JP2023001205A

JP2023001205A - 移植可能な軟骨組織およびその選択方法

Info

Publication number: JP2023001205A
Application number: JP2022172251A
Authority: JP
Inventors: ロエル，ジュリエッタ; Roel Giulietta; カプス，クリスチャン; Kaps Christian; エッシェン，クラウディア; Eschen Claudia
Original assignee: Co Don AG
Current assignee: Co Don AG
Priority date: 2017-06-25
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2023-01-04
Also published as: US20200147269A1; CN110944684A; EP3417888A1; CN110944684B; EP3645067A1; BR112019027474A2; WO2019002148A1; CA3067770A1; EA202090133A1; BR112019027474B8; BR112019027474B1; JP2020525107A; CN114540285A

Abstract

【課題】改善された特性、特に天然の軟骨細胞との同一性などの十分な品質を有する改善された移植可能な軟骨組織と、関節軟骨欠損の治療および療法の奏効のために高品質な移植片を得ることができるような改善された品質のスフェロイドと、を提供する。【解決手段】本発明は、軟骨細胞またはスフェロイドから選択し選ぶことによる軟骨組織の製造方法、および、医薬組成物、医薬品または移植片としてのその使用に関する。特に、本発明は、特に移植のための軟骨組織を製造するための適切な軟骨細胞を同定するためのマーカーに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、軟骨細胞またはスフェロイドから選択し選ぶことによる軟骨組織の製造方法、および、医薬組成物、医薬または移植材料としてのその使用に関する。特に、本発明は、特に移植のための軟骨組織の製造のための適切な軟骨細胞を同定するためのマーカーに関する。

関節軟骨は著しい復元力を示すが、この組織はそれ自身を修復または再生することが不可能であるかまたはほとんど不可能であり、未治療のレギオンは変形性関節症を引き起こす可能性がある。この低い自然再生能力が、関節軟骨欠損の、痛みを伴わない機能修復を提供することを目的とする自家軟骨細胞移植（ＡＣＴ）などの細胞療法の開発をもたらした。たとえば外傷性病変を有し、またはさらに軟骨変性の症状も有する若くて活動的な患者における軟骨再生法および軟骨欠損の治療法が強く求められている。

ヒト軟骨細胞を用いる生化学・分子学的研究は、生検材料において入手可能な細胞がごく少数であること、増殖能が限定的であること、および、培養した軟骨細胞の表現型の不安定性が高いことと関連する、ヒト組織の利用可能性の欠如などの一連の要因によって妨げられてきた。

軟骨細胞は、軟骨芽細胞に由来し、軟骨組織において形成される細胞である。軟骨細胞は、細胞間質（細胞外基質（ＥＣＭ））とともに、軟骨、特に関節軟骨の主な構成要素を形成する。

胚発生の特定のプロセスの模倣によって、たとえば、分化能に関して単層細胞よりも優れ、たとえば軟骨様特性を有する細胞集合体が製造されるようにアガロース基質上に三次元的にヒト軟骨細胞を培養することはすでに公知である。天然の関節軟骨組織をできるだけ正確に反映するこれらの特性は、コラーゲンＩＩ（硝子軟骨の細胞外基質における主要構造タンパク質）の発現、プロテオグリカン、たとえばアグリカンの発現、および、細胞内軟骨細胞特異的タンパク質Ｓ１００の発現によって特徴付けられる。

さらに、単層培養物の細胞増殖期において必然的にアップレギュレートされるＩ型コラーゲンの発現は、その細胞集合体において再度低下することが望ましい。なぜなら、このタンパク質は天然の関節軟骨にはほとんど存在しないからである。若年患者において外傷によって引き起こされる軟骨欠損を治療するために、本出願人は、２００２年以来、このようにして作成された細胞集合体（スフェロイド）を提案してきた。この目的のために、患者から天然の関節軟骨組織を摘出し、健康な軟骨領域から硝子軟骨の生検材料を摘出する。コラゲナーゼ溶液による軟骨組織の酵素消化によって軟骨組織中の軟骨細胞を単離し、自家血清の存在下、細胞培養フラスコ中で標準的な細胞培養条件下（単層培養）で増殖し、移植可能な軟骨組織の製造のための十分な軟骨細胞を提供する。増殖した細胞は、細胞集合体、すなわちスフェロイドとして公知のものを形成するが、これは移植してもよい。しかしながら、このようにして製造される細胞集合体は、それらの分化状態が限定的であり、通例、重要な物質であるＩＩ型コラーゲンの比較的弱い局所発現とプロテオグリカンのわずかな合成とを示し、望ましくない物質であるＩ型コラーゲンの比較的強い発現を示す。これらの細胞集合体の分化をさらに改善するために、特定の生物活性物質で培地を強化することは可能である。これらには、主として、多くの場合文献にコラーゲン合成の補因子として記載されている増殖因子ＴＧＦ－β１～３およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）が含まれる。しかしながら、この生化学的刺激は、一方では、多くの場合、軟骨に特
有な構築物が産生される程度にまで３Ｄ細胞集合体における軟骨細胞の分化を誘導するには不十分であり、他方では、ＴＧＦ－βなどの増殖因子の使用は、特にヒトにおける臨床使用に関して問題視されている。

３次元細胞集合体、たとえばスフェロイドとして知られている形態でのヒト細胞の培養は、ヒトにおける臨床使用のために、たとえば、骨幹細胞、軟骨幹細胞または間葉系幹細胞からの３次元軟骨組織および骨組織のｉｎｖｉｔｒｏ製造方法に関する特許文献１において自家軟骨移植片としてすでに記載されている。この場合、最初に細胞が単層培養物で培養され、次いで、分化細胞が埋め込まれた少なくとも４０体積％の細胞外基質を含む細胞集合体が製造されるまで懸濁液中で培養される。

この方法では、アガロースでコーティングした細胞培養器において少なくとも１～２週間細胞を培養することによって細胞集合体が製造される。

特許文献２は、３次元軟骨組織および骨組織のｉｎｖｉｔｒｏ製造方法であって、１×１０^５個の細胞を少なくとも２週間培養することによって骨幹細胞、軟骨幹細胞または間葉系幹細胞から移植可能なスフェロイドを製造することを特徴とする方法を開示している。

非特許文献１も、３次元軟骨組織のｉｎｖｉｔｒｏ製造方法を開示している。この方法によれば、スフェロイドを製造するために、１×１０^５個または２×１０^５個の軟骨細胞が５日間、２週間、１、２および３ヶ月間培養される。

従来技術に記載されている、ｉｎｖｉｔｒｏで製造される軟骨組織は、天然組織と同様なＩＩ型コラーゲンなどの最も重要なマトリックスタンパク質の発現パターンを示さない。軟骨細胞からｉｎｖｉｔｒｏで産生される細胞外基質（ＥＣＭ）の組成は、むしろ、天然の軟骨組織からかなり外れている。しかしながら、ＥＣＭの組成は、軟骨の生物学的機能性、たとえば機械的耐荷重能力にとって鍵である。したがって、軟骨組織を製造するための新しい技術が求められており、品質管理も求められている。

「移植可能な軟骨組織」とは、製造される組織が天然組織と十分に一致するかまたは天然組織と同一であるｅｘ－ｖｉｖｏ製造またはｉｎ－ｖｉｔｒｏ技術を用いての製造を意味する。本発明の意味において、移植可能な軟骨組織は、たとえば細胞外基質の発現または発現パターンに関して、たとえばＩＩ型コラーゲンなどの構造タンパク質もしくはプロテイドおよび／またはＳ１００タンパク質および／または組織特異的プロテオグリカン、たとえばアグリカンなどの軟骨特異的プロテオグリカンの発現または発現パターンに関して、天然組織と十分に一致する。この発現または発現パターンは、たとえば組織学的または免疫組織学的に検出することができる。

軟骨細胞を単離する組織は、たとえば筋骨格組織、骨格組織、軟骨、骨、関節半月板、椎間板、骨髄、関節または腱から選択される。本発明の方法によって製造される移植可能な軟骨組織は、組成およびタンパク質発現に関して天然組織と同様である（上記参照）。

天然の関節軟骨組織は、関節組織の湿重量に対しておおよそ６０～８０％の水で構成される細胞外基質の組成を有する。高い水分含有量は軟骨組織の機械的耐荷重能力に重要であり、プロテオグリカンとともに「スポンジ効果」に重要である。天然の関節軟骨は、水のほかにも構造タンパク質または基質タンパク質を含む。この場合、構造高分子は関節軟骨組織の湿重量のおおよそ２０～４０％を占める。

天然の関節軟骨組織の場合は、軟骨の乾燥重量に対して、コラーゲンの割合は６０％で
あり、プロテオグリカンの割合は２５～３５％であり、非コラーゲンタンパク質および糖タンパク質の割合は１５～２０％である。ＩＩ型コラーゲンは、天然の関節軟骨組織の全コラーゲン含有量のおおよそ９０～９５％を占める。

天然のヒト関節軟骨組織は、その組織量に対しておおよそ１～５％の軟骨細胞を含む。この場合、軟骨細胞は機能性天然組織のマトリックス分子の本質的な生産者である。

このように、十分な品質を有し、治療の奏効を期待することができるような、天然組織に一致する適切な移植可能な軟骨組織を製造することができる軟骨細胞を提供することが強く求められている。この治療の奏効は、主として移植可能な軟骨組織の品質に依存する。

独国特許出願公開第１００１３２２３号明細書米国特許第７８８７８４３（Ｂ２）号明細書欧州特許第２３４５４５０（Ｂ１）号明細書独国特許出願公開第１０２００９０２５３４７（Ａ１）号明細書

Ａｎｄｅｒｅｒら，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｏｎｅａｎｄＭｉｎｅｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（２００２），ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，Ｖｏｌ．１７，ｎｏ．８，ｐ．１４２０－１４２９ＭｉｃｈａｅｌＷ．Ｐｆａｆｆｌ，Ａｎｅｗｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｍｏｄｅｌｆｏｒｒｅｌａｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｒｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２００１，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．９

したがって、本発明の目的は、特に、改善された特性、特に天然の軟骨細胞との同一性などの十分な品質を有する改善された移植可能な軟骨組織と、特に関節軟骨欠損の治療および療法の奏効のために高品質な移植片を得ることができるような改善された品質のスフェロイドと、を提供することである。

本発明者らは、驚くべきことに、移植可能な軟骨組織の製造のための十分な品質を可能にする、単離軟骨細胞におけるマーカーを同定することができた。本発明のマーカーは、特に、培養物における単離軟骨細胞の、天然の軟骨細胞に対する軟骨細胞の同一性（「同一性マーカー」）の測定を可能にする。

適切な軟骨細胞の同一性が、今度は、適切な移植可能な軟骨組織の製造を可能にする。なぜなら、一方では十分な軟骨特異的細胞外基質（ＥＣＭ）を得ることができ、他方では関節軟骨欠損の改善された治療が実現されるからである。

さらなる実施形態において、本発明のマーカーは、単離軟骨細胞またはスフェロイドの純度または夾雑物（「純度マーカー」）の測定を可能にする。

前述のマーカーは十分な品質を保証し、それによって「品質マーカー」となる。

したがって、本発明は、移植可能な軟骨組織の製造のための軟骨細胞またはスフェロイ
ドの選択方法であって、少なくとも１つの品質マーカーまたは同一性マーカーまたは純度マーカーが測定されることを特徴とする方法に関する。

本発明による、移植可能な軟骨組織の製造のための軟骨細胞またはスフェロイドの選択方法は、第１ステップにおいて、軟骨細胞を単層培養物（上記参照、２次元拡大培養物として公知のもの）で増殖させ、第２ステップにおいて、軟骨細胞を集合させてスフェロイドを形成させ、それからスフェロイドを選択してもよいように、集合させてスフェロイド（上記参照、３Ｄ培養として公知のもの）を形成させることができることを含む。

好ましい実施形態において、品質マーカーまたは同一性マーカーまたは純度マーカーはＫＡＬ１、ＣＲＴＡＣ１、ＮＲＮ１またはＥＢＦ３のグループから選択され、これ（これら）はｉｎｖｉｔｒｏで測定される。

好ましい実施形態において、品質マーカーまたは同一性マーカーはＫＡＬ１、ＣＲＴＡＣ１のグループから選択され、および／または純度マーカーはＥＢＦ３、ＮＲＮ１である。特に、滑膜細胞は、純度マーカーＥＢＦ３によってｉｎｖｉｔｒｏで測定されてもよい不都合な夾雑物である。このような夾雑物は、軟骨細胞の品質を低下させる場合があり、スフェロイドの品質も低下させる場合がある。

さらに好ましい実施形態において、前述のマーカーに加えて、潜在的マーカーとして公知のものが本発明により求められてもよい。この潜在的マーカーはスフェロイドから得られる移植可能な軟骨組織の活性および再生能力の予測を可能にする。本発明によるこのような潜在的マーカーは、好ましくはプロテオグリカンであり、特に好ましくはアグリカン（ＡＣＡＮ）である。

関連付けられたＤＮＡ配列は、アクセッション番号（たとえばＮＣＢＩ）によって明確に特定することができる。

本発明のマーカーのｉｎｖｉｔｒｏ測定は、好ましくは、これらのマーカーの遺伝子発現を測定することによって、そして単離軟骨細胞および得られたスフェロイドにおける遺伝子発現レベルも測定することによって達成され、これらは、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、特にｑＰＣＲ）によってルーチンに測定することができる。実施例を参照のこと。

本発明によれば、マーカーは、遺伝子発現だけでなく、本発明の方法における遺伝子発現の増減も示し、したがってマーカーとしてのそれらの適合性も示す。

さらなる実施形態において、遺伝子発現または遺伝子発現レベルは、参照遺伝子の存在下で、かつその遺伝子発現または遺伝子発現レベルと比較して測定してもよい。これによって、そしてソフトウェア支援によっても、遺伝子発現の正規化およびその定量が可能となる。非特許文献２を参照のこと。

本発明の範囲内で、用語「選択」とは、たとえば、本発明のマーカーの遺伝子発現を示さない軟骨細胞またはスフェロイド、または、他の軟骨細胞またはスフェロイドと比較して比較的低い遺伝子発現または遺伝子発現レベルを示す軟骨細胞またはスフェロイドを廃棄することを意味する。当業者は、得られた遺伝子発現パターンに基づいて、１以上の軟骨細胞／スフェロイドのより強い遺伝子発現とより弱い遺伝子発現とを区別することと、それに応じてこのような軟骨細胞／スフェロイドを選ぶことができる。

さらに好ましい実施形態において、増殖後、それから得られる、１つ／両方の参照遺伝子（Ｒ）、より具体的にはＢ２Ｍおよび／またはＴＯＰ１に対する以下の遺伝子発現の比を有する単離軟骨細胞およびスフェロイドを選択し選ぶものとする：
ＣＲＴＡＣ１／Ｒ＞０．００３
ＮＲＮ１／Ｒ≧０．１
ＫＡＬ１／Ｒ＞１．０
ＥＢＦ３／Ｒ≦０．４
ＡＣＡＮ／Ｒ≧０．２９
さらに好ましい比は、
ＣＲＴＡＣ１／Ｒ≧０．００６、特に≧０．００９および≧０．０１２
ＮＲＮ１／Ｒ≧０．２、特に≧０．３および≧０．４
ＫＡＬ１／Ｒ≧２．０、特に≧３．０および≧４．０
ＥＢＦ３／Ｒ≦０．３、特に≦０．２および≦０．１
ＡＣＡＮ／Ｒ≧０．３９、特に≧０．４９および≧０．５９
である。

これらの記載されている値は適切な閾値であると考えられる。

したがって、本発明は、移植可能な軟骨組織の製造のための軟骨細胞またはスフェロイドの選択方法であって、本発明のマーカーを参照遺伝子と比較して測定することを特徴とする方法に関する。

さらに好ましい実施形態において、実施される純度マーカーＥＢＦ３の測定の過程で、増殖後の単離軟骨細胞または得られたスフェロイドにおける細胞の総数に対する夾雑物としての滑膜細胞の割合は９％以下であり、特に５％以下である。

本発明の方法は、特に移植用軟骨組織として選ばれる軟骨細胞およびスフェロイドの選択を可能にする。これは、本発明のマーカー、特に品質マーカーまたは同一性マーカーまたは純度マーカーの特定の特性に基づく。したがって、特定の遺伝子発現を示す軟骨細胞およびスフェロイドが選ばれ、対応する遺伝子産物はたとえばＰＣＲによって検出することができる。

したがって、本発明は、本発明の方法によって得られる単離軟骨細胞または得られた単離スフェロイドに関する。特に、関節軟骨欠損および／または自家軟骨細胞移植の治療に使用するための、特に薬物または医薬品の形態での、またはこのような軟骨細胞もしくはスフェロイドを含む医薬組成物の形態での移植可能な軟骨組織も含まれる。

本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明による移植可能な軟骨組織は、アプリケーター（特許文献３（出願人のｃｏ．ｆｉｘ１５０）または特許文献４を参照のこと）を用いて患者に移植される。移植軟骨組織は、好ましくは、さらなる補助剤および添加剤を加えた生理食塩水中で医薬組成物の形態で保存されてもよい。
本発明の精神および範囲は、添付する特許請求の範囲の中に存在するが、本願の出願時に特許請求の範囲として存在し、その一部は補正により削除された、以下の［予備的な特許請求の範囲］の中にも潜在する。この［予備的な特許請求の範囲］の記載事項は、本願明細書の開示に含まれるものとする。
［予備的な特許請求の範囲］
［予備請求項１］・・・
移植可能な軟骨組織の製造のための軟骨細胞の選択方法であって、ＫＡＬ１、ＣＲＴＡＣ１、ＮＲＮ１またはＥＢＦ３のグループから選択される少なくとも１つの同一性マーカーまたは純度マーカーをｉｎｖｉｔｒｏで測定することを特徴とする、方法。
［予備請求項２］
移植可能な軟骨組織を製造するために、第１ステップにおいて、前記軟骨細胞を単層構造体で増殖させ、第２ステップにおいて、集合させてスフェロイドを形成させることを特徴とする、予備請求項１に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項３］
前記軟骨細胞を集合させてスフェロイドを形成させ、それからスフェロイドを選ぶことを特徴とする、前記予備請求項１または２のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。［予備請求項４］
前記同一性マーカーがＫＡＬ１、ＣＲＴＡＣ１のグループから選ばれ、および／または前記純度マーカーがＮＲＮ１、ＥＢＦ３のグループから選ばれることを特徴とする、予備請求項１～３のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項５］
ｉ．）前記同一性マーカーＫＡＬ１を有する、単層培養物中の軟骨細胞をｉｎｖｉｔｒｏで測定し、および／またはｉｉ．）少なくとも１つの同一性マーカーＣＲＴＡＣ１を有する、スフェロイド中の軟骨細胞をｉｎｖｉｔｒｏで測定することを特徴とする、予備請求項１～４のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項６］
プロテオグリカン、特にアグリカンをｉｎｖｉｔｒｏでさらに測定することを特徴とする、予備請求項１～５のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項７］
本発明のマーカーを参照遺伝子と比較して測定することを特徴とする、予備請求項１～６のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項８］
ＣＲＴＡＣ１／Ｒ＞０．００３
ＮＲＮ１／Ｒ≧０．１
ＫＡＬ１／Ｒ＞１．０
ＥＢＦ３／Ｒ≦０．４
ＡＣＡＮ／Ｒ≧０．２９
のグループから選択される遺伝子発現の少なくとも１つの比を測定することを特徴とする、予備請求項７に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項９］
ＣＲＴＡＣ１／Ｒ≧０．００６、特に≧０．００９および≧０．０１２
ＮＲＮ１／Ｒ≧０．２、特に≧０．３および≧０．４
ＫＡＬ１／Ｒ≧２．０、特に≧３．０および≧４．０
ＥＢＦ３／Ｒ≦０．３、特に≦０．２および≦０．１
ＡＣＡＮ／Ｒ≧０．３９、ｖ≧０．４９および≧０．５９
のグループから選択される遺伝子発現の少なくとも１つの比を測定することを特徴とする、予備請求項７に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項１０］
増殖後の単離軟骨細胞または得られたスフェロイドにおける総細胞数に対する滑膜細胞の割合が９％以下であり、特に５％以下であることを特徴とする、予備請求項１～９のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
［予備請求項１１］
予備請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって得られる単離軟骨細胞。
［予備請求項１２］
予備請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって得られる単離スフェロイド。［予備請求項１３］
前記スフェロイドにおける総細胞数に対する滑膜細胞の割合が９％以下であることを特徴とする、予備請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法によって得られる単離スフェロイド。
［予備請求項１４］
予備請求項１０～１３のいずれか１項に記載の軟骨細胞および／またはスフェロイド、または予備請求項１～９のいずれか１項に記載の方法によって得られる軟骨細胞および／またはスフェロイドを含む移植可能な軟骨組織。
［予備請求項１５］
関節軟骨欠損の治療または自家軟骨細胞移植に使用するための、予備請求項１４に記載の移植可能な軟骨組織。

以下の図面および実施例は、本発明を説明するために役に立つが、図面および実施例を限定するものではない。
実施例１：
軟骨生検材料および細胞培養物からの軟骨細胞の単離
軟骨特異的細胞
軟骨特異的細胞（軟骨細胞）は、コラゲナーゼ（３５０単位／ｍｌ）を用いる酵素消化によって軟骨生検材料から単離した。酵素消化は４～６時間続け、３７℃で行った。軟骨生検材料は、膝関節の大腿骨顆部から採取した。酵素消化後、軟骨細胞を遠心分離し、洗浄し、計数して、細胞培養培地（アルファＭＥＭ／ハムＦ１２培地１：１、１％グルタミン）および自家血清（１０～１５％ヒト血清）とともに組織培養フラスコに播種した。増殖のために、２次元拡大培養（単層）で、３７℃で７～３８日間、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞を培養した。３～６日毎に細胞培養培地を交換した。細胞培養物がコンフルエントになると、パパインを用いて細胞培養物を継代培養し、いくつかの培養フラスコに分けた。

単層培養によって十分な細胞数に達した後、２％アガロースでコーティングされたマイクロタイタープレートに１ウェル当たり２００，０００個の細胞を播種した。細胞は集合して３次元の丸い構造体（スフェロイド）を形成した。スフェロイドの培養中、１０％自家血清と混合した細胞培養培地（アルファＭＥＭ／ハムＦ１２培地１：１、１％グルタミン）は定期的（３～６日毎）に交換した。１４～４２日間、３Ｄ培養を続けた。

スフェロイド培養後、医療品担体（０．９％ＮａＣｌ）中にスフェロイドを採取することによって移送および移植のための軟骨細胞移植片を調製し、次いでそれをアプリケーターシステムｃｏ．ｆｉｘ１５０またはシリンジに移した。

要約すれば、軟骨細胞移植片の製造は、単離軟骨細胞を増殖させるための単層培養段階と、軟骨細胞を集合させてスフェロイドを形成させるための３Ｄ培養段階とからなった。軟骨細胞移植片は、自家適用を目的とするもの、すなわち、同じ患者の膝への移植を目的とするものであった。
実施例２：
ａ．）ＲＮＡの単離
スフェロイドの製造まで２次元拡大培養（単層）で軟骨細胞を培養し、次いで酵素溶液（パパイン）を用いて細胞培養フラスコの底部から、かつその細胞複合体から軟骨細胞を摘出した。同一性試験のために、細胞浮遊液から１×１０^６個のこれらの軟骨細胞を摘出し、反応容器に移し、残りの細胞はその後のスフェロイドの製造に用いた。試験に関連する単層細胞は遠心分離除去し、その細胞ペレットを適切な溶解緩衝液（ＰｅｑＧＯＬＤ、Ｐｅｑｌａｂ社）に溶解し、ショック凍結し、ＲＮＡの単離まで－７０℃で保存した。軟骨細胞スフェロイドのマーカー試験のために、２週間の培養時間後に、ウェルプレートから８個のスフェロイドを摘出し、ＰＢＳで洗浄し、適切な溶解緩衝液（ＰｅｑＧＯＬＤ、Ｐｅｑｌａｂ社）に溶解した。最善の細胞破壊のために、溶解緩衝液に入れたスフェロイドをシリンジおよびカニューレで吸引し排出することによって機械的にホモジナイズした。次いで溶解物を液体窒素中でショック凍結し、ＲＮＡの単離まで－７０℃で保存した。

製造業者の使用説明書に従って、Ｐｅｑｌａｂ社製のｐｅｑＧＯＬＤＴｏｔａｌＲＮＡＫｉｔによって、またはＱｕｉａｇｅｎ社製のＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＭｉｎｉ
Ｋｉｔを用いて軟骨細胞のスフェロイドおよび単層細胞から全ＲＮＡの抽出を行った。単離ＲＮＡはヌクレアーゼフリー水で溶出し、ｃＤＮＡ合成まで－７０℃で保存した。ＲＮＡの単離後、製造業者の使用説明書に従って、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）およびバイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）によってＲＮＡの量、品質および完全性を測定した。
ｂ．）ｃＤＮＡ合成
製造業者の使用説明書に従って、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）によってｃＤＮＡ合成を行った。各試料について、ランダムヘキサマープライマーを用いて８０ｎｇの全ＲＮＡを転写した。滅菌反応容器中に鋳型プライマー混合物を入れ、反応容量を２０μｌにした。鋳型プライマー混合物に、以下のさらなる成分をピペットで移した：トランスクリプターリバーストランスクリプターゼ反応緩衝液、プロテクターＲＮａｓｅインヒビター、デオキシヌクレオチドミックス、トランスクリプターリバーストランスクリプターゼ。反応バッチを混合し、あわせて遠心分離し、次いでサーモサイクラー中でインキュベートした。次いで、逆転写されたｃＤＮＡをヌクレアーゼフリー水で最終濃度１ｎｇ／μｌに希釈した。ｑＰＣＲ解析においてさらに使用するまで、－２０℃で試料を保存した。
ｃ．）ｑＰＣＲ
ｑＰＣＲ解析のために、３８４ウェルフォーマットのＬｉｇｈｔＣＹｃｌｅｒ（登録商標）４８０インスツルメントＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社）によるｑＰＣＴ技術を用いた。プライマーをＨＰＬＣ精製し、ヌクレアーゼフリー水に１０μＭの濃度に溶解した。試料は１０μＭの濃度で用いた。測定されるマーカーのために、プライマーと試料濃度と添加剤使用とに関する既定のｑＰＣＲ反応条件を作成した。全試料に対して、特異的プライマーの反応条件に応じてマスターミックスを作成した。各標的遺伝子に特異的な８μｌの反応混合物を、３８４ウェルプレートの対応するウェルにピペットで移し、次いで２μｌのｃＤＮＡ試料（１ｎｇ／μｌ）を加え、それによって各ｑＰＣＲ反応の全量を１０μｌにした。

ｑＰＣＲ解析は、対象の遺伝子の蛍光標識ＰＣＲ増幅産物の指数的増加に基づく。ｑＰＣＲデータは、ＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｌａｔｉｖｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎソフトウェアモジュール（Ｒｏｃｈｅ社）を使用するＬｉｇｈｔＣＹｃｌｅｒ（登録商標）
４８０ソフトウェアを用いて解析した。用いた検出フォーマットは、以下のパラメータ：励起フィルター４８３ｎｍ、発光フィルター５３３ｎｍ、フィルターコンビネーションＦＡＭでの、いわゆるＭｏｎｏＣｏｌｏｕｒＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓｓａｍｐｌｅ／ＵＲＬＳａｍｐｌｅＰｒｏｇｒａｍであった。相対定量のためのソフトウェアモジュールを用いてｑＰＣＲデータを作成し解析した。様々な標的遺伝子の絶対ｑＰＣＲデータ（ＣＰ値）は、ＡｂｓＱｕａｎｔ／２ｎｄＤｅｒｉｖａｔｉｖｅＭａｘ法によって作成した。Ｃｐ値（クロッシングポイント値またはサイクル閾値）は、設定した蛍光シグナル閾値を超えるために必要なＰＣＲサイクル数である。各サイクルの終わりに、７２℃で蛍光シグナルの検出を行った。

参照遺伝子に対する標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの正規化は、ＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｌａｔｉｖｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎソフトウェアモジュール（Ｒｏｃｈｅ社）を用いるいわゆる「効率」法を用いて行った。２つの参照遺伝子、ＴＯＰ１およびＢ２Ｍも、それぞれ、各試料の内部正規化対照として測定した。この参照遺伝子に対して標的遺伝子の発現が正規化され、正規化されたデータは、標的値／参照値（Ｔ／Ｒ）として、ＳｏｆｔｗａｒｅＭｏｄｕｌｅＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｌａｔｉｖｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎから自動的に提供された。このソフトウェアモジュールの基礎を形成する数学モデルは、参照遺伝子に比べた標的遺伝子のＣｐ値間の関係に基づき、また、特にプライマー特異的増殖効率に関する考察に基づく。

正規化された発現値は、軟骨細胞移植片の品質の試験のために用いた。重要な品質属性は同一性、純度および潜在能力であったが、各品質パラメータについて少なくとも１つの特異的マーカーが特定され、十分な品質を確認するために測定することができた。正規化されたマーカー発現値は、十分な品質の確認のために設定された許容限度を満足しなければならなかった。品質パラメータの値は、単層軟骨細胞（ＫＡＬ１）またはスフェロイド（ＣＲＴＡＣ１、ＮＲＮ１、ＥＢＦ３およびＡＣＡＮ）におけるｍＲＮＡ発現レベルに基づいた。

表３－１～表３－２は、軟骨移植体に対する、記載されている選択の適用を示す。記載されているように、全部で４８の軟骨移植体を製造し、本発明のマーカーを用いる同一性、純度（夾雑物）および潜在能力の試験に供した。４８の軟骨移植片のうち、４８が、単層（ＫＡＬ１）およびスフェロイド（ＣＲＴＡＣ１）における同一性の基準を満たした。４８の軟骨移植片のうち４つが純度（夾雑物）（ＥＢＦ３、ＮＲＮ１）の基準を満たすことができず、４８の軟骨移植片のうち１９が潜在能力の基準を満たすことができなかった。全体として、４８の軟骨移植片のうち２２が、軟骨細胞品質（同一性、純度／夾雑物または潜在能力）の基準を満たすことができなかった。４８の軟骨細胞移植片のうち２６が、移植可能な軟骨組織の製造に適しており、選ばれた。

実施例３：
設定された品質（本例においては同一性）の、単層培養で増殖された軟骨細胞による移植用軟骨組織の製造
軟骨欠損を有する治療対象の患者の健康な軟骨領域から硝子軟骨の生検材料を採取した。コラゲナーゼ溶液による軟骨組織の酵素消化によって、軟骨組織中の軟骨細胞を単離し、自家血清の存在下、最大集団倍加レベル（ＰＤＬ）が１０を超えないような細胞培養フラスコでの標準的な細胞培養条件（単層培養）で増殖し、移植可能な軟骨組織の製造のための十分な軟骨細胞を入手することができた。単層で増殖された軟骨細胞の一部は軟骨細胞の同一性を測定するために用い、残りの部分は移植可能な軟骨組織を製造するために用いた。単層培養物中の軟骨細胞の同一性マーカーは、軟骨細胞が軟骨細胞培養物中に含まれていることを示した。単層培養物中の軟骨細胞の同一性のために、単層中の培養した軟骨細胞の全ＲＮＡを従来の分子生物学技術によって単離し、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写した。少なくとも１つの参照遺伝子（上記、表２）および同一性マーカー「ＫＡＬ１」の発現を従来のポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。参照遺伝子の発現と「ＫＡＬ１」の発現とを比較して、正規化された同一性マーカー「ＫＡＬ１」の遺伝子発現値を得た。「ＫＡＬ１」の発現は、移植可能な軟骨組織の製造のための十分な品質（同一性）の軟骨細胞が存在することを示した。

移植可能な軟骨組織を製造するために、標準的な細胞培養培地および自家血清の存在下で、細胞培養器に、単層で増殖された十分な品質（同一性）の、少なくとも１００，０００個の軟骨細胞を移した。たとえば細胞培養の底部のアガロースコーティングによって軟骨細胞の細胞培養器への付着を防いだ。数日後、軟骨細胞は互いに付着して集合体、すなわちスフェロイドとして公知のものを形成した。このスフェロイドを少なくとも１～２週間にわたって培養し、軟骨様細胞外基質を形成させた（スフェロイド培養）。この軟骨組織（十分な品質（同一性）の軟骨細胞および軟骨様細胞外基質）は、治療対象の患者の軟骨欠損への挿入後に、欠損を充填し、天然の軟骨組織の機能を果たす置換軟骨組織を構築するのに適していた。

品質（単層培養物における同一性）の不十分な軟骨組織は置換軟骨組織を構築するのには適しておらず、廃棄した。
実施例４：
設定された品質（本例においては同一性）のスフェロイド培養物中の軟骨細胞による移植用軟骨組織の製造
移植可能な軟骨組織の製造のために、実施例３で単離され、単層で増殖された軟骨細胞を用いた。

実施例３に記載されているように、単層で増殖された軟骨細胞を、軟骨細胞の付着を防ぐ特別な細胞培養器中に移し、それによって数日後、集合体、すなわちスフェロイドとして公知のものが形成された。このスフェロイドを少なくとも１～２週間にわたって培養し、軟骨様細胞外基質を形成させた（スフェロイド培養）。

スフェロイド培養物中の軟骨細胞の同一性マーカーは、軟骨細胞がスフェロイド培養物中に含まれていることを示した。スフェロイド培養物中の軟骨細胞の同一性を測定するために、スフェロイド中の培養した軟骨細胞の一部の全ＲＮＡを従来の分子生物学技術によって単離し、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写した。少なくとも１つの参照遺伝子（上記、表２）および同一性マーカー「ＣＲＴＡＣ１」の発現を標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって測定した。参照遺伝子の発現と「ＣＲＴＡＣ１」の発現とを比較して、正規化された同一性マーカー「ＣＲＴＡＣ１」の遺伝子発現値を得た。「ＣＲＴＡＣ１」の発現は、軟骨組織の移植のための十分な品質（同一性）の軟骨細胞がスフェロイドに含まれていることを示した。

この軟骨組織（十分な品質（同一性）の軟骨細胞および軟骨様細胞外基質）は、治療対象の患者の軟骨欠損への挿入後に、欠損を充填し、天然の軟骨組織の機能を果たす置換軟
骨組織を構築するのに適していた。品質（単層培養物における同一性）の不十分な軟骨組織は置換軟骨組織を構築するのには適しておらず、廃棄した。
実施例５：
設定された品質（本例においては純度）のスフェロイド培養物中の軟骨細胞による移植用軟骨組織の製造
移植可能な軟骨組織の製造のために、実施例３で単離され、単層で増殖された軟骨細胞を用いた。

軟骨細胞の純度マーカーは、スフェロイド培養物中の軟骨細胞の含有量を示した。スフェロイド培養物中の軟骨細胞の純度を測定するために、スフェロイド中の培養した軟骨細胞の一部の全ＲＮＡを従来の分子生物学技術によって単離し、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写した。少なくとも１つの参照遺伝子（上記、表２）および同一性マーカー「ＮＲＮ１」の発現を標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって測定した。参照遺伝子の発現と「ＮＲ１」の発現とを比較して、正規化された同一性マーカー「ＮＲＮ１」の遺伝子発現値を得た。「ＮＲＮ１」の発現が純度の既定の閾値、たとえば１．０を超える場合、これは軟骨組織の移植のための十分な品質（純度）の軟骨細胞がスフェロイドに含まれていることを示す。この純度の閾値に届かない場合、不十分な品質（純度）の軟骨細胞が、軟骨組織の移植のためのスフェロイドに含まれている。

この軟骨組織（十分な品質（純度）の軟骨細胞および軟骨様細胞外基質）は、治療対象の患者の軟骨欠損への挿入後に、欠損を充填し、天然の軟骨組織の機能を果たす置換軟骨組織を作成するのに適している。品質（単層培養物における同一性）の不十分な軟骨組織は置換軟骨組織を作成するのには適しておらず、廃棄した。
実施例６：
スフェロイド培養物中の軟骨細胞と設定された細胞夾雑物とによる移植用軟骨組織の製造
移植可能な軟骨組織の製造のために、実施例３で単離され、単層で増殖された軟骨細胞を用いた。

実施例３に記載されているように、軟骨様細胞外基質を形成させるために、少なくとも１～２週間にわたってスフェロイドを形成させ培養した（スフェロイド培養）。

軟骨細胞の夾雑物マーカーは、スフェロイド培養物中の滑膜細胞、骨細胞および／または脂肪細胞による細胞夾雑物の含有量を示す。スフェロイド培養物中の軟骨細胞の細胞夾雑物を測定するために、スフェロイド中の培養した軟骨細胞の一部の全ＲＮＡを従来の分子生物学技術によって単離し、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写した。少なくとも１つの参照遺伝子（上記、表２）および夾雑物マーカー「ＥＢＦ３」の発現を標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって測定した。参照遺伝子の発現と「ＥＢＦ３」の発現とを比較して、正規化された同一性マーカー「ＥＢＦ３」の遺伝子発現値を得た。「ＥＢＦ３」の発現が夾雑物の既定の閾値、たとえば０．８に届かない場合、これは軟骨組織の移植のためのスフェロイド中に滑膜細胞による過剰な細胞夾雑物が存在しないことを示す。夾雑物の閾値を超える場合、軟骨組織の移植のためのスフェロイドに不十分な品質（夾雑物）の軟骨細胞が存在する。

この軟骨組織（十分な品質（夾雑物）の軟骨細胞および軟骨様細胞外基質）は、治療対象の患者の軟骨欠損への挿入後に、欠損を充填し、天然の軟骨組織の機能を果たす置換軟
骨組織を構築するのに適していた。不十分な品質（細胞夾雑物の含有量の増加）の軟骨組織は置換軟骨組織を構築するのには適しておらず、廃棄した。
実施例７：
設定された潜在能力のスフェロイド培養物中の軟骨細胞による移植用軟骨組織の製造
移植可能な軟骨組織の製造のために、実施例３で単離され、単層で増殖された軟骨細胞を用いた。

軟骨細胞の潜在能力マーカーは、スフェロイド培養物中の軟骨細胞が軟骨様細胞外基質を形成する能力を有していることを示した。スフェロイド培養物中の軟骨細胞の潜在能力を測定するために、スフェロイド中の培養した軟骨細胞の一部の全ＲＮＡを従来の分子生物学技術によって単離し、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写した。少なくとも１つの参照遺伝子および潜在能力マーカー「アグリカン」の発現を標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって測定した。参照遺伝子の発現と「アグリカン」の発現とを比較して、正規化された夾雑物マーカー「アグリカン」の遺伝子発現値を得た。「アグリカン」の発現が潜在能力の既定の閾値、たとえば０．１を超える場合、これは十分な品質（潜在能力）の軟骨細胞が軟骨組織の移植のためのスフェロイドに含まれていることを示す。潜在能力の閾値に届かない場合、不十分な品質（不十分な潜在能力）の軟骨細胞が軟骨組織の移植のためのスフェロイドに含まれる。

この軟骨組織（十分な品質（潜在能力）の軟骨細胞および軟骨様細胞外基質）は、治療対象の患者の軟骨欠損への挿入後に、欠損を充填し、天然の軟骨組織の機能を果たす置換軟骨組織を構築するのに適していた。不十分な品質（潜在能力）の軟骨組織は置換軟骨組織を構築するのには適しておらず、廃棄した。
実施例８：
設定された品質の軟骨細胞による移植用軟骨組織の製造
移植可能な軟骨組織の製造のために、実施例３で単離され、単層で増殖された軟骨細胞を用いた。

関節軟骨欠損の移植および再生のための高品質スフェロイド培養物を検出するために、実施例３に記載されているように、同一性マーカー「ＫＡＬ１」によって同一性を測定し、実施例４に記載されているように、同一性マーカー「ＣＲＴＡＣ１」によって同一性を測定した。さらに、実施例５に記載されているように純度マーカー「ＮＲＮ１」を測定し、実施例６に記載されているように純度マーカー「ＥＢＦ３」を測定した。実施例７に記載されているように、潜在能力マーカー「アグリカン」も測定した。

軟骨組織（十分な品質（単層培養および／またはスフェロイド培養における同一性、十分な純度および／または許容される細胞夾雑物の程度および軟骨様細胞外基質を形成する十分な潜在能力）の軟骨細胞および軟骨様細胞外基質）は、治療対象の患者の軟骨欠損への挿入後に、欠損を充填し、天然の軟骨組織の機能を果たす置換軟骨組織を構築するのに適していた。不十分な品質（単層培養物および／またはスフェロイド培養物における証明されていない同一性、不十分な純度および／または細胞夾雑物の不十分な程度および軟骨様細胞外基質を形成するのに不十分な潜在能力）の軟骨組織は置換軟骨組織を構築するのには適しておらず、廃棄した。
実施例９：
２０名の患者からの移植用軟骨組織に対するここでの実施例８に記載した手順を後ろ向き研究に用いた。ここでは、関節軟骨損傷の再生のための軟骨組織を用いた。置換軟骨組織を構築する移植軟骨組織の能力を、確立された軟骨修復スコア（ＫＯＯＳ‐膝外傷および変形性膝関節症転帰スコア：ＲｏｏｓＥＭ＆ＬｏｈｍａｎｄｅｒＬＳ，ＨｅａｌｔｈａｎｄＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅＯｕｔｃｏｍｅｓ２００３，Ｉ：６４）、すなわち治療の臨床的奏効に基づいて臨床的に評価した。この目的のために、移植用軟骨組織による治療の前に患者質問票によって各患者のＫＯＯＳを決定した（基準値）。移植用軟骨組織による治療の１年後に、患者質問票によって再度各患者のＫＯＯＳを決定した（１年後の経過観察値）。この治療の臨床的奏効または治療奏効は、１年後の経過観察値と基準値との差（ＫＯＯＳΔ）が少なくとも８ポイントであった場合に確定された（ＲｏｏｓＥＭ＆ＬｏｈｍａｎｄｅｒＬＳ，ＨｅａｌｔｈａｎｄＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅＯｕｔｃｏｍｅｓ２００３，Ｉ：６４）。１年後の経過観察値と基準値との差（ＫＯＯＳΔ）が８ポイント未満であった場合、治療の結果としての臨床的改善は見られなかった。すなわち治療は不成功に終わったと見なした。

２０名の患者のうち４名（５６９７－１６０７、５８６２－１３１１、６０７０－２４１３、６９８８－２４２３）からの移植可能な軟骨組織において、潜在能力マーカー「アグリカン」は設定された限度値を下回ったが、同一性マーカー「ＫＡＬ１」および「ＣＲＴＡＣ１」に基づいて軟骨細胞の同一性を決定することができることが見出された。発現値は、設定された限度値を上回った。移植用軟骨組織の純度も、夾雑物マーカー「ＥＢＦ３」に基づいて測定することができ、確定されたが、ここで発現値は設定された限度値を下回った。したがって、これらの４つの移植用軟骨組織は、置換軟骨組織の構築のためには不十分であることが立証され、廃棄された。これは２０％の棄却率（２０の移植用軟骨組織のうち４つ）に該当する。

２０名の患者のうち１６名（６２６６－２６０１、６６５８－２４２０、７４９４－２２８４、８５２８－２２８６、９０７０－２７０９、９１１０－２２９４、５６６９－２２６３、９１１０－２２９４、６０９４－１３１２、６３４０－２２７７、６６１１－２４１８、８３１５－２４３４、８９１６－２４４０、８９３１－１１２６、８９４８－２７０６、８９６６－２４４１）からの移植可能な軟骨組織において、潜在能力マーカー「アグリカン」も設定された限度値を上回り、軟骨細胞の同一性は同一性マーカー「ＫＡＬ１」および「ＣＲＴＡＣ１」に基づいて決定することができることが見出された。発現値も、設定された限度値を上回った。移植用軟骨組織の純度も、夾雑物マーカー「ＥＢＦ３」に基づいて測定することができ、確定されたが、ここで発現値は設定された限度値を下回った。したがって、これらの１６の移植用軟骨組織は置換軟骨組織の構築のために十分な品質であることが立証され、移植に用いられた。これは８０％の成功率（２０の移植用軟骨組織のうち１６）に該当する。

このように、２０名の患者のうち４名（５６９７－１６０７、５８６２－１３１１、６０７０－２４１３、６９８８－２４２３）の移植可能な軟骨組織は不十分な品質（単層構造体および／またはスフェロイド構造体における証明されていない同一性、不十分な純度および／または細胞夾雑物の不十分な程度および軟骨様細胞外基質を形成するのに不十分な潜在能力）の軟骨組織であることが立証されたが、２０名の患者のうち１６名（６２６６－２６０１、６６５８－２４２０、７４９４－２２８４、８５２８－２２８６、９０７０－２７０９、９１１０－２２９４、５６６９－２２６３、９１１０－２２９４、６０９４－１３１２、６３４０－２２７７、６６１１－２４１８、８３１５－２４３４、８９１６－２４４０、８９３１－１１２６、８９４８－２７０６、８９６６－２４４１）からの移植可能な骨組織は、十分な品質（単層構造体および／またはスフェロイド構造体における同一性、十分な純度および／または細胞夾雑物の十分な程度および軟骨様細胞外基質を形成するのに十分な潜在能力）の軟骨組織を有していた。

この治療の臨床的奏効または治療奏効に関して、後ろ向き研究において不十分な品質の移植可能な軟骨組織が決定された、２０名の患者のうち４名の患者（５６９７－１６０７、５８６２－１３１１、６０７０－２４１３、６９８８－２４２３）において、治療の結果としての臨床的改善が見られなかったことが見出された（表４参照）。ＫＯＯＳの１年後の経過観察値とＫＯＯＳの基準値との差は８ポイント未満であり、したがってその治療は不成功に終わった。一方、十分な品質の移植可能な軟骨組織が決定された、２０名の患者のうちの１６名の患者（６２６６－２６０１、６６５８－２４２０、７４９４－２２８４、８５２８－２２８６、９０７０－２７０９、９１１０－２２９４、５６６９－２２６３、９１１０－２２９４、６０９４－１３１２、６３４０－２２７７、６６１１－２４１８、８３１５－２４３４、８９１６－２４４０、８９３１－１１２６、８９４８－２７０６、８９６６－２４４１）において、治療の結果としての臨床的改善が見られたことが見出された。ＫＯＯＳの１年後の経過観察値とＫＯＯＳの基準値との差は少なくとも８ポイントであり、したがってその治療は成功した。

本発明は、軟骨細胞またはスフェロイドから選択し採用することによる軟骨組織の製造方法、および、医薬組成物、医薬または移植材料としてのその使用に関する。特に、本発明は、特に移植のための軟骨組織の製造のための適切な軟骨細胞を同定するためのマーカーに関する。

Claims

移植可能な軟骨組織の製造のための軟骨細胞の選択方法であって、ＫＡＬ１、ＣＲＴＡＣ１のグループから選ばれる同一性マーカー、およびＮＲＮ１、ＥＢＦ３のグループから選ばれる純度マーカーがｉｎｖｉｔｒｏで測定され、プロテオグリカン、特にアグリカンがｉｎｖｉｔｒｏでさらに測定されることを特徴とする、方法。
移植可能な軟骨組織を製造するために、第１ステップにおいて、前記軟骨細胞を単層培養物で増殖させ、第２ステップにおいて、集合させてスフェロイドを形成させることを特徴とする、請求項１に記載の軟骨細胞の選択方法。
前記軟骨細胞を集合させてスフェロイドを形成させ、それからスフェロイドを選ぶことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の軟骨細胞の選択方法。
ｉ．）前記同一性マーカーＫＡＬ１を有する、単層培養物中の軟骨細胞をｉｎｖｉｔｒｏで測定し、および／またはｉｉ．）少なくとも１つの同一性マーカーＣＲＴＡＣ１を有する、スフェロイド中の軟骨細胞をｉｎｖｉｔｒｏで測定することを特徴とする、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
本発明のマーカーを参照遺伝子と比較して測定することを特徴とする、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
ＣＲＴＡＣ１／Ｒ＞０．００３
ＮＲＮ１／Ｒ≧０．１
ＫＡＬ１／Ｒ＞１．０
ＥＢＦ３／Ｒ≦０．４
ＡＣＡＮ／Ｒ≧０．２９
のグループから選択される遺伝子発現の少なくとも１つの比を測定することを特徴とする、請求項５に記載の軟骨細胞の選択方法。
ＣＲＴＡＣ１／Ｒ≧０．００６、特に≧０．００９および≧０．０１２
ＮＲＮ１／Ｒ≧０．２、特に≧０．３および≧０．４
ＫＡＬ１／Ｒ≧２．０、特に≧３．０および≧４．０
ＥＢＦ３／Ｒ≦０．３、特に≦０．２および≦０．１
ＡＣＡＮ／Ｒ≧０．３９、特にｖ≧０．４９および≧０．５９
のグループから選択される遺伝子発現の少なくとも１つの比を測定することを特徴とする、請求項５に記載の軟骨細胞の選択方法。
増殖後の単離軟骨細胞または得られたスフェロイドにおける総細胞数に対する滑膜細胞の割合が９％以下であり、特に５％以下であることを特徴とする、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の軟骨細胞の選択方法。
請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の方法によって単離スフェロイドを得る方法。
前記スフェロイドにおける総細胞数に対する滑膜細胞の割合が９％以下であることを特徴とする、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の方法によって単離スフェロイドを得る方法。
請求項１０に記載の方法によってスフェロイドを含む移植可能な軟骨組織を得る方法。
移植可能な軟骨組織を関節軟骨欠損の治療または自家軟骨細胞移植に使用する、請求項１１に記載の方法。