KR20200091894A

KR20200091894A - 외배엽성 간엽계 줄기 세포 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20200091894A
Application number: KR1020207018355A
Authority: KR
Inventors: 가츠토 다마이; 다카시 심보; 에이지 사사키; 다케히코 야마자키
Original assignee: 가부시키가이샤 스템림; 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-07-31
Also published as: AU2018376452A1; CN111868231A; CN111868231B; EP3719117A1; US20200291359A1; CA3084013A1; EP3719117A4; JPWO2019107566A1; JP2023033613A; WO2019107566A1

Abstract

본 발명자들은, 괴사성 조직 손상에 의해 유도되어, 말초혈 중을 순환하는 외배엽성 간엽계 줄기 세포가 손상 조직의 재생에 기여하고 있음을 알아냈다. 이러한 발견에 기초하여, 외배엽성 간엽계 줄기 세포 및 그의 제조 방법, 그리고 괴사성 조직 손상에 의해 유도되는 말초혈 중의 세포를 지표로 하여 다능성 줄기 세포의 유도 활성을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

Description

외배엽성 간엽계 줄기 세포 및 그의 제조 방법

본 발명은 외배엽성 간엽계 줄기 세포 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 다능성 줄기 세포(multipotent stem cell) 유도 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

골수액 등에 포함되어 있는 간엽계 줄기 세포(MSC)는 뼈, 연골, 지방, 근육, 신경, 상피 등, 여러가지 조직으로 분화할 수 있는 능력(다분화능)을 갖고 있다는 점에서, 근년, MSC를 사용하여 재생 의료(세포 이식 치료)를 행하는 시도가 널리 이루어져 있다. 그러나, 지금까지 재생 의료에 사용되고 있는 MSC는, 체외에서 계대 배양을 계속하면 점차 증식 능력이나 다분화능을 잃어버리는 것이 알려져 있다. 그래서, 일반적인 MSC보다도 조직 재생을 촉진하는 능력이 높은 세포나, 당해 세포를 생체 내에서 활성화/유도하는 작용을 가진 물질을 알아내어, 종래의 재생 의료보다도 효과가 높은 치료 방법을 제공할 것이 요구되고 있다.

WO2012/147470

PNAS 2011 Apr 19; 108(16): 6609-14

본 발명의 목적은, 외배엽성 간엽계 줄기 세포 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 괴사성 조직 손상에 의해 유도되어, 말초혈 중을 순환하는 외배엽성 간엽계 줄기 세포(ectomesenchymal stem cells: EMSCs)가 손상 조직의 재생에 기여하고 있음을 알아냈다. 이것은, 본 발명자들이 이전에 보고한 「표피 수포증에 있어서, 박리 표피 내의 괴사 조직으로부터 방출되는 HMGB1이 말초혈 순환을 통하여 골수 간엽계 줄기 세포를 박리 표피부에 집적시켜, 손상 피부의 재생을 유도한다」라는 메커니즘의 발견(PNAS 2011 Apr 19; 108(16): 6609-14)에 추가로, 금회, 「파라바이오시스 모델의 한쪽에 표피 수포증 마우스의 피부를 이식하고, 다른쪽에 HMGB1의 단편 펩티드를 투여하면, PDGFRα 계보 양성의 세포가 피부 이식부에 집적하여 표피를 재생한다」, 「마우스에 연골 손상을 제작하고, HMGB1의 단편 펩티드를 투여하면, P0 계보 양성의 세포가 말초혈 순환을 통하여 연골 손상 부위에 집적하여, 연골 조직을 재생한다」라는 결과를 얻은 것 등에 기초한다. 또한, 말초혈 중의 EMSC의 소스가 골수 내의 특정한 PDGFRα 양성 세포일 가능성, 및 말초혈 중의 EMSC가 두부 신경 주름(cranial neural fold)의 표피측에서 발생하는 외배엽성 간엽계 세포(ectomesenchyme)를 발생학적 기원으로 하는 세포일 가능성을 시사하는 실험 결과도 얻었다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은, 외배엽성 간엽계 줄기 세포 및 그의 제조 방법, 그리고 괴사성 조직 손상에 의해 유도되는 말초혈 중의 세포를 지표로 하여, 다능성 줄기 세포의 유도 활성을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법의 발명을 완성시켰다.

본 발명자들은 지금까지, HMGB1 단백질의 A-박스의 N 말단의 위치 1 내지 44의 아미노산 서열(MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKK)을 포함하는 펩티드(이하, 「HA1-44 펩티드」라고 한다)가 간엽계 줄기 세포(MSC) 등의 다능성 줄기 세포를 골수로부터 말초혈 중에 동원하고, 여러가지 질환 모델에서 치료 효과를 발휘하는 것을 알아내었다. 금회, 본 발명자들은, HA1-44 펩티드의 투여에 의해 일어나는 생체의 반응((i) 말초혈 중의 PDGFRα 양성 세포 집단의 구성이 변화함, (ii) 말초혈 중의 PDGFRα 양성 세포의 수가 증가함, (iii) 추골 골수 내의 PDGFRα 양성 세포의 유전자 발현이 변화함)을 새롭게 알아냈다. 그리고, 이들 반응을 지표로 하여 HA1-44 펩티드와 마찬가지의 활성을 갖는 물질, 즉 다능성 줄기 세포 유도 물질을 스크리닝하는 방법을 알아내고, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 피검 물질을 동물 등의 대상에게 투여하고, 상기 (i) 내지 (iii) 중 어느 것과 동일한 반응이 일어나는지 여부를 지표로 하여, 해당 피검 물질이 HA1-44 펩티드와 마찬가지의 활성을 갖는(다능성 줄기 세포의 유도 및/혹은 동원, 그리고/또는 조직 재생을 촉진하는)지 여부를 판정하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 또한, HA1-44 펩티드에 의해 말초혈 중 및 손상 조직에 동원되어, 해당 조직의 재생에 기여하는 세포를 상세하게 해석한 결과, (i) HA1-44 펩티드에 의한 조직 재생 촉진에 기여하고 있는 말초혈 중의 세포는 추골 골수 유래의 PDGFRα 양성 세포인 것, (ii) 추골 골수 유래 PDGFRα 양성 세포는 다른 뼈의 골수에서 유래되는 PDGFRα 양성 세포보다도 뼈, 연골, 및/또는 지방으로의 분화능이 높은 것, (iii) 추골 골수 유래 PDGFRα 양성 세포와 동일한 발생 계보(Prx1 계보 음성)의 PDGFRα 양성 세포가 다른 뼈의 골수 중에도 조금 존재하는 것을 알아냈다. 본 발명자들은, 이러한 지견에 기초하여, 골수나 말초혈 등의 MSC를 포함하는 생체 조직에서 유래되는 세포 집단을 디쉬 상에서 배양하여 콜로니를 형성시키고, 각 콜로니를 서브 클로닝하고, 뼈, 연골, 및/또는 지방으로의 높은 분화능을 나타내는 세포 클론을 선발함으로써, 종래법(골수를 채취하여 디쉬 상에서 배양한다)으로 취득되는 MSC보다도 조직 재생 촉진 능력이 높은 다능성 줄기 세포를 얻을 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명은 상세하게는, 이하에 관한 것이다.

A) 외배엽성 간엽계 줄기 세포.

B) 외배엽성 간엽계 줄기 세포의 제조 방법.

C) 항목 B)에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 세포.

D) MSC 혈중 동원 물질에 의해 유도되는 말초혈 중의 세포 또는 세포 집단.

E) 고이동성 그룹 박스(High-mobility group box 1(HMGB1)) 단백질의 A-박스의 N 말단의 위치 1-44의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 포함하는 펩티드(이하, 「HA1-44 펩티드」라고도 칭한다)에 의해 유도되는 추골 골수 내의 세포 또는 세포 집단.

F) 항목 D) 또는 E)에 기재된 세포 또는 세포 집단의 제조 방법.

G) 간엽계 줄기 세포(MSC)를 포함하는 생체 조직으로부터, 추골 골수 내의 PDGFRα 양성 세포와 마찬가지의 높은 조직 재생 촉진 능력을 갖는 세포를 취득, 분리 및/또는 농축하는 방법.

H) 항목 G)에 기재된 방법에 의해 얻어지는 세포 또는 세포 집단.

I) 외배엽성 간엽계 줄기 세포를 함유하는, 조직 재생 촉진을 위하여 사용되는 조성물.

J) 괴사성 조직 손상에 의해 유도되는 말초혈 중의 세포를 지표로 하여, 다능성 줄기 세포의 유도 활성을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법.

K) HA1-44 펩티드를 양성 대조로서 사용하고, 생체 내에서 조직 재생에 기여하고 있는 다능성 줄기 세포의 반응을 지표로 하여, 다능성 줄기 세포의 유도 활성을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법.

L) 말초혈 중의 콜로니 형성성 Pα 세포를 지표로 하여, MSC 혈중 동원 물질을 투여한 대상에게 있어서 기대되는 조직 재생 촉진 효과를 판정하는 방법.

본 발명은 보다 상세하게는, 이하에 관한 것이다.

a) 이하의 i)의 특징 그리고 ii) 및/또는 iii)의 특징을 갖는 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포:

i) 골아 세포, 지방 세포, 및 연골 세포로의 분화능을 갖는다;

ii) 표피 세포로의 분화능을 갖는다;

iii) P0 계보 양성이다.

b) PDGFRα 양성인, 항목 a)에 기재된 세포.

c) Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는, 항목 a) 또는 b)에 기재된 세포.

d) PDGFRα 양성, CD34 양성, 또한 Sca1 음성인, 추골 골수 유래 세포.

e) 이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:

1) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상(固相) 상에서 배양하는 공정;

2) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양한 후, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

3) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈로부터 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

4) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈로부터 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.

f) 이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:

1) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정;

2) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양한 후, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

3) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈로부터 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

4) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈로부터 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.

g) 이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:

1) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 고상 상에서 배양하는 공정;

2) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 고상 상에서 배양한 후, Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 및 Sox1^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

3) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 해당 골수로부터 Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 및 Sox1^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

4) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 해당 골수로부터 Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 및 Sox1^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.

h) 이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:

1) 대상으로부터 채취된 추골 골수를 고상 상에서 배양하는 공정;

2) 대상으로부터 채취된 추골 골수를 고상 상에서 배양한 후, Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 및 Sox1^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

3) 대상으로부터 채취된 추골 골수로부터 Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 및 Sox1^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;

4) 대상으로부터 채취된 추골 골수로부터 Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 및 Sox1^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.

i) MSC 혈중 동원 물질을 대상에게 투여하고, 해당 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써 얻어지는, 세포 집단.

j) MSC 혈중 동원 물질이, HA1-44 펩티드인, 항목 i)에 기재된 세포 집단.

k) MSC 혈중 동원 물질을 대상에게 투여하고, 당해 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 당해 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.

l) MSC 혈중 동원 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.

m) MSC 혈중 동원 물질이, HA1-44 펩티드인, 항목 k) 또는 l)에 기재된 방법.

n) 1) HA1-44 펩티드를 대상에게 투여하고, 2) 해당 대상으로부터 추골의 골수를 채취하고, 3) 해당 채취된 골수를 고상 상에서 배양하는 것 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류함으로써 얻어지는, 세포 집단.

o) 1) HA1-44 펩티드를 대상에게 투여하고, 2) 해당 대상으로부터 추골의 골수를 채취하고, 3) 해당 채취된 골수를 고상 상에서 배양하거나 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.

p) HA1-44 펩티드가 투여된 대상으로부터 채취된 추골의 골수를 고상 상에서 배양하거나 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.

q) 이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법:

1) MSC를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단을 고상 상에서 배양하는 공정;

2) 공정 1에서 얻어진 콜로니를 서브 클로닝하는 공정;

3) 서브 클로닝에 의해 얻어진 세포의 일부를, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 유도 배지에서 배양하고, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 마커의 발현 레벨을 측정하는 공정; 및

4) 대퇴골의 골수를 고상 상에서 배양함으로써 얻어진 MSC를, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 유도 배지에서 배양한 경우의, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 마커의 발현 레벨과 비교하여, 높은 발현 레벨을 나타낸 세포 클론을 선발하는 공정.

r) 이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법:

1) MSC를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단을 고상 상에서 배양하는 공정; 및

2) Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 콜로니를 선발하는 공정.

s) 공정 2가, Prx1 계보 음성의 콜로니를 선발하는 공정인, 항목 r)에 기재된 방법.

t) MSC를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단으로부터, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법.

u) 이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법:

1) MSC를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단으로부터, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정; 및

2) 공정 1)에서 회수된 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.

v) 청구항 * 내지 *에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 또는 세포 집단.

w) 이하의 i)의 특징 그리고 ii) 및/또는 iii)의 특징을 갖는 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 함유하는, 조직 재생 촉진을 위하여 사용되는 조성물:

ii) 표피 세포로의 분화능을 갖는다;

iii) P0 계보 양성이다.

x) 중배엽 또는 외배엽에서 유래되는 조직의 재생 촉진을 위하여 사용되는, 청구항 *에 기재된 조성물.

y) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

1) 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈에 포함되는 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정;

2) 피검 물질을 투여한 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈에 포함되는 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정; 및

3) 공정 2)에서 계수된 세포의 수가, 공정 1)에서 계수된 세포의 수보다도 많은 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.

z) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

1) 대상으로부터 채취된 말초혈에 포함되는 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정;

2) 피검 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈에 포함되는 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정; 및

aa) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

1) 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

2) 공정 1에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;

3) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(HA1-44 펩티드)를 대상에게 투여하고, 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

4) 공정 3에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;

5) 피검 물질을 대상에게 투여하고, 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

6) 공정 5에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;

7) 공정 2 및 4에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정;

8) 공정 2 및 6에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정; 및

9) 공정 7의 해석 결과와 공정 8의 해석 결과를 비교하여, 공정 5에서 얻어진 세포 집단(피검 물질 투여군)이 공정 3에서 얻어진 세포 집단(HA1-44 펩티드 투여군)과 동일한 클러스터 구성을 갖는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.

ab) 공정 3에 있어서 HA1-44 펩티드 대신에 피검 물질이 투여되고, 또한 공정 5에 있어서 피검 물질 대신에 HA1-44 펩티드가 투여되는, 항목 aa)에 기재된 방법.

ac) 망라적 유전자 발현 해석이 RNA 시퀀싱(RNA-seq)인, 항목 aa) 또는 ab)에 기재된 방법.

ad) 클러스터링 해석이 iterative clustering and guide-gene selection(ICGS) 알고리즘을 사용하여 행하여지는, 항목 aa) 내지 ac) 중 어느 하나에 기재된 방법.

ae) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

1) 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

2) 공정 1)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;

3) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(HA1-44 펩티드)가 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

4) 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;

5) 피검 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

6) 공정 5)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;

7) 공정 2) 및 4)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정;

8) 공정 2) 및 6)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정; 및

9) 공정 7)의 해석 결과와 공정 8)의 해석 결과를 비교하여, 공정 5)에서 얻어진 세포 집단이, 공정 3)에서 얻어진 세포 집단과 동일한 클러스터 구성을 갖는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.

af) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

2) 공정 1)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정;

3) 피검 물질을 대상에게 투여하고, 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

4) 공정 3)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정; 및

5) 공정 4)에서 계수된 콜로니의 수가, 공정 2)에서 계수된 콜로니의 수보다도 많은 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.

ag) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

2) 공정 1)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정;

3) 피검 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;

4) 공정 3)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정; 및

ah) 공정 2) 및 4)에 있어서 계수하는 콜로니가, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 콜로니인, 항목 ae) 또는 af)에 기재된 스크리닝 방법.

ai) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

1) 대상의 추골로부터 골수를 채취하고, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;

3) 피검 물질을 대상에게 투여하고, 추골로부터 골수를 채취하고, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;

5) 공정 2 및 4에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 패스웨이 해석을 행하는 공정; 및

6) 공정 5의 해석 결과, 공정 1에서 얻어진 세포 집단(미처치군)과 비교하여, 공정 3에서 얻어진 세포 집단(피검 물질 투여군)에 있어서 (i) EIF2 시그널링, eIF4 및 p70S6K 시그널링의 조절, 및/또는 mTOR 시그널링에 관련하는 패스웨이가 활성화되어 있거나 또는 (ii) 세포사 관련 유전자의 발현이 억제되어 있는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.

aj) 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:

1) 대상의 추골로부터 채취된 골수로부터, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;

3) 피검 물질이 투여된 대상의 추골로부터 채취된 골수로부터, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;

5) 공정 2) 및 4)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 패스웨이 해석을 행하는 공정; 및

6) 공정 5)의 해석의 결과, 공정 1)에서 얻어진 세포 집단과 비교하여, 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 있어서 (i) EIF2 시그널링, eIF4 및 p70S6K 시그널링의 조절, 및/또는 mTOR 시그널링에 관련하는 패스웨이가 활성화되어 있거나 또는 (ii) 세포사 관련 유전자의 발현이 억제되어 있는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.

ak) 망라적 유전자 발현 해석이 RNA 시퀀싱(RNA-seq)인, 항목 ai) 또는 aj)에 기재된 방법.

al) 이하의 공정:

1) MSC 혈중 동원 물질을 투여하기 전의 대상으로부터 채취된 말초혈 중에 포함되는 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정; 및

2) MSC 혈중 동원 물질을 투여한 후의 해당 대상으로부터 채취된 말초혈 중에 포함되는 Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정;

을 포함하고, 공정 2)에서 계수된 세포의 수가 공정 1)에서 계수된 세포의 수보다도 많은 경우에, 해당 대상에게 있어서 조직 재생이 촉진되는 것이 시사되는, MSC 혈중 동원 물질의 조직 재생 촉진 효과의 판정 방법.

본 발명에 따르면, 외배엽성 간엽계 줄기 세포 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이 가능해진다. 또한, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이 가능해진다.

도 1은 피부판(Skin flap)을 제작한 마우스와 제작하고 있지 않은 마우스 각각에 대해서, 말초혈 중의 Pα 세포의 수와 HMGB1 농도를 플롯한 도면이다.
도 2는 마우스의 말초혈을 배양하여 얻어진 콜로니의 사진, 및 말초혈 1mL당으로 환산한 CFU 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 마우스 말초혈로부터 얻은 iCFPα 세포에 대해서, 골아 세포, 지방 세포, 연골 세포, 및 케라틴 5 발현 세포로의 분화 유도를 행한 결과를 나타내는 사진이다. 골아 세포는 ALP 염색, 지방 세포는 오일 레드(Oil Red)-O 염색, 연골 세포는 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 염색, 케라틴 5 발현 세포는 리포터 단백 tdTomato의 형광에 의해 각각 검출하였다.
도 4는 iCFPα 세포에 대하여 단일 세포 트랜스크립톰 해석을 행하고, 얻어진 데이터에 기초하여 클러스터링 해석을 행한 결과를 도시하는 도면이다. 좌측에 표시되어 있는 것은, 유전자 발현 프로파일(특정한 유전자 세트의 고발현 등)에 기초하여 예측된 세포종이다.
도 5는 iCFPα 세포를 콜로니 단위로 트랜스크립톰 해석하고, 클러스터링 해석을 행한 결과를 도시하는 도면이다. 좌측에 표시되어 있는 것은, 유전자 발현 프로파일(특정한 유전자 세트의 고발현 등)에 기초하여 예측된 세포종이다. 또한, 하나의 열이 하나의 콜로니에 대응한다.
도 6은 Pα-H2B-GFP 마우스의 말초혈을 배양하여 얻어진 콜로니 형성 세포의 사진이다.
도 7은 iCFPα 세포에 대해서, Pα 계보, P0 계보, Prx1 계보, Sox1 계보 및 LepR 계보의 음성/양성률을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 피부판을 제작한 마우스와 제작하고 있지 않은 마우스 각각에 대해서, 말초혈로부터 얻은 콜로니 형성 세포의 CFU 활성을 Prx1 계보별로 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스의 대퇴골, 추골, 흉골, 장골, 고관절(대퇴골 골두 및 구개) 및 두개골의 골수 조직에 존재하는 세포에 대해서, Pα 발현 및 Prx1 계보를 검출한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스의 대퇴골, 추골, 흉골 및 장골의 골수 세포를 FACS로 해석한 결과를 도시하는 도면이다.
도 11은 추골 골수 유래의 CFPα 세포에 대해서, P0 계보, Prx1 계보, Sox1 계보 및 LepR 계보를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 대퇴골 골수 유래의 CFPα 세포에 대해서, P0 계보, Prx1 계보, Sox1 계보 및 LepR 계보를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 추골 및 대퇴골의 골수 유래 CFPα 세포에 대해서, (a) 콜로니의 사진, (b) 콜로니수, 및 (c) 증식 곡선을 나타낸다. (c)의 횡축은 계대수를 나타낸다(P0=초대 배양).
도 14는 추골 및 대퇴골의 골수 유래 CFPα 세포를 지방 세포로의 분화 유도 조건 하에서 배양하고, 지방 세포의 분화 마커의 발현을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 추골 및 대퇴골의 골수 유래 CFPα 세포를 골아 세포로의 분화 유도 조건 하에서 배양하고, 골아 세포의 분화 마커의 발현을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 (a) 추골 및 대퇴골의 골수 유래 CFPα 세포를 연골 세포로의 분화 유도 조건 하에서 배양하고, 연골 세포의 분화 마커의 발현을 조사한 결과를 나타내는 그래프, 그리고 (b) 형성된 연골 펠릿의 사진 및 (c) 연골 펠릿의 중량을 도시하는 도면이다.
도 17은 추골 골수 유래 CFPα 세포를 케라티노사이트로의 분화 유도 조건 하에서 배양함으로써 얻어진 K5 발현 세포의 사진이다.
도 18은 대퇴골 골수 유래 CFPα 세포를 케라티노사이트로의 분화 유도 조건 하에서 배양함으로써 얻어진 K5 발현 세포의 사진이다.
도 19는 추골 및 대퇴골의 골수 내 Pα 세포에 대하여 단일 세포 트랜스크립톰 해석을 행하고, 얻어진 데이터에 기초하여 클러스터링 해석을 행한 결과를 도시하는 도면이다.
도 20은 추골 골수 내 Pα 세포를 Sca1과 CD34의 발현을 지표로 하여 FACS로 4종의 집단으로 분리하고, CFU 어세이를 행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 말초혈 중의 iCFPα 세포를 추골 및 대퇴골의 Pα 세포와 함께 클러스터링 해석에 제공한 결과를 도시하는 도면이다.
도 22는 골수 내 S34-MSC 클러스터의 세포에 있어서의 Procr의 발현을 도시하는 도면이다.
도 23은 Pα-H2B-GFP 마우스의 경추, 흉추, 요추 및 대퇴골의 골수에 있어서의 Sca1⁺CD34⁺ 세포의 존재량(PDGFRα⁺CD45^- 생세포에서 차지하는 비율)을 나타내는 그래프이다.
도 24는 말초혈을 배양하여 얻어진 콜로니 형성 세포의 사진(a), 및 해당 세포의 말초혈 1mL당으로 환산한 CFU 활성을 나타내는 그래프(b)이다.
도 25는 파라바이오시스 모델의 개략을 도시하는 도면(a), 및 HA1-44 펩티드 투여 후의 이식 피부 조직의 관찰 결과를 나타내는 사진(b)이다. Pα 세포는 YFP의 형광, 7형 콜라겐은 항체에서 각각 검출하였다.
도 26은 파라바이오시스 모델의 개략을 도시하는 도면(a), HA1-44 펩티드 투여 후의 이식 피부 조직의 관찰 결과를 나타내는 사진(b), 및 해당 이식 피부 조직 내에 있어서의 PDGFRα⁺ 세포의 비율을 나타내는 그래프(c)이다. PDGFRα의 발현은 GFP의 형광, Prx1 계보는 리포터 단백 tdTomato의 형광에 의해 각각 검출하였다.
도 27은 파라바이오시스 모델의 개략을 도시하는 도면(a), 및 대조군(생리 식염수 투여)과 HA1-44 펩티드 투여군에 있어서의 무릎 연골 손상 부위의 조직 관찰 결과를 나타내는 사진(b)이다. P0^lin+의 세포를 리포터 단백 tdTomato의 형광으로 검출하였다.
도 28은 무릎 연골 결손 제작으로부터 2, 4, 8 및 12주일 후에 있어서의, 대조군(생리 식염수 투여) 및 HA1-44 펩티드 투여군의 무릎 연골 손상 부위의 조직 관찰 결과(사프라닌 O 염색)를 나타내는 사진이다. 화살촉은, 유리 연골의 재생이 관찰된 부분을 나타낸다.
도 29는 마우스의 말초혈을 배양하여 얻어진 세포를 콜로니 단위로 트랜스크립톰 해석하고, 클러스터링 해석을 행한 결과를 도시하는 도면이다. 좌측에 표시되어 있는 것은, 유전자 발현 프로파일(특정한 유전자 세트의 고발현 등)에 기초하여 예측된 세포종이다. 하나의 열이 하나의 콜로니에 대응한다. HA1-44 펩티드 투여군의 마우스 유래 콜로니에 대응하는 열 밑에는 사각을 표시하였다.
도 30은 마우스 말초혈 유래 콜로니의 클러스터링 해석 결과를 간략화한 표이다.
도 31은 HA1-44 펩티드 투여군 및 생리 식염수 투여군의 마우스에 있어서의 추골 Pα 세포의 트랜스크립톰 해석 데이터에 기초하여 행한 패스웨이 해석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 32는 HA1-44 펩티드 투여군 및 생리 식염수 투여군의 마우스에 있어서의 추골 Pα 세포의 트랜스크립톰 해석 데이터에 기초하여 행한 패스웨이 해석(function 해석)의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 33은 HA1-44 펩티드 투여 전, 투여 8시간 후, 및 투여 24시간 후에 채취한 인간 말초혈 단핵구 분획에 있어서의 CD45 음성, TER-119 음성, 또한 PDGFRβ 양성 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.

본원에 있어서, 「세포」란, 문맥에 따라서 1개의 세포 또는 복수개의 세포를 의미한다. 예를 들어, 본원에 있어서의 세포는, 1종류의 세포를 포함하는 세포 집단이어도 되고, 복수종의 세포를 포함하는 세포 집단이어도 된다. 예를 들어, 「골아 세포, 지방 세포 및 연골 세포로의 분화능을 갖는 세포」라는 표현은, 1개/1종의 세포(에서 유래하는 균일한 세포 집단)가 이들 3개의 세포종으로의 분화능을 갖는 경우 뿐만 아니라, 복수종의 세포를 포함하는 세포 집단이, 세포 집단 전체로서 당해 3개의 세포종으로의 분화능을 발휘하는 경우도 포함한다.

본원에 있어서, 외배엽성 간엽계 줄기 세포(EMSC)란, 콜로니 형성능, 그리고 간엽계의 3 계보(골아 세포, 지방 세포, 연골 세포)로의 분화능을 갖고, 또한 외배엽 유래인 것이 시사되는 PDGFR 양성 세포를 의미한다. 당해 세포가 외배엽 유래인 것은, 예를 들어 P0^lin+인 것에 의해 시사된다. 일 형태에 있어서, EMSC은, 표피 세포(구체적으로는, K5 양성 케라티노사이트)로의 분화능도 갖는다. EMSC를 분화할 수 있는 표피 세포로서는, 케라티노사이트, 케라틴 5(K5)를 발현하는 세포(K5 양성 세포), K5를 발현하는 케라티노사이트(K5 양성 케라티노사이트)를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, K5 양성 케라티노사이트로의 분화능을 갖는지의 여부는, 케라티노사이트의 분화 유도 조건 하에서 배양한 경우에 K5를 발현하는 세포로 분화할 수 있는지 여부로 판정할 수 있다.

EMSC를 특징짓는 마커(세포 계보 마커를 포함한다)로서는, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-를 들 수 있다.

EMSC의 예로서는,

(a) 괴사성 조직 손상(피부판 등)에 응답하여 말초혈 중에 있어서의 존재량이 증대하는 콜로니 형성성 Pα 세포(necrotic injury-induced colony-forming Pα cells; 이하, 「iCFPα 세포」라고도 칭한다), 및

(b) 추골 골수에 포함되는 콜로니 형성성 Pα 세포(이하, 「추골 CFPα 세포」 또는 「추골 유래 CFPα 세포」라고도 칭한다)를 들 수 있다.

iCFPα 세포는, i) 콜로니 형성능을 갖고, 또한 ii) 골아 세포, 지방 세포 및 연골 세포로의 분화능을 갖고 있다. 따라서, iCFPα 세포는 간엽계 줄기 세포로서의 성질을 갖고 있다고 할 수 있다. 또한, iCFPα 세포는, 표피 세포(K5 양성 케라티노사이트)로의 분화능을 갖고, 또한 P0^lin+이다. 따라서, iCFPα 세포는 외배엽성 간엽계 줄기 세포라고 할 수 있다.

iCFPα 세포를 특징짓는 마커로서는, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-를 들 수 있다.

추골 유래 CFPα 세포는, i) 콜로니 형성능을 갖고, 또한 ii) 골아 세포, 지방 세포 및 연골 세포로의 분화능을 갖고 있다. 따라서, 추골 유래 CFPα 세포는 간엽계 줄기 세포로서의 성질을 갖고 있다고 할 수 있다. 또한, 추골 유래 CFPα 세포는, 표피 세포(K5 양성 케라티노사이트)로의 분화능을 갖고, 또한 P0^lin+이다. 따라서, 추골 유래 CFPα 세포는 외배엽성 간엽계 줄기 세포라고 할 수 있다.

추골 유래 CFPα 세포를 특징짓는 마커로서는, Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 및 Sox1^lin-을 들 수 있다. 또한, 추골 유래 CFPα 세포에는, LepR^lin+ 세포와 LepR^lin- 세포가 포함된다. 이 중 LepR^lin- 세포는, 말초혈 중의 iCFPα 세포에 보다 가까운 성질을 나타내는 것으로 생각된다.

본원은, EMSC의 일 형태로서, 이하의 i)의 특징 그리고 ii) 및/또는 iii)의 특징을 갖는 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제공한다:

ii) 표피 세포로의 분화능을 갖는다;

iii) P0 계보 양성이다.

일 실시 형태에 있어서, 상기 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포는, PDGFRα 양성 세포이다. 다른 실시 형태에 있어서, 상기 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포는, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포이다.

상기 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포의 추가적인 특징의 예로서, 이하의 것이 들 수 있다:

·Pα⁺이다;

·CD34⁺이다;

·Sca1^-이다;

·CD34⁺, 또한 Sca1^-이다;

·CD34⁺이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·CD34⁺, 또한 Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·P0^lin+, 또한 Prx1^lin-이다;

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-이다;

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·Pα^lin+, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-이다;

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-이다;

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 CD34⁺이다;

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 Sca1^-이다;

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 또한 Sca1^-이다;

·Pα⁺, 또한 CD34⁺이다;

·Pα⁺, 또한 Sca1^-이다;

·Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1^-이다;

·Pα⁺, 또한 CD34⁺이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·Pα⁺, 또한 Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·Pα⁺이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는다;

·Pα⁺, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-이다;

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-이다;

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-이다;

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-이다;

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-이다;

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 CD34⁺이다;

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 Sca1^-이다;

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 또한 Sca1^-이다.

일 실시 형태에서는, 본 발명은 PDGFRα 양성, CD34 양성, 또한 Sca1 음성인, 추골 골수 유래 세포에 관한 것이다. 당해 세포는, 마커의 공통성으로부터, 말초혈 중의 iCFPα 세포에 상당하는 세포인 것으로 추측된다. 따라서, iCFPα 세포와 마찬가지의 성질을 나타낼 것이 기대된다. 당해 추골 골수 유래 세포는, 예를 들어, 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1^-의 세포를 선택적으로 회수함으로써 얻을 수 있다.

또한, 본원은, 골수 유래 Pα⁺CD34⁺Sca1⁺ 세포를 제공한다. 또한 본원은, 골수로부터 Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1⁺의 세포를 선택적으로 회수하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법을 제공한다.

Pα⁺CD34⁺Sca1⁺ 세포의 소스로서 사용할 수 있는 골수로서는, 추골(경추, 흉추, 요추) 및 대퇴골의 골수를 들 수 있다. 하나의 양태에 있어서, Pα⁺CD34⁺Sca1⁺ 세포의 소스로서 사용할 수 있는 골수는, 추골의 골수이다. 다른 양태에 있어서, Pα⁺CD34⁺Sca1⁺ 세포의 소스로서 사용할 수 있는 골수는, 경추의 골수이다.

본 발명자들은 또한, Pα⁺CD34⁺Sca1⁺ 세포가, 외배엽성 간엽계 세포를 발생학적 기원으로 하는 뼈의 골수 중에도 많이 존재하는 것을 알아냈다. 따라서, 본원은, 외배엽성 간엽계 세포를 발생학적 기원으로 하는 뼈의 골수에서 유래되는 Pα⁺CD34⁺Sca1⁺ 세포를 제공한다. 또한, 본원은, 외배엽성 간엽계 세포를 발생학적 기원으로 하는 뼈의 골수로부터, Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1⁺의 세포를 선택적으로 회수하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법을 제공한다. 외배엽성 간엽계 세포를 발생학적 기원으로 하는 뼈로서는, 전두골, 비골, 협골, 상악골, 구개골, 하악골 등을 들 수 있다.

일 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다:

1) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양하는 공정;

괴사성 조직 손상으로서는, 피부판, 표피 수포증에 있어서의 표피 박리 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 피부판에서는, 판(flap)의 선단 부분으로의 혈액 공급이 부족하여, 허혈 상태로 됨으로써, 세포/조직의 괴사가 발생한다. 표피 수포증에 있어서는, 박리한 표피 조직에 괴사가 발생한다.

말초혈을 고상 상에서 배양하는 경우, 배양 전에 말초혈로부터 적혈구를 제거해도 된다. 적혈구의 제거는, 당업자에게 공지된 용혈 시약을 사용하는 방법, 헤타스타치(hetastarch)로 말초혈을 처리하여 유핵 세포를 포함하는 상청을 회수하는 방법 등에 의해 행할 수 있다.

상기 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법의 공정 2), 3) 또는 4)에 있어서 선택적으로 회수하는 세포의 예로서는, 이하를 들 수 있다:

·Pα⁺의 세포

·CD34⁺의 세포

·Sca1^-의 세포

·CD34⁺, 또한 Sca1^-의 세포

·CD34⁺이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·CD34⁺, 또한 Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 CD34⁺의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα⁺, 또한 CD34⁺의 세포

·Pα⁺, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα⁺, 또한 CD34⁺이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·Pα⁺, 또한 Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1^-이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·Pα⁺이며, 또한 Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포

·Pα⁺, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 CD34⁺의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 또한 Sca1^-의 세포.

본원에 있어서, 세포를 「선택적으로 회수」하는 방법으로서는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다:

(1) 세포 분류기 등을 사용하여, 원하는 마커 분자를 발현하는 세포를 「분류」 하는 방법,

(2) 눈으로 보아, 또는 유전자 발현 해석의 결과에 기초하여, 원하는 마커 분자를 발현하는 세포/콜로니를 「회수」, 「선발」, 「분리」, 「단리」 또는 「농축」하는 방법.

여기에 말하는 마커 분자로서는, 표면 마커(세포 표면 항원), 계보(lineage) 마커 유전자의 리포터 단백 등을 들 수 있다.

일 실시 형태에서는, 상기 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법의 공정 2), 3) 또는 4)에 있어서, Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin- 및 LepR^lin-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수해도 된다.

·P0^lin+의 세포

·Prx1^lin-의 세포

·Sox1^lin-의 세포

·P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·P0^lin+, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, 또한 P0^lin+의 세포

·Pα⁺, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα⁺, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·LepR^lin-의 세포

·P0^lin+, 또한 LepR^lin-의 세포

·Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·P0^lin+, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포.

콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포의 소스로서 사용할 수 있는 추골로서는, 경추, 흉추, 요추를 들 수 있다. 일 형태에 있어서, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포의 소스로서 사용하는 추골은, 경추이다.

또한, 발명자들이 지금까지 행한 실험에 있어서, 추골 골수를 고상 상에서 배양하여 얻어지는 콜로니는, 모두 PDGFR 양성인 것을 확인하고 있다.

본원에 있어서, 대상으로부터 채취되는 「골수」란, 여러가지 골수 세포를 포함하는 골수 조직을 의미한다.

하나의 양태에 있어서, 본 발명은 괴사성 조직 손상에 의해 유도되는 말초혈 중의 세포를 지표로 하여, 다능성 줄기 세포의 유도 활성을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은, 괴사성 조직 손상(예를 들어 피부판)에 의해 말초혈 중의 iCFPα 세포가 증가하는 것, 및 HA1-44 펩티드의 투여에 의해 말초혈 중의 Pα⁺P0^lin+Prx1^lin- 세포(즉, iCFPα 세포를 포함하는 세포 집단)가 증가하는 것을 알아냈다. 따라서, 말초혈 중에 있어서의 iCFPα 세포의 증대를 지표로 하면, 증식능(콜로니 형성능)과 다분화능(multi-lineage differentiation potency)을 갖는 다능성 줄기 세포(예를 들어 MSC)의 말초혈 중에 있어서의 존재량을 증대시키는 작용을 가진 물질(이하, 다능성 줄기 세포 동원 물질, 또는 다능성 줄기 세포 유도 물질이라고도 칭한다)을 스크리닝할 수 있다.

일 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다:

상기 스크리닝 방법에 있어서 계수하는 세포의 특징에 대해서, 표면 마커(Pα, CD34, Sca1)는 항체 등을 사용하여 검출할 수 있다. 혹은, 표면 마커 유전자의 프로모터 하류에 리포터 유전자를 삽입한 실험 동물이면, 리포터 유전자의 산물(형광 단백 등)을 지표로 하여 검출할 수 있다. 계보 마커(Pα, P0, Prx1, Sox1, LepR)는 목적 유전자의 계보 추적(lineage tracing)을 가능하게 하는 DNA 구조/컨스트럭트(Cre-loxP계 등)를 갖는 트랜스제닉 동물을 사용함으로써 검출할 수 있다.

상기 스크리닝 방법의 공정 1) 및 2)에 있어서 계수하는 세포의 예로서는, 이하를 들 수 있다:

·Pα⁺의 세포

·CD34⁺의 세포

·Sca1^-의 세포

·CD34⁺, 또한 Sca1^-의 세포

·P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 CD34⁺의 세포

·Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα⁺, 또한 CD34⁺의 세포

·Pα⁺, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα⁺, CD34⁺, 또한 Sca1^-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, 또한 Prx1^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

·Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, 또한 LepR^lin-의 세포

하나의 양태에 있어서, 본 발명은 HA1-44 펩티드를 양성 대조로서 사용하고, 생체 내에서 조직 재생에 기여하고 있는 다능성 줄기 세포의 반응을 지표로 하여, 다능성 줄기 세포의 유도 활성을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시 형태에서는, 공정 3에 있어서 HA1-44 펩티드 대신에 피검 물질이 투여되고, 또한 공정 5에 있어서 피검 물질 대신에 HA1-44 펩티드가 투여된다. 즉, HA1-44 펩티드와 피검 물질은, 어느 쪽을 먼저 대상에게 투여해도 된다. 공정 1, 3 및 5에 있어서의 대상은, 동일한 개체여도 되고, 별도의 개체여도 된다. 예를 들어, 동일 계통(strain)의 동물을 3마리 준비하고, 1마리는 물질을 투여하지 않고(또는 용매만 투여), 별도의 1마리에 HA1-44 펩티드를 투여하고, 나머지 1마리에 피검 물질을 투여한 후, 각 개체로부터 말초혈을 채취하여 접착성의 세포 집단의 취득, 망라적 유전자 발현 해석 및 클러스터링 해석을 행해도 된다. 공정 1에 있어서의 대상은, 공정 3 및 5에 있어서 각각 HA1-44 펩티드 및 피검 물질을 투여할 때에 사용하는 용매와 동일한 용매만을 투여한 대상이어도 된다.

다른 실시 형태에서는, HA1-44 펩티드 대신에 HA1-44 펩티드의 변이체, 수식체, 또는 태그 구비 HA1-44 펩티드가 사용된다. 변이체는, HA1-44 펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 수개, 예를 들어, 1 내지 5개, 바람직하게는, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이, 치환, 삽입, 결실 및/또는 부가되어 있는 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 변이체는, HA1-44 펩티드의 아미노산 서열에 대하여 로컬 얼라인먼트(Local Alignment)를 실시한 경우에, 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 더욱 바람직하게는 70％ 이상, 보다 바람직하게는 80％ 이상, 보다 한층 바람직하게는 85％ 이상, 특히 바람직하게는 90％ 이상(예를 들어, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 또는 98％)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 아미노산 서열의 상동성은, 예를 들어, FASTA, BLAST, DNASIS(히타치 소프트웨어 엔지니어링(주)제), GENETYX((주)제네틱스제)를 사용하여 측정할 수 있다. 혹은, 단순히 서열을 비교하여 계산할 수도 있다. 수식체는, HA1-44 펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 수개, 예를 들어, 1 내지 5개, 바람직하게는, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 더욱 바람직하게는 1 내지 2개, 보다 바람직하게는 1개의 아미노산의 아미노산 잔기가 수식되어 있는 아미노산 서열을 갖는다. 태그 구비 HA1-44 펩티드가 사용되는 경우, 예시적인 태그로서는, His₆-태그, FLAG 태그, myc 태그, 및 GST 태그를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 태그는, 아미노산 서열의 N 말단에 부가해도 되고, C 말단에 부가해도 된다.

당해 스크리닝 방법에 있어서, 망라적 유전자 발현 해석은 RNA 시퀀싱(RNA-seq)이어도 된다. 당해 스크리닝 방법에 있어서, 클러스터링 해석은 iterative clustering and guide-gene selection(ICGS) 알고리즘을 사용하여 행하여져도 된다.

다른 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다:

2) 공정 1)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정;

4) 공정 3)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정; 및

공정 1)에 있어서의 대상은, 공정 3)에 있어서 피검 물질을 투여할 때에 사용하는 용매와 동일한 용매만을 투여한 대상이어도 된다.

공정 2) 및 4)에 있어서 계수하는 콜로니는, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺ 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 콜로니여도 된다.

2) 공정 1)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정;

4) 공정 3)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정; 및

공정 1)에 있어서의 대상은, 공정 3)에 있어서 피검 물질이 투여될 때에 사용되는 용매와 동일한 용매만을 투여된 대상이어도 된다.

공정 1에 있어서의 대상은, 공정 3에 있어서 피검 물질을 투여할 때에 사용하는 용매와 동일한 용매만을 투여한 대상이어도 된다.

당해 스크리닝 방법에 있어서, 망라적 유전자 발현 해석은 RNA 시퀀싱(RNA-seq)이어도 된다. 당해 스크리닝 방법에 있어서, 패스웨이 해석은 Ingenuity Pathway Analysis(IPA) 소프트웨어(https://www.qiagenbioinformatics.com)를 사용하여 행해도 된다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은 MSC 혈중 동원 물질에 의해 유도되는 말초혈 중의 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HA1-44 펩티드에 의해 유도되는 추골 골수 내의 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다.

본원에 있어서, 「MSC 혈중 동원 물질」이란, 간엽계 줄기 세포(MSC)를 말초혈 중에 동원하는 활성, 또는 말초혈 중에 있어서의 MSC의 존재량을 증대시키는 활성을 갖는 물질을 의미한다. MSC 혈중 동원 물질의 예로서는, HMGB1 단백, HMGB2 단백 및 HMGB3 단백(예를 들어 WO2008/053892 및 WO2009/133939에 기재), S100A8 단백 및 S100A9 단백(예를 들어 WO2009/133940 및 WO2011/052668에 기재), 그리고 본 발명자들에 의한 국제 출원 WO2012/147470에 기재된 각종 HMGB1 펩티드(예를 들어, HMGB1 단백의 아미노산 잔기 1-44를 포함하는 펩티드(본원에 있어서의 HA1-44 펩티드)) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

일 실시 형태에서는, 본 발명은 MSC 혈중 동원 물질을 대상에게 투여하고, 해당 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써 얻어지는, 세포 집단에 관한 것이다. 일 실시 형태에 있어서, MSC 혈중 동원 물질은 HA1-44 펩티드여도 된다.

다른 실시 형태에서는, 본 발명은 1) HA1-44 펩티드를 대상에게 투여하고, 2) 해당 대상으로부터 추골의 골수를 채취하고, 3) 해당 채취된 골수를 고상 상에서 배양하는 것 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류함으로써 얻어지는, 세포 집단에 관한 것이다.

다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 세포 또는 세포 집단의 제조 방법에 관한 것이다.

일 실시 형태에서는, 본 발명은 MSC 혈중 동원 물질을 대상에게 투여하고, 당해 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 당해 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 다른 실시 형태에서는, 본 발명은 MSC 혈중 동원 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 이들 제조 방법의 일 실시 형태에 있어서, MSC 혈중 동원 물질은 HA1-44 펩티드여도 된다.

다른 실시 형태에서는, 본 발명은 1) HA1-44 펩티드를 대상에게 투여하고, 2) 해당 대상으로부터 추골의 골수를 채취하고, 3) 해당 채취된 골수를 고상 상에서 배양하거나 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

또다른 양태에 있어서, 본 발명은 간엽계 줄기 세포(MSC)를 포함하는 생체 조직으로부터, 추골 골수 내의 PDGFRα 양성 세포와 마찬가지의 높은 조직 재생 촉진 능력을 갖는 세포를 취득, 분리 및/또는 농축하는 방법에 관한 것이다. 또한 또다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 취득, 분리 및/또는 농축하는 방법에 의해 얻어지는 세포 또는 세포 집단에 관한 것이다.

일 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법에 관한 것이다:

1) 간엽계 줄기 세포(MSC)를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단을 고상 상에서 배양하는 공정;

2) 공정 1에서 얻어진 콜로니를 서브 클로닝하는 공정;

다른 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법에 관한 것이다:

2) Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 콜로니를 선발하는 공정. 일 실시 형태에 있어서, 공정 2는, Prx1 계보 음성의 콜로니를 선발하는 공정이어도 된다.

다른 실시 형태에서는, 본 발명은 MSC를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단으로부터, Pα⁺, Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-, CD34⁺, 및 Sca1^-로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법에 관한 것이다.

2) 공정 1)에서 회수된 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.

본원의 세포 집단의 제조 방법에 있어서, MSC를 포함하는 생체 조직으로서는, 골수, 탯줄, 제대혈, 태반, 지방 조직, 치수, 골막, 활막, 난막, 말초혈 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 골수로서는, 대퇴골, 추골, 흉골, 장골, 두개골 등의 골수를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또다른 양태에 있어서, 본 발명은 외배엽성 간엽계 줄기 세포를 함유하는, 조직 재생 촉진을 위하여 사용되는 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 i)의 특징 그리고 ii) 및/또는 iii)의 특징을 갖는 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 함유하는, 조직 재생 촉진을 위하여 사용되는 조성물에 관한 것이다:

ii) 표피 세포로의 분화능을 갖는다;

iii) P0 계보 양성이다.

일 실시 형태에서는, 해당 조성물은, 중배엽 또는 외배엽에서 유래되는 조직의 재생 촉진을 위하여 사용되는 것이다. 중배엽에서 유래되는 조직으로서는, 뼈, 연골, 근육, 혈관 내피 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 외배엽에서 유래되는 조직으로서는, 상피 조직(예를 들어 표피), 신경 조직 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 조직 재생 촉진을 위하여 사용되는 조성물은, 의약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함해도 된다. 본 발명의 조직 재생 촉진을 위하여 사용되는 조성물에 포함되는 외배엽성 간엽계 줄기 세포의 양, 조성물의 제형, 투여 빈도 등은, 재생 대상으로 하는 조직의 종류 및/또는 투여되는 대상의 상태 등의 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

또다른 양태에 있어서, 본 발명은 외배엽성 간엽계 줄기 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상의 조직 재생을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 i)의 특징 그리고 ii) 및/또는 iii)의 특징을 갖는 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 해당 대상의 조직 재생을 촉진하는 방법에 관한 것이다:

ii) 표피 세포로의 분화능을 갖는다;

iii) P0 계보 양성이다.

상기 세포의 투여 방법은, 재생을 촉진하는 조직의 종류 및/또는 투여되는 대상의 상태 등의 조건에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 당해 투여 방법으로서는, 피내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 정맥내 투여, 경비 투여, 경구 투여, 좌제 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또다른 양태에 있어서, 본 발명은 대상의 조직 재생 촉진에 있어서의 사용을 위한 외배엽성 간엽계 줄기 세포에 관한 것이다.

또다른 양태에 있어서, 본 발명은 대상에게 있어서의 조직 재생을 촉진하기 위한 의약 제조를 위한 외배엽성 간엽계 줄기 세포의 사용에 관한 것이다.

말초혈 중의 iCFPα 세포는, 괴사성 조직 손상이 발생하고 있는 케이스 등에 있어서, EMSC에 매개되는 조직 재생 활성을 평가하기 위한 유익한 바이오마커가 될 것으로 생각된다. 따라서, 본원은, 말초혈 중의 iCFPα 세포를 지표로 하여, MSC 혈중 동원 물질을 투여한 대상에게 있어서 기대되는 조직 재생 촉진 효과를 판정하는 방법을 제공한다.

일 실시 형태에서는, 본 발명은 이하의 공정:

을 포함하고, 공정 2)에서 계수된 세포의 수가 공정 1)에서 계수된 세포의 수보다도 많은 경우에, 해당 대상에게 있어서 조직 재생이 촉진되는 것이 시사되는, MSC 혈중 동원 물질의 조직 재생 촉진 효과의 판정 방법에 관한 것이다.

본원에 있어서, 「대상」은, 인간 및 비인간 동물의 어느 것이어도 된다. 일 형태에 있어서, 대상은 비인간 동물이다. 비인간 동물로서는, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 모르모트, 말, 양 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본원이 제공하는 세포(또는 세포 집단)의 제조 방법, 스크리닝 방법, 및 MSC 혈중 동원 물질의 조직 재생 촉진 효과의 판정 방법에 대해서, 대상으로부터 말초혈을 채취하는 타이밍은 특별히 한정되지 않는다. 인위적으로 괴사성 조직 손상을 작성하는 경우 또는 MSC 혈중 동원 물질을 투여하는 경우에는, 예를 들어, 괴사성 조직 손상의 제작 또는 MSC 혈중 동원 물질의 투여로부터 2 내지 24시간 후에 말초혈을 채취하는 방법을 들 수 있다. 일 형태에 있어서, 대상으로부터 말초혈을 채취하는 타이밍은, 괴사성 조직 손상의 제작 또는 MSC 혈중 동원 물질의 투여로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간 후일 수 있다. 다른 양태에 있어서, 대상으로부터 말초혈을 채취하는 타이밍은, 괴사성 조직 손상의 제작 또는 MSC 혈중 동원 물질의 투여로부터 4 내지 24시간 후, 8 내지 24시간 후, 8 내지 16시간 후, 또는 10 내지 14시간 후일 수 있다.

본원이 제공하는 세포, 세포(또는 세포 집단)의 제조 방법, 세포를 포함하는 조성물, 및 스크리닝 방법의 일 형태에 있어서, PDGFR 양성 세포는, PDGFRα 양성 세포이다.

부언하면, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입된다. 또한, 본원은, 2017년 12월 1일에 미국 특허 상표청에 출원된 미국 가특허출원 제62/593310호에 기초하는 우선권을 주장하는 것이며, 당해 미국 가특허출원의 내용은, 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.

이하에, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 부언하면, 이하에 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하에 기재되는 양태에 한정되는 것은 아니다.

실시예

재료 및 방법

1. 마우스

PDGFRα의 발현을 GFP의 형광에서 확인할 수 있는 Pα-H2B-GFP 마우스(The Jackson Laboratory, Stock No: 007669), 및 Cre-loxP 시스템을 이용한 각종 세포 계보 추적 마우스를 실험에 사용하였다. Cre-loxP 시스템을 이용한 세포 계보 추적 마우스는, Cre 드라이버 마우스와 Cre 리포터 마우스를 교배함으로써 만들어 낼 수 있다. Cre 드라이버 마우스란, 원하는 유전자의 프로모터 서열의 하류에 Cre 리콤비나아제의 코딩 서열이 도입된 DNA 구조를 갖는 트랜스제닉 마우스이다. Cre 리포터 마우스란, ROSA26 등의 유전자 자리에 「프로모터(CAG 프로모터 등)-loxP-stop 카세트-loxP-원하는 리포터 유전자(본원의 실시예에 있어서는 EYFP 또는 tdTomato)」라는 구조의 DNA 서열이 도입된 트랜스제닉 마우스이다.

본원 실시예에서는, Cre 드라이버 마우스로서, 이하의 마우스를 준비하였다.

·Pα-Cre 마우스(The Jackson Laboratory, Stock No: 013148)

·P0-Cre 마우스(The Jackson Laboratory, Stock No: 017927)

·Prx1-Cre 마우스(The Jackson Laboratory, Stock No: 005584)

·Sox1-Cre 마우스(RIKEN BioResource Research Center, Accession No. CDB0525K)

·LepR-Cre 마우스(The Jackson Laboratory, Stock No: 008320)

·Krt5-Cre 마우스(MGI ID: 1926815, Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Jul 8; 94(14): 7400-5에 기재된 K5 Cre 트랜스제닉 마우스)

Cre 리포터 마우스로서, 이하의 마우스를 준비하였다.

·Rosa26-EYFP 마우스(The Jackson Laboratory, Stock No: 006148)

·Rosa26-tdTomato 마우스(The Jackson Laboratory, Stock No: 007909)

상기 6종의 드라이버 마우스와 Rosa26-tdTomato 리포터 마우스를 교배함으로써, 이하의 세포 계보 추적 마우스를 만들어 냈다.

·Pα-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스

·P0-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스

·Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스

·Sox1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스

·LepR-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스

·Krt5-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스

또한, Pα-Cre 드라이버 마우스와 Rosa26-EYFP 리포터 마우스를 교배함으로써, Pα-Cre::Rosa26-EYFP 마우스를 만들어 냈다.

Pα-H2B-GFP 마우스는, PDGFRα 유전자의 프로모터 하류에 히스톤 H2B와 eGFP의 융합 단백을 코딩하는 서열이 녹인된 마우스이다. 당해 Pα-H2B-GFP 마우스와 상기 Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스를 교배함으로써, Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스를 만들어 냈다.

2. 피부판의 제작

본원 실시예에 있어서는, 괴사성 조직 손상을 일으키는 방법으로서, 피부판의 제작을 행하였다. 구체적인 피부판의 제작 방법은 이하와 같다.

8 내지 10주령 수형의 마우스(20 내지 25g)에 대하여 1.5 내지 2.0％(v/v)의 이소플루란 흡입 마취 하에서 배면부의 면도를 행하였다. 꼬리측만 피부의 연속성을 유지하도록 하고, 전도를 사용하여 배면부 중앙에 가로 2.0×세로 4.0㎝의 피부판을 제작했다(이에 의해, 판의 근원으로부터 이격된 선단부가 허혈 상태로 되어, 피부 조직의 괴사성 손상이 발생한다). 피부판 제작 후의 환부는, 충분한 크기의 반창고로 보호하였다. 피부판 제작으로부터 12시간 후에 각각 심장혈 채혈, 추골 및 대퇴골 골수의 세포 분리, 추골 및 대퇴골의 동결 절편 제작을 행하였다.

3. 파라바이오시스의 제작

Kamran P et al. J Vis Exp. 2013 Oct 6; (80)을 참고로, 6주령 수형의 야생형 마우스와 6주령 수형의 세포 계보 추적 마우스를 사용한 파라바이오시스 모델을 제작하였다. 2마리 동시에 이소플루란에 의한 전신 마취 도입을 행하고, 가열 패드(heat pad) 상에 포지셔닝하였다. 2마리의 상대하는 체측면을 면도하고, 주관절부터 무릎 관절에 걸쳐서 약 5㎜폭으로 피부를 절제하였다. 등측의 피부를 5-0 바이크릴로 연속 봉합하였다. 상대하는 주관절, 무릎 관절을 3-0 바이크릴로 봉합하였다. 마찬가지로 5-0 바이크릴로 배측의 피부를 연속 봉합하였다. 마취로부터의 각성을 가열 패드 상에서 기다렸다. 활동이 제한되기 때문에, 1케이지에 1쌍까지의 사육으로 하고, 모이 주기를 행하였다.

4. 조직 염색 및 관찰

추골 및 대퇴골을 채취 후, 4％ 파라포름알데히드 고정, 0.5M EDTA 용액 탈회, 30％ 수크로오스 용액 치환을 거쳐서, 가와모토법용 동결 포매제 Super Cryoembedding Medium; SCEM(Leica)을 사용하여 동결 블록을 제작하였다. Cryofilm 타입 2C(9)(Leica)를 사용하여 두께 10㎛로 얇게 자르기를 행하고, 각 항체를 사용하여 면역 염색을 행하였다(1차 항체는 4℃에서 밤새, 2차 항체는 4℃에서 1시간). 공초점 현미경을 사용하여 조직의 관찰을 행하였다.

5. 말초혈, 추골, 대퇴골의 세포 취득과 배양

말초혈로부터의 세포 회수는 다음 방법으로 행하였다. 전신 마취 하에서 심장으로부터 말초혈을 약 800 내지 1000μL 채취했다(헤파린을 함유하는 1mL 시린지를 사용). 적혈구를 제거하기 위해서, 채취한 혈액과 등량의 Hetasep(STEMCELL Technologies사, Cat No. ST-07906)을 첨가하고, 100G로 2분간 원심하고, 실온에서 15분간 인큐베이트한 후, 상청을 회수하였다. 당해 상청을, 말초혈 중의 유핵 세포를 포함하는 샘플로서 다음 실험에 제공하였다.

골수로부터의 세포 회수는 다음 방법으로 행하였다. 전신 마취 하에서 채취한 추골, 대퇴골을 0.2％ 콜라게나아제 A 용액(Sigma사, Cat#10103578001)에 침지하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 유발로 골수 세포를 압출하고, 피펫팅으로 회수하여 40㎛의 세포 스트레이너에 통과시켰다. 300G로 5분간 원심하여 상청을 제거하고, RBC 용해 완충액(Lysis buffer)(BioLegend사, cat#420301)으로 용혈하여 적혈구를 제거하고, 골수 세포로서 다음 실험에 제공하였다.

6. 말초혈의 콜로니 어세이

상기 수순에 의해 얻은 상청(말초혈 중의 유핵 세포 함유 샘플)을 콜라겐 I로 코팅된 6웰 플레이트(Corning사, Cat No. 356400)에 파종하고, MesenCult Expansion Kit(STEMCELL Technologies사, Cat No. ST-05513)를 이용하여 당해 키트의 매뉴얼대로 조제한 확장 배지(Expansion Medium)에 1％ L-글루타민(나카라이테스크사), 10μM ROCK 저해제(Y27632, Tocris Bioscience사) 및 1％ 페니실린/스트렙토마이신(나카라이테스크사)을 함유시킨 배지(수치는 모두 최종 농도)를 사용하여, 37℃, 5％ CO2, 5％ O2의 조건 하에서 10일간 배양하였다. 배양 기간 중에는 1주일에 2회, 배지를 신선한 것으로 교환하였다. 배양 10일째에, Differential Quik Stain Kit(시스멕스 가부시키가이샤, Cat No. 16920)를 사용하여 플레이트 상의 세포를 염색하고, 50개 이상의 세포를 포함하는 콜로니의 수를 카운트하였다.

7. 골아/지방/연골 세포로의 분화 유도

계대(Passage) 3-5의 생세포를 12웰 플레이트에 50,000세포/웰로 파종하고, 서브 콘플루언트가 될 때까지 10％ FBS/DMEM에서 배양하였다. 그 후, 지방 세포로의 분화에는 100nM 덱사메타손(Sigma), 0.5mM 이소부틸메틸크산틴(Sigma), 50mM 인도메타신(Wako), 10μg/ml 인슐린(Sigma)을 포함하는 10％ FBS/DMEM을 사용하여 14일간 지방 분화 유도를 행하였다.

골아 세포로의 분화에는 1nM 덱사메타손, 20mM β-글리세롤 포스페이트(Wako), 50μg/ml 아스코르베이트-2-포스페이트(Sigma-Aldrich Corp.)를 포함하는 10％ FBS/DMEM을 사용하여 21일간 골아 세포 분화 유도를 행하였다. 각 분화 유도 후에 4％ PFA에서 고정하고, 지방 세포는 오일 레드-O 염색, 골아 세포는 ALP activity assay kit(TAKARA BIO Inc.,Kusatsu,Japan)를 사용하여 ALP 염색을 행하고, 각각 현미경으로 관찰하였다.

연골 분화 유도에서는, 먼저 300,000 세포를 15ml 튜브에서 300g, 5분간의 원심을 행하였다. 40ng/ml 프롤린(Sigma), 50μg/ml 아스코르브산 2-포스페이트, x100 ITS mix(BD Bioscience), 2μg/ml 플루오시놀론(Tokyo chemistry industry, Tokyo, Japan), 5ng/ml 형질전환 성장 인자(transforming growth factor)-b3(R&D Systems, Minneapolis, MN), 100nM 덱사메타손(Sigma)을 포함하는 10％ FBS/DMEM에서 21일간, 연골 분화 유도를 행하였다. 완성한 연골 펠릿은, 파라핀 포매하고, 6㎛의 두께로 얇게 자르고, 톨루이딘 블루 염색을 행하였다.

8. 케라티노사이트로의 분화 유도

·동물

Krt5-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스를 8 내지 10주령이 될 때까지 사육하고, 실험에 사용하였다.

·채재(採材)

채재 전날에 마우스 배면부에 피부판을 제작하고, 제작으로부터 12시간 경과 후에 마취 하에서 심장 채혈에 의해 말초혈을 채취하였다. 피부판을 제작하고 있지 않은 마우스에 대해서도 마찬가지로 말초혈을 채취하였다. 채혈 후에 대퇴골 및 추골을 채취하였다.

·세포 조정

말초혈은 HetaSep을 사용하여 적혈구를 제거하고, 6웰의 콜라겐 I 코팅의 플레이트에 1마리분의 혈액분을 1웰에 파종하고, 5％ O₂, 5％ CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 배지는, MesenCult 또는 20％ FBS/MEMα(모두 Rock 저해제 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신 함유)를 사용하였다.

채재한 대퇴골은 양쪽 골단을 절단하여 세로로 절반으로 나누고, 추골은 세로로 절반으로 나누어, 0.2％ 콜라게나아제 A/DMEM(10mM HEPES, 1％ 페니실린-스트렙토마이신)으로 처리했다(37℃ 워터 배스, 1시간). 콜라게나아제 A 처리 후에 유발을 사용하여 골수 세포를 회수하고, 40um 세포 스트레이너에서 단일 세포에 분산시키고, 1×RBC 용해 용액(Lysis solution)으로 용혈하고 나서 파종하고, 5％ O₂, 5％ CO₂, 37℃의 조건에서 배양하였다. 배지는 MesenCult 또는 20％ FBS/MEMα(모두 Rock 저해제 및 1％ 페니실린-스트렙토마이신 함유)를 사용하였다.

·분화 유도

콜로니 형성을 확인한 후, 1uM 레티노산(SIGMA) 및 25ng/mL BMP4(R&D)를 포함한 배지를 웰에 첨가하고, 5％ CO₂, 37℃에서 배양하여 케라티노사이트로 분화 유도하였다. 올인원 현미경(키엔스)에 의해, Tomato 양성/음성인 세포를 관찰하였다.

9. 트랜스크립톰 해석(세포 집단의 RNA-seq)

세포 집단으로부터 RNA를 추출하고, Smart-seq2 프로토콜(Nature protocols 9, 171-181(2014) doi: 10.1038/nprot.2014.006)에 따라서 RNA-seq 라이브러리를 제작하였다. 얻어진 라이브러리를, nextseq high output kit(37bp 페어 엔드 리드)를 사용하여 Nextseq500(Illumina)으로 시퀀스하였다. Illumina의 bcl2fastq v 2.17.1.14를 디폴트의 파라미터 및 --no-lane-splitting 옵션에서 사용하여, 베이스 콜의 fastq 포맷으로의 변환과 디멀티플렉스(demultiplex)를 행하였다. TrimGalore(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)를 사용하여 리드를 트림하고, RSEM(Li et al.,BMC Bioinformatics 12,323(2011); 버전은 STAR-2.5.2b)을 사용하여 매핑과 카운트(정량)를 행하였다. 샘플 간의 발현 변동 해석은 DESeq2(Love et al.,Genome Biol. 15, 550(2014))를 사용하여 행하였다. 발현 변동 유전자(DEGs)를 Ingenuity Pathway Analysis(IPA) 소프트웨어(https://www.qiagenbioinformatics.com)에 업로드하고, DEGs와 가장 관련성이 높은 생물학적 패스웨이 및 기능을 추출하였다. RSEM에서 얻은 TPM(Transcripts Per kilobase Million) 카운트에 1을 더하고 log2 변환한 값(log2(TPM+1))에 기초하여, AltAnalyze_v.2.1.0-Py의 ICGS 알고리즘을 사용하여 클러스터링 해석을 행하였다.

10. 트랜스크립톰 해석(단일 세포 RNA-seq)

단세포 부유액을 조제하고, 자동 셀 카운터 TC20(BioRad)으로 세포 생존을 평가하였다. ddSEQ Single-Cell Isolator 및 SureCell WTA 3' Library prep kit를 제조원의 프로토콜에 따라서 사용하고, 단일 세포 RNA-seq 라이브러리를 제작하였다. 얻어진 라이브러리를, Nextseq high output kit(Read1: 68bp, Read2:75bp)를 사용하여 Nextseq500(Illumina)에서 시퀀스하였다. Illumina의 bcl2fastq v2.17.1.14를 디폴트의 파라미터 및 --no-lane-splitting 옵션에서 사용하여, 베이스 콜의 fastq 포맷으로의 변환과 디멀티플렉스(demultiplex)를 행하였다. 세포 바코드 영역에 발생할 가능성이 있는 합성 상 및 시퀀싱 상의 에러는 Edit distance(ED)<2로 수정하였다. Drop-Seq Tools v1.12(STAR 버전은 STAR-2.5.2b)를 사용하여 리드를 해석(매핑과 정량)하고, 디지털 발현 매트릭스를 생성하였다. 얻어진 매트릭스를 voom(limma 3.32.10)을 사용하여 표준화하였다. 해당 표준화된 매트릭스에 기초하여, AltAnalyze_v.2.1.0-Py를 디폴트 설정으로 사용하여 ICGS 알고리즘에 의한 클러스터링 해석을 행하였다. 또한, 해당 표준화된 매트릭스에 기초하여, tSNE 알고리즘(Rtsne를 사용)에 의한 차원 압축과 hclust(method=ward.D2)를 사용한 클러스터링 해석을 행하고, 결과를 ggplot2 또는 plot.ly를 사용하여 플롯하였다. 발현 변동 해석에는 DESingle를 사용하였다.

11. FACS 해석

추골 및 대퇴골로부터 채취한 골수 세포에 대해서, 각종 표면 분자에 대한 형광 표지 항체를 사용하여 FACS 해석을 행하였다. 형광 검출, 분류 등의 일련의 프로세스는 BD FACS Aria III system을 사용하여 행하고, 얻어진 데이터의 해석은 FlowJo software Ver. 6.3.3(Tree Star, Ashland, OR)을 사용하여 행하였다.

12. 파라바이오시스 및 연골 결손 모델

상기 3.에 기재한 방법으로, 6주령 수형의 야생형 마우스와 6주령 수형의 P0-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스를 사용한 파라바이오시스 모델을 제작하였다. 수술 후 4주일에 혈액 키메라가 완성된 후, 0.5㎜ 직경의 수동 드릴(MEISINGER사제)을 사용하여 야생형 마우스의 무릎 관절에 0.5x0.5x0.5㎜의 연골 결손을 제작하였다. 연골 결손을 제작한 직후에 생리 식염수 100μL로 희석한 HA1-44 펩티드 100μg을 미정맥으로부터 투여하고, 그 후에도 동일한 용량으로 수술 후 4주까지 2회/주의 빈도로 투여하였다. 대조군에는, HA1-44 펩티드 투여군과 동일한 스케줄로, 생리 식염수 100μL/마리를 미정맥으로부터 투여하였다. 무릎 연골 결손 제작으로부터 12주일 후에 무릎 관절을 채취하고, 4％ 파라포름알데히드 고정(밤새), 0.5M EDTA 용액에 의한 탈회(3일간), 30％ 수크로오스 치환(1일간)을 거쳐서, 동결 블록을 제작하였다. 크라이오스탯을 사용하여 두께 10㎛로 얇게 자르고, 공초점 현미경을 사용하여 Tomato 양성 세포의 분포를 해석하였다. 또한, 8주령 수형의 야생형 마우스를 사용하여 상기와 마찬가지로 무릎 관절에 연골 결손을 제작하고, 상기와 같은 용량 및 스케줄로 HA1-44 펩티드를 투여하고, 무릎 연골 결손 제작으로부터 2, 4, 8 및 12주일 후에 무릎 관절을 채취하여 조직 절편의 사프라닌 O 염색을 행하였다.

약어

마커에 대해서(XX, YY는 원하는 유전자/단백명)

XX⁺: XX 양성

XX^-: XX 음성

YY^lin+: YY 계보 양성

YY^lin-: YY 계보 음성

PDGFR: 혈소판-유래 성장 인자 수용체(platelet-derived growth factor receptor)

Pα: 혈소판-유래 성장 인자 수용체 alpha(PDGFRα)

Pα 세포: PDGFRα 양성 세포

MSC: 간엽계 줄기 세포

EMSC: 외배엽성 간엽계 줄기 세포(ectomesenchymal stem cell)

CFPα 세포: 콜로니 형성성 Pα 세포(colony-forming Pα cells)

iCFPα 세포: 괴사성 손상으로 유도되는 콜로니 형성성 Pα 세포(necrotic injury-induced colony-forming Pα cells)

CFU: 콜로니 형성 단위(colony-forming unit)

LepR: 렙틴 수용체(Leptin receptor)

실시예 1

말초혈 중의 iCFPα 세포의 성질

Pα-H2B-GFP 마우스의 배면부에 피부판을 제작하고, 12시간 후에 채취한 말초혈에 포함되는 Pα 세포의 수를 조사하였다. 그 결과, 피부판을 제작하고 있지 않은 대조군과 비교하여 피부판군에서는 Pα 세포가 현저하게 증가하고 있어, 당해 Pα 세포의 증가는 말초혈 중의 HMGB1 농도의 상승과 상관이 보였다(도 1). 또한, Pα-H2B-GFP 마우스의 말초혈을 배양하여 콜로니 어세이를 행한 결과, 대조군보다도 피부판군에서 현저하게 많은 콜로니가 얻어져(모두 Pα 양성 세포), CFU 활성이 높은 것으로 나타났다(도 2). 이러한 결과는, 괴사성 조직 손상에 의해, 말초혈 중의 콜로니 형성성 Pα 세포가 증가하는 것을 나타낸다.

또한, 피부판을 제작한 마우스의 말초혈을 배양하여 얻은 콜로니 형성성 Pα 세포(즉, iCFPα 세포)는 골아 세포, 지방 세포, 및 연골 세포로의 분화능을 나타내고, 또한 케라티노사이트로의 분화 유도 조건에 있어서, 케라틴 5(Krt5, K5)를 발현하는 세포로 분화되는 능력을 나타냈다(도 3).

피부판 제작 후의 말초혈 유래 CFPα 세포(iCFPα 세포)에 대하여 단일 세포 트랜스크립톰 해석을 행한 결과, MSC 등의 세포종에 대응하는 유전자군의 발현이 높은 세포가 대부분이었다(도 4). 또한, Krt8이나 Krt18 등의 표피 세포에 특징적인 유전자를 발현하는 세포도 포함되어 있었다. 또한, 대조군과 피부판군의 말초혈 유래 CFPα 세포를 콜로니 단위로 트랜스크립톰 해석하고, ICGS 알고리즘으로 클러스터링 해석한 결과, 피부판 제작 후의 CFPα 세포가 대부분을 차지하는 클러스터에서는, 골수 줄기 세포나 MSC 등의 세포종에 특징적인 유전자군의 발현이 높고, 그 중에서도 HoxA2 유전자가 고발현하고 있는 것이 특징적이었다(도 5).

실시예 2

말초혈 중의 iCFPα 세포의 표면 마커

대조군 및 피부판군의 어느 것이든, 말초혈을 배양하여 얻어지는 콜로니는 모두 Pα 양성이었다(도 6). 또한, 피부판군의 말초혈 CFPα 세포(iCFPα 세포)를 단일 세포에서 트랜스크립톰 해석한 결과, CD34 양성, 또한 Sca1 음성이었다.

실시예 3

말초혈 중의 iCFPα 세포의 세포 계보 마커

피부판 제작 마우스의 말초혈 유래 CFPα 세포(iCFPα 세포)를 Pα 계보, P0 계보, Prx1 계보, Sox1 계보 및 LepR 계보에 대해서, Cre-loxP계를 이용한 트랜스제닉 마우스를 사용하여 계보 추적한 바, iCFPα 세포는 모두, Pα 계보 양성, P0 계보 양성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성이었다(도 7). Prx1 계보에 대해서는, iCFPα 세포의 93％가 음성이었다(도 7).

또한, 평상 시의 혈 중에도 Prx1 계보 양성과 음성인 콜로니 형성 세포가 조금 존재하지만, 피부판에서 증가하는 것은 오로지 Prx1 계보 음성의 세포였다(도 8). 따라서, iCFPα 세포는 Prx1 계보 음성으로 정의할 수 있다.

말초혈의 iCFPα 세포는, P0^lin+ 또한 Prx1^lin-인 점에서 외배엽 유래라고 생각되고, 또한 Sox1^lin-인 것 및 HoxA2 유전자가 고발현하고 있는 것을 고려하면, 두부 신경 주름을 발생학적 기원으로 하는 세포인 것이 시사된다.

실시예 4

외배엽 유래 간엽계 세포의 탐색

Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스로부터 채취한 대퇴골, 추골, 흉골, 장골, 고관절(대퇴골 골두 및 구개), 및 두개골의 골수 조직을 조사한 바, Pα⁺ 또한 Prx1^lin-의 세포는 (당해 조사의 범위 내에서는) 추골에 특이적으로 존재하고 있었다(도 9 및 10).

실시예 5

추골 및 대퇴골의 CFPα 세포의 계보 마커

추골 및 대퇴골의 골수를 배양하여 얻은 CFPα 세포에 대해서, 세포 계보 추적 마우스를 사용하여 P0 계보, Prx1 계보, Sox1 계보 및 LepR 계보를 조사하였다. 그 결과, 추골의 CFPα 세포는, P0^lin+, Prx1^lin-, 또한 Sox1^lin-에서, LepR lin에 대해서는 약 60％가 음성이었다(도 11). 대퇴골의 CFPα 세포는, P0^lin+, Prx1^lin+, 또한 Sox1^lin-에서, LepR^lin에 대해서는 약 80％가 양성이었다(도 12). 이러한 결과로부터, 말초혈의 iCFPα 세포(Pα^lin+, P0^lin+, Prx1^lin-, Sox1^lin-, LepR^lin-)의 소스가 추골에 존재하는 것이 시사된다.

실시예 6

추골 및 대퇴골의 CFPα 세포의 성질

추골 및 대퇴골의 골수를 배양하여 얻은 CFPα 세포에 대해서, 콜로니 형성능과 골아 세포, 지방 세포 및 연골 세포로의 분화능을 비교한 바, 모두 추골 CFPα 세포쪽이 높은 능력을 나타냈다(도 13 내지 16). 또한, 추골 및 대퇴골의 CFPα 세포를 오르트 랑스 레티노산(ATRA)과 BMP-4에서 분화 유도한 결과, 케라틴 5를 발현하는 콜로니가 관찰되어(도 17 및 18), 추골 및 대퇴골의 CFPα 세포가 K5 양성 세포로의 분화능을 갖는 세포를 포함하고 있는 것이 확인되었다.

실시예 7

추골 및 대퇴골의 Pα 세포의 트랜스크립톰 해석

추골 및 대퇴골의 골수 세포로부터 Pα 세포를 분류하고, 단일 세포 트랜스크립톰 해석을 행하였다. 클러스터링 해석의 결과, 골수의 Pα 세포는 6개의 클러스터로 나뉘었다(도 19). 당해 6개의 클러스터를, 각 클러스터의 세포가 특이적으로 발현하고 있는 유전자에 기초하여, (1) S34-MSC(Sca1 및 CD34-발현), (2) 골전구세포(osteoprogenitor)(오스테오모듈린(Osteomodulin) 및 Wnt16-발현), (3) 골모세포(osteoblast)(오스테릭스(osterix) 및 오스테오칼린(osteocalcin)-발현), (4) 골세포(osteocyte)(PHEX 및 DMP1-발현), (5) CAR 세포(CXCL12 및 LepR-발현), 및 (6) CD45-발현 세포로 정의하였다. 추골과 대퇴골을 비교하면, 추골에는 S34-MSC 클러스터의 세포가 많고, CAR 클러스터의 세포가 적은 데 반해, 대퇴골에는 CAR 클러스터의 세포가 많고, S34-MSC 클러스터의 세포가 적은 것을 알 수 있다.

또한, S34-MSC 클러스터 중에는, Sca1⁺CD34⁺, Sca1⁺CD34^-, 및 Sca1^-CD34⁺의 세포가 포함되어 있었다. 그래서, 추골의 Pα 세포를, Sca1과 CD34의 발현을 지표로 하여 FACS로 분리하고, CFU 어세이를 행하였다. 그 결과, CFU 활성은, Sca1⁺CD34⁺ 세포>Sca1⁺CD34^- 세포 및 Sca1^-CD34⁺ 세포>Sca1^-CD34^- 세포의 순으로 높았다(도 20).

실시예 8

말초혈 중의 Pα 세포와 추골의 Pα 세포의 대응

말초혈 중의 iCFPα 세포의 트랜스크립톰 해석 데이터에 기초하여, 추골 및 대퇴골의 Pα 세포와 함께 클러스터링 해석을 행하였다. 그 결과, 말초혈의 iCFPα 세포는, S34-MSC 클러스터의 근처에 위치했다(도 21). 또한, 당해 말초혈 iCFPα 세포는, CD34⁺Sca1^-였다. 이 결과를 계보 마커와 아울러 고려하면, 말초혈 iCFPα 세포는 추골의 S34-MSC 클러스터에 포함되는 CD34⁺Sca1^- 세포에 상당하는 것이 시사된다.

실시예 9

골수 내 Sca1 ⁺ CD34 ⁺ 세포

골수의 S34-MSC 클러스터에 포함되는 Sca1⁺CD34⁺ 세포는, Procr를 특이적으로 발현하고 있었다(도 22). 따라서, Procr는, 증식능이 가장 높고 골수 Pα 세포 중에서 가장 히에라르키가 높은 세포라고 생각되는 Sca1⁺CD34⁺ 세포의 마커가 될 수 있다. 또한, 경추, 흉추, 요추, 대퇴골에 있어서의 Sca1⁺CD34⁺ 세포의 존재량을 조사한 바, 경추>흉추>요추>대퇴골의 순으로 많았다(도 23).

실시예 10

HMGB1 투여에 의해 유도되는 혈중 순환 세포의 조직 재생에 대한 기여

본 발명자들은 지금까지, 골수 유래 Pα 양성 간엽계 줄기 세포를 말초혈 중에 동원하는 활성을 가진 도메인으로서 HMGB1 단백의 N 말단에 1번째부터 44번째의 아미노산 서열(서열 번호: 1)을 포함하는 펩티드(HA1-44 펩티드)를 동정하고 있다. 금회, HA1-44 펩티드의 투여에 의해 유도되는 말초혈 중의 세포에 대하여 이하의 실험 결과를 얻었다.

(1) HA1-44 펩티드를 투여한 계보 추적 마우스의 말초혈을 배양하면, 대조군(생리 식염수 투여)의 말초혈보다도 많은 콜로니가 얻어지고, 당해 콜로니는 모두 Pα 양성이며, 그의 대부분은 Prx1 계보 음성이었다(도 24).

(2) Pα-Cre::Rosa26-EYFP 마우스와 야생형(WT) 마우스의 파라바이오시스 모델을 제작하고, 야생형 마우스에 표피 수포증 마우스의 피부를 이식한 후, HA1-44 펩티드를 Pα-Cre::Rosa26-EYFP 마우스에 투여하였다. 그 결과, 피부 이식 내의 재생한 상피 조직 중에, 7형 콜라겐을 발현하는 Pα^lin+의 세포의 존재가 확인되었다(도 25).

(3) Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스와 야생형 마우스의 파라바이오시스 모델을 제작하고, 야생형 마우스의 배면부에 야생형 마우스 신생자의 피부를 이식한 후, HA1-44 펩티드를 Pα-H2B-GFP::Prx1-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스에 투여하였다. 그 결과, 피부 이식 내에 Pα⁺ 또한 Prx1^lin-의 세포의 존재가 확인되었다(도 26).

(4) P0-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스와 야생형 마우스의 파라바이오시스 모델을 제작하고, 야생형 마우스의 무릎 관절에 연골 손상을 제작한 후, HA1-44 펩티드를 P0-Cre::Rosa26-tdTomato 마우스에 투여하였다. 그 결과, HA1-44 펩티드 투여군에서는 연골 손상 부위에 P0^lin+ 세포의 집적이 확인된 것에 대해, 대조군(생리 식염수 투여)에서는 P0^lin+ 세포의 집적은 보이지 않았다(도 27). 또한, 파라바이오시스 모델이 아닌 단독의 야생형 마우스에 무릎 관절의 연골 손상을 제작한 후, HA1-44 펩티드 또는 생리 식염수를 투여한 결과, HA1-44 펩티드 투여군에서는 연골 손상 부위에 있어서 유리 연골이 재생된 것에 반해, 생리 식염수 투여군의 연골 손상 부위에 보인 것은 섬유 연골만이었다(도 28).

이상의 결과로부터, HA1-44 펩티드에 의해 유도되는 말초혈 중의 Pα 세포(Pα⁺P0^lin+Prx1^lin- 세포)는 괴사성 조직 손상에 의해 유도되는 iCFPα 세포와 동일하거나, 또는 적어도 iCFPα 세포를 포함하고 있고, 표피나 연골 등의 조직 손상을 수복하는 기능을 하고 있는 것으로 생각된다.

실시예 11

HMGB1 투여에 의해 유도되는 세포의 변화

(1) HA1-44 펩티드를 투여한 마우스 및 생리 식염수를 투여한 마우스로부터 말초혈을 채취하고, 플라스틱 플레이트 상에서 배양하여 접착성 세포의 콜로니를 얻었다. 당해 세포에 대해서, 콜로니 단위로 트랜스크립톰 해석을 행하고, 얻어진 데이터에 기초하여 ICGS 알고리즘으로 클러스터링을 행한 바, 도 29와 같은 결과를 얻었다. 또한, 당해 클러스터링의 결과를 간략화하여 나타낸 것이 도 30이다. 본원의 스크리닝 방법에 있어서는, HA1-44 펩티드와 마찬가지의 결과, 예를 들어, 도 30과 마찬가지의 예측 세포종(에 대응하는 유전자 세트의 발현)에 의해 특징지워지는 클러스터가 형성되고, 각 클러스터에 속하는 콜로니의 수가 「클러스터 1: 생식군≒피검 물질군, 클러스터 2: 생식군<피검 물질군, 클러스터 3: 생식군>피검 물질군, 클러스터 4: 생식군>피검 물질군」이 되는 결과를 초래하는 물질은, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 평가할 수 있다.

(2) HA1-44 펩티드를 투여한 마우스 및 생리 식염수를 투여한 마우스로부터 채취한 추골의 Pα 세포에 대하여 트랜스크립톰 해석을 행하고, 얻어진 데이터에 기초하여 IPA로 패스웨이 해석을 행하였다. 그 결과, HA1-44 펩티드 투여군의 추골 Pα 세포에서는, 대조군과 비교하여 EIF2 시그널링, eIF4 및 p70S6K 시그널링의 조절, 및 mTOR 시그널링에 관련하는 패스웨이가 활성화되어 있었다(도 31). 또한, HA1-44 펩티드 투여군의 추골 Pα 세포에서는, 대조군과 비교하여 세포사 관련 유전자의 발현이 억제되어 있었다(도 32).

실시예 12

인간체 내에 있어서의 HMGB1 펩티드의 활성

I상 임상 시험에 있어서, HA1-44 펩티드의 정맥내 투여에 의해 순환 혈 중에 있어서의 CD45 음성, TER-119 음성, 또한 PDGFRβ 양성 세포가 증가하는 것이 나타났다(도 33). PDGFRβ는 인간 간엽계 줄기 세포의 마커이기 때문에, 본 명세서에 기재된 말초혈 중의 iCFPα 세포 및 추골 CFPα 세포를 규정하는 마커(복수의 마커의 조합을 포함한다)에 있어서 「PDGFRα」를 「PDGFRβ」라고 다르게 부르는 것도, 인간에게 있어서의 EMSC(말초혈 중 또는 추골 내의 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포)를 규정하는 마커(복수의 마커의 조합을 포함한다)로 되는 것으로 생각된다.

본 발명에 관한 말초혈 중의 외배엽성 간엽계 줄기 세포는, 종래 재생 의료에 사용되어 온 골수 유래 간엽계 줄기 세포보다도 증식능이나 다분화능이 우수하고, 또한 골수 천자보다도 저침습인 말초혈 채취와 같은 방법에 의해 얻는 것이 가능한 치료용 세포로서, 세포 이식 요법 등에 사용할 수 있다. 또한, 손상 조직의 재생에 기여하고 있는 말초혈 중의 외배엽성 간엽계 줄기 세포의 특징(마커 등)이 밝혀진 것에 의해, 당해 세포를 지표로 하여, 체내의 다능성 줄기 세포를 유도하는 활성을 가진 물질을 효율적으로 스크리닝하는 것이 가능해진다.

SEQUENCE LISTING <110> StemRIM Inc. Osaka University <120> Ectomesenchymal stem cells and methods for producing the cells <150> US 62/593310 <161> 2017-12-01 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys 35 40

Claims

이하의 i)의 특징 그리고 ii) 및/또는 iii)의 특징을 갖는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포:
i) 골아 세포, 지방 세포, 및 연골 세포로의 분화능을 갖는다;
ii) 표피 세포로의 분화능을 갖는다;
iii) P0 계보 양성이다.
제1항에 있어서, PDGFRα 양성인, 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는, 세포.
PDGFRα 양성, CD34 양성, 또한 Sca1 음성인, 추골 골수 유래 세포.
이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:
1) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상(固相) 상에서 배양하는 공정;
2) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양한 후, PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
3) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈로부터 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
4) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈로부터 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.
이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:
1) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정;
2) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양한 후, PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
3) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈로부터 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
4) 괴사성 조직 손상을 갖는 대상으로부터 채취된 말초혈로부터 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.
이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:
1) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 고상 상에서 배양하는 공정;
2) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 고상 상에서 배양한 후, PDGFRα 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, 및 Sox1 계보 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
3) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 해당 골수로부터 PDGFRα 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, 및 Sox1 계보 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
4) 대상으로부터 추골 골수를 채취하고, 해당 골수로부터 PDGFRα 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, 및 Sox1 계보 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.
이하의 1) 내지 4) 중 어느 공정을 포함하는, 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 제조하는 방법:
1) 대상으로부터 채취된 추골 골수를 고상 상에서 배양하는 공정;
2) 대상으로부터 채취된 추골 골수를 고상 상에서 배양한 후, PDGFRα 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, 및 Sox1 계보 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
3) 대상으로부터 채취된 추골 골수로부터 PDGFRα 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, 및 Sox1 계보 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정;
4) 대상으로부터 채취된 추골 골수로부터 PDGFRα 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, 및 Sox1 계보 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하고, 해당 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.
MSC 혈중 동원 물질을 대상에게 투여하고, 해당 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써 얻어지는, 세포 집단.
제9항에 있어서, MSC 혈중 동원 물질이, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 세포 집단.
MSC 혈중 동원 물질을 대상에게 투여하고, 당해 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 당해 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.
MSC 혈중 동원 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, MSC 혈중 동원 물질이, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 방법.
1) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 대상에게 투여하고, 2) 해당 대상으로부터 추골의 골수를 채취하고, 3) 해당 채취된 골수를 고상 상에서 배양하는 것 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류함으로써 얻어지는, 세포 집단.
1) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 대상에게 투여하고, 2) 해당 대상으로부터 추골의 골수를 채취하고, 3) 해당 채취된 골수를 고상 상에서 배양하거나 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.
서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 투여된 대상으로부터 채취된 추골의 골수를 고상 상에서 배양하거나 또는 해당 채취된 골수로부터 PDGFRα 양성 세포를 분류하는 공정을 포함하는, 세포의 제조 방법.
이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법:
1) 간엽계 줄기 세포를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단을 고상 상에서 배양하는 공정;
2) 공정 1)에서 얻어진 콜로니를 서브 클로닝하는 공정;
3) 서브 클로닝에 의해 얻어진 세포의 일부를, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 유도 배지에서 배양하고, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 마커의 발현 레벨을 측정하는 공정; 및
4) 대퇴골의 골수를 고상 상에서 배양함으로써 얻어진 간엽계 줄기 세포를, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 유도 배지에서 배양한 경우의, 뼈, 연골, 및/또는 지방의 분화 마커의 발현 레벨과 비교하여, 높은 발현 레벨을 나타낸 세포 클론을 선발하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법:
1) 간엽계 줄기 세포를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단을 고상 상에서 배양하는 공정; 및
2) PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 콜로니를 선발하는 공정.
제18항에 있어서, 공정 2)가 Prx1 계보 음성의 콜로니를 선발하는 공정인, 방법.
간엽계 줄기 세포를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단으로부터, PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법.
이하의 공정을 포함하는, 세포 집단의 제조 방법:
1) 간엽계 줄기 세포를 포함하는 생체 조직 유래의 세포 집단으로부터, PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성, 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 선택적으로 회수하는 공정; 및
2) 공정 1)에서 회수된 세포를 고상 상에서 배양하는 공정.
제5항 내지 제8항, 제11항 내지 제13항, 및 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 또는 세포 집단.
이하의 i)의 특징 그리고 ii) 및/또는 iii)의 특징을 갖는 콜로니 형성성 PDGFR 양성 세포를 함유하는, 조직 재생 촉진을 위하여 사용되는 조성물:
i) 골아 세포, 지방 세포, 및 연골 세포로의 분화능을 갖는다;
ii) 표피 세포로의 분화능을 갖는다;
iii) P0 계보 양성이다.
제23항에 있어서, 중배엽 또는 외배엽에서 유래되는 조직의 재생 촉진을 위하여 사용되는, 조성물.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈에 포함되는 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정;
2) 피검 물질을 투여한 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 해당 말초혈에 포함되는 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정; 및
3) 공정 2)에서 계수된 세포의 수가, 공정 1)에서 계수된 세포의 수보다도 많은 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상으로부터 채취된 말초혈에 포함되는 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정;
2) 피검 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈에 포함되는 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정; 및
3) 공정 2)에서 계수된 세포의 수가, 공정 1)에서 계수된 세포의 수보다도 많은 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
2) 공정 1)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
3) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 대상에게 투여하고, 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
5) 피검 물질을 대상에게 투여하고, 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
6) 공정 5)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
7) 공정 2) 및 4)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정;
8) 공정 2) 및 6)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정; 및
9) 공정 7)의 해석 결과와 공정 8)의 해석 결과를 비교하여, 공정 5)에서 얻어진 세포 집단이, 공정 3)에서 얻어진 세포 집단과 동일한 클러스터 구성을 갖는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
2) 공정 1)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
3) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
5) 피검 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
6) 공정 5)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
7) 공정 2) 및 4)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정;
8) 공정 2) 및 6)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 클러스터링 해석을 행하는 공정; 및
9) 공정 7)의 해석 결과와 공정 8)의 해석 결과를 비교하여, 공정 5)에서 얻어진 세포 집단이, 공정 3)에서 얻어진 세포 집단과 동일한 클러스터 구성을 갖는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상으로부터 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
2) 공정 1)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정;
3) 피검 물질을 대상에게 투여하고, 말초혈을 채취하고, 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정; 및
5) 공정 4)에서 계수된 콜로니의 수가, 공정 2)에서 계수된 콜로니의 수보다도 많은 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
2) 공정 1)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정;
3) 피검 물질이 투여된 대상으로부터 채취된 말초혈을 고상 상에서 배양함으로써, 접착성의 세포 집단을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 콜로니의 수를 세는 공정; 및
5) 공정 4)에서 계수된 콜로니의 수가, 공정 2)에서 계수된 콜로니의 수보다도 많은 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
제29항 또는 제30항에 있어서, 공정 2) 및 4)에 있어서 계수하는 콜로니가, PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 콜로니인, 스크리닝 방법.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상의 추골로부터 골수를 채취하고, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;
2) 공정 1)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
3) 피검 물질을 대상에게 투여하고, 추골로부터 골수를 채취하고, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
5) 공정 2) 및 4)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 패스웨이 해석을 행하는 공정; 및
6) 공정 5)의 해석의 결과, 공정 1)에서 얻어진 세포 집단과 비교하여, 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 있어서 (i) EIF2 시그널링, eIF4 및 p70S6K 시그널링의 조절, 및/또는 mTOR 시그널링에 관련하는 패스웨이가 활성화되어 있거나 또는 (ii) 세포사 관련 유전자의 발현이 억제되어 있는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
이하의 공정을 포함하는, 다능성 줄기 세포 유도 물질의 스크리닝 방법:
1) 대상의 추골로부터 채취된 골수로부터, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;
2) 공정 1)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
3) 피검 물질이 투여된 대상의 추골로부터 채취된 골수로부터, 고상 상에서의 배양 또는 세포 분류에 의해 PDGFRα 양성의 세포 집단을 얻는 공정;
4) 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 대하여 콜로니 또는 단일 세포 단위로 망라적 유전자 발현 해석을 행하는 공정;
5) 공정 2) 및 4)에서 얻어진 유전자 발현 데이터를 합하여, 패스웨이 해석을 행하는 공정; 및
6) 공정 5)의 해석의 결과, 공정 1)에서 얻어진 세포 집단과 비교하여, 공정 3)에서 얻어진 세포 집단에 있어서 (i) EIF2 시그널링, eIF4 및 p70S6K 시그널링의 조절, 및/또는 mTOR 시그널링에 관련하는 패스웨이가 활성화되어 있거나 또는 (ii) 세포사 관련 유전자의 발현이 억제되어 있는 경우에, 당해 피검 물질을, 다능성 줄기 세포 유도 활성을 갖는 물질의 후보로서 선택하는 공정.
이하의 공정:
1) MSC 혈중 동원 물질을 투여하기 전의 대상으로부터 채취된 말초혈 중에 포함되는 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정; 및
2) MSC 혈중 동원 물질을 투여한 후의 해당 대상으로부터 채취된 말초혈 중에 포함되는 PDGFRα 양성, PDGFRα 계보 양성, P0 계보 양성, Prx1 계보 음성, Sox1 계보 음성, LepR 계보 음성, CD34 양성 및 Sca1 음성으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 갖는 세포를 계수하는 공정
을 포함하고, 공정 2)에서 계수된 세포의 수가 공정 1)에서 계수된 세포의 수보다도 많은 경우에, 해당 대상에게 있어서 조직 재생이 촉진되는 것이 시사되는, MSC 혈중 동원 물질의 조직 재생 촉진 효과의 판정 방법.