JPWO2019107566A1 - 外胚葉性間葉系幹細胞およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
A)外胚葉性間葉系幹細胞。
B)外胚葉性間葉系幹細胞の製造方法。
C)項目B)に記載の製造方法によって得られる細胞。
D)MSC血中動員物質によって誘導される末梢血中の細胞または細胞集団。
E)High-mobility group box 1 (HMGB1)タンパク質のA-boxのN末端の位置1-44のアミノ酸配列(配列番号1)からなるペプチド(以下、「HA1-44ペプチド」とも称する)によって誘導される椎骨骨髄内の細胞または細胞集団。
F)項目D)またはE)に記載の細胞または細胞集団の製造方法。
G)間葉系幹細胞(MSC)を含む生体組織から、椎骨骨髄内のPDGFRα陽性細胞と同様の高い組織再生促進能力を有する細胞を取得、分離および/または濃縮する方法。
H)項目G)に記載の方法によって得られる細胞または細胞集団。
I)外胚葉性間葉系幹細胞を含有する、組織再生促進のために用いられる組成物。
J)壊死性組織損傷によって誘導される末梢血中の細胞を指標にして、多能性幹細胞の誘導活性を持つ物質をスクリーニングする方法。
K)HA1-44ペプチドを陽性対照として用い、生体内で組織再生に寄与している多能性幹細胞の反応を指標にして、多能性幹細胞の誘導活性を持つ物質をスクリーニングする方法。
L)末梢血中のコロニー形成性Pα細胞を指標として、MSC血中動員物質を投与した対象において期待される組織再生促進効果を判定する方法。
a)以下のi)の特徴ならびにii)および/またはiii)の特徴を有する、コロニー形成性PDGFR陽性細胞:
i)骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を有する;
ii)表皮細胞への分化能を有する;
iii)P0系譜陽性である。
b)PDGFRα陽性である、項目a)に記載の細胞。
c)Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する、項目a)またはb)に記載の細胞。
d)PDGFRα陽性、CD34陽性、且つSca1陰性である、椎骨骨髄由来細胞。
e)以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、固相上で培養する工程;
2)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、固相上で培養した後、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、該末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、該末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
f)以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血を固相上で培養する工程;
2)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血を固相上で培養した後、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
g)以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)対象から椎骨骨髄を採取し、固相上で培養する工程;
2)対象から椎骨骨髄を採取し、固相上で培養した後、Pα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)対象から椎骨骨髄を採取し、該骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)対象から椎骨骨髄を採取し、該骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
h)以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)対象から採取された椎骨骨髄を固相上で培養する工程;
2)対象から採取された椎骨骨髄を固相上で培養した後、Pα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)対象から採取された椎骨骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)対象から採取された椎骨骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
i)MSC血中動員物質を対象に投与し、該対象から末梢血を採取し、該採取された末梢血を固相上で培養することによって得られる、細胞集団。
j)MSC血中動員物質が、HA1-44ペプチドである、項目i)に記載の細胞集団。
k)MSC血中動員物質を対象に投与し、当該対象から末梢血を採取し、当該採取された末梢血を固相上で培養する工程を含む、細胞の製造方法。
l)MSC血中動員物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養する工程を含む、細胞の製造方法。
m)MSC血中動員物質が、HA1-44ペプチドである、項目k)またはl)に記載の方法。
n)1)HA1-44ペプチドを対象に投与し、2)該対象から椎骨の骨髄を採取し、3)該採取された骨髄を固相上で培養すること又は該採取された骨髄からPDGFRα陽性細胞をソーティングすることによって得られる、細胞集団。
o)1)HA1-44ペプチドを対象に投与し、2)該対象から椎骨の骨髄を採取し、3)該採取された骨髄を固相上で培養するか又は該採取された骨髄からPDGFRα陽性細胞をソーティングする工程を含む、細胞の製造方法。
p)HA1-44ペプチドを投与された対象から採取された椎骨の骨髄を固相上で培養するか又は該採取された骨髄からPDGFRα陽性細胞をソーティングする工程を含む、細胞の製造方法。
q)以下の工程を含む、細胞集団の製造方法:
1)MSCを含む生体組織由来の細胞集団を固相上で培養する工程;
2)工程1で得られたコロニーをサブクローニングする工程;
3)サブクローニングにより得られた細胞の一部を、骨、軟骨、および/または脂肪の分化誘導培地で培養し、骨、軟骨、および/または脂肪の分化マーカーの発現レベルを測定する工程;および
4)大腿骨の骨髄を固相上で培養することによって得られたMSCを、骨、軟骨、および/または脂肪の分化誘導培地で培養した場合の、骨、軟骨、および/または脂肪の分化マーカーの発現レベルと比較して、高い発現レベルを示した細胞クローンを選抜する工程。
r)以下の工程を含む、細胞集団の製造方法:
1)MSCを含む生体組織由来の細胞集団を固相上で培養する工程;および
2)Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有するコロニーを選抜する工程。
s)工程2が、Prx1系譜陰性のコロニーを選抜する工程である、項目r)に記載の方法。
t)MSCを含む生体組織由来の細胞集団から、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程を含む、細胞集団の製造方法。
u)以下の工程を含む、細胞集団の製造方法:
1)MSCを含む生体組織由来の細胞集団から、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;および
2)工程1)で回収された細胞を固相上で培養する工程。
v)請求項*〜*に記載の製造方法によって得られる細胞または細胞集団。
w)以下のi)の特徴ならびにii)および/またはiii)の特徴を有するコロニー形成性PDGFR陽性細胞を含有する、組織再生促進のために用いられる組成物:
i)骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を有する;
ii)表皮細胞への分化能を有する;
iii)P0系譜陽性である。
x)中胚葉または外胚葉に由来する組織の再生促進のために用いられる、請求項*に記載の組成物。
y)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から末梢血を採取し、該末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
2)被験物質を投与した対象から末梢血を採取し、該末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
3)工程2)で計数された細胞の数が、工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
z)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から採取された末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
2)被験物質を投与された対象から採取された末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
3)工程2)で計数された細胞の数が、工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
aa)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド(HA1-44ペプチド)を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)被験物質を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
6)工程5で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
7)工程2および4で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;
8)工程2および6で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;および
9)工程7の解析結果と工程8の解析結果を比較し、工程5で得られた細胞集団(被験物質投与群)が、工程3で得られた細胞集団(HA1-44ペプチド投与群)と同じクラスター構成を有する場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
ab)工程3においてHA1-44ペプチドに代えて被験物質が投与され、かつ工程5において被験物質に代えてHA1-44ペプチドが投与される、項目aa)に記載の方法。
ac)網羅的遺伝子発現解析がRNAシークエンシング(RNA-seq)である、項目aa)またはab)に記載の方法。
ad)クラスタリング解析がiterative clustering and guide-gene selection(ICGS)アルゴリズムを用いて行われる、項目aa)〜ac)のいずれか1つに記載の方法。
ae)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド(HA1-44ペプチド)を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)被験物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
6)工程5)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
7)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;
8)工程2)および6)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;および
9)工程7)の解析結果と工程8)の解析結果を比較し、工程5)で得られた細胞集団が、工程3)で得られた細胞集団と同じクラスター構成を有する場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
af)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られたコロニーの数を数える工程;
3)被験物質を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られたコロニーの数を数える工程;および
5)工程4)で計数されたコロニーの数が、工程2)で計数されたコロニーの数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
ag)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られたコロニーの数を数える工程;
3)被験物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られたコロニーの数を数える工程;および
5)工程4)で計数されたコロニーの数が、工程2)で計数されたコロニーの数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
ah)工程2)および4)において計数するコロニーが、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有するコロニーである、項目ae)またはaf)に記載のスクリーニング方法。
ai)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象の椎骨から骨髄を採取し、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
2)工程1で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)被験物質を対象に投与し、椎骨から骨髄を採取し、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
4)工程3で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)工程2および4で得られた遺伝子発現データをプールし、パスウェイ解析を行う工程;および
6)工程5の解析の結果、工程1で得られた細胞集団(未処置群)と比較して、工程3で得られた細胞集団(被験物質投与群)において(i)EIF2シグナリング、eIF4およびp70S6Kシグナリングの調節、および/またはmTORシグナリングに関連するパスウェイが活性化されているか又は(ii)細胞死関連遺伝子の発現が抑制されている場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
aj)以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象の椎骨から採取された骨髄から、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)被験物質を投与された対象の椎骨から採取された骨髄から、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、パスウェイ解析を行う工程;および
6)工程5)の解析の結果、工程1)で得られた細胞集団と比較して、工程3)で得られた細胞集団において(i)EIF2シグナリング、eIF4およびp70S6Kシグナリングの調節、および/またはmTORシグナリングに関連するパスウェイが活性化されているか又は(ii)細胞死関連遺伝子の発現が抑制されている場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
ak)網羅的遺伝子発現解析がRNAシークエンシング(RNA-seq)である、項目ai)またはaj)に記載の方法。
al)以下の工程:
1)MSC血中動員物質を投与する前の対象から採取された末梢血中に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
2)MSC血中動員物質を投与した後の該対象から採取された末梢血中に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
を含み、工程2)で計数された細胞の数が工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、該対象において組織再生が促進されることが示唆される、MSC血中動員物質の組織再生促進効果の判定方法。
(a)壊死性組織損傷(skin flap等)に応答して末梢血中における存在量が増大するコロニー形成性Pα細胞(necrotic injury-induced colony-forming Pα cells; 以下、「iCFPα細胞」とも称する)、および
(b)椎骨骨髄に含まれるコロニー形成性Pα細胞(以下、「椎骨CFPα細胞」または「椎骨由来CFPα細胞」とも称する)が挙げられる。
i)骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を有する;
ii)表皮細胞への分化能を有する;
iii)P0系譜陽性である。
一実施形態において、上記コロニー形成性PDGFR陽性細胞は、PDGFRα陽性細胞である。別の実施形態において、上記コロニー形成性PDGFR陽性細胞は、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞である。
・Pα+である;
・CD34+である;
・Sca1-である;
・CD34+、且つSca1-である;
・CD34+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・Sca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・CD34+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・P0lin+、且つPrx1lin-である;
・P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-である;
・P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-である;
・P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-である;
・Pαlin+、P0lin+、且つPrx1lin-である;
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-である;
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-である;
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-である;
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つCD34+である;
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つSca1-である;
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、且つSca1-である;
・Pα+、且つCD34+である;
・Pα+、且つSca1-である;
・Pα+、CD34+、且つSca1-である;
・Pα+、且つCD34+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・Pα+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・Pα+、CD34+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・Pα+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する;
・Pα+、P0lin+、且つPrx1lin-である;
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-である;
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-である;
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-である;
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、且つPrx1lin-である;
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-である;
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-である;
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-である;
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つCD34+である;
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つSca1-である;
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、且つSca1-である。
Pα+CD34+Sca1+ 細胞のソースとして用い得る骨髄としては、椎骨(頸椎、胸椎、腰椎)および大腿骨の骨髄が挙げられる。一つの態様において、Pα+CD34+Sca1+ 細胞のソースとして用い得る骨髄は、椎骨の骨髄である。別の態様において、Pα+CD34+Sca1+ 細胞のソースとして用い得る骨髄は、頸椎の骨髄である。
1)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、固相上で培養する工程;
2)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、固相上で培養した後、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、該末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、該末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
1)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血を固相上で培養する工程;
2)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血を固相上で培養した後、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血からPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
・Pα+の細胞
・CD34+の細胞
・Sca1-の細胞
・CD34+、且つSca1-の細胞
・CD34+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Sca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・CD34+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つCD34+の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つSca1-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、且つSca1-の細胞
・Pα+、且つCD34+の細胞
・Pα+、且つSca1-の細胞
・Pα+、CD34+、且つSca1-の細胞
・Pα+、且つCD34+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+、CD34+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+、P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つCD34+の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つSca1-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、且つSca1-の細胞。
(1)セルソーター等を用いて、所望のマーカー分子を発現する細胞を「ソート」する方法、
(2)目視により、または遺伝子発現解析の結果に基づいて、所望のマーカー分子を発現する細胞/コロニーを「回収」、「選抜」、「分離」、「単離」または「濃縮」する方法。
ここにいうマーカー分子としては、表面マーカー(細胞表面抗原)、lineageマーカー遺伝子のレポータータンパク等が挙げられる。
1)対象から椎骨骨髄を採取し、固相上で培養する工程;
2)対象から椎骨骨髄を採取し、固相上で培養した後、Pα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)対象から椎骨骨髄を採取し、該骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)対象から椎骨骨髄を採取し、該骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
1)対象から採取された椎骨骨髄を固相上で培養する工程;
2)対象から採取された椎骨骨髄を固相上で培養した後、Pα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)対象から採取された椎骨骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)対象から採取された椎骨骨髄からPα+、P0lin+、Prx1lin-、およびSox1lin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。
・P0lin+の細胞
・Prx1lin-の細胞
・Sox1lin-の細胞
・P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・P0lin+、且つSox1lin-の細胞
・Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、且つP0lin+の細胞
・Pα+、且つPrx1lin-の細胞
・Pα+、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・Pα+、P0lin+、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・LepRlin-の細胞
・P0lin+、且つLepRlin-の細胞
・Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・P0lin+、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、P0lin+、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞。
1)対象から末梢血を採取し、該末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
2)被験物質を投与した対象から末梢血を採取し、該末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
3)工程2)で計数された細胞の数が、工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
1)対象から採取された末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
2)被験物質を投与された対象から採取された末梢血に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
3)工程2)で計数された細胞の数が、工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
・Pα+の細胞
・CD34+の細胞
・Sca1-の細胞
・CD34+、且つSca1-の細胞
・CD34+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Sca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・CD34+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つCD34+の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つSca1-の細胞
・Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、且つSca1-の細胞
・Pα+、且つCD34+の細胞
・Pα+、且つSca1-の細胞
・Pα+、CD34+、且つSca1-の細胞
・Pα+、且つCD34+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+、CD34+、且つSca1-であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+であり、且つ、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、およびLepRlin-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞
・Pα+、P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、且つPrx1lin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、且つLepRlin-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つCD34+の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、且つSca1-の細胞
・Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、且つSca1-の細胞。
1)対象から末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド(HA1-44ペプチド)を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)被験物質を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
6)工程5で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
7)工程2および4で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;
8)工程2および6で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;および
9)工程7の解析結果と工程8の解析結果を比較し、工程5で得られた細胞集団(被験物質投与群)が、工程3で得られた細胞集団(HA1-44ペプチド投与群)と同じクラスター構成を有する場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
1)対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチド(HA1-44ペプチド)を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)被験物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
6)工程5)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
7)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;
8)工程2)および6)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;および
9)工程7)の解析結果と工程8)の解析結果を比較し、工程5)で得られた細胞集団が、工程3)で得られた細胞集団と同じクラスター構成を有する場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
1)対象から末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られたコロニーの数を数える工程;
3)被験物質を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られたコロニーの数を数える工程;および
5)工程4)で計数されたコロニーの数が、工程2)で計数されたコロニーの数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
工程1)における対象は、工程3)において被験物質を投与する際に用いる溶媒と同じ溶媒のみを投与した対象であってもよい。
工程2)および4)において計数するコロニーは、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有するコロニーであってもよい。
1)対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られたコロニーの数を数える工程;
3)被験物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られたコロニーの数を数える工程;および
5)工程4)で計数されたコロニーの数が、工程2)で計数されたコロニーの数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
工程1)における対象は、工程3)において被験物質が投与される際に用いられる溶媒と同じ溶媒のみを投与された対象であってもよい。
工程2)および4)において計数するコロニーは、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有するコロニーであってもよい。
1)対象の椎骨から骨髄を採取し、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
2)工程1で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)被験物質を対象に投与し、椎骨から骨髄を採取し、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
4)工程3で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)工程2および4で得られた遺伝子発現データをプールし、パスウェイ解析を行う工程;および
6)工程5の解析の結果、工程1で得られた細胞集団(未処置群)と比較して、工程3で得られた細胞集団(被験物質投与群)において(i)EIF2シグナリング、eIF4およびp70S6Kシグナリングの調節、および/またはmTORシグナリングに関連するパスウェイが活性化されているか又は(ii)細胞死関連遺伝子の発現が抑制されている場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
工程1における対象は、工程3において被験物質を投与する際に用いる溶媒と同じ溶媒のみを投与した対象であってもよい。
1)対象の椎骨から採取された骨髄から、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)被験物質を投与された対象の椎骨から採取された骨髄から、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、パスウェイ解析を行う工程;および
6)工程5)の解析の結果、工程1)で得られた細胞集団と比較して、工程3)で得られた細胞集団において(i)EIF2シグナリング、eIF4およびp70S6Kシグナリングの調節、および/またはmTORシグナリングに関連するパスウェイが活性化されているか又は(ii)細胞死関連遺伝子の発現が抑制されている場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。
1)間葉系幹細胞(MSC)を含む生体組織由来の細胞集団を固相上で培養する工程;
2)工程1で得られたコロニーをサブクローニングする工程;
3)サブクローニングにより得られた細胞の一部を、骨、軟骨、および/または脂肪の分化誘導培地で培養し、骨、軟骨、および/または脂肪の分化マーカーの発現レベルを測定する工程;および
4)大腿骨の骨髄を固相上で培養することによって得られたMSCを、骨、軟骨、および/または脂肪の分化誘導培地で培養した場合の、骨、軟骨、および/または脂肪の分化マーカーの発現レベルと比較して、高い発現レベルを示した細胞クローンを選抜する工程。
1)MSCを含む生体組織由来の細胞集団を固相上で培養する工程;および
2)Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有するコロニーを選抜する工程。一実施形態において、工程2は、Prx1系譜陰性のコロニーを選抜する工程であってもよい。
1)MSCを含む生体組織由来の細胞集団から、Pα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+、およびSca1- から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;および
2)工程1)で回収された細胞を固相上で培養する工程。
i)骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を有する;
ii)表皮細胞への分化能を有する;
iii)P0系譜陽性である。
一実施形態では、該組成物は、中胚葉または外胚葉に由来する組織の再生促進のために用いられるものである。中胚葉に由来する組織としては、骨、軟骨、筋肉、血管内皮等が挙げられるが、これらに限定されない。外胚葉に由来する組織としては、上皮組織(例えば表皮)、神経組織等が挙げられるが、これらに限定されない。
i)骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を有する;
ii)表皮細胞への分化能を有する;
iii)P0系譜陽性である。
上記細胞の投与方法は、再生を促進する組織の種類および/または投与される対象の状態などの条件に応じて適宜選択することができる。当該投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与、座剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
1)MSC血中動員物質を投与する前の対象から採取された末梢血中に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
2)MSC血中動員物質を投与した後の該対象から採取された末梢血中に含まれるPα+、Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-、CD34+およびSca1-から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
を含み、工程2)で計数された細胞の数が工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、該対象において組織再生が促進されることが示唆される、MSC血中動員物質の組織再生促進効果の判定方法に関する。
1.マウス
PDGFRαの発現をGFPの蛍光で確認できるPα-H2B-GFPマウス(The Jackson Laboratory、Stock No: 007669)、およびCre-loxPシステムを利用した各種の細胞系譜追跡マウスを実験に用いた。Cre-loxPシステムを利用した細胞系譜追跡マウスは、CreドライバーマウスとCreレポーターマウスを交配することにより作出できる。Creドライバーマウスとは、所望の遺伝子のプロモーター配列の下流にCreリコンビナーゼのコード配列が導入されたDNA構造を有するトランスジェニックマウスである。Creレポーターマウスとは、ROSA26等の遺伝子座に「プロモーター(CAGプロモーター等)−loxP−stopカセット−loxP−所望のレポーター遺伝子(本願の実施例においてはEYFPまたはtdTomato)」という構造のDNA配列が導入されたトランスジェニックマウスである。
・Pα-Creマウス(The Jackson Laboratory、Stock No: 013148)
・P0-Creマウス(The Jackson Laboratory、Stock No: 017927)
・Prx1-Creマウス(The Jackson Laboratory、Stock No: 005584)
・Sox1-Creマウス(RIKEN BioResource Research Center、Accession No. CDB0525K)
・LepR-Creマウス(The Jackson Laboratory、Stock No: 008320)
・Krt5-Creマウス(MGI ID: 1926815、Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jul 8;94(14):7400-5に記載のK5 Cre トランスジェニックマウス)
・Rosa26-EYFPマウス(The Jackson Laboratory 、Stock No: 006148)
・Rosa26-tdTomatoマウス(The Jackson Laboratory、Stock No: 007909)
・Pα-Cre::Rosa26-tdTomatoマウス
・P0-Cre::Rosa26-tdTomatoマウス
・Prx1-Cre::Rosa26-tdTomatoマウス
・Sox1-Cre::Rosa26-tdTomatoマウス
・LepR-Cre::Rosa26-tdTomatoマウス
・Krt5-Cre::Rosa26-tdTomatoマウス
Pα- H2B-GFPマウスは、PDGFRα遺伝子のプロモーターの下流にヒストンH2BとeGFPの融合タンパクをコードする配列がノックインされたマウスである。当該Pα- H2B-GFPマウスと上記Prx1-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスを交配することにより、Pα- H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスを作出した。
本願実施例においては、壊死性組織損傷を起こす方法として、skin flapの作成を行った。具体的なskin flapの作成方法は、以下の通りである。
8-10週齢雄のマウス(20-25g)に対して、1.5-2.0%(v/v)のイソフルレン吸入麻酔下で背部の剃毛を行った。尾側のみ皮膚の連続性を保つようにして、剪刀を用いて背部中央に横2.0×縦4.0 cmのSkin flapを作成した(これにより、flapの根元から離れた先端部が虚血状態となり、皮膚組織の壊死性損傷が生じる)。Skin flap作成後の患部は、十分な大きさの絆創膏で保護した。Skin flap作成から12時間後にそれぞれ心臓血採血、椎骨および大腿骨骨髄の細胞分離、椎骨および大腿骨の凍結切片作成を行った。
Kamran P et al. J Vis Exp. 2013 Oct 6;(80)を参考に、6週齢雄の野生型マウスと6週齢雄の細胞系譜追跡マウスを用いたパラビオーシスモデルを作成した。2匹同時にイソフルレンでの全身麻酔導入を行い、heat pad上にポジショニングした。2匹の相対する体側面を剃毛し、肘関節から膝関節にかけて約5mm幅で皮膚を切除した。背側の皮膚を5-0バイクリルで連続縫合した。相対する肘関節、膝関節を3-0バイクリルで縫合した。同様に5-0バイクリルで腹側の皮膚を連続縫合した。麻酔からの覚醒をheat pad上で待った。活動が制限されるため、1ケージに1ペアまでの飼育とし、撒き餌を行った。
椎骨および大腿骨を採取後、4%パラホルムアルデヒド固定、0.5M EDTA溶液脱灰、30%スクロース溶液置換を経て、川本法用凍結包埋剤 Super Cryoembedding Medium;SCEM(Leica)を用いて凍結ブロックを作成した。Cryofilmタイプ2C(9)(Leica)を用いて厚さ10μmで薄切を行い、各抗体を用いて免疫染色を行った(1次抗体は4℃で一晩、2次抗体は4℃で1時間)。共焦点顕微鏡を用いて組織の観察を行った。
末梢血からの細胞回収は次の方法で行った。全身麻酔下で心臓から末梢血を約800-1000μL採取した(ヘパリンを含有する1 mLシリンジを使用)。赤血球を除去するため、採取した血液と等量のHetasep(STEMCELL Technologies社、Cat No. ST-07906)を加え、100Gで2分間遠心し、室温で15分間インキュベートした後、上清を回収した。当該上清を、末梢血中の有核細胞を含むサンプルとして次の実験に供した。
骨髄からの細胞回収は次の方法で行った。全身麻酔下で採取した椎骨、大腿骨を0.2%コラゲナーゼA溶液(Sigma社、Cat#10103578001)に浸漬し、37℃で1時間インキュベートした。乳鉢で骨髄細胞を押し出し、ピペッティングで回収して40μmのセルストレーナーに通した。300Gで5分間遠心して上清を除去し、RBC Lysis buffer(BioLegend社、cat#420301)で溶血して赤血球を除去し、骨髄細胞として次の実験に供した。
上記の手順によって得た上清(末梢血中の有核細胞含有サンプル)を、コラーゲンIでコートされた6ウェルプレート(Corning社、Cat No. 356400)に播種し、MesenCult Expansion Kit(STEMCELL Technologies社、Cat No. ST-05513)を利用して当該キットのマニュアル通りに調製したExpansion Mediumに1% L-glutamine(ナカライテスク社)、10μM ROCK inhibitor(Y27632、Tocris Bioscience社)および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン(ナカライテスク社)を含有させた培地(数値はいずれも終濃度)を用いて、37℃、5%CO2、5%O2の条件下で10日間培養した。培養期間中は1週間に2回、培地を新鮮なものに交換した。培養10日目に、Differential Quik Stain Kit(シスメックス株式会社、Cat No. 16920)を用いてプレート上の細胞を染色し、50個以上の細胞を含むコロニーの数をカウントした。
Passage 3-5の生細胞を12well plateに50,000細胞/wellで播種し、サブコンフルエントになるまで10% FBS/DMEMで培養した。その後、脂肪細胞への分化には100 nM dexamethasone (Sigma)、0.5 mM isobutylmethylxanthine (Sigma)、50 mM indomethacin (Wako)、10μg/ml insulin (Sigma)を含む10% FBS/DMEMを用いて14日間脂肪分化誘導を行った。
骨芽細胞への分化には1 nM dexamethasone、20 mM β-glycerol phosphate (Wako)、50 μg/ml ascorbate-2-phosphate (Sigma-Aldrich Corp.)を含む10% FBS/DMEMを用いて21日間骨芽細胞分化誘導を行った。各分化誘導後に4% PFAで固定し、脂肪細胞はoil red-O染色、骨芽細胞はALP activity assay kit (TAKARA BIO Inc., Kusatsu, Japan)を用いてALP染色を行い、それぞれ顕微鏡で観察した。
軟骨分化誘導では、まず300,000細胞を15 ml チューブで300g、5分間の遠心を行った。40ng/ml proline(Sigma)、50μg/ml ascorbic acid 2-phosphate、x100 ITS mix (BD Bioscience)、2μg/ml fluocinolone (Tokyo chemistry industry, Tokyo, Japan)、5 ng/ml transforming growth factor-b3 (R&D Systems, Minneapolis, MN)、100 nM dexamethasone (Sigma)を含む10% FBS/DMEMで21日間、軟骨分化誘導を行った。完成した軟骨ペレットは、パラフィン包埋し、6μmの厚さで薄切、トルイジンブルー染色を行った。
・動物
Krt5-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスを8〜10週齢になるまで飼育し、実験に使用した。
・採材
採材前日にマウス背部にskin flapを作成し、作成から12時間経過後に麻酔下で心臓採血により末梢血を採取した。skin flapを作成していないマウスについても同様に末梢血を採取した。採血後に大腿骨および椎骨を採取した。
・細胞調整
末梢血はHetaSepを用いて赤血球を除去し、6wellのcollagen I コートのプレートに1匹分の血液分を1wellに播種し、5%O2、5%CO2、37℃の条件で培養した。培地は、MesenCult または 20% FBS/MEMα(いずれもRock inhibitorおよび1% Penicillin-Streptomycin含有)を使用した。
採材した大腿骨は両骨端を切断して縦半分に割り、椎骨は縦半分に割って、0.2% CollagenaseA / DMEM (10mM HEPES, 1% Penicillin-Streptomycin)で処理した(37℃ウォーターバス,1時間)。CollagenaseA処理後に乳鉢をもちいて骨髄細胞を回収し、40um cell strainerで単一細胞に分散させ、1×RBC Lysis solutionで溶血してから播種し、5%O2、5%CO2、37℃の条件で培養した。培地はMesenCult または 20% FBS/MEMα(いずれもRock inhibitorおよび1% Penicillin-Streptomycin含有)を用いた。
・分化誘導
コロニー形成を確認した後、1uM レチノイン酸(SIGMA)および25ng/mL BMP4(R&D)を含んだ培地をwellに添加して、5%CO2、37℃で培養してケラチノサイトへ分化誘導した。オールインワン顕微鏡(キーエンス)により、Tomato陽性/陰性の細胞を観察した。
細胞集団からRNAを抽出し、Smart-seq2 protocol (Nature Protocols 9, 171-181 (2014) doi:10.1038/nprot.2014.006) に従ってRNA-seqライブラリを作成した。得られたライブラリを、nextseq high output kit (37bp ペアエンドリード)を用いて Nextseq500 (Illumina)でシークエンスした。Illuminaの bcl2fastq v2.17.1.14 をデフォルトのパラメータおよび--no-lane-splitting オプションで用いて、ベースコールの fastq フォーマットへの変換とデマルチプレックス(demultiplex)を行った。TrimGalore(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)を用いてリードをトリムし、RSEM(Li et al., BMC Bioinformatics 12, 323 (2011); バージョンはSTAR-2.5.2b)を用いてマッピングとカウント(定量)を行った。サンプル間の発現変動解析はDESeq2(Love et al., Genome Biol. 15, 550 (2014))を用いて行った。発現変動遺伝子(DEGs)をIngenuity Pathway Analysis (IPA) ソフトウェア(https://www.qiagenbioinformatics.com)にアップロードし、DEGsと最も関連性の高い生物学的パスウェイおよび機能を抽出した。RSEMで得たTPM(Transcripts Per kilobase Million)カウントに1を加えてlog2変換した値(log2(TPM+1))に基づき、AltAnalyze_v.2.1.0-PyのICGSアルゴリズムを用いてクラスタリング解析を行った。
単細胞浮遊液を調製し、自動セルカウンター TC20 (BioRad) で細胞生存を評価した。ddSEQ Single-Cell Isolator および SureCell WTA 3’ Library prep kit を製造元のプロトコールに従って使用し、シングルセルRNA-seq ライブラリを作成した。得られたライブラリを、Nextseq high output kit (Read1:68bp, Read2:75bp)を用いて Nextseq500 (Illumina) でシークエンスした。Illuminaの bcl2fastq v2.17.1.14 をデフォルトのパラメータおよび--no-lane-splitting オプションで用いて、ベースコールの fastq フォーマットへの変換とデマルチプレックス(demultiplex)を行った。細胞バーコード領域に生じる可能性のある合成上およびシークエンシング上のエラーは Edit distance (ED)<2 で修正した。Drop-Seq Tools v1.12 (STARバージョンはSTAR-2.5.2b) を用いてリードを解析(マッピングと定量)し、デジタル発現マトリックスを生成した。得られたマトリックスを voom (limma 3.32.10)を用いて標準化した。該標準化されたマトリックスに基づき、AltAnalyze_v.2.1.0-Py をデフォルト設定で用いてICGSアルゴリズムによるクラスタリング解析を行った。また、該標準化されたマトリックスに基づき、tSNEアルゴリズム(Rtsneを使用)による次元圧縮とhclust(method=ward.D2)を用いたクラスタリング解析を行い、結果をggplot2またはplot.lyを用いてプロットした。発現変動解析にはDESingleを使用した。
椎骨および大腿骨から採取した骨髄細胞について、各種の表面分子に対する蛍光標識抗体を用いてFACS解析を行った。蛍光検出、ソーティング等の一連のプロセスはBD FACS Aria III systemを用いて行い、得られたデータの解析はFlowJo software Ver. 6.3.3 (Tree Star, Ashland, OR)を用いて行った。
上記3.に記載した方法で、6週齢雄の野生型マウスと6週齢雄のP0-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスを用いたパラビオーシスモデルを作成した。術後4週間で血液キメラが完成後、0.5mm径の手回しドリル(MEISINGER社製)を用いて野生型マウスの膝関節に0.5x0.5x0.5mmの軟骨欠損を作成した。軟骨欠損を作成した直後に生理食塩水100μLで希釈したHA1-44ペプチド 100μgを尾静脈より投与し、その後も同じ用量で術後4週まで2回/週の頻度で投与した。対照群には、HA1-44ペプチド投与群と同じスケジュールで、生理食塩水100μL/匹を尾静脈より投与した。膝軟骨欠損作成から12週間後に膝関節を採取し、4% パラホルムアルデヒド固定(一晩)、0.5M EDTA溶液による脱灰(3日間)、30% スクロース置換(1日間)を経て、凍結ブロックを作成した。クライオスタットを用いて厚さ10μmで薄切し、共焦点顕微鏡を用いてTomato陽性細胞の分布を解析した。また、8週齢雄の野生型マウスを用いて上記と同様に膝関節に軟骨欠損を作成し、上記と同じ用量およびスケジュールでHA1-44ペプチドを投与し、膝軟骨欠損作成から2、4、8および12週間後に膝関節を採取して組織切片のサフラニンO染色を行った。
マーカーに関して(XX、YYは所望の遺伝子/タンパク名)
XX+: XX陽性
XX-: XX陰性
YYlin+: YY系譜陽性
YYlin-: YY系譜陰性
PDGFR: platelet-derived growth factor receptor
Pα: platelet-derived growth factor receptor alpha(PDGFRα)
Pα細胞: PDGFRα陽性細胞
MSC: 間葉系幹細胞
EMSC: 外胚葉性間葉系幹細胞(ectomesenchymal stem cell)
CFPα細胞: コロニー形成性Pα細胞(colony-forming Pα cells)
iCFPα細胞: 壊死性損傷に誘導されるコロニー形成性Pα細胞(necrotic injury-induced colony-forming Pα cells)
CFU: コロニー形成単位(colony-forming unit)
LepR: レプチン受容体(Leptin receptor)
末梢血中のiCFPα細胞の性質
Pα- H2B-GFPマウスの背部にskin flapを作成し、12時間後に採取した末梢血に含まれるPα細胞の数を調べた。その結果、skin flapを作成していない対照群と比較してskin flap 群ではPα細胞が顕著に増加しており、当該Pα細胞の増加は末梢血中のHMGB1濃度の上昇と相関が見られた(図1)。また、Pα- H2B-GFPマウスの末梢血を培養してコロニーアッセイを行った結果、対照群よりもskin flap群で顕著に多くのコロニーが得られ(全てPα陽性細胞)、CFU活性が高いことが示された(図2)。かかる結果は、壊死性組織損傷によって、末梢血中のコロニー形成性Pα細胞が増加することを示す。
さらに、skin flapを作成したマウスの末梢血を培養して得たコロニー形成性Pα細胞(即ち、iCFPα細胞)は、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を示し、且つ、ケラチノサイトへの分化誘導条件において、ケラチン5(Krt5, K5)を発現する細胞へ分化する能力を示した(図3)。
末梢血中のiCFPα細胞の表面マーカー
対照群およびskin flap群のいずれも、末梢血を培養して得られるコロニーは全てPα陽性であった(図6)。また、skin flap群の末梢血CFPα細胞(iCFPα細胞)をシングルセルでトランスクリプトーム解析した結果、CD34陽性、且つSca1陰性であった。
末梢血中のiCFPα細胞の細胞系譜マーカー
skin flap作成マウスの末梢血由来CFPα細胞(iCFPα細胞)を、Pα系譜、P0系譜、Prx1系譜、Sox1系譜およびLepR系譜について、Cre-loxP系を利用したトランスジェニックマウスを用いて系譜追跡したところ、iCFPα細胞は全て、Pα系譜陽性、P0系譜陽性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性であった(図7)。Prx1系譜については、iCFPα細胞の93%が陰性であった(図7)。
また、平常時の血中にもPrx1系譜陽性と陰性のコロニー形成細胞がわずかに存在するが、skin flapで増加するのは専らPrx1系譜陰性の細胞であった(図8)。したがって、iCFPα細胞はPrx1系譜陰性と定義できる。
末梢血のiCFPα細胞は、P0lin+且つPrx1lin-であることから外胚葉由来であると考えられ、さらに、Sox1lin-であることおよびHoxA2遺伝子が高発現していることを考慮すると、頭部神経襞を発生学的起源とする細胞であることが示唆される。
外胚葉由来間葉系細胞の探索
Pα- H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスから採取した大腿骨、椎骨、胸骨、腸骨、股関節(大腿骨骨頭および臼蓋)、および頭蓋骨の骨髄組織を調べたところ、Pα+且つPrx1lin-の細胞は(当該調査の範囲内では)椎骨に特異的に存在していた(図9および10)。
椎骨および大腿骨のCFPα細胞の系譜マーカー
椎骨および大腿骨の骨髄を培養して得たCFPα細胞について、細胞系譜追跡マウスを用いてP0系譜、Prx1系譜、Sox1系譜およびLepR系譜を調べた。その結果、椎骨のCFPα細胞は、P0lin+、Prx1lin-、且つSox1lin-で、LepRlinに関しては約60%が陰性であった(図11)。大腿骨のCFPα細胞は、P0lin+、Prx1lin+、且つSox1lin-で、LepRlinに関しては約80%が陽性であった(図12)。かかる結果から、末梢血のiCFPα細胞(Pαlin+、P0lin+、Prx1lin-、Sox1lin-、LepRlin-)のソースが椎骨に存在することが示唆される。
椎骨および大腿骨のCFPα細胞の性質
椎骨および大腿骨の骨髄を培養して得たCFPα細胞について、コロニー形成能と骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨細胞への分化能を比較したところ、いずれも椎骨CFPα細胞の方が高い能力を示した(図13〜16)。また、椎骨および大腿骨のCFPα細胞をオールトランスレチノイン酸(ATRA)とBMP-4で分化誘導した結果、ケラチン5を発現するコロニーが観察され(図17および18)、椎骨および大腿骨のCFPα細胞がK5陽性細胞への分化能を有する細胞を含んでいることが確認された。
椎骨および大腿骨のPα細胞のトランスクリプトーム解析
椎骨および大腿骨の骨髄細胞からPα細胞をソートし、シングルセルトランスクリプトーム解析を行った。クラスタリング解析の結果、骨髄のPα細胞は6つのクラスターに分かれた(図19)。当該6つのクラスターを、各クラスターの細胞が特異的に発現している遺伝子に基づいて、(1)S34-MSC(Sca1 and CD34-expressing)、(2)osteoprogenitor(Osteomodulin and Wnt16- expressing)、(3)osteoblast(osterix and osteocalcin-expressing)、(4)osteocyte(PHEX and DMP1-expressing)、(5)CAR cell(CXCL12 and LepR-expressing)、および(6)CD45-expressing cellと定義した。椎骨と大腿骨を比較すると、椎骨にはS34-MSCクラスターの細胞が多く、CARクラスターの細胞が少ないのに対し、大腿骨にはCARクラスターの細胞が多く、S34-MSCクラスターの細胞が少ないことが見て取れる。
また、S34-MSCクラスターの中には、Sca1+CD34+、Sca1+CD34-、およびSca1-CD34+の細胞が含まれていた。そこで、椎骨のPα細胞を、Sca1とCD34の発現を指標にしてFACSで分離し、CFUアッセイを行った。その結果、CFU活性は、Sca1+CD34+細胞>Sca1+CD34-細胞およびSca1-CD34+細胞>Sca1-CD34-細胞の順で高かった(図20)。
末梢血中のPα細胞と椎骨のPα細胞との対応
末梢血中のiCFPα細胞のトランスクリプトーム解析データに基づき、椎骨および大腿骨のPα細胞と共にクラスタリング解析を行った。その結果、末梢血のiCFPα細胞は、S34-MSCクラスターの近くに位置した(図21)。また、当該末梢血iCFPα細胞は、CD34+Sca1-であった。この結果を系譜マーカーと併せて考慮すると、末梢血iCFPα細胞は椎骨のS34-MSCクラスターに含まれるCD34+Sca1-細胞に相当することが示唆される。
骨髄内Sca1 + CD34 + 細胞
骨髄のS34-MSCクラスターに含まれるSca1+CD34+細胞は、Procrを特異的に発現していた(図22)。したがって、Procrは、増殖能が最も高く骨髄Pα細胞の中で最もヒエラルキーの高い細胞と考えられるSca1+CD34+細胞のマーカーになり得る。また、頸椎、胸椎、腰椎、大腿骨におけるSca1+CD34+細胞の存在量を調べたところ、頸椎>胸椎>腰椎>大腿骨の順で多かった(図23)。
HMGB1投与によって誘導される血中循環細胞の組織再生に対する寄与
本発明者らはこれまでに、骨髄由来Pα陽性間葉系幹細胞を末梢血中に動員する活性を持ったドメインとしてHMGB1タンパクのN末端の1番目から44番目のアミノ酸配列(配列番号:1)からなるペプチド(HA1-44ペプチド)を同定している。今回、HA1-44ペプチドの投与によって誘導される末梢血中の細胞に関して以下の実験結果を得た。
(1)HA1-44ペプチドを投与した系譜追跡マウスの末梢血を培養すると、対照群(生理食塩水投与)の末梢血よりも多くのコロニーが得られ、当該コロニーは全てPα陽性であり、その大部分はPrx1系譜陰性であった(図24)。
(2)Pα-Cre::Rosa26-EYFPマウスと野生型(WT)マウスのパラビオーシスモデルを作成し、野生型マウスに表皮水庖症マウスの皮膚を移植した後、HA1-44ペプチドをPα-Cre::Rosa26-EYFPマウスに投与した。その結果、植皮内の再生した上皮組織の中に、7型コラーゲンを発現するPαlin+の細胞の存在が確認された(図25)。
(3)Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスと野生型マウスのパラビオーシスモデルを作成し、野生型マウスの背部に野生型マウス新生仔の皮膚を移植した後、HA1-44ペプチドをPα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスに投与した。その結果、植皮内にPα+且つPrx1lin-の細胞の存在が確認された(図26)。
(4)P0-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスと野生型マウスのパラビオーシスモデルを作成し、野生型マウスの膝関節に軟骨損傷を作成した後、HA1-44ペプチドをP0-Cre::Rosa26-tdTomatoマウスに投与した。その結果、HA1-44ペプチド投与群では軟骨損傷部位にP0lin+細胞の集積が確認されたのに対し、対照群(生理食塩水投与)ではP0lin+細胞の集積は見られなかった(図27)。また、パラビオーシスモデルではない単独の野生型マウスに膝関節の軟骨損傷を作成した後、HA1-44ペプチドまたは生理食塩水を投与した結果、HA1-44ペプチド投与群では軟骨損傷部位において硝子軟骨が再生されたのに対し、生理食塩水投与群の軟骨損傷部位に見られたのは線維軟骨のみであった(図28)。
以上の結果から、HA1-44ペプチドによって誘導される末梢血中のPα細胞(Pα+P0lin+Prx1lin-細胞)は、壊死性組織損傷によって誘導されるiCFPα細胞と同じであるか、又は少なくともiCFPα細胞を含んでおり、表皮や軟骨等の組織損傷を修復する機能を果たしているものと考えられる。
HMGB1投与によって誘導される細胞の変化
(1)HA1-44ペプチドを投与したマウスおよび生理食塩水を投与したマウスから末梢血を採取し、プラスチックプレート上で培養して接着性細胞のコロニーを得た。当該細胞について、コロニー単位でトランスクリプトーム解析を行い、得られたデータに基づいてICGSアルゴリズムでクラスタリングを行ったところ、図29のような結果を得た。また、当該クラスタリングの結果を簡略化して表したものが図30である。本願のスクリーニング方法においては、HA1-44ペプチドと同様の結果、例えば、図30と同様の予測細胞種(に対応する遺伝子セットの発現)によって特徴付けられるクラスターが形成され、各クラスターに属するコロニーの数が「クラスター1:生食群≒被験物質群、クラスター2:生食群<被験物質群、クラスター3:生食群>被験物質群、クラスター4:生食群>被験物質群」となるような結果をもたらす物質は、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として評価できる。
(2)HA1-44ペプチドを投与したマウスおよび生理食塩水を投与したマウスから採取した椎骨のPα細胞についてトランスクリプトーム解析を行い、得られたデータに基づいてIPAでパスウェイ解析を行った。その結果、HA1-44ペプチド投与群の椎骨Pα細胞では、対照群と比較してEIF2シグナリング、eIF4およびp70S6Kシグナリングの調節、およびmTORシグナリングに関連するパスウェイが活性化されていた(図31)。また、HA1-44ペプチド投与群の椎骨Pα細胞では、対照群と比較して細胞死関連遺伝子の発現が抑制されていた(図32)。
ヒト体内におけるHMGB1ペプチドの活性
Phase I 臨床試験において、HA1-44ペプチドの静脈内投与により循環血中におけるCD45陰性、TER-119陰性、且つPDGFRβ陽性細胞が増加することが示された(図33)。PDGFRβはヒト間葉系幹細胞のマーカーであるため、本明細書に記載の末梢血中のiCFPα細胞および椎骨CFPα細胞を規定するマーカー(複数のマーカーの組み合わせを含む)において「PDGFRα」を「PDGFRβ」と読み替えたものも、ヒトにおけるEMSC(末梢血中または椎骨内のコロニー形成性PDGFR陽性細胞)を規定するマーカー(複数のマーカーの組み合わせを含む)になるものと考えられる。
Claims (34)
- 以下のi)の特徴ならびにii)および/またはiii)の特徴を有する、コロニー形成性PDGFR陽性細胞:
i)骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を有する;
ii)表皮細胞への分化能を有する;
iii)P0系譜陽性である。 - PDGFRα陽性である、請求項1に記載の細胞。
- PDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する、請求項1または2に記載の細胞。
- PDGFRα陽性、CD34陽性、且つSca1陰性である、椎骨骨髄由来細胞。
- 以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、固相上で培養する工程;
2)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、固相上で培養した後、PDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、該末梢血からPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)壊死性組織損傷を有する対象から末梢血を採取し、該末梢血からPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。 - 以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血を固相上で培養する工程;
2)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血を固相上で培養した後、PDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血からPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)壊死性組織損傷を有する対象から採取された末梢血からPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。 - 以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)対象から椎骨骨髄を採取し、固相上で培養する工程;
2)対象から椎骨骨髄を採取し、固相上で培養した後、PDGFRα陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、およびSox1系譜陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)対象から椎骨骨髄を採取し、該骨髄からPDGFRα陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、およびSox1系譜陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)対象から椎骨骨髄を採取し、該骨髄からPDGFRα陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、およびSox1系譜陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。 - 以下の1)〜4)のいずれかの工程を含む、コロニー形成性PDGFR陽性細胞を製造する方法:
1)対象から採取された椎骨骨髄を固相上で培養する工程;
2)対象から採取された椎骨骨髄を固相上で培養した後、PDGFRα陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、およびSox1系譜陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
3)対象から採取された椎骨骨髄からPDGFRα陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、およびSox1系譜陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;
4)対象から採取された椎骨骨髄からPDGFRα陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、およびSox1系譜陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収し、該細胞を固相上で培養する工程。 - MSC血中動員物質を対象に投与し、該対象から末梢血を採取し、該採取された末梢血を固相上で培養することによって得られる、細胞集団。
- MSC血中動員物質が、配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項9に記載の細胞集団。
- MSC血中動員物質を対象に投与し、当該対象から末梢血を採取し、当該採取された末梢血を固相上で培養する工程を含む、細胞の製造方法。
- MSC血中動員物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養する工程を含む、細胞の製造方法。
- MSC血中動員物質が、配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項11または12に記載の方法。
- 1)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドを対象に投与し、2)該対象から椎骨の骨髄を採取し、3)該採取された骨髄を固相上で培養すること又は該採取された骨髄からPDGFRα陽性細胞をソーティングすることによって得られる、細胞集団。
- 1)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドを対象に投与し、2)該対象から椎骨の骨髄を採取し、3)該採取された骨髄を固相上で培養するか又は該採取された骨髄からPDGFRα陽性細胞をソーティングする工程を含む、細胞の製造方法。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドを投与された対象から採取された椎骨の骨髄を固相上で培養するか又は該採取された骨髄からPDGFRα陽性細胞をソーティングする工程を含む、細胞の製造方法。
- 以下の工程を含む、細胞集団の製造方法:
1)間葉系幹細胞を含む生体組織由来の細胞集団を固相上で培養する工程;
2)工程1)で得られたコロニーをサブクローニングする工程;
3)サブクローニングにより得られた細胞の一部を、骨、軟骨、および/または脂肪の分化誘導培地で培養し、骨、軟骨、および/または脂肪の分化マーカーの発現レベルを測定する工程;および
4)大腿骨の骨髄を固相上で培養することによって得られた間葉系幹細胞を、骨、軟骨、および/または脂肪の分化誘導培地で培養した場合の、骨、軟骨、および/または脂肪の分化マーカーの発現レベルと比較して、高い発現レベルを示した細胞クローンを選抜する工程。 - 以下の工程を含む、細胞集団の製造方法:
1)間葉系幹細胞を含む生体組織由来の細胞集団を固相上で培養する工程;および
2)PDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有するコロニーを選抜する工程。 - 工程2)が、Prx1系譜陰性のコロニーを選抜する工程である、請求項18に記載の方法。
- 間葉系幹細胞を含む生体組織由来の細胞集団から、PDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程を含む、細胞集団の製造方法。
- 以下の工程を含む、細胞集団の製造方法:
1)間葉系幹細胞を含む生体組織由来の細胞集団から、PDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性、およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を選択的に回収する工程;および
2)工程1)で回収された細胞を固相上で培養する工程。 - 請求項5〜8、11〜13、および15〜21のいずれかに記載の製造方法によって得られる細胞または細胞集団。
- 以下のi)の特徴ならびにii)および/またはiii)の特徴を有するコロニー形成性PDGFR陽性細胞を含有する、組織再生促進のために用いられる組成物:
i)骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞への分化能を有する;
ii)表皮細胞への分化能を有する;
iii)P0系譜陽性である。 - 中胚葉または外胚葉に由来する組織の再生促進のために用いられる、請求項23に記載の組成物。
- 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から末梢血を採取し、該末梢血に含まれるPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
2)被験物質を投与した対象から末梢血を採取し、該末梢血に含まれるPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
3)工程2)で計数された細胞の数が、工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から採取された末梢血に含まれるPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;
2)被験物質を投与された対象から採取された末梢血に含まれるPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
3)工程2)で計数された細胞の数が、工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドを対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)被験物質を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
6)工程5)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
7)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;
8)工程2)および6)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;および
9)工程7)の解析結果と工程8)の解析結果を比較し、工程5)で得られた細胞集団が、工程3)で得られた細胞集団と同じクラスター構成を有する場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)配列番号1のアミノ酸配列からなるペプチドを投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)被験物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
6)工程5)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
7)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;
8)工程2)および6)で得られた遺伝子発現データをプールし、クラスタリング解析を行う工程;および
9)工程7)の解析結果と工程8)の解析結果を比較し、工程5)で得られた細胞集団が、工程3)で得られた細胞集団と同じクラスター構成を有する場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られたコロニーの数を数える工程;
3)被験物質を対象に投与し、末梢血を採取し、固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られたコロニーの数を数える工程;および
5)工程4)で計数されたコロニーの数が、工程2)で計数されたコロニーの数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られたコロニーの数を数える工程;
3)被験物質を投与された対象から採取された末梢血を固相上で培養することにより、接着性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られたコロニーの数を数える工程;および
5)工程4)で計数されたコロニーの数が、工程2)で計数されたコロニーの数よりも多い場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 工程2)および4)において計数するコロニーが、PDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有するコロニーである、請求項29または30に記載のスクリーニング方法。
- 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象の椎骨から骨髄を採取し、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)被験物質を対象に投与し、椎骨から骨髄を採取し、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、パスウェイ解析を行う工程;および
6)工程5)の解析の結果、工程1)で得られた細胞集団と比較して、工程3)で得られた細胞集団において(i)EIF2シグナリング、eIF4およびp70S6Kシグナリングの調節、および/またはmTORシグナリングに関連するパスウェイが活性化されているか又は(ii)細胞死関連遺伝子の発現が抑制されている場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 以下の工程を含む、多能性幹細胞誘導物質のスクリーニング方法:
1)対象の椎骨から採取された骨髄から、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
2)工程1)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
3)被験物質を投与された対象の椎骨から採取された骨髄から、固相上での培養またはセルソーティングによりPDGFRα陽性の細胞集団を得る工程;
4)工程3)で得られた細胞集団についてコロニー又はシングルセル単位で網羅的遺伝子発現解析を行う工程;
5)工程2)および4)で得られた遺伝子発現データをプールし、パスウェイ解析を行う工程;および
6)工程5)の解析の結果、工程1)で得られた細胞集団と比較して、工程3)で得られた細胞集団において(i)EIF2シグナリング、eIF4およびp70S6Kシグナリングの調節、および/またはmTORシグナリングに関連するパスウェイが活性化されているか又は(ii)細胞死関連遺伝子の発現が抑制されている場合に、当該被験物質を、多能性幹細胞誘導活性を有する物質の候補として選択する工程。 - 以下の工程:
1)MSC血中動員物質を投与する前の対象から採取された末梢血中に含まれるPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程;および
2)MSC血中動員物質を投与した後の該対象から採取された末梢血中に含まれるPDGFRα陽性、PDGFRα系譜陽性、P0系譜陽性、Prx1系譜陰性、Sox1系譜陰性、LepR系譜陰性、CD34陽性およびSca1陰性から選択される1つ以上の特徴を有する細胞を計数する工程
を含み、工程2)で計数された細胞の数が工程1)で計数された細胞の数よりも多い場合に、該対象において組織再生が促進されることが示唆される、MSC血中動員物質の組織再生促進効果の判定方法。
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