CN110944684B - 用于制备可移植性软骨组织的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于通过从软骨细胞或球状体中进行选择和挑选来制备软骨组织的方法，以及所述软骨组织作为药用组合物、药物、移植物的用途。特别地，本发明涉及用于鉴定合适的软骨细胞以便制备软骨组织(其特别地为了移植目的)的标志物。

Description

用于制备可移植性软骨组织的方法
说明书
本发明涉及用于通过从软骨细胞或球状体中进行选择和挑选来制备软骨组织的方法，以及所述软骨组织作为药用组合物、药物或移植物的用途。特别地，本发明涉及用于鉴定合适的软骨细胞以便制备软骨组织(其特别地为了移植目的)的标志物。
虽然关节软骨显示出值得注意的抵抗能力，但是该组织不具有或具有非常低的进行自我修复和再生的能力，而且未治疗的损害可以导致例如骨关节炎。这种低的进行自发再生的潜力导致细胞疗法(例如，自体软骨细胞移植(ACT))的发展，以力求提供功能性的和无痛的关节软骨缺陷的修复。存在高的对于用于软骨再生的方法的需求，例如在具有创伤性损害或甚至具有软骨退化症状的年轻的有活力的患者中，或者为了治疗软骨缺陷。
用人软骨细胞的生物化学和分子研究受到一系列因素的阻碍，例如与非常少数目的在活组织检查中可用的细胞相联系的人组织的可得性不足，经培养的软骨细胞的有限的增殖能力和高的表型不稳定性。
软骨细胞是一种来源于成软骨细胞并定居在软骨组织中的细胞。与细胞间质(细胞外基质(ECM))一起，软骨细胞构成软骨，特别是关节软骨的主要组成部分。
已经知道，通过模拟胚胎发育的某些过程，例如在琼脂糖基底上三维地培养人软骨细胞，从而产生在其分化状态方面优于单层细胞并且具有例如软骨样特性的细胞聚集体。尽可能准确地反映了天然骨关节组织的这些特性以胶原II(透明软骨的细胞外基质的主要结构蛋白质)、蛋白聚糖(例如，聚集蛋白聚糖)和细胞内的软骨细胞特异性的蛋白S100的表达为特征。
此外，希望的是，在以单层培养物的细胞扩增期期间必然被上调的胶原I的表达在细胞聚集体中重又降低，这是因为这种蛋白质在天然关节软骨中不存在。自2002年以来，如此产生的细胞聚集体(球状体)已被申请人用于在年轻患者中处理和治疗由损伤引起的软骨缺陷。为此，从患者中取出本身的关节软骨组织，更确切地说，从健康的软骨区域中取出透明软骨的活组织检查物。通过用胶原酶溶液酶促消化软骨组织而分离出位于软骨组织中的软骨细胞并使其通过标准细胞培养条件在细胞培养瓶中(单层培养物)在自体血清存在下进行扩增，并且提供足够的软骨细胞以供制备可移植性软骨组织使用。经扩增的细胞形成细胞聚集体(所谓的球状体)，其可以被移植。然而，如此制备出的细胞聚集体在其分化状态方面受到限制，并且大多数显示出重要的胶原II的相对弱的局部表达和蛋白聚糖的处于边缘的合成，而不希望的胶原I则有相对强的表达。为了进一步改善这些细胞聚集体的分化，可以用某些生物活性物质使培养基丰富。这首要地包括多次在文献中被描述为关于胶原合成的辅因子的生长因子TGF-β1-3以及L-抗坏血酸(维生素C)。但是，一方面，这种生物化学刺激常常不足以诱导在3D细胞聚集体中的软骨细胞分化至产生软骨典型的构造的程度，和另一方面，生长因子例如TGF-β的使用特别地对于在人中的临床应用来说是值得怀疑的。
在DE 100 13 223中已经描述了以三维细胞聚集体的形式(例如以球状体的形式)的人细胞的培养，以用于在人中的临床应用，例如作为自体软骨移植物，并且涉及用于在体外从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞制备三维软骨组织和骨组织的方法。在该情况下，将细胞首先以单层培养物进行培养，随后以悬浮液培养如此长的时间，直至产生细胞聚集体，其包含至少40体积％的细胞外基质，在其中包埋有经分化的细胞。
在所述方法中，通过将细胞在涂覆有琼脂糖的细胞培养容器中培养至少1-2周来制备细胞聚集体。
US 7,887,843 B2公开了一种用于在体外产生三维软骨组织和骨组织的方法，其中通过将1×105个细胞培养至少两周来从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞制备可移植性球状体。
Anderer等人(Journal of Bone and Mineral Research(2002),New York,NY,US,第17卷,第8期,第1420-1429页)同样公开了一种用于在体外产生三维软骨组织的方法。按照该方法，将1×105或2×105个软骨细胞培养5天、2周、1个月、2个月和3个月以制备球状体。
现有技术中所描述的在体外制备的软骨组织不显示出与天然组织的那些类似的基本基质蛋白质例如II型胶原的表达模式。更确切地说，在体外由软骨细胞产生的细胞外基质(ECM)的组成明显地不同于天然软骨组织。然而，ECM的组成对于软骨的生物学功能(例如，机械负荷能力)是决定性的。因此，存在对于用于制备软骨组织(也用于品质控制)的新方法的需求。
“可移植性软骨组织”意指离体的或借助于体外方法的制备，其中所制备的组织在很大程度上相应于天然组织或者与天然组织相同。在本发明的范围内，可移植性软骨组织例如在细胞外基质的表达或表达模式方面在很大程度上相应于天然组织，例如在结构蛋白质或蛋白例如II型胶原和/或S100蛋白和/或组织特异性蛋白聚糖(例如，软骨特异性蛋白聚糖，例如聚集蛋白聚糖)的表达或表达模式方面。表达或表达模式的检测可以例如以组织学或免疫组织学方式来进行。
从其中分离出软骨细胞的组织例如选自肌骨骼组织、骨骼组织、软骨、骨、半月板、椎间盘、骨髓、关节或肌腱。在该情况下，按照根据本发明的方法制备的可移植性软骨组织在组成和蛋白质表达方面类似于天然组织(见上)。
天然关节软骨组织具有如下的细胞外基质的按比例的组成：大约60-80％的水，相关于软骨组织的湿重而言。高的含水量对于软骨组织的机械负荷能力来说是重要的，并且与蛋白聚糖一起对于“海绵效应”来说是重要的。除了水之外，天然软骨关节还包含结构蛋白质或基质的蛋白质，例如胶原、蛋白聚糖和非胶原蛋白质。在该情况下，结构大分子总计为关节软骨组织的湿重的大约20-40％。
在天然关节软骨组织的情况下，胶原份额为60％，蛋白聚糖份额为25-35％，以及非胶原蛋白质和糖蛋白份额为15-20％，相关于软骨干重而言。II型胶原总计为天然关节软骨组织的总胶原含量的大约90-95％。
人的天然关节软骨组织包含大约1-5％的软骨细胞，相关于组织体积而言。在该情况下，软骨细胞是功能性天然组织的基质分子的基本产生者。
存在高的提供这样的软骨细胞的需求，所述软骨细胞具有足够的品质并且可以产生相应于天然组织的合适的可移植性软骨组织，从而使得可以预期治疗成功。该治疗成功决定性地取决于可移植性软骨组织的品质。
因此，本发明的任务在于提供经改善的可移植性软骨组织，其特别地具有经改善的特性，特别是充足的品质，例如与天然软骨细胞的一致性和在品质上经改善的球状体，从而使得可以获得高品质的移植物，特别是为了成功地处理和治疗关节软骨缺陷。
出人意料地，发明人可以在经分离的软骨细胞中鉴定出这样的标志物，其允许充足的品质以制备可移植性软骨组织。根据本发明的标志物特别地允许测定在培养物中经分离的软骨细胞与天然软骨细胞的软骨细胞一致性(一致性标志物)。
合适的软骨细胞一致性反过来允许合适的可移植性软骨组织的制备，这是因为一方面可以取得充足的软骨的细胞外基质(ECM)，另一方面取得经改善的关节软骨缺陷的治疗。
在一个进一步的实施方案中，根据本发明的标志物允许测定经分离的软骨细胞或球状体的纯度或污染(“纯度标志物”)。
上面提及的标志物确保充足的品质并且因此为“品质标志物”。
因此，本发明涉及用于选择软骨细胞或球状体以便制备可移植性软骨组织的方法，其中测定至少一种品质标志物或者说一致性标志物或纯度标志物。
根据本发明的用于选择软骨细胞或球状体以便制备可移植性软骨组织的方法包括：使所述软骨细胞在第一步骤中以单层培养物进行扩增(见上，所谓的二维扩展培养物)，和在第二步骤中可以聚集成球状体(见上，所谓的3D-培养)，从而使得所述软骨细胞聚集成球状体，并且可以挑选球状体。
在一个优选的实施方案中，所述品质标志物或者说一致性标志物或纯度标志物选自下组：KAL1、CRTAC1、NRN1或EBF3，其在体外进行测定。
在一个优选的实施方案中，所述品质标志物或者说一致性标志物选自KAL1、CRTAC1这一组，和/或所述纯度标志物选自EBF3、NRN1这一组。特别地，滑膜细胞是不利的污染，其可以通过纯度标志物EBF3在体外进行测定。此类污染降低了软骨细胞以及球状体的品质。
在一个进一步的优选的实施方案中，除了上面所提及的标志物外，根据本发明还可以设法寻找所谓的潜力标志物，其允许对于待从球状体获得的可移植性软骨组织的活性和再生能力进行预测。这样的根据本发明的潜力标志物优选地为蛋白聚糖，特别优选地聚集蛋白聚糖(ACAN)。
表1：根据本发明的标志物基因
Figure BDA0002374763630000051
Figure BDA0002374763630000061
相关的DNA序列可以通过登录号而明确地识别出来(例如，NCBI)。
根据本发明的标志物的体外测定优选地通过测定这些标志物的基因表达以及在经分离的软骨细胞和所获得的球状体中的基因表达水平来进行，其可以例如常规地用聚合酶链式反应(PCR，特别地qPCR)来确定，参见实施例。
根据本发明，所述标志物在根据本发明的方法中显示出基因表达以及升高的或降低的基因表达，从而存在作为标志物的能力。
在一个进一步的实施方案中，基因表达或基因表达水平的测定也可以在参考基因及其基因表达或基因表达水平存在下和与之相比较地来进行。这允许基因表达的标准化以及其定量，也借助于软件支持，参见Michael W.Pfaffl,A new mathematical model forrelative quantification in real-time RT-PCR,Nucleic Acids Research,2001,第29卷,第9期。
表2：根据本发明的参考基因
Figure BDA0002374763630000062
相关的DNA序列可以通过登录号而明确地识别出来(例如，NCBI)。
在本发明的范围内，“选择”意指例如丢弃这样的软骨细胞或球状体，其不具有根据本发明的标志物的基因表达或者相比于其他软骨细胞或球状体而言具有相对较低的基因表达或基因表达水平。专业人员能够依照所获得的基因表达模式来区分对于一种或多种软骨细胞/球状体的更强的基因表达与更弱的基因表达并且相应地挑选这样的软骨细胞或球状体。
因此，在一个进一步的优选的实施方案中，选择以及挑选在扩增后这样的经分离的软骨细胞以及由此获得的球状体，其具有下述的与一个或两个参考基因(R)(更确切地说，B2M和/或TOP1)的基因表达比例：
Figure BDA0002374763630000071
进一步的优选的比例是这样的，例如
Figure BDA0002374763630000072
所给出的值被理解为合适的阈值。
因此，本发明涉及用于选择软骨细胞或球状体以便制备可移植性软骨组织的方法，其中与参考基因相比较地测定根据本发明的标志物。
在一个进一步的优选的实施方案中，在所进行的纯度标志物EBF3的测定的过程中，相比于细胞总数目而言，在扩增后经分离的软骨细胞中或在所获得的球状体中的作为污染的滑膜细胞的份额少于或等于9％，特别地少于或等于5％。
根据本发明的方法允许选择对于待移植的软骨组织来说特异地被挑选的软骨细胞以及球状体。这基于根据本发明的标志物(即品质标志物或者说一致性标志物或纯度标志物)的特别的特性。因此，挑选这样的软骨细胞以及球状体，其具有特异的基因表达并且相应的基因产物可以例如通过PCR来进行检测。
因此，本发明涉及通过根据本发明的方法可获得的经分离的软骨细胞或经分离的所获得的球状体。此外还包括，可移植性软骨组织，其特别地以药剂或药物的形式或者以药用组合物的形式(包含此类软骨细胞或球状体)，其特别地用于在关节软骨缺陷的治疗和/或自体软骨细胞移植中使用。
在本发明的一个进一步的优选的实施方案中，根据本发明的可移植性软骨组织借助于施药器(参见EP2345450B1(申请人的co.fix 150)或DE102009025347A1)来施用给患者。优选地，可以将以药用组合物的形式的所移植的软骨组织连同其他助剂、添加剂一起保持在生理盐水中。
下面的附图和实施例用于解释本发明，然而并不将本发明限制于所述附图和实施例。
实施例1：
从软骨活组织检查物中分离出软骨细胞和进行细胞培养
通过使用胶原酶(350个单位/ml)的酶促消化来从软骨活组织检查物中分离出软骨特异性细胞(软骨细胞)。所述酶促消化持续4至6个小时并且在37℃下进行。所述软骨活组织检查物从膝关节的股骨髁中获取。在酶促消化后，将软骨细胞离心、洗涤、计数并且与细胞培养基(αMEM/Ham’F12 1:1，1％谷氨酰胺)和自体血清(10-15％人血清)一起接种在组织培养瓶中。为了扩展，将细胞在37℃下以二维扩展培养物(单层)在体外培养7至38天。每3-6天进行细胞培养基的更换。当细胞培养物汇合时，将细胞培养物借助于木瓜蛋白酶来进行传代并且分配在多个培养瓶中。
在达到足够数目的来自单层培养物的细胞后，在包覆有2％琼脂糖的微量滴定板中接种200,000个细胞/孔。所述细胞进行聚集并形成三维的圆形结构(球状体)。在培养球状体期间，定期地(每3-6天)更换掺有10％自体血清的细胞培养基(αMEM/Ham’F12 1:1，1％谷氨酰胺)。该3D-培养持续14至42天。
在球状体培养之后，准备用于运输和植入的软骨细胞移植物，这通过将球状体收集在药物承载体(0.9％NaCl)中并随后转移到施药器系统co.fix 150或注射器中来进行。
概括来说，软骨细胞移植物的制备由下列组成：为扩增经分离的软骨细胞的单层培养期，和为使软骨细胞聚集成球状体的3D-培养期。所述软骨细胞移植物旨在自体应用，即植入到相同患者的膝盖中。
实施例2：
a.)RNA分离
将软骨细胞以二维扩展培养物(单层)进行培养直至制备球状体，随后借助于酶溶液(木瓜蛋白酶)从细胞培养瓶底部开始和从细胞联合体中进行溶解。从细胞悬浮液中取1×10E6个这些软骨细胞用于一致性检验并且转移到反应容器中，而将余下的细胞用于接下来的球状体制备。将检验相关的单层细胞离心下来，并且将细胞粒状沉淀在相应的裂解缓冲液(PeqGOLD,Peqlab)中进行裂解、速冻并贮存于-70℃直至RNA分离。对于在软骨细胞-球状体上的标志物测试，在两周的培养持续时间后，从孔板中取8个球状体，用PBS进行洗涤，并且用相应的裂解缓冲液(PeqGOLD,Peqlab)进行裂解。为了最佳的细胞分解，借助于注射器和套管，将接纳在裂解缓冲液中的球状体通过将所球状体抽起和推出来以机械方式进行均质化。接着，将裂解物在液氮中进行速冻并且贮存于-70℃直至RNA分离。
借助于Peqlab公司的peqGOLD Total RNA Kits或用Qiagen公司的RNeasy PlusMini Kit，按照制造商的说明书来进行从软骨细胞-球状体和软骨细胞-单层细胞中的总RNA的提取。将经分离的RNA在无核酸酶的水中进行洗脱并且贮存于-70℃直至cDNA合成。在RNA分离后，用分光光度计(NanoDrop,Thermo Scientific)和借助于生物分析仪(Agilent)按照制造商的说明书测定RNA的数量、品质和完整性。
b.)cDNA合成
借助于Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche)按照制造商的说明书来进行cDNA合成。对于每个样品，通过使用随机六聚体引物来转录80ng总RNA。在无菌反应容器中放置模板-引物混合物，用于20μl的反应体积。向所述模板-引物混合物中吸移添加下列的其他组分：Transcriptor逆转录酶反应缓冲液、Protector RNA酶抑制剂、脱氧核苷酸混合物、Transcriptor逆转录酶。将反应批料混合，离心下来，然后在热循环仪中进行温育。然后，将逆转录出的cDNA用无核酸酶的水进行稀释直至1ng/μl的最终浓度。将样品贮存于-20℃直至在qPCR分析中的进一步使用。
c.)qPCR
对于qPCR分析，使用以384-孔形式的用
Figure BDA0002374763630000102
480 Instrument II(Roche)的qPCR技术。将引物进行HPLC纯化并且溶解在无核酸酶的水中至10μΜ的浓度。以10μΜ的浓度使用探针。对于待测量的标志物，首先建立关于引物浓度和探针浓度以及对于添加剂的使用的经确定的qPCR反应条件。对于所有样品，根据特定引物的反应条件来制备主混合物。各自将8μl的对于每个目标基因来说特异的反应混合物吸移到384-孔平板的相应的孔中，然后添加2μl cDNA样品(1ng/μl)，由此得出每个qPCR反应10μl的总体积。
qPCR分析基于目的基因的经荧光标记的PCR扩增物的指数增加。qPCR数据的评价借助于
Figure BDA0002374763630000101
480软件通过使用Advanced Relative Quantification软件模块(Roche)来进行。所使用的检测形式为所谓的单色水解样品/UPL样品程序，具有下列参数：激发滤波器483nm，发射滤波器533nm，滤波器组合FAM。qPCR数据用用于相对定量的软件模块来产生和分析。各个目标基因的绝对qPCR数据(CP值)用Abs Quant/2nd Derivative Max方法来产生。Cp值(交叉点或循环阈值)是为了超过所确定的荧光信号阈值所必需的PCR循环的数目。荧光信号采集在每个循环结束时在72℃下进行。
相对于参考基因而言的目标基因的mRNA表达水平的标准化借助于所谓的E-(效率)-方法通过使用Advanced Relative Quantification软件模块(Roche)来进行。将两个参考基因(TOP1和B2M)各自作为关于每个样品的内部标准化对照一起进行测量。将目标基因的表达对于这些参考基因进行标准化，并且将经标准化的数据自动地由AdvancedRelative Quantification软件模块作为目标/参考值(T/R)来进行提供。作为该软件模块的基础的数学模型基于相比于参考基因而言目标基因的Cp值之间的关系，并且考虑尤其是引物特异性扩增效率。
将经标准化的表达值用于检验软骨细胞移植物的品质。关键的品质属性为一致性、纯度和潜力，其中对于每个品质参数鉴定至少一种特异性标志物，其可以被测量以检测足够的品质。在该情况下，标志物的经标准化的表达值必须满足为了检测足够的品质所规定的接受极限。关于品质参数的值基于在单层软骨细胞(KAL1)或球状体(CRTAC1、NRN1、EBF3和ACAN)中的mRNA表达水平。
表3显示了所描述的对于软骨移植物产品的选择的应用。总而言之，如所描述的那样制备48个软骨移植物产品，并且使其经历用根据本发明的标志物的对于一致性、纯度(污染)以及潜力的检验。所述48个软骨移植物中的四十八个在单层中(KAL1)和在球状体中(CRTAC1)满足一致性的标准。所述48个软骨移植物中的四个不满足纯度(污染)标准(EBF3、NRN1)，而所述48个软骨移植物中的19个不满足潜力标准。总而言之，所述48个软骨细胞移植物中的22个不满足软骨细胞品质(一致性、纯度/污染或潜力)的标准。所述48个软骨细胞移植物中的二十六个满足软骨细胞品质(一致性、纯度/污染或潜力)的标准，并且适合于制备可移植性软骨组织并被挑选。
表3：按照所给出的阈值进行挑选
Figure BDA0002374763630000121
Figure BDA0002374763630000131
n.d.＝未测定。ID＝标识符。T/R＝靶标与参考的比例。
实施例3：
用具有确定品质(在此：一致性)的以单层培养物进行扩增的软骨细胞来制备待移植的软骨组织
由具有待治疗的软骨缺陷的患者，从健康的软骨区域中取出透明软骨的活组织检查物。通过用胶原酶溶液酶促消化软骨组织而分离出位于软骨组织中的软骨细胞并使其通过标准细胞培养条件在细胞培养瓶中(单层培养物)在自体血清存在下进行扩增，以致于不超过10的最大群体倍增水平(Population Doubling Level；PDL)，并且提供足够的软骨细胞以供制备可移植性软骨组织使用。将一部分的以单层进行扩增的软骨细胞用于测定软骨细胞一致性，而将其余部分用于制备可移植性软骨组织。
在单层培养物中关于软骨细胞一致性的标志物指明，在软骨细胞培养物中存在软骨细胞。对于在单层培养物中的软骨细胞一致性，用常用的分子生物学技术分离出以单层进行培养的软骨细胞的总RNA并用逆转录酶转录成cDNA。用常用的聚合酶链式反应(PCR)来测定至少一个参考基因(见上，表2)和一致性标志物“KAL1”的表达。将“KAL1”的表达与参考基因的表达相关联，并因此得出关于一致性标志物“KAL1”的经标准化的基因表达值。“KAL1”的表达指明，存在用于制备可移植性软骨组织的具有足够品质(一致性)的软骨细胞。
为了制备可移植性软骨组织，将至少100,000个具有足够品质(一致性)的以单层进行扩增的软骨细胞在标准细胞培养基和自体血清存在下转移到细胞培养容器中。该细胞培养容器通过例如细胞培养物底部的琼脂糖涂层来阻止软骨细胞的粘附。在几天后，软骨细胞相互粘附并形成聚集体(所谓的球状体)。将球状体培养至少1-2周的时间段并形成软骨样细胞外基质(球状体培养物)。该软骨组织(具有足够品质(一致性)的软骨细胞和软骨样细胞外基质)适合于在引入到待治疗的患者的软骨缺陷中后建立软骨替代组织，其填充缺陷并承担天然软骨组织的功能。具有不足品质(在单层培养物中的一致性)的软骨组织不适合于建立软骨替代组织并被丢弃。
实施例4：
用具有确定品质(在此：一致性)的位于球状体培养物中的软骨细胞来制备待移植的软骨组织
将在实施例3中分离出的并且以单层进行扩增的软骨细胞用于制备可移植性软骨组织。
如在实施例3中所描述的那样，将以单层进行扩增的软骨细胞转移到阻止软骨细胞粘附的特殊的细胞培养容器中，从而在几天后形成聚集体(所谓的球状体)。将球状体培养至少1-2周的时间段并形成软骨样细胞外基质(球状体培养物)。
在球状体培养物中关于软骨细胞一致性的标志物指明，在球状体培养物中存在软骨细胞。为了测定在球状体培养物中的软骨细胞一致性，用常用的分子生物学技术分离出一部分的以球状体进行培养的软骨细胞的总RNA并用逆转录酶转录成cDNA。用常用的聚合酶链式反应(PCR)来测定至少一个参考基因(见上，表2)和一致性标志物“CRTAC1”的表达。将“CRTAC1”的表达与参考基因的表达相关联，并因此得出关于一致性标志物“CRTAC1”的经标准化的基因表达值。“CRTAC1”的表达指明，在用于移植软骨组织的球状体中存在具有足够品质(一致性)的软骨细胞。
该软骨组织(具有足够品质(一致性)的软骨细胞和软骨样细胞外基质)适合于在引入到待治疗的患者的软骨缺陷中后建立软骨替代组织，其填充缺陷并承担天然软骨组织的功能。具有不足品质(在球状体培养物中的一致性)的软骨组织不适合于建立软骨替代组织并被丢弃。
实施例5：
用具有确定品质(在此：纯度)的位于球状体培养物中的软骨细胞来制备待移植的软骨组织
将在实施例3中分离出的并且以单层进行扩增的软骨细胞用于制备可移植性软骨组织。
如在实施例3中所描述的那样，将以单层进行扩增的软骨细胞转移到阻止软骨细胞粘附的特殊的细胞培养容器中，从而在几天后形成聚集体(所谓的球状体)。将球状体培养至少1-2周的时间段并形成软骨样细胞外基质(球状体培养物)。
关于软骨细胞纯度的标志物指明了在球状体培养物中的软骨细胞的含量。为了测定在球状体培养物中的软骨细胞纯度，用常用的分子生物学技术分离出一部分的以球状体进行培养的软骨细胞的总RNA并用逆转录酶转录成cDNA。用常用的聚合酶链式反应(PCR)来测定至少一个参考基因(见上，表2)和纯度标志物“NRN1”的表达。将“NRN1”的表达与参考基因的表达相关联，并因此得出关于纯度标志物“NRN1”的经标准化的基因表达值。如果“NRN1”的表达水平超过先前规定的关于纯度的阈值，例如1.0，那么这指明，在用于移植软骨组织的球状体中存在具有足够品质(纯度)的软骨细胞。如果未超过关于纯度的阈值，那么在用于移植软骨组织的球状体中存在具有不足品质(纯度)的软骨细胞。
该软骨组织(具有足够品质(纯度)的软骨细胞和软骨样细胞外基质)适合于在引入到待治疗的患者的软骨缺陷中后建立软骨替代组织，其填充缺陷并承担天然软骨组织的功能。具有不足品质(降低的纯度)的软骨组织不适合于建立软骨替代组织并被丢弃。
实施例6：
用具有确定的细胞污染的位于球状体培养物中的软骨细胞来制备待移植的软骨组织
将在实施例3中分离出的并且以单层进行扩增的软骨细胞用于制备可移植性软骨组织。
如在实施例3中所描述的那样，形成球状体并将其培养至少1-2周的时间段以便形成软骨样细胞外基质(球状体培养物)。
关于软骨细胞污染的标志物指明了在球状体培养物中的具有滑膜细胞、骨细胞和/或脂肪细胞的细胞污染的含量。为了测定在球状体培养物中的软骨细胞的细胞污染，用常用的分子生物学技术分离出一部分的以球状体进行培养的软骨细胞的总RNA并用逆转录酶转录成cDNA。用常用的聚合酶链式反应(PCR)来测定至少一个参考基因(见上，表2)和污染标志物“EBF3”的表达。将“EBF3”的表达与参考基因的表达相关联，并因此得出关于污染标志物“EBF3”的经标准化的基因表达值。如果“EBF3”的表达水平未超过先前规定的关于污染的阈值，例如0.8，那么这指明，在用于移植软骨组织的球状体中不存在过量的由滑膜细胞引起的细胞污染。如果超过关于污染的阈值，那么在用于移植软骨组织的球状体中存在具有不足品质(污染)的软骨细胞。
该软骨组织(具有足够品质(污染)的软骨细胞和软骨样细胞外基质)适合于在引入到待治疗的患者的软骨缺陷中后建立软骨替代组织，其填充缺陷并承担天然软骨组织的功能。具有不足品质(升高的细胞污染的含量)的软骨组织不适合于建立软骨替代组织并被丢弃。
实施例7：
用具有确定潜力的位于球状体培养物中的软骨细胞来制备待移植的软骨组织
将在实施例3中分离出的并且以单层进行扩增的软骨细胞用于制备可移植性软骨组织。
如在实施例3中所描述的那样，形成球状体并将其培养至少1-2周的时间段以便形成软骨样细胞外基质(球状体培养物)。
关于软骨细胞潜力的标志物指明，在球状体培养物中的软骨细胞具有形成软骨样细胞外基质的能力。为了测定在球状体培养物中的软骨细胞的潜力，用常用的分子生物学技术分离出一部分的以球状体进行培养的软骨细胞的总RNA并用逆转录酶转录成cDNA。用常用的聚合酶链式反应(PCR)来测定至少一个参考基因和潜力标志物“聚集蛋白聚糖”的表达。将“聚集蛋白聚糖”的表达与参考基因的表达相关联，并因此得出关于潜力标志物“聚集蛋白聚糖”的经标准化的基因表达值。如果“聚集蛋白聚糖”的表达水平超过先前规定的关于潜力的阈值，例如0.1，那么这指明，在用于移植软骨组织的球状体中存在具有足够品质(潜力)的软骨细胞。如果未超过关于潜力的阈值，那么在用于移植软骨组织的球状体中存在具有不足品质(不足的形成软骨样细胞外基质的潜力)的软骨细胞。
该软骨组织(具有足够品质(潜力)的软骨细胞和软骨样细胞外基质)适合于在引入到待治疗的患者的软骨缺陷中后建立软骨替代组织，其填充缺陷并承担天然软骨组织的功能。具有不足品质(潜力)的软骨组织不适合于建立软骨替代组织并被丢弃。
实施例8：
用具有确定品质的软骨细胞来制备待移植的软骨组织
将在实施例3中分离出的并且以单层进行扩增的软骨细胞用于制备可移植性软骨组织。
如在实施例3中所描述的那样，形成球状体并将其培养至少1-2周的时间段以便形成软骨样细胞外基质(球状体培养物)。
为了定性地检测用于移植和用于再生关节软骨缺陷的高品质的球状体培养物，如在实施例3中所描述的那样用一致性标志物“KAL1”和如在实施例4中所描述的那样用一致性标志物“CRTAC1”来测定一致性。此外，如在实施例5中所描述的那样，测定纯度标志物“NRN1”，和/或如在实施例6中所描述的那样，测定污染标志物“EBF3”。进一步地，如在实施例7中所描述的那样，测定潜力标志物“聚集蛋白聚糖”。
软骨组织(具有足够品质(在单层培养物中和/或在球状体培养物中的一致性，足够的纯度和/或可接受的细胞污染程度，以及足够的形成软骨样细胞外基质的潜力)的软骨细胞和软骨样细胞外基质)适合于在引入到待治疗的患者的软骨缺陷中后建立软骨替代组织，其填充缺陷并承担天然软骨组织的功能。具有不足品质(未存在的在单层培养物中和/或在球状体培养物中的一致性，不足的纯度和/或不足的细胞污染程度，以及不足的形成软骨样细胞外基质的潜力)的软骨组织不适合于建立软骨替代组织并被丢弃。
实施例9：
将在此在实施例8中所描述的程序回顾性地应用于20名患者的待移植的软骨组织，在他们中使用用于再生膝关节软骨损伤的软骨组织。按照已设立的软骨修复得分(KOOS–Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score(膝盖损伤和骨关节炎后果得分)：Roos EM&Lohmander LS,Health and Quality of Life Outcomes 2003,I:64)在临床上评定经移植的软骨组织建立软骨替代组织的能力，即治疗的临床成功。为此，在用待移植的软骨组织进行治疗前，借助于患者问卷来测定每位患者的KOOS(基础值)。在用待移植的软骨组织进行治疗后一年，再次借助于患者问卷来测定每位患者的KOOS(1年随访值)。当1年随访值与基础值之间的差异(KOOSΔ)为至少8个点时，得出治疗的临床或治疗学成功(Roos EM&Lohmander LS,Health and Quality of Life Outcomes 2003,I:64)。如果1年随访值与基础值之间的差异(KOOSΔ)小于8个点，那么不存在通过治疗而引起的临床改善，即该疗法不是成功的。
证明了在20名患者中的4名(5697-1607，5862-1311，6070-2413，6988-2423)的可移植性软骨组织中，潜力标志物“聚集蛋白聚糖”在确定的极限值之下，而软骨细胞的一致性可以借助于一致性标志物“KAL1”或“CRTAC1”来进行确定。表达值在确定的极限值之上。待移植的软骨组织的纯度也可以借助于污染标志物“EBF3”来进行测定并给出；在此，表达值在确定的极限值之下。因此，这4个待移植的软骨组织显示出不足的用于建立软骨替代组织的品质并且被丢弃。这相应于20％的淘汰率(20个待移植的软骨组织中的4个)。
在20名患者中的16名(6266-2601，6658-2420，7494-2284，8528-2286，9070-2709，9110-2294，5669-2263，9110-2294，6094-1312，6340-2277，6611-2418，8315-2434，8916-2440，8931-1126，8948-2706，8966-2441)的可移植性软骨组织中，潜力标志物“聚集蛋白聚糖”在确定的极限值之上，并且软骨细胞的一致性可以借助于一致性标志物“KAL1”或“CRTAC1”来进行确定。表达值同样也在确定的阈值之上。待移植的软骨组织的纯度也可以借助于污染标志物“EBF3”来进行测定并给出；在此，表达值在确定的阈值之下。因此，这16个待移植的软骨组织显示出足够的用于建立软骨替代组织的品质并且被用于进行移植。这相应于80％的成功率(20个待移植的软骨组织中的16个)。
因此，20名患者中的4名(5697-1607，5862-1311，6070-2413，6988-2423)的可移植性软骨组织显示出具有不足品质(未存在的在单层培养物中和/或在球状体培养物中的一致性，不足的纯度和/或不足的细胞污染程度，以及不足的形成软骨样细胞外基质的潜力)的软骨组织，而20名患者中的16名(6266-2601，6658-2420，7494-2284，8528-2286，9070-2709，9110-2294，5669-2263，9110-2294，6094-1312，6340-2277，6611-2418，8315-2434，8916-2440，8931-1126，8948-2706，8966-2441)的可移植性软骨组织有着具有足够品质(已存在的在单层培养物中和/或在球状体培养物中的一致性，足够的纯度和/或足够的细胞污染程度，以及足够的形成软骨样细胞外基质的潜力)的软骨组织。
关于治疗的临床或治疗学成功，证明了(参见表4)在20患者中的那4名患者(5697-1607，5862-1311，6070-2413，6988-2423)(在他们中回顾性地确定了具有不足品质的可移植性软骨组织)中，不存在通过治疗而引起的临床改善。KOOS 1年随访值与KOOS基础值之间的差异小于8个点，因此该疗法不是成功的。与此相反，证明了在20名患者的那16名患者(6266-2601，6658-2420，7494-2284，8528-2286，9070-2709，9110-2294，5669-2263，9110-2294，6094-1312，6340-2277，6611-2418，8315-2434，8916-2440，8931-1126，8948-2706，8966-2441)(在他们中回顾性地确定了具有足够品质的可移植性软骨组织)中，存在通过治疗而引起的临床改善。KOOS 1年随访值与KOOS基础值之间的差异为至少8个点，因此该疗法是成功了的。
表4：具有已知临床疗法结果(KOOSΔ)的20名患者的关于一致性、纯度/污染和潜力的品质标志物
Figure BDA0002374763630000211
Figure BDA0002374763630000221
KOOS：膝盖损伤和骨关节炎后果得分。n.d.＝未测定。

Claims (16)

1.用于选择软骨细胞以便制备可移植性软骨组织的方法，其特征在于，在体外测定至少一种从下组中选择的一致性标志物或纯度标志物：KAL1、NRN1或EBF3，其中与参考基因相比较地测定所述标志物，并且测定至少一种从下组中选择的基因表达的比例：
Figure FDA0003499625670000011
2.用于选择软骨细胞以便制备可移植性软骨组织的方法，其特征在于，在体外测定一致性标志物和/或纯度标志物，一致性标志物选自KAL1、CRTAC1这一组，纯度标志物选自NRN1、EBF3这一组，其中与参考基因相比较地测定所述标志物，并且测定至少一种从下组中选择的基因表达的比例：
Figure FDA0003499625670000012
3.根据权利要求1或2的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，为了制备可移植性软骨组织，使所述软骨细胞在第一步骤中以单层培养物进行扩增，和在第二步骤中聚集成球状体。
4.根据前述权利要求1至2中任一项的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，使所述软骨细胞聚集成球状体，并且挑选球状体。
5.根据前述权利要求1至2中任一项的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，i.)在体外测定具有一致性标志物KAL1的以单层培养物的软骨细胞，和/或ii.)在体外测定具有至少一种一致性标志物CRTAC1的以球状体的软骨细胞。
6.根据前述权利要求1至2中任一项的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，另外在体外测定蛋白聚糖。
7.根据前述权利要求1至2中任一项的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，另外在体外测定聚集蛋白聚糖。
8.根据权利要求7的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，测定至少一种从下组中选择的基因表达的比例：
Figure FDA0003499625670000021
9.根据权利要求7的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，测定至少一种从下组中选择的基因表达的比例：
Figure FDA0003499625670000022
10.根据权利要求7的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，测定至少一种从下组中选择的基因表达的比例：
Figure FDA0003499625670000023
11.根据前述权利要求1至2中任一项的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，相比于总细胞数目而言，在扩增后经分离的软骨细胞中或在所获得的球状体中的滑膜细胞的份额少于或等于9％。
12.根据前述权利要求1至2中任一项的用于选择软骨细胞的方法，其特征在于，相比于总细胞数目而言，在扩增后经分离的软骨细胞中或在所获得的球状体中的滑膜细胞的份额少于或等于5％。
13.经分离的通过根据权利要求1至12之一的方法可获得的球状体。
14.经分离的通过根据权利要求1至12之一的方法可获得的球状体，其特征在于，相比于总细胞数目而言，在所述球状体中的滑膜细胞的份额少于或等于9％。
15.可移植性软骨组织，其包含根据权利要求14的球状体。
16.根据权利要求15的可移植性软骨组织在制备用于关节软骨缺陷的治疗或自体软骨细胞移植的药物中的用途。
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