KR20220024205A

KR20220024205A - 연골의 배양 방법 및 연골의 구상체

Info

Publication number: KR20220024205A
Application number: KR1020217043019A
Authority: KR
Inventors: 크리스티안 캅스; 지우리에타 로엘; 클라우디아 에쉔
Original assignee: 코.돈 아게
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2020-06-02
Publication date: 2022-03-03
Also published as: BR112021023242A2; WO2020240040A1; CN114402063A; EP3938493A1; SG11202113257YA; CA3141639A1; JP2022535363A; EP3744831A1; US20220220443A1

Abstract

본 발명은 연골 세포를 증식 또는 부유화하고, 연골의 구상체를 제공하기 위한 방법에 관한 것으로, 여기서 구상체는 자가연골세포이식(ACI) 제품에 유용하다. 따라서, 본 발명은 특히 관절 연골로부터의 구상체의 생산 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

연골의 배양 방법 및 연골의 구상체

본 발명은 연골 세포를 증식 또는 부유화하고, 연골의 구상체(spheroids)를 제공하기 위한 방법에 관한 것이고, 여기에서 구상체는 자가연골세포이식(ACI: autologous chondrocyte implantation) 제품에 유용하다. 따라서, 본 발명은 특히 관절 연골로부터의 구상체의 생산 및 이들의 용도에 관한 것이다.

비록 관절 연골이 뚜렷한 탄성력을 보여주기는 하나, 이 조직은 스스로 회복할 수 없거나 거의 회복할 수 없고, 치료되지 않은 영역이 골관절염을 야기할 수 있다. 이러한 낮은 자발적인 재생 가능성은 관절 연골 결손의 기능적이고 고통없는 회복을 제공하는 것을 목적으로 자가연골세포이식(ACI)과 같은 세포 치료법의 개발로 이어졌다. 그러나, 이러한 형태의 기술들은 연골 재생을 보장할 수 없고, 이전에는 어떠한 적절한 장기 연구도 없었다. 결과적으로, 예를 들어 외상성 영역을 갖거나 심지어 연골 퇴화의 시스템들을 가진 젊고 활동적인 환자들에서 연골 재생을 위한 방법에 대한 요구가 높다.

소, 토끼 또는 양의 연골에서 단리된 연골세포들에 대해 다수의 연구들이 실행되었다. 그러나, 이러한 형태의 수득된 데이터 및 동물-기반 개념들은 인간의 상황으로 이전될 수 없다. 인간 연골세포에 대한 상세한, 생화학적 및 분자적 연구는 생체검사에서 획득가능한 매우 적은 수의 세포들과 연관된 인간 조직의 획득가능성의 결여, 제한된 증식 능력 및 배양된 연골세포의 높은 표현형 불안정성과 같은 일련의 요인에 의해 방해받고 있다.

연골세포(chondrocyte ; 동의어 연골 세포(cartilage cell))는 연골아세포에서 유래하고 연골 조직 중에 자리잡고 있는 세포이다. 세포간 물질(세포외 기질(ECM: extra cellular matrix)과 함께 연골의 주요 구성요소를 형성한다.

천연의 관절 연골 조직은 관절 조직의 습윤 중량(wet weight)에 대하여 대략 60 내지 80% 수분으로 형성된 세포외 기질의 조성을 갖는다. 높은 수분 함량은 연골 조직의 기계적 하중-지지능(load-bearing ability)에 중요하며, 프로테오글리칸들(proteoglycans)과 함께 "스펀지 효과(sponge effect)"에 중요하다. 수분 외에도, 천연의 관절 연골은 콜라겐, 프로테오글리칸 및 비-콜라겐 단백질과 같은 기질의 구조 고분자(structural macromolecules)를 포함한다. 여기에서, 구조 고분자는 관절 연골 조직의 대략 20 내지 40%의 습식 중량을 차지한다.

예를 들어 배아 발달의 특정한 과정을 모방하는 것에 의해 분화 능력의 면에서 단층 세포 보다 우수하고 예를 들어 연골-유사 특성을 갖는 세포 응집물(cell aggregates)이 생산되도록 하기 위해 예를 들어 아가로스 기질(agarose substrate)에서 3차원적으로 인간 연골 세포를 배양하는 것이 이미 공지되어 있다. 가능한 한 정확하게 천연 관절 연골 조직을 반영하는 이들 특성은 프로테오글리칸, 예를 들어 아그레칸(aggrecan)의 콜라겐 II(초자 연골(hyaline cartilage)의 세포외 기질 중의 1차 구조 단백질) 및 세포내 연골세포-특이적 단백질 S100의 발현에 의해 특정된다. 게다가, 천연의 관절 연골에는 콜라겐 I가 실질적으로 부재하기 때문에, 세포 증식 단계 동안 단층 배양에서 필수적으로 상향조절되는 콜라겐 I의 발현이 세포 응집물에서는 다시 감소되는 것이 바람직하다. 따라서 생성된 세포 응집물(구상체들)은 주로 손상에 의해 야기된 작은 연골 결손을 치료하도록 2002년부터 본 출원인(co.don AG)에 의해 제공되어 왔다. 이를 위해, 천연의 관절 연골 조직을 환자로부터 제거하고 그로부터 단리된 세포를 증식 및 3D 배양 후 구상체로서 이식된다. 자가 연골세포 이식(ACI) 제품은 Spherox ®로 공지되어 있다.

3-차원 세포 응집물의 형태, 특히 구상체로 공지된 형태로의 인간 세포의 배양은 예를 들어 자가 연골 이식(DE 100 13 223)으로서 이미 인간들에서의 임상 용도로 허가되었다. DE 100 13 223은 골 줄기 세포, 연골 줄기 세포 또는 간충직 줄기 세포들로부터 3-차원 연골 조직 및 골 조직을 시험관 내 생산을 위한 방법에 관한 것이다. 여기에서, 세포가 먼저 단층 배양으로 배양되고 계속해서 세포 응집물 내에 분화된 세포들이 매립된 최소 40 용적%의 세포외 기질을 포함하는 세포 응집물이 생성될 때까지 현탁액 중에서 배양된다. 본 방법에서, 세포를 적어도 1 내지 2 주 동안 아가로스로 코팅된 세포 배양 용기 내에서 배양하는 것에 의해 세포 응집물이 생성된다.

US 7 887 843 B2는 3-차원 연골 조직 및 골 조직의 시험관 내 생산을 위한 방법을 기술하고 있고, 여기에서 구상체는 1 x 10⁵ 세포를 적어도 2 주 동안 배양시키는 것에 의해 골 줄기 세포, 연골 줄기 세포 또는 간충직 줄기 세포로부터 생산된다. US 7 887 843 B2에 따라 생산된 구상체는 1 주 후 500 내지 700 ㎛의 직경을 갖는다. 이러한 방법에 따라, 구상체를 생성하기 위해서는 1 x 10⁵ 또는 2 x 10⁵ 연골세포를 5일, 2주, 1개월, 2개월 및 3개월 동안 배양한다.

본 발명에 따르면, 환자-유래 조직 생체검사가 출발 물질로 사용된다. 조직-구축 세포들이 조직의 효소 소화, 이동 또는 표적 세포를 인식하는 시약들을 사용하여 통상의 방법에 따른 생체검사로부터 단리된다.

본 발명에 따르면, 이들 세포들은 계속해서 고정 배양(stationary culturing)에 적용되고, 여기에서 세포들이 먼저 기질 지지 단층 배양(2-차원)에서 배양되고 계속해서 세포 응집물 내에 매립된 분화된 세포를 갖는 세포외 기질(ECM)의 최소 40용적% 그리고 최대 95용적%까지 포함하는 3-차원 세포 응집물이 형성될 때까지 현탁액 중에서 특히 소수성 표면을 갖는 세포 배양 용기들 중의 통상의 배양 배지를 사용하여 단순한 방법으로 기질 없이 배양된다. 이렇게 형성된 세포 응집물을 본 발명의 의미로 구상체라고 한다.

본 발명에 따른 세포 배양 용기들로서, 현탁액 중의 배양 단계는 소수성, 즉 폴리스티렌 또는 테프론 등과 같이 접착-방지 표면을 갖는 것의 사용을 필요로 한다. 비-소수성 표면을 갖는 세포 배양 용기들은 바람직하게는 한천(agar) 또는 아가로스로의 코팅에 의해 소수성화될 수 있다. 추가의 첨가제는 필요하지 않다. 바람직하게는, 96-웰 플레이트가 세포 배양 용기로서 사용된다.

본 발명에 따라 생산된 구상체 내에 집적된 세포들이 생존한다는 것과 진전된 배양 기간 이후에도 내부의 세포들이 괴사하지 않는다는 것이 주목할 만하다. 배양의 시간이 증가함에 따라, 세포 응집물 내부의 세포들이 분화를 진행하여 ECM, 분화된 세포들 및 말초 증식 영역(peripheral proliferation zone)으로 이루어지는 구상체를 형성한다. 매립된 세포를 수반하는 조직-특이적인 기질이 형성되는 과정은 체내에서의 조직의 형성 또는 조직 신생(neogenesis) 및 재구성(reorganization)의 과정과 매우 유사하다. 세포 배양 중의 분화 동안, 조직-특이적인 기질의 형성으로 인하여 응집된 세포들의 간격이 증가한다. 조직 조직학은 천연의 조직과 매우 유사한 구상체의 내부를 발달시킨다. 천연의 연골에서와 마찬가지로, 구상체들 내부의 세포들에는 단지 확산을 통해 영양분들이 공급된다. 구상체 제조의 추가의 과정 동안, 증식 및 이동이 가능한 세포들의 영역이 구상체의 경계에서 형성된다. 이러한 영역은 결손들에 구상체들을 결합한 후, 이러한 말초 영역 내에 위치된 세포들이 이동하여 주변 조직과 능동 접촉을 이루고/이루거나 시험관 내 환경에서 시험관 내 생성된 조직의 통합을 가능하게 한다는 점에서 매우 유리하다. 따라서, 생성된 조직-특이적 세포 응집물은 조직 결손의 치료에 그리고 조직의 시험관 내 및 생체 내 조직 신생에 매우 적합하다.

그러나, 본 발명의 목적은 공지된 방법과 이 방법으로 수득가능한 구상체들을 개선하고, 특히 무-반응자들 또는 치료 실패자들의 환자들 또는 환자 모집단들의 결과를 감소시키고 그리고 환자의 임상 안정성을 보다 더 높이는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 무-반응 환자는 수술 전 상황에 비하여 8 내지 10점의 소위 KOOS 값의 변화로 식별될 수 있다(Roos EM, Lohmander LS. The Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score (KOOS): from joint injury to osteoarthritis. Health Qual Life Outcomes 2003; 1: 64.).

놀랍게도, 본 발명자들은 120 명의 환자(NCT01225575 및 NCT0122259)를 포함한 연구에서 방법과 연관된 운영 범위들(operational ranges) 또는 공정 매개변수들이 구상체의 효능에 가치있는 영향을 미친다는 결론을 내렸다.

따라서, 근본적인 기술적 문제는 적어도 하나의 특허청구범위에 의해 해결되며, 여기에서 배양 시간이 중대한 특징이다.

특히, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 연골 세포를 증식 또는 부유화하고 연골의 구상체를 제공하기 위한 방법에 관한 것이다:

a.) 인간 또는 동물 유래의 조직으로부터 연골 세포를 단리하는 단계,

b.) 기질 상에 위치되는 단층을 확장시켜(2D) a.)로부터의 세포를 배양하는 단계,

c.) a.)로부터 단층을 회수하고 상기 세포를 현탁액 중에서 3D 환경 중에서 배양하는 단계,

d.) 여기에서 단계 b.) 및 단계 c.)의 총 배양 시간이 단계 a.)의 출발 시간부터 계산하여 55일 이하이고, 그리고 여기에서 단계 b.)의 지속 시간이 10일 초과임,

e.) 수득된 구상체를 선별하는 단계.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 b.)의 지속 시간이 38일이고/이거나 단계 c.)의 지속 시간이 28일 미만이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 b.)의 지속 시간은 10일 초과 또는 16일 초과 또는 20일 초과이고 38일 미만이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 b.)의 지속 시간은 10일 초과이고 16일 이하이다.

놀랍게도, 수득된 구상체는 각각 양과 크기(직경)가 최적화되어 있고 따라서 최상의 효능의 구상체가 제공되어 무-반응자 또는 치료 실패자의 환자 또는 환자 모집단, 특히 이하에서 개괄된 바와 같이 8 미만(< 8)의 KOOS 값을 갖는 환자의 지속가능한 감소를 야기한다.

따라서, 수득되고 선별된 구상체는 3,000 내지 200,000 세포들의 최적화된 범위, 바람직하게는 3,500 내지 75,000 세포의 범위의 세포들로 구성된다.

더욱이, 구상체의 직경(크기)은 100 내지 1,000 ㎛, 바람직하게는 200 내지 900 ㎛ 또는 바람직하게는 240 내지 870 ㎛의 최적화된 범위 이내이다.

수득되거나 선별된 이러한 구상체는 가장 효과적이고 10 ㎠의 결손들을 치료할 수 있고, 여기에서 ㎠ 당 10 내지 70 개의 구상체의 양이 사용된다.

이러한 방식으로 수득된 구상체는 추가로 가공되어 약제학적 제제를 형성한다.

본 발명의 의미 내에서, "기질(substrate)"은 단층을 적재하기에 적절한 임의의 물질을 의미한다.

배양은 당해 기술분야에서 통상의 기술자에게 공지된 세포 배양 조건 및 배양 매질을 사용하여 수행된다(Schubert T, Anders S, Neumann E, Scholmerich J, Hofstadter F, Grifka J, Muller-Ladner U, Libera J, Schedel J. Int J Mol Med. 2009 Apr;23(4):455-60.).

본 발명의 방법은 연골 세포 및 연골 세포의 구상체의 유리한 풍부화 및 증식을 가능하게 한다.

본 발명에 따르면, KOOS 값들과 첫 번째 통과 이전의 단층 배양 시간(간단히: P0)(스피어만 상관 계수(Spearman), P = 0.025)(도 1a), 구상체 배양 시간(간단히: 3D)(P = 0.026)(도 1c) 및 단층(간단히: ML) 및 구상체 중에서의 연골세포의 총 배양 시간(P = 0.007)(도 1e)과 같은 공정 매개변수 사이에 음의 상관관계가 발견되었다. 도 1에서 KOOS 총 델타 점수들을 환자들의 모든 구상체 배치에 대해 P0, 3D 및 ML + 3D의 세포 배양 시간들에 대해 도식화(plotted) 하였으며, 음의 상관관계를 나타내고 있다(도 1a 내지 도 1c). 이들 초기 연구 결과들은 이식 후 보다 나은 임상 결과로 대표되는 생성물의 품질에 대해 보다 짧은 배양 시간이 도움이 된다는 것을 시사하고 있다. 이는 무-반응자 그룹(KOOS < 8)이 반응자 그룹에 비해 P0에서 상당히 긴 배양 시간으로 제조된 구상체 배치를 수령하였다는 관측에 의해 뒷받침된다(도 5a). 또한, ML 및 3D의 총 세포 배양 지속시간이 무-반응자 그룹에서 평균적으로 보다 긴 것으로 나타났다(도 5b). 이는 구상체의 효능에 대한 부정적인 영향과 환자의 결과에 대한 단점을 회피하기 위해 연구 데이터에 기초한 세포 배양 기간에 대한 운영 범위 또는 공정 매개변수를 새롭게 정의하고 제한할 필요성을 강조한다.

연골세포 배양에 대한 잠정적인 최대 시간을 결정하기 위해, 음의 상관 관계가 사라질 때까지 후속하여 가장 긴 배양 시간을 갖는 배치들이 데이터 세트로부터 삭제되었다(스피어만 상관 계수). 첫 번째 통과인 P0 이전의 ML 배양 시간에 대해서는, 임상 결과에 대한 부정적인 영향이 없는 최대 배양 시간이 19일로 정의되었다. 그러나, P0에서 배양 19일째에 배치는 무-반응자에 속하였다. 따라서, 잠정적인 최대 배양 시간은 18일로 설정되었다(도 1d). 구상체 배양을 위한 잠정적인 최대 허용 시간은 31일로 설정되었다(도 1e). ML 및 3D에서의 총 배양 시간에 대해서는 배치들이 P0에서 16일 그리고 3D에서 28일 초과 동안 배양되었을 때 단지 배치들이 55일 남았을 때까지 배양 시간들을 갖는 배치들만 데이터 세트로부터 제거되었다. 이 환자들/배치들의 그룹에서 놀랍게도 총 배양 시간과 효능 사이에 어떠한 상관 관계도 발견되지 않았다(도 1f).

임상 결과와 P0, 3D 및 총 배양 시간들 사이의 상관 계수들이 매우 낮았기 때문에(-0.2), 높은 배양 시간으로 생산된 배치가 무-반응자(KOOS 점수 < 8)에 대해 추가로 분석되었다. 이는 19일 내지 28일의 ML P0에서 배양된 구상체 배치로 치료된 환자들의 그룹에서 80%, 그리고 16일 내지 28일에서 배양된 배치들에 대해 61.5%의 주목할 만한 높은 무-반응자 비율을 나타내었다(표 1 참조). 16일까지 배양된 배치는 28%의 무-반응자 비율을 나타내었고, 이는 전체 임상 연구 그룹의 무-반응자의 31.7%에 비해 상당히 낮다. 제조 동안의 배양 시간의 실행가능성과 함께 무-반응자 비율을 고려하면, 잠정적인 최대 배양 시간은 16일로 정의되었으나, 16일 보다 더 추가로 제한되는 것은 아니다.

구상체 배양 시간에 대한 잠정적인 한계를 정의하기 위해 동일한 분석이 수행되었다. 32일 보다 더 긴 배양 시간을 갖는 구상체 배치를 데이터 세트로부터 삭제한 후, 음의 상관관계가 사라졌다(도 1e). 그러나, 32일 동안 배양된 구상체 배치 모두가 무-반응자(n = 4)에 속하기 때문에 잠정적인 한계를 31일로 설정하였다. 더욱이, 32일 내지 42일 사이에 3D에서 배양된 구상체로 치료된 환자들은 59%의 상대적으로 높은 무-반응자 비율(n = 17)(표 2 참조)을 나타내어 또한 3D 배양 시간을 한정해야 한다는 요건을 강조한다. 28일까지의 가능한 제한이 무-반응자 비율을 더욱 감소시키기 위해 고려되었다. 실제로, 배양 29일 내지 42일에서, 50%의 무-반응자 비율은 3D에서 배양 시간을 추가로 제한하면 반응자 비율을 향상시킬 수 있다는 것을 나타내고 있다. 이에 따라, 배양이 42일에서 최대 28일까지 제한될 때 그룹 내에서 무-반응자 비율이 보다 낮았으며; 무-반응자 비율은 각각 31.7% 대 26.6%이었다(표 2 참조). 다시, 무-반응자 비율 뿐만 아니라 구상체 배양 시간 실행가능성에 기초하여, 구상체 배양 시간은 최대 28일로 추가로 제한되었다.

ML 및 3D 배양 시간의 별도의 평가에서 예상되는 바와 같이, 총 배양 시간은 또한 임상 결과와 부정적인 상관관계를 나타내었다(도 1c). 제조 공정 동안 ML 및 3D의 부가 효과(additive effects)를 식별하기 위해, 먼저 52%의 무-반응자를 포함하는 데이터 세트에서 P0에서 16일 초과 그리고 3D에서 28일 초과 배양된 배치를 제거하여 개별 효과를 배제시켰다(참조 표 3). 분석에서 잔류한 구상체 배치의 그룹을 55일 이하로 배양시켰다. 이 그룹에서 배양 시간과 임상 결과 사이에 어떠한 상관관계도 발견되지 않았으며, 따라서 새로 정의된 배양 시간 내에 배치를 배양시켰을 때 P0와 3D의 부가 효과들이 함께 제공되지 않았다는 것을 입증하고 있다(도 1f). 따라서 무-반응자 비율에 기초한 추가의 제한은 단지 임상 효능 또는 안전성에 대한 총 배양 시간(ML + 3D)의 영향 만을 고려할 것이다. 55일까지 배양한 배치의 그룹은 26.1%의 무-반응자 비율을 나타내어 배치의 전체 그룹의 31.7%에 비해 크게 개선되었다.

따라서, 총 배양 시간은 본 발명의 최적의 방식에 따라 55일 이하로 제한되도록 한다.

전체적으로 보아, 이들 분석은 긴 배양 시간을 갖는 배치들이 높은 무-반응자 비율을 보여주며 연골세포 배양 시간에 대한 운영 범위를 조정할 필요성을 강조한다.

긴 배양 시간을 갖는 배치로 치료된 환자 중에서 무-반응자의 높은 발생을 고려하여, 무-반응자 및 반응자 그룹을 새로 정의된 한계 이외의 연장된 배양 시간에 대해 비교하였다. 이 연구 그룹이 미세골절(MFX: micro-fracture) 치료 그룹과 비교할 수 있기 때문에, 지금 이 시점부터는, 단지 본 연구에 포함된 환자만이 추가로 분석되었다. 본 연구에서 총 환자 그룹의 25%(n = 12)는 이식 후 1년 후 ACI 치료에 대해 반응하지 않았다. 이 그룹을 살펴보면, 무-반응자 12명(16.7%) 중 2명이 P0에서 16일 초과 배양된 것으로 나타난 반면, 반응자의 8.5% 만이 이 경우에 해당되었다(36명 중 n = 3). 연장된 3D 배양 시간에 대하여 보다 놀라운 불일치를 무-반응자와 반응자 사이에서 볼 수 있었으며; 무-반응자(58.3%)의 그룹에 속하는 12개의 배치 중 7개의 배치가 3D에서 28일 보다 더 긴 일수 동안 배양된 반면, 반응자 배치(n = 8)의 단 16.6% 만이 이 경우에 해당되었다. 반응자 그룹(22.2%)에 비해 무-반응자 그룹(66.7%)에서 새롭게 제한된 배양 시간을 넘어서 제조된 배치의 과다-대표(over-representation)가 배양 시간의 조정의 필요성을 다시 입증하고 있다. 본 연구의 전체 그룹에서 배치의 67%가 보다 엄격한 운영 범위(ORs), 하위 그룹 1에 따라 제조되었고, 배치의 33%가 새로이 정의된 배양 한계, 하위 그룹 2 이외에서 제조되었다.

운영 범위 또는 공정 매개변수가 임상 효능과 관련이 없을 경우, ACI 이후 임상적인 개선의 결과를 가져오지 않는 배치의 분포는 짧은 배양 시간을 갖는 배치와 긴 배양 시간을 갖는 배치들 사이에서 균등하게 분포되었을 것이다. 따라서, 이들 분석은 KOOS와 배양 시간 사이의 초기 상관관계 분석과 제조 과정이 적어도 부분적으로는 ACI에 사용되는 연골세포 구상체의 효능의 상실을 야기할 수 있음을 나타내고 있다.

ACI 치료의 임상 효능의 개선을 기대할 수 있을 정도로 세포 배양 시간의 제한이 효과적인 경우, 연구 배치에 대한 가능한 개선은 대조군 MFX와의 비교에 의해 정량화되었다. ML, 3D 및 총 배양 시간에서 세포 배양 시간에 대한 새로운 한계를 정의한 후, 임상 데이터의 소급 평가가 실시되었다. 여기에서, 환자가 2 그룹으로 분할되었다. 이러한 분할은 이전에 설명한 바와 같이 연구 데이터로부터 배치들을 제거하는 것에 기초하고 있다. 하위 그룹은 공정 매개변수 P0, 3D 및 ML + 3D에 대해 새로 정의된 운영 범위 이내인 하위 그룹 1 또는 배양 단계 중의 적어도 하나에서 이들 범위 이외의 하위 그룹 2에서 생성된 구상체 배치들로 이루어진다. 두 하위 그룹들 사이의 배양 시간에서의 차이를 도 2에 묘사하였다.

여기에서, 단층(ML)과 3D에서의 배양 시간 및 총 배양 시간(ML + 3D)이 하위 그룹 2의 배치에서 유의미하게 긴 것으로 나타났다(도 2b 내지 도 2d). 그러나 P0에 대해서는, 두 하위 그룹 사이에서 통계학적으로 유의미한 차이가 없었다(도 2a). 이는 연장된 3D 배양 시간을 갖고, 그에 따라 하위 그룹 2로 할당된 일부 배치는 여전히 새로이 정의된 범위 내의 P0 배양 시간을 가졌기 때문이다.

제한된 배양 시간으로 생성된 연골세포 구상체로 치료된 32명의 환자로 구성된 하위 그룹 1을 연구 환자의 전체 그룹과 비교하여 임상 결과의 차이점을 찾아냈다. 이 하위 그룹은 전체 연구 그룹의 75%에 비해 반응자의 수가 87.5%로 더 높다(도 3). 이에 반해, 새로이 정의된 운영 범위 이외에서 배양된 구상체 배치로 치료된 16명의 환자의 하위 그룹은 이식 후 1년 후 단지 50%의 양성 임상 결과를 나타내었다(도 3).

조정된 제조 공정에 의해 생산된 구상체로 치료된 환자의 임상적 개선을 비교하기 위해, 이들 배치와 미세-골절 치료(MFX) 사이의 우위 분석(superiority analysis)이 수행되었다, 표 4 참조.

ACI 제품의 이식 후 1년 후 연구 임상 결과는 미세-골절(MFX) 수술에 비하여 비-열등성을 입증하였다(도 4). MFX와 비교한 연골세포 구상체-기반 ACI의 KOOS(총 델타) 평균 사이의 차이는 이식 후 1년 후 5.75점으로 ACI 치료에 유리했다. 신뢰구간 95%(CI 95%)로, -1.03의 하한은 MFX에 비해 ACI 치료가 열등하지 않음을 입증하였다(도 4). 새로이 정의된 운영 범위 내에서 제조된 하위 그룹의 KOOS-기반의 임상 결과의 가능한 개선을 다루기 위해, ACI 하위 그룹 1과 MFX KOOS 점수 사이의 평균의 차이를 산출하였다. 구상체 배치의 이러한 하위 그룹은 Spherox®의 현재 상용적인 제조 공정을 나타내며 MFX(CI 95%)에 비해 10.21의 평균 차이 및 2.53의 하한이 이제 도 4에서 MFX 보다 우월성을 나타내었다. 따라서, 데이터 세트로부터 긴 배양 시간을 갖는 배치의 특정한 그룹을 소급 제거하면 이 그룹에서 보다 높은 평균 KOOS 점수의 결과를 가져온다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 임플란트, 이식물 및 기능적 대체 조직에 관한 것이다. 시험관 내 또는 생체 내 제조된 임플란트, 이식물 또는 기능적 대체 조직은 바람직하게는 주사에 의해 수령인(recipient)의 주변 천연조직 내로 도입될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 구상체에서, 즉 임플란트, 이식물 또는 기능적 대체 조직에서 세포 분열이 일어나지 않는다. 기능적 조직이 천연의 조직 내로 도입된 경우, 계속해서 구상체는 천연 조직에 부착되고(유착) 및 간극 내로의 이동하나(이동), 분열하지는 않는다. 따라서 기능적 대체 조직의 제어되지 않은 증식의 위험 없이 최적의 공급/복원이 보장된다. 이를 위해, 시험관 내 제조된 본 발명의 수득된 구상체들이 병들거나 퇴화된 조직 내로 주사된다. 그렇게 하려면, 주사 바늘 또는 다른 적절한 적용 시스템은 적어도 구상체의 직경을 가져야 한다. 적절한 수송 및 주사 시스템이 본 출원인의 DE102009025347A1 및 EP2345450B1에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 구상체 및 임의선택적으로 추가로 부형제 및 첨가제로 이루어지거나 이들을 포함하는 제제, 특히 약제학적 제제 또는 조직 제제, 약물, 이식물 또는 임플란트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 구상체 및 임의선택적으로 추가로 부형제 및 첨가제를 포함하는 약제학적 제제, 조직 제제 및 약물, 특히 현탁액 및 용액, 특히 주사 용액에 관한 것이다.

본 발명은 또한 연골 결손 및/또는 골 결손, 특히 외상성 연골 결손 및/또는 골 결손, 병변, 특히 외상성 병변, 연골 퇴화, 골 퇴화, 골관절염을 치료하기 위한 그리고 생체 내 치료학적 연골 재생 및/또는 골 재생을 위한 본 발명에 따른 약제학적 제제, 조직 제제, 본 발명에 따른 약물, 본 발명에 따른 이식물 또는 본 발명에 따른 임플란트의 특정한 치료학적/약제학적 용도에 관한 것이다.

하기 도면 및 실시예는 본 발명을 도면 및 실시예로 제한됨이 없이 본 발명을 설명할 것이다.

전체로서 본 연구(상기)의 120명의 환자가 임상 결과와 운영 범위 또는 공정 매개변수 사이의 통계학적 상관관계 분석에 사용되었다. 본 연구에서 사용된 임상 효능을 측정하기 위한 주요 종점은 기준선으로부터의 'Knee injury and Osteoarthritis Outcome Scores'(KOOS) 변화이었다. 72명의 환자, 48명의 ACI 치료 환자 및 49명의 MFX 치료 환자로부터의 데이터가 본 연구에서 사용되었고 그리고 표 5에 제공되었다.

관절경검사 이전(= 기준선) 및 이식 후 1년 후 총 KOOS 점수(모든 하위척도 포함)가 사용되었다[19]. 임상 결과는 두 점수; 기준선으로부터 전체 변화 사이의 최소 8점의 차이에서 양성으로 정의되었고, 그리고 KOOS 설문지(www.koos.nu)에 대한 사용자 가이드에서 기술된 바와 같이 8 내지 10의 최소 주요 변화(MIC: minimal important change)에 기초하였다.

제조 과정에서 사용된 서로 다른 세포 배양 경로 사이의 단층 배양 시간의 운영 범위, 구상체 배양 시간 및 총 배양 시간을 본 연구를 위해 생산된 모든 배치에 대해 임상 결과와 비교하여 통계학적으로 평가되었다.

후속하여 세포 배양 시간에 대해 사용된 새로이 정의된 범위 및 한계가 생성물 효능에 대해 영향을 미칠 수 있는 지에 대한 통찰력을 얻기 위해, 연구의 48명의 환자가 새로이 정의된 세포 배양 시간에 따라 제조된 배치로 치료된 하나의 그룹(하위 그룹 1) 및 이들 제한 이외에서 제조된 배치의 제2 그룹(하위 그룹 2)으로 나누었다. 총 그룹, 하위 그룹 1 및 하위 그룹 2 각각의 KOOS 총 델타 점수의 평균값을 MFX 그룹과 비교하였다(우월성 분석). 두 하위 그룹들의 환자 특성이 표 1에 나열되었다.

통계학적 분석

평균들 사이의 차이들은 Mann-Whitney의 unpaired t-test(양측 검정(two-tailed), P-값 < 0.05가 유의미한 것으로 고려함)를 사용하여 시험되었다. P < 0.05가 유의미한 것으로 고려되는 Spearman의 상관 계수를 사용하여 상관관계 분석들이 수행되었다. MFX 치료에 비하여 ACI 치료의 우월성/비-열등성 분석은 95% 신뢰 구간으로 Welch의 보정을 수반하는 unpaired t-test로 수행되었다. GraphPad Prism v6(GraphPad Software, USA)을 사용하여 모든 통계학적 분석이 수행되었다.

도 1. 세포 배양 시간들과의 임상 결과 상관관계

본 연구에 사용된 120개의 구상체 배치에서, 이식 후 1년 후 임상 결과에 대한 운영 범위들이 평가되었다. 첫 번째 통과 전 단층(P0)(도 1a)에서, 3D(구상체들)(도 1b)에서 그리고 ML 및 3D(도 1c)에서 합계로 긴 배양 시간이 낮은 KOOS 총 델타 점수와 상관되었다. 긴 배양 시간으로 제조된 데이터 세트에서 구상체 배치들을 제거하면 P0(도 1d), 3D(e) 및 총 배양 시간(도 1f)에서 상관관계의 손실의 결과를 가져왔다. 이는 배양 시간이 의약품 효능에 대해 부정적인 영향을 미치지 않도록 하여 최대 배양 시간에 대한 잠정적인 한계(화살표)를 설정할 수 있다. P0에 대한 최대 배양 시간은 18일(도 1d)로, 3D에 대한 최대 배양 시간은 31일(도 1e)로 그리고 ML 및 3D에서의 총 배양 시간에 대한 최대 배양 시간은 55일(도 1f)로 설정되었다. r은 P-값이 < 0.05인 경우 유의미한 것으로 간주되는 Spearman 상관 계수임. KOOS는 Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score임.

도 2. 본 연구의 하위 그룹 1 및 하위 그룹 2에서의 연골세포 배양 시간

연구 배치들은 두 하위 그룹들; 새로이 정의된 최대 배양 시간들 이내에 배양된 하위 그룹 1 및 이들 한계들 이외에서 배양된 하위 그룹 2로 분할되었다. ML 총 배양 시간, P = 0.003(도 2b), 3D, P < 0.001(도 2c) 및 ML과 3D, P < 0.001(도 2d)에서의 총 배양 시간을 고려할 때 구상체 배치들이 하위 그룹 2에서 유의미하게 보다 길게 배양되었다. P0(도 2a)의 경우, 이 하위 그룹이 P0(< 16일)에서 운영 범위들(ORs) 이내에서 배양된 긴 3D 배양 시간(> 28일)을 갖는 배치들을 포함하기 때문에 두 하위 그룹들 사이에서 배양 시간이 유의미하게 상이하지 않았다(P = 0.07). 그룹들 사이의 평균은 P-값이 < 0.05인 경우 유의미한 것으로 간주되는 Mann-Witney t-test(양측 검정)를 사용하여 분석되었다.

도 3. 짧은 배양 시간들을 갖는 구상체 배치들이 개선된 반응자 비율을 나타냄

ACI를 받은 환자들은 두 하위 그룹들: 제한된 배양 시간들로 제조된 구상체 배치들로 치료된 환자들로 구성된 하위 그룹 1 및 보다 긴 배양 시간들을 갖는 구상체 배치들로 치료된 하위 그룹 2로 분할되었다. 도 3a: 환자들의 전체 연구 그룹으로부터, 75%의 구상체 배치들이 반응자 환자들에 속한다(KOOS > 8). 도 3b: 하위 그룹 1에서, 87,5%의 환자들이 유의미한 임상적 개선(KOOS > 8)을 나타내었음에 반해, 하위 그룹 2(도 3c)에서는 단지 50%의 환자들이 임상적 개선을 나타내었다. 도 3d: 연구 비교 군(MFX)에서 69%의 환자들이 1년 후 임상적 개선을 나타내었다(KOOS > 8).

도 4. 하위 그룹 1 및 2의 우월성/비-열등성 분석

본 연구에 포함된 환자의 임상 결과는, 이식 후 1년 후 미세골절(MFX)에 비해 비-열등성을 나타내고 있다. 본 연구로부터 새로이 정의된 운영 범위 이내의, 하위 그룹 1 또는 새로이 정의된 운영 범위 이외의, 하위 그룹 2에서 배양된 구상체 배치를 포함하는 두 하위 그룹들이 파생되었다. 환자들의 전체 그룹, 하위 그룹 1 및 하위 그룹 2의 KOOS 총 델타 점수의 평균을 치료 후 1년 후 MFX 치료환자의 평균 KOOS 총 델타 점수와 비교하였다. 보다 더 제한된 배양 시간 이내에서 제조된 구상체 배치의 소급 선택은 MFX 치료에 대해 우월성을 나타내는 임상 결과를 갖는 환자를 선택하는 결과를 가져온다.

도 5a, 도 5b 무-반응자 환자의 그룹에서의 보다 긴 연골세포 배양 시간

본 연구에 포함된 120명의 환자로부터, 무-반응자 환자(KOOS 총 델타 점수 < 8)은 P0(도 5a)와 총 배양 시간(도 5b)에서 유의미하게 긴 배양 시간으로 제조된 구상체 배치를 수령하였다. p < 0.05를 갖는 Mann-Witney t-test가 유의미한 것으로 고려되었다. P0는 첫 번째 통과 이전에 단리된 연골세포의 단층 배양 시간.

표 1: 세포 배양 시간과 관련하여 무-반응자 비율을 사용하여 본 발명 방법의 운영 범위(OR)를 정의함. 'N'으로 표시된, 회색으로 칠한 환자 ID들은 무-반응자 환자(KOOS < 8)에 해당한다.

표 2: 구상체 배양 시간과 관련하여 무-반응자 비율을 사용하여 본 발명 방법의 운영 범위(OR)를 정의함. 'N'으로 표시된, 회색으로 칠한 환자 ID들은 무-반응자 환자(KOOS < 8)에 해당한다.

표 3: 총 배양 시간과 관련하여 무-반응자 비율을 사용하여 본 발명 방법의 운영 범위(OR)를 정의함. 'N'으로 표시된, 회색으로 칠한 환자 ID들은 무-반응자 환자(KOOS < 8)에 해당한다.

추가 참고 문헌:

Niemeyer P, Laute V, John T, Becher C, Diehl P, Kolombe T, et al. The Effect of Cell Dose on the Early Magnetic Resonance Morphological Outcomes of Autologous Cell Implantation for Articular Cartilage Defects in the Knee: A Randomized Clinical Trial. Am J Sports Med 2016.

Becher C, Laute V, Fickert S, Zinser W, Niemeyer P, John T, et al. Safety of three different product doses in autologous chondrocyte implantation: results of a prospective, randomised, controlled trial. J Orthop Surg Res 2017; 12: 71.

Schubert T, Anders S, Neumann E, Scholmerich J, Hofstadter F, Grifka J, et al. Long-term effects of chondrospheres on cartilage lesions in an autologous chondrocyte implantation model as investigated in the SCID mouse model. Int J Mol Med 2009; 23: 455-460.

Claims

하기 단계를 포함하는, 연골 세포를 증식 또는 부유화하고 연골의 구상체를 제공하기 위한 방법:
a.) 인간 또는 동물 유래의 조직으로부터 연골 세포를 단리하는 단계,
b.) 기질 상에 위치되는 단층(2D)을 확장시켜 a.)로부터의 세포를 배양하는 단계,
c.) a.)로부터의 단층을 회수하고 상기 세포를 현탁액 중에서 3D 환경 중에서 배양하는 단계,
d.) 여기에서 단계 b.) 및 단계 c.)의 총 배양 시간이 단계 a.)의 출발 시간부터 계산하여 55일 이하이고, 그리고 여기에서 단계 b.)의 지속 시간이 10일 초과임,
e.) 수득된 구상체를 선별하는 단계.
제1항에 있어서,
단계 b.)의 지속 시간이 38일 미만이고/이거나 단계 c.)의 지속 시간이 28일 미만인, 방법.
제1항에 있어서,
단계 b.)의 지속 시간이 16일 초과이고 38일 미만인, 방법.
제1항에 있어서,
단계 b.)의 지속 시간이 16일 이하인, 방법.
제1항에 있어서,
구상체가 3,000 초과의 세포로 구성되는, 방법.
제1항에 있어서,
구상체가 3,000 내지 200,000 세포의 범위, 특히 3,500 내지 75,000 세포의 범위의 세포로 구성되는, 방법.
제1항에 있어서,
구상체의 직경이 100 내지 1,000 ㎛, 특히 200 내지 900 ㎛ 또는 바람직하게는 240 내지 870 ㎛의 범위 이내인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
무-반응자 또는 치료 실패자의 환자의 결과가 감소된다는 것을 특징으로 하는, 방법.
제8항에 있어서,
환자가 8 미만의 Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score(KOOS)를 갖는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 구상체(speroid).
연골 결손 및/또는 골 결손, 특히 외상성 연골 결손 및/또는 골 결손, 병변, 특히 외상성 병변, 연골 퇴화, 골 퇴화, 골관절염을 치료하기 위한, 생체 내 치료학적 연골 재생 및/또는 골 재생을 위한, 제10항에 따른 구상체를 포함하는 약제학적 제제.
제10항에 따른 구상체를 포함하는 약제학적 제제.
제10항에 따른 구상체를 포함하는 임플란트, 이식물 및 기능적 대체 조직.