得的文库进行测序。使用Illumina, Inc.的bcl2fastq v2.17.1.14(具有默认参数)和任选的 –无泳道分隔(no-lane-splitting)，进行碱基调用至fastq格式的转化和多重化。使用TrimGalore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)修剪读数，并使用RSEM (Li等人, BMCBioinformatics 12, 323 (2011); 版本STAR-2.5.2b)进行作图和计数(定量)。使用DESeq2 (Love等人, Genome Biol. 15, 550 (2014))进行样品间的差异表达分析。将差异表达基因(DEG)上传至Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件(https://www.qiagenbioinformatics.com)，以提取与DEG最相关的生物学途径和功能。使用AltAnalyze_v.2.1.0-Py的ICGS算法，基于用RSEM (log2(TPM + 1))获得的1-加TPM(每千碱基转录物)计数的log2转换值，进行聚类分析。
10. 转录组分析(单细胞RNA-seq)
制备单细胞悬浮液，并用自动化细胞计数器TC20 (BioRad)评估细胞活力。根据制造商的方案，使用ddSEQ Single-Cell Isolator和SureCell WTA 3' Library制备试剂盒产生单细胞RNA-seq文库。使用Nextseq高输出试剂盒(读取1：68 bp，读取2：75bp)，用Nextseq500 (Illumina, Inc.)对获得的文库进行测序。使用Illumina, Inc.的bcl2fastqv2.17.1.14(具有默认参数)和任选的 –无泳道分隔(no-lane-splitting)，进行碱基调用至fastq格式的转化和多重化。用编辑距离(ED) < 2校正细胞条形码区域中可能发生的任何合成和测序错误。使用Drop-Seq Tools v1.12 (STAR版本：STAR-2.5.2b)分析读数(通过作图和定量)以生成数字表达矩阵。所得的矩阵用voom (limma 3.32.10)进行标准化。使用AltAnalyze_v.2.1.0-Py(具有默认设置)基于标准化的矩阵进行用ICGS算法的聚类分析。基于标准化的矩阵，还进行用tSNE算法(使用Rtsne)的尺寸压缩，和使用hclust (方法 =ward.D2)的聚类分析，并将结果用ggplot2或plot.ly作图。DESingle用于差异表达分析。
11. FACS分析
用荧光标记的针对各种表面分子的抗体，对从椎骨和股骨收集的骨髓细胞进行FACS分析。使用BD FACS Aria III系统进行一系列处理，包括荧光检测、分选等，并且用FlowJo软件Ver.6.3.3 (Tree Star, Ashland, OR)进行获得的数据的分析。
12. 异种共生和软骨缺损模型
使用上述3中所述的方法，使用6周龄雄性野生型小鼠和6周龄雄性P0-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠产生异种共生模型。在手术后4周完成血液嵌合体后，使用0.5 mm-直径手工打磨钻(由MEISINGER USA, L.L.C.制造)在野生型小鼠的膝关节中产生0.5 x 0.5 x 0.5mm软骨缺损。产生软骨缺损后不久，从尾静脉施用用100 µL盐水稀释的100 µg HA1-44肽，且随后每周两次以相同剂量施用，直至手术后4周。对于对照组，按照与HA1-44肽施用组中相同的时间表从尾静脉向每只小鼠施用100 μL盐水。在膝软骨缺损产生后12周收集膝关节，然后进行用4%多聚甲醛固定(过夜)，用0.5 M EDTA溶液脱灰(3天)和30%蔗糖置换(1天)以产生冷冻块。将其使用低温恒温器以10 µm的厚度切片，并通过共聚焦显微镜分析Tomato-阳性细胞的分布。也使用8周龄雄性野生型小鼠以与上述相同的方式在膝关节中产生软骨缺损，并以与上述相同的剂量和时间表施用HA1-44肽，然后在膝软骨缺损产生后2、4、8和12周收集膝关节，以用番红精O染色组织切片。
缩写
标志物的缩写(XX、YY是期望的基因/蛋白名称)
XX+：XX-阳性
XX-：XX-阴性
YYlin+：YY谱系-阳性
YYlin-：YY谱系-阴性
PDGFR：血小板衍生的生长因子受体
Pα：血小板衍生的生长因子受体α(PDGFRα)
Pα细胞：PDGFRα-阳性细胞
MSC：间充质干细胞
EMSC：外胚层间充质干细胞
CFPα细胞：集落形成Pα细胞
iCFPα细胞：坏死损伤诱导的集落形成Pα细胞
CFU：集落形成单位
LepR：瘦素受体。
实施例1
实施例1
外周血中的iCFPα细胞的特性
在Pα-H2B-GFP小鼠的背部上产生皮肤瓣，并且在12小时后，收集外周血，并检查外周血中含有的Pα细胞的数目。作为结果，与其中没有产生皮肤瓣的对照组相比，皮肤瓣组中的Pα细胞显著增加。Pα细胞的增加与外周血中的HMGB1浓度增加相关(图1)。还通过培养Pα-H2B-GFP小鼠的外周血进行集落测定。作为结果，皮肤瓣组具有比对照组显著更多的集落(所有Pα-阳性细胞)，显示更高的CFU活性(图2)。此类结果表明坏死组织损伤引起外周血中的集落形成Pα细胞的增加。
此外，通过培养其中产生皮肤瓣的小鼠的外周血而获得的集落形成Pα细胞(即iCFPα细胞)表现出分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力，并且进一步表现出在诱导分化为角质形成细胞的条件下分化为表达角蛋白5(Krt5、K5)的细胞的效力(图3)。
对皮肤瓣产生后源自外周血的CFPα细胞(iCFPα细胞)进行单细胞转录组分析。作为结果，大多数细胞显示对应于包括MSC的细胞类型的基因组的高表达(图4)。还包括表达表皮细胞特征性的基因(诸如Krt8和Krt18)的细胞。此外，在对照和皮肤瓣组中对源自外周血的CFPα细胞进行基于集落的转录组分析，并进行用ICGS算法的聚类分析。作为结果，在其中皮肤瓣产生后CFPα细胞占大多数的聚类中，包括骨髓干细胞和MSC的细胞类型特征性的基因组的表达高。特别地，HoxA2基因的表达特征性地高(图5)。
实施例2
实施例2
外周血中的iCFPα细胞的表面标志物
在对照组和皮肤瓣组两者中，通过培养外周血获得的所有集落都是Pα-阳性(图6)。此外，皮肤瓣组中的外周血CFPα细胞(iCFPα细胞)的单细胞转录组分析导致CD34-阳性和Sca1-阴性。
实施例3
实施例3
外周血中的iCFPα细胞的细胞谱系标志物
使用利用Cre-loxP系统的转基因小鼠，将皮肤瓣产生的小鼠的外周血来源的CFPα细胞(iCFPα细胞)针对Pα谱系、P0谱系、Prx1谱系、Sox1谱系和LepR谱系进行谱系追踪。作为结果，所有iCFPα细胞都是Pα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Sox1谱系-阴性和LepR谱系-阴性(图7)。对于Prx1-谱系，93%的iCFPα细胞为阴性(图7)。
尽管甚至在正常状态下，血液中仍存在少量的Prx1谱系-阳性和阴性集落形成细胞，但只有皮肤瓣增加Prx1谱系-阴性细胞(图8)。因此，可以将iCFPα细胞定义为Prx1谱系-阴性。
据信外周血中的iCFPα细胞源自外胚层，因为它们是P0lin+和Prx1lin-。此外，考虑到它们是Sox1lin-并且HoxA2基因被高表达，表明它们是其胚胎起源是颅神经折叠的细胞。
实施例4
实施例4
外胚层来源的间充质细胞的探索
在检查从Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠收集的股骨、椎骨、胸骨、髂骨、髋关节(股骨头和腰椎盖(lumbar lid))和头骨的骨髓组织后，Pα+和Prx1lin-细胞特别存在于椎骨中(在本研究的范围内)(图9和10)。
实施例5
实施例5
椎骨和股骨中的CFPα细胞的谱系标志物
对于通过培养椎骨和股骨骨髓获得的CFPα细胞，使用细胞谱系追踪小鼠检查P0谱系、Prx1谱系、Sox1谱系和LepR谱系。作为结果，椎骨中的CFPα细胞是P0lin+、Prx1lin-和Sox1lin-，并且它们中的约60%是LepRlin阴性的(图11)。股骨中的CFPα细胞是P0lin+、Prx1lin+和Sox1lin-，并且它们中的约80%是LepRlin阳性的(图12)。此类结果表明，椎骨中存在外周血中的iCFPα细胞(Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-)的来源。
实施例6
实施例6
椎骨和股骨中的CFPα细胞的特性
在通过培养椎骨骨髓获得的CFPα细胞和通过培养股骨骨髓获得的那些之间比较集落形成能力和分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力。作为结果，椎骨CFPα细胞显示集落形成能力和分化效力两者中的较高能力(图13至16)。此外，用全反式维甲酸(all-transletinoic acid, ATRA)和BMP-4进行椎骨和股骨的CFPα细胞的分化诱导。作为结果，观察到表达角蛋白5的集落(图17和18)，证实椎骨和股骨中的CFPα细胞包括具有分化为K5-阳性细胞的效力的细胞。
实施例7
实施例7
椎骨和股骨中的Pα细胞的转录组分析
从椎骨和股骨骨髓细胞分选Pα细胞，并进行单细胞转录组分析。作为聚类分析的结果，骨髓中的Pα细胞被分为六个聚类(图19)。基于每个聚类的细胞特异性表达的基因，六个聚类被定义为(1) S34-MSC (表达Sca1和CD34)，(2)骨祖细胞(表达骨调蛋白和Wnt16)，(3)成骨细胞(表达osterix和骨钙蛋白)，(4)骨细胞(表达PHEX和DMP1)，(5) CAR细胞(表达CXCL12和LepR)和(6)表达CD45的细胞。在椎骨和股骨之间比较，可以看到椎骨具有更多的S34-MSC聚类细胞和更少的CAR聚类细胞，而股骨具有更多的CAR聚类细胞和更少的S34-MSC聚类细胞。
此外，在S34-MSC聚类中包括Sca1+CD34+、Sca1+CD34-和Sca1-CD34+的细胞。然后使用Sca1和CD34表达作为指标，通过FACS分离椎骨的Pα细胞，并进行CFU测定。作为结果，CFU活性以Sca1+CD34+细胞> Sca1+CD34-细胞和Sca1-CD34+细胞> Sca1-CD34-细胞的顺序变高(图20)。
实施例8
实施例8
外周血中的Pα细胞和椎骨的Pα细胞的对应关系
基于外周血中的iCFPα细胞的转录组分析数据，用椎骨和股骨的Pα细胞进行聚类分析。作为结果，外周血中的iCFPα细胞位于S34-MSC聚类附近(图21)。此外，外周血iCFPα细胞是CD34+Sca1-。结合谱系标志物考虑该结果，表明外周血iCFPα细胞对应于椎骨的S34-MSC聚类中包括的CD34+Sca1-细胞。
实施例9
实施例9
骨髓中的Sca1+CD34+细胞
骨髓S34-MSC聚类中含有的Sca1+CD34+细胞特异性表达Procr(图22)。因此，Procr可以是Sca1+CD34+细胞的标志物，所述Sca1+CD34+细胞被认为是骨髓Pα细胞中增殖最高、最有层次的细胞。此外，颈椎、胸椎、腰椎和股骨中存在的Sca1+CD34+细胞的量的检查显示，该量以宫颈椎骨>胸椎>腰椎>股骨的顺序变高(图23)。
实施例10
实施例10
HMGB1施用诱导的血液中的循环细胞对组织再生的贡献
本发明人先前已经将由HMGB1蛋白的N-末端的位置1-44的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)组成的肽(HA1-44肽)鉴定为具有将骨髓来源的Pα-阳性间充质干细胞动员至外周血中的活性的结构域。现在，本发明人已经获得关于通过施用HA1-44肽诱导的外周血中的细胞的以下实验结果。
(1)培养施用HA1-44肽的谱系追踪小鼠的外周血导致比对照组(盐水施用)中的外周血更多的集落。所有集落都是Pα-阳性，并且其中大多数是Prx1谱系-阴性(图24)。
(2)产生Pα-Cre::Rosa26-EYFP小鼠和野生型(WT)小鼠的异种共生模型，并将大疱表皮松解小鼠的皮肤移植至野生型小鼠中，然后将HA1-44肽施用于Pα-Cre::Rosa26-EYFP小鼠。作为结果，在皮肤移植物中的再生上皮组织中证实表达7型胶原蛋白的Pαlin+细胞的存在(图25)。
(3)产生Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠和野生型小鼠的异种共生模型，并将野生型新生小鼠的皮肤移植至野生型小鼠的背部上，然后将HA1-44肽施用于Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠。作为结果，证实在皮肤移植物中Pα+和Prx1lin-细胞的存在(图26)。
(4)产生P0-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠和野生型小鼠的异种共生模型，并对野生型小鼠的膝关节造成软骨损伤，然后将HA1-44肽施用于P0-Cre::Rosa26-tdTomato小鼠。作为结果，在HA1-44肽施用组中在软骨损伤部位证实P0lin+细胞的积累，而在对照组(盐水施用)中未看到P0lin+细胞的积累(图27)。此外，单独对不是异种共生模型的野生型小鼠的膝关节造成软骨损伤，然后施用HA1-44肽或盐水。作为结果，在HA1-44肽施用组中在软骨损伤部位处再生透明质软骨，而在盐水施用组中在软骨损伤部位处仅看到纤维软骨(图28)。
从以上结果相信，由HA1-44肽诱导的外周血中的Pα细胞(Pα+P0lin+Prx1lin-细胞)与由坏死组织损伤诱导的iCFPα细胞相同，或至少包括iCFPα细胞，其用于修复组织诸如表皮和软骨的损伤。
实施例11
实施例11
HMGB1施用诱导的细胞中的变化
(1)从用HA1-44肽施用的小鼠和从用盐水施用的小鼠收集外周血，并将其在塑料板上培养以获得粘附细胞的集落。基于集落对细胞进行转录组分析，并且基于获得的数据用ICGS算法进行聚类。获得的结果显示于图29中。另外，图30是聚类的结果的简化表示。在本申请的筛选方法中，具有与HA1-44肽相似的结果的物质，例如，具有这样的结果的物质，可以作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物进行评估，在所述结果中，形成特征在于类似于图30的预测的细胞类型(或对应于预测的细胞类型的基因集合的表达)的聚类，并且属于每个聚类的集落数是“聚类1：盐水组 ≌ 测试物质组，聚类2：盐水组<测试物质组，聚类3：盐水组>测试物质组，聚类4：盐水组>测试物质组”。
(2)对从用HA1-44肽施用的小鼠和用盐水施用的小鼠收集的椎骨的Pα细胞进行转录组分析，并且基于获得的数据用IPA进行途径分析。作为结果，与对照组中的那些相比，在HA1-44肽施用组中的椎骨Pα细胞中活化与EIF2信号传导、eIF4和p70S6K信号传导的调节以及mTOR信号传导相关的途径(图31)。此外，与对照组中的那些相比，在HA1-44肽施用组中的椎骨Pα细胞中，细胞死亡相关的基因的表达被抑制(图32)。
实施例12
实施例12
HMGB1肽在人中的活性
在I期临床研究中，HA1-44肽的静脉内施用显示循环血液中的CD45-阴性、TER-119-阴性和PDGFRβ-阳性细胞的增加(图33)。由于PDGFRβ是人间充质干细胞的标志物，所以据信定义本文所述的外周血中的iCFPα细胞和椎骨CFPα细胞的标志物(包括多种标志物的组合)(其中术语“PDGFRα”用术语“PDGFRβ”替代)，也将是定义人中的MSC(在外周血或椎骨中的集落形成PDGFR-阳性细胞)的标志物(包括多种标志物的组合)。
产业适用性
与常规用于再生医学中的骨髓来源的间充质干细胞相比，根据本发明的外周血中的外胚层间充质干细胞具有优异的增殖能力和多谱系分化效力，并且可以作为通过外周血收集方法(其侵袭性小于骨髓抽吸)可获得的治疗细胞用于细胞移植疗法等中。此外，已经揭示有助于损伤组织的再生的外周血中的外胚层间充质干细胞的特征(标志物等)。因此，使用该细胞作为指标，可以有效地筛选具有在体内诱导多能干细胞的活性的物质。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽序列
<400> 1
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
20 25 30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys
35 40

Claims (34)

1.集落形成PDGFR-阳性细胞，其具有以下特征i)和特征ii)和/或iii)：
i)具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力；
ii)具有分化为表皮细胞的效力；
iii)是P0谱系-阳性的。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是PDGFRα-阳性的。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞具有选自以下的一种或多种特征：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性。
4.椎骨骨髓来源的细胞，其为PDGFRα-阳性、CD34-阳性和Sca1-阴性的。
5.用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血；
2)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，在固相上培养所述外周血，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；
3)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，和从所述外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；
4)从具有坏死组织损伤的受试者收集外周血，从所述外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性，和在固相上培养所述细胞。
6.用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)在固相上培养从具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血；
2)在固相上培养从具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；
3)从由具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；
4)从由具有坏死组织损伤的受试者收集的外周血选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性，和在固相上培养所述细胞。
7.用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)从受试者收集椎骨骨髓，和在固相上培养所述椎骨骨髓；
2)从受试者收集椎骨骨髓，在固相上培养所述椎骨骨髓，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性和Sox1谱系-阴性；
3)从受试者收集椎骨骨髓，和从所述椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性和Sox1谱系-阴性；
4)从受试者收集椎骨骨髓，从所述椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性和Sox1谱系-阴性，和在固相上培养所述细胞。
8.用于产生集落形成PDGFR-阳性细胞的方法，其包括以下步骤1)至4)中的任何一个：
1)在固相上培养从受试者收集的椎骨骨髓；
2)在固相上培养从受试者收集的椎骨骨髓，且然后选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性和Sox1谱系-阴性；
3)从由受试者收集的椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性和Sox1谱系-阴性；
4)从由受试者收集的椎骨骨髓选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性和Sox1谱系-阴性，和在固相上培养所述细胞。
9.通过如下获得的细胞群：将MSC血液中动员物质施用于受试者，从所述受试者收集外周血，和在固相上培养收集的外周血。
10.根据权利要求9所述的细胞群，其中所述MSC血液中动员物质是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽。
11.用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：将MSC血液中动员物质施用于受试者，从所述受试者收集外周血，和在固相上培养收集的外周血。
12.用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：在固相上培养从已经向其施用MSC血液中动员物质的受试者收集的外周血。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述MSC血液中动员物质是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽。
14.通过如下获得的细胞群：1)将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽施用于受试者，2)从所述受试者收集椎骨骨髓，和3)在固相上培养收集的椎骨骨髓或从收集的椎骨骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
15.用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：1)将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽施用于受试者，2)从所述受试者收集椎骨骨髓，和3)在固相上培养收集的椎骨骨髓或从收集的椎骨骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
16.用于产生细胞的方法，其包括以下步骤：在固相上培养从已经向其施用由SEQ IDNO:1的氨基酸序列组成的肽的受试者收集的椎骨骨髓，或从收集的椎骨骨髓分选PDGFRα-阳性细胞。
17.用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养来自含有间充质干细胞的生物组织的细胞群；
2)亚克隆步骤1)中获得的集落；
3)在诱导分化为骨、软骨和/或脂肪的培养基中培养通过亚克隆获得的细胞中的一部分，和测量骨、软骨和/或脂肪的分化标志物的表达水平；和
4)选择细胞克隆，所述细胞克隆显示与在以下情况下骨、软骨和/或脂肪的分化标志物的表达水平相比的高表达水平：在诱导分化为骨、软骨和/或脂肪的培养基中在固相上培养通过培养股骨骨髓获得的间充质干细胞。
18.用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养源自含有间充质干细胞的生物组织的细胞群；和
2)选择具有选自以下的一种或多种特征的集落：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤2)是选择Prx1谱系-阴性集落的步骤。
20.用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：从源自含有间充质干细胞的生物组织的细胞群选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性。
21.用于产生细胞群的方法，其包括以下步骤：
1)从源自含有间充质干细胞的生物组织的细胞群选择性回收具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；和
2)在固相上培养在步骤1)中回收的细胞。
22.通过根据权利要求5至8、11至13和15至21中任一项所述的方法获得的细胞或细胞群。
23.用于促进组织再生的组合物，其包含集落形成PDGFR-阳性细胞，所述集落形成PDGFR-阳性细胞具有以下特征i)和特征ii)和/或iii)：
i)具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的效力；
ii)具有分化为表皮细胞的效力；
iii)是P0谱系-阳性的。
24.根据权利要求23所述的组合物，其用于促进源自中胚层或外胚层的组织的再生。
25.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和计数所述外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；
2)从已经向其施用测试物质的受试者收集外周血，和计数所述外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；和
3)当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
26.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)计数从受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；
2)计数从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；和
3)当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
27.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)将测试物质施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
6)基于集落或单细胞，对步骤5)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
7)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；
8)合并步骤2)和6)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；和
9)将步骤7)的分析结果与步骤8)的分析结果进行比较，和当步骤5)中获得的细胞群具有与步骤3)中获得的细胞群相同的聚类构型时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
28.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养从受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)在固相上培养从已经向其施用由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽的受试者收集的外周血，以获得粘附细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)在固相上培养从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
6)基于集落或单细胞，对步骤5)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
7)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；
8)合并步骤2)和6)中获得的基因表达数据，和进行聚类分析；和
9)将步骤7)的分析结果与步骤8)的分析结果进行比较，和当步骤5)中获得的细胞群具有与步骤3)中获得的细胞群相同的聚类构型时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
29.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
2)计数步骤1)中获得的集落数；
3)将测试物质施用于受试者，收集外周血，和在固相上培养所述外周血以获得粘附细胞群；
4)计数步骤3)中获得的集落数；和
5)当步骤4)中计数的集落数大于步骤2)中计数的集落数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
30.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)在固相上培养从受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
2)计数步骤1)中获得的集落数；
3)在固相上培养从已经向其施用测试物质的受试者收集的外周血以获得粘附细胞群；
4)计数步骤3)中获得的集落数；和
5)当步骤4)中计数的集落数大于步骤2)中计数的集落数时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
31.根据权利要求29或30所述的筛选方法，其中步骤2)和4)中计数的集落是具有选自以下的一种或多种特征的集落：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性。
32.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)从受试者的椎骨收集骨髓，和通过在固相上培养或细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)将测试物质施用于受试者，从椎骨收集骨髓，和通过在固相上培养或细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行途径分析；和
6)当作为步骤5)的分析的结果，与步骤1)中获得的细胞群相比，步骤3)中获得的细胞群中的(i)与EIF2信号传导、eIF4和p70S6K信号传导的调节和/或mTOR信号传导相关的途径被活化或(ii)细胞死亡相关基因的表达被抑制时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
33.用于筛选多能干细胞诱导剂的方法，其包括以下步骤：
1)通过在固相上培养由受试者的椎骨收集的骨髓或从由受试者的椎骨收集的骨髓进行细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
2)基于集落或单细胞，对步骤1)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
3)通过在固相上培养由已经向其施用测试物质的受试者的椎骨收集的骨髓或从由已经向其施用测试物质的受试者的椎骨收集的骨髓进行细胞分选来获得PDGFRα-阳性细胞群；
4)基于集落或单细胞，对步骤3)中获得的细胞群进行详尽的基因表达分析；
5)合并步骤2)和4)中获得的基因表达数据，和进行途径分析；和
6)当作为步骤5)的分析的结果，与步骤1)中获得的细胞群相比，步骤3)中获得的细胞群中的(i)与EIF2信号传导、eIF4和p70S6K信号传导的调节和/或mTOR信号传导相关的途径被活化或(ii)细胞死亡相关基因的表达被抑制时，选择所述测试物质作为具有多能干细胞诱导活性的物质的候选物。
34.用于确定MSC血液中动员物质的组织再生促进作用的方法，其包括以下步骤：
1)在施用MSC血液中动员物质之前，计数从受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性；和
2)在施用MSC血液中动员物质之后，计数从所述受试者收集的外周血中含有的具有选自以下的一种或多种特征的细胞：PDGFRα-阳性、PDGFRα谱系-阳性、P0谱系-阳性、Prx1谱系-阴性、Sox1谱系-阴性、LepR谱系-阴性、CD34-阳性和Sca1-阴性，
其中当步骤2)中计数的细胞数大于步骤1)中计数的细胞数时，表明在受试者中促进组织再生。
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