CN101616693A - 用于鉴定软骨细胞表型稳定性以及筛选软骨形成影响因子的标记基因 - Google Patents

用于鉴定软骨细胞表型稳定性以及筛选软骨形成影响因子的标记基因 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可用于预测细胞群在植入到体内时形成软骨的潜能的一组基因。标志物组尤其被用于细胞的质量控制以及用于评价化合物和条件对细胞软骨形成能力的影响的筛选试验。

Description

用于鉴定软骨细胞表型稳定性以及筛选软骨形成影响因子的标记基因
发明领域
本发明涉及用于确定软骨细胞表型稳定性的方法和工具以及用于鉴定可用于治疗软骨缺损及软骨相关疾病的化合物的筛选系统。
发明背景
修复软骨缺损主要通过手术方法完成，例如骨髓刺激技术或植入软骨形成细胞(软骨细胞，软骨祖细胞和前体细胞，或可形成软骨的干细胞)。因此，鉴定能够对体内软骨形成有正面影响的因子是有益的。比较理想的是鉴定出能够对缺损部位内或其邻近部位存在的局部细胞介导的软骨形成有正面影响的手术过程或治疗方法或化合物。另外，对于以细胞为基础的治疗措施来说，鉴定出能够对已在体外扩增或传代的分离细胞群在体内稳定形成软骨的能力有正面影响的因子或处理方法也是有益的。
文献已经报道过多种不同的方法，其中参与软骨形成的基因的表达被用作筛选化合物的参数。US2002061514描述了一种方法，其中报告基因可对转录因子SOX9产生反应。SOX9是一种高迁移率组(HMG)域转录因子，表达于软骨细胞、软骨祖细胞和其他组织，已被证实是软骨细胞分化和软骨形成所必须的。其他方法是以参与软骨代谢和骨软骨缺损的各个基因[如，WO02081745所述的骨质疏松症相关基因]的表达水平而建立的。
筛选方法在文献中也有描述，这些方法的基础在于细胞在体外向软骨的分化。但是，研究发现，这些模型的预测价值是有限的，这些分析方法需要大量的细胞，并且十分费时。
WO200466723提供了一种体内模型，其中在斑马鱼体内评价了化合物对骨和软骨形成的效应。用于评价细胞稳定形成软骨的能力的一种最可靠方法是将细胞植入到裸鼠的肌肉内，然后通过组织学分析方法评价产生的植入物。利用这种裸鼠模型可以避免采用WO0124833所述的技术，但是这种方法本身也是十分费时的，并且不适于高通量的筛选。本专利申请描述了根据软骨形成的裸鼠模型鉴定出的分子标志物在评价用于移植目的的扩增或传代细胞的软骨形成潜能中的应用。同样，US2003235813描述了一组用于评价软骨细胞表型稳定性的合适标志物。然而，尽管这些标志物的鉴定为能在体内产生稳定透明软骨的细胞群的鉴定提供了基础，但是依然有进一步改进的需要。
发明概述
本发明的基础在于提供一种特异性标志物模式的新概念，这种特异性标志物模式可作为任何给定环境内软骨形成的指示因子，即，对细胞来说无论是天然的或者是诱导的环境，都被认为是可鉴定软骨形成影响因子的靶模式。
相应的，本发明提供了一组标志物，该组标志物可用于可靠地预测一群细胞的软骨形成潜能。这些标志物的表达水平可用于预测细胞群，例如，在体外或在体内，在被植入到体内时或者被刺激时是否能够生成软骨。这组标志物还提供了一种可靠的工具，用于确定一个给定处理对一群植入前的细胞的软骨细胞表型稳定性的效应。另外，本发明还提供了组合治疗方案，该方案包括给予关节内的干细胞或骨软骨细胞以及给予能影响所给予细胞群的软骨形成潜能的药物。
根据本发明，细胞群在体外的表型稳定性被用于筛选试验中以鉴定能影响体外和/或体内软骨细胞表型稳定性的因子。本发明提供了一组能指示软骨细胞表型稳定性的标志物，这些标志物的表达被用于预测化合物和/或条件对细胞群在体内生成软骨的能力的体外或体内效应。在筛选试验中使用这些标志物可以使我们无需太长的时间和繁重的动物实验就能够筛选大量的作用于软骨细胞的化合物和/或条件
在一个方面，本发明提供了确定一个细胞群稳定生成透明软骨的能力的方法。更具体地说，本发明提供了在体外确定一个细胞群在体内稳定生成透明软骨的能力的方法。在具体实施方式中，该方法包括确定细胞群表达一组至少三个标志物基因的水平，这一组标志物基因包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物基因。
在本发明提供的方法的具体实施方式中，细胞群与化合物或条件接触。
在具体实施方式中，本发明提供的方法包括使一群细胞与化合物或条件接触以及确定一组至少三个标志物基因在这群细胞内的表达水平的步骤，其中这一组标志物基因包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物基因。在这些方法中，一组至少三个标志物的表达水平可作为细胞在体内稳定生成透明软骨的能力的指示因子，例如，在被植入到患者体内时。
本文所述方法的其他实施方式包括以下步骤：在细胞群与化合物或条件接触前确定这组至少三个标志物基因在这群细胞内的表达水平，以及在接触步骤后，确定化合物或条件的存在是否能够影响这组至少三个标志物基因中的一个或多个基因的表达。更具体的是，本发明提供的方法包括根据化合物或条件存在时对这组至少三个标志物基因在细胞群内的表达水平的影响，确定化合物或条件对细胞群在体内稳定生成透明软骨的能力的效应。在本文所述方法的具体实施方式中，能增强选自FRZB、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个正标志物基因的表达水平的化合物或条件被鉴定为对软骨形成有正面影响，能增强PEDF和/或ALK-1表达水平的化合物被鉴定为对软骨形成有负面影响，特别是对细胞在体内稳定生成透明软骨的能力有负面影响。
在本文所述方法的其他具体实施方式中，这组标志物是包括至少4、5或6个标志物基因的一组，其中包含FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2或FGFR3的2、3和4个标志物基因。本文所述更具体的方法实施方式涉及的方法中，这组标志物基因是一组包含FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3的至少6个标志物基因。
在本文所述方法的具体实施方式中，化合物或条件影响软骨形成的能力根据化合物或条件对这组至少三个标志物基因的表达的累积效应而定。更具体的是，化合物或条件对选自FRZB、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一组的正标志物基因表达的累积效应以及化合物或条件对负标志物基因PEDF和/或ALK-1表达的累积效应可作为化合物或条件影响细胞群软骨细胞表型稳定性的指示因子。
在本文所述方法的具体实施方式中，细胞群获自关节。细胞群获自健康供者或获自患骨软骨缺损的个体。在特殊试验中分析了化合物或条件对两类细胞的效应。在本文所述方法的具体实施方式中，利用定量方法确定一个或多个标志物的表达水平。
本发明的再一方面涉及一组标志物在鉴定能够影响细胞，特别是软骨细胞或软骨前体细胞，在体内生成软骨的能力的化合物中的应用。在具体实施方式中，所述应用的特征在于，这组标志物包含一组至少三个标志物基因，其中包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物。在具体实施方式中，所述应用涉及至少6个标志物基因，其中包括FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3。
本发明的再一方面提供了试剂盒，该试剂盒包含用于检测一组基因在软骨形成细胞内的表达水平的探针，其中这组基因包括由FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物组成的一组至少三个标志物基因。
在具体实施方式中，本发明提供了试剂盒，其中这组标志物基因是包括FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3的一组至少6个标志物基因。
本文所述试剂盒的具体实施方式是试剂盒，其中探针是能够与mRNA杂交的寡核苷酸，其中探针是抗体和/或其中探针是待测标志物特异性的PCR引物对。本发明的试剂盒包含不同类型的探针。在试剂盒的其他具体实施方式中，提供了标记探针。
本发明的另一方面提供了用于检测一组基因在细胞内，更具体的是通常能生成软骨的细胞，的表达水平的装置。在这种装置的具体实施方式中，提供了下列一种或多种组分：检测标志物基因表达水平的单元，以及由FRZB、ALK1和选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物组成的一组至少三个标志物基因的探针。本文所述装置的具体实施方式是特别适用于检测一个细胞群所表达的一组标志物基因的装置，其中这组标志物基因是包含FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3的一组至少6个标志物基因。
发明详述
定义
术语“软骨形成的”在用于细胞或细胞群时是指在合适的环境中该细胞或细胞群具有生成软骨或刺激软骨生长的固有能力。
在本文中，“软骨形成化合物”是指能诱导稳定软骨细胞表型和/或促进软骨形成的化合物。
术语“软骨细胞表型稳定性”或“软骨形成潜能”在用于指细胞群时是指细胞群在体内生成软骨的能力。这种能力可通过如下过程检测：(异位)注射一部分细胞群(至少约1-20×106细胞)到哺乳动物内(体内)，如免疫缺陷鼠，以及确定(在约3周的时间范围内)软骨植入物没有出现血管侵入的迹象、矿化或被骨或纤维组织替代。另外，一部分细胞群(至少约1-20×106细胞/cm2)接种到或包裹进生物相容性基质，然后植入到皮下，约6-8周后确定软骨植入物稳定发育，并且没有血管侵入或软骨内骨化的迹象。根据本发明，一群能在体内生成稳定透明软骨的细胞的特征是存在本文所述的表型稳定性标志物的特异性组合。在传代过程中，成熟软骨细胞的软骨表型稳定性逐渐丧失。
在本文中，术语“新鲜分离的细胞”(FI)是指活检组织经过组织消化后得到的细胞群。因此，在本文中，术语“新鲜分离的软骨细胞”是指直接获自含软骨细胞的组织如软骨经过消化而未传代的细胞群。
术语“扩增的”用于指获自组织如软骨的细胞群时，是指已置于使细胞通过增殖因而数目增加的条件下的细胞群。在其最简单的版本中，扩增是通过在含合适培养基的培养容器内提供细胞群而完成的，任选直到汇合为止。作为扩增新鲜分离细胞的结果而得到细胞群被称作P0。
术语“传代的”是指已经扩增的细胞，扩增以后利用酶消化的、化学的和/或物理的方法从培养容器内收获细胞，然后以较低的密度接种到另一培养容器内。传代的细胞是指其在培养基内所传的代数(P1、P2等)，或者是指其群体倍增的次数(PD1、PD2等)。
在本文中。术语“软骨缺损”是指软骨丢失或损伤导致的任何疾病或任何患病的软骨部分。
术语“标志物评分”用于指本发明标志物表达水平的数值。“累积的标志物评分”是指本发明标志物组的不同标志物的标志物评分组合。可以是总和各个标志物得到的结果。另外，累积标志物评分考虑到了每一个标志物在预测软骨细胞表型稳定性中的能力的差异，相应的要根据较复杂的数学公式计算。
术语“组织学评分”是指根据组织学分析而得到的赋予软骨的定性或半定性值(例如，非软骨、纤维软骨、透明软骨)。
在本申请中，基因所用的缩写如下：
FRZB：卷曲相关蛋白1[OMIM 605083，Genbank U91903]
ALK1：II型活化素A受体样激酶1[OMIM 601284，Genbank Z22533]
PEDF：色素上皮衍生因子[OMIM 172860，Genbank M76979]
COL11：XI型胶原A1[OMIM 120280，Genbank J04177]
COL2：II型胶原α1[OMIM 120140，Genbank L10347]
FGFR3：成纤维细胞生长因子受体3[OMIM 134934，Genbank M58051]
BMP-2：骨形态发生蛋白2[OMIM 112261，Genbank M22489]
RASF-PLA2：磷脂酶A2，IIA族[OMIM 172411，Genbank M22430]
OPN：骨桥蛋白[OMIM 166490，Genbank X13694]
本发明的基础在于已经鉴定出一组特异性标志物基因，研究证明这些基因的表达水平是细胞在体内形成软骨的能力的指示因子。更具体的是，已经证明，通过赋予这些基因中的每一个基因以数值，其累积数值可表示为累积标志物评分，反映了细胞群在体内生成表型稳定的软骨的能力。
本发明所鉴定的用于评价细胞群形成软骨的能力的标志物基因选自包括正标志物基因FRZB、COL11、COL2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2或OPN以及负标志物基因ALK1和PEDF的一组。其他标志物也可以包括在该组中，例如，作为对照。
因此，根据本发明，已经鉴定出一组9个标志物，其中既包括正标志物也包括负标志物。能在体内生成稳定透明软骨的细胞群高表达正标志物，而能生成稳定透明软骨的细胞群低水平表达或不表达负标志物。根据本发明，不表达负标志物可以被当作正标志物。但是，在本发明的上下文中，不表达这种标志物是软骨细胞表型稳定性的能力的指示因子，在本文中被称作负标志物。
本发明的标志物基因的表达是细胞群的一个性能特征，该细胞群通常包含约0.2×105-1.0×106个细胞。
确定基因表达的各种方法是本领域所熟知的。根据本发明，最常见的是，从一部分细胞群(一般含0.2×105-1.0×106个细胞，优选0.2×106-1×106)中分离RNA，通过反转录PCR扩增RNA。这种扩增可以半定量的方式完成，扩增片段电泳，其相对密度值与看家基因如β肌动蛋白的相对密度值比较。然而，利用核苷酸扩增技术可以分析较低数量的细胞甚至单个细胞的表达水平。另外，利用，例如，Taqman技术，可以定量的方式测定DNA的量。技术人员根据标志物基因的已知序列可以很容易地鉴定适于本申请所述的标志物的引物。
另外，可在蛋白质水平上测定标志物的表达。利用免疫学方法如蛋白质印迹或ELISA可以确定蛋白质水平。
在本发明的具体实施方式中，可以通过比较对照组和试验组内标志物的表达水平来评价标志物的表达，例如通过微芯片技术或一维或二维蛋白电泳后的分析方法。在这当中，标志物蛋白在凝胶内按照其Mr(一维的)和其等电点(IEP)(二维的)迁移。蛋白质水平上表达的差异可通过检测蛋白质在其Mr和/或IEP相应位置上存在的量来测定。考马斯亮蓝染色或类似染色后可定量测定蛋白质，或者通过掺入放射性代谢标记物(例如，35S甲硫氨酸)定量测定蛋白质。
根据所使用的技术，可以用，例如，发色基团或磁性或放射性标记物，标记抗体、寡核苷酸探针或蛋白质探针(如抗体)以检测表达。
在具体实施方式中，本发明涉及通过不同技术检测不同标志物。例如，利用ELISA可检测多种标志物，而通过PCR可检测其他标志物。
本发明另一方面提供了适于检测本发明标志物的装置。在具体实施方式中，这种装置包括用于直接或间接检测本发明的标志物(例如在DNA、RNA或蛋白质水平)的单元。该单元可基于RNA、DNA杂交或基于免疫学检测。这种单元可以是(定量)PCR装置，用于完成免疫学分析的装置或用于测定蛋白质的装置(例如，HPLC、质谱、电泳装置)，但是也可以是(一次性的)微矩阵装置或芯片。在使用时，这种单元可配备用于检测本发明的标志物基因或蛋白的探针或抗体。任选这种装置还可以包括细胞培养单元，其中两个或多个细胞群可在相同或不同条件(例如，密度、传代次数、培养基组成)下培养。另外，本发明的装置可包括用于将一种或多种待测化合物转移到细胞培养单元内的单元(转移量或转移时间表可根据情况而变化)。最后，装置可包括用于收集细胞以及分离细胞材料(DNA、RNA、蛋白质)的单元。
另外，本发明还提供了一次性药筒，其中包含本文所述的标志物所用的探针或特异性试剂，可用于分析这些标志物的表达以便于快速而有效地确定细胞群的状态。相应的，本发明提供了自动装置，该装置任选与一次性药筒组合，以便于有效质控体内或体外应用中所使用的细胞。
根据本发明的具体实施方式，本发明提供了标志物基因亚组，该亚组标志物基因可以使我们更可靠地评价细胞群的软骨细胞表型稳定性，或者化合物或条件影响细胞群在体内形成软骨的能力。最特殊的是，适宜的标志物基因亚组包含至少3个、更具体的是至少4个、更具体的是至少5个、以及最特殊的是至少6个已鉴定的标志物基因。根据一个实施方式，标志物基因亚组包含至少一个正标志物基因和一个负标志物基因。
一般而言，考虑进去的标志物基因数越少，测量误差和一个特定标志物的潜在异常表达的影响就越大。不同的标志物还反映了不同的过程(例如，合成代谢过程，分解代谢过程等)和参与软骨细胞代谢的不同通路(信号通路，受体和配基，基质组分，处理酶)，每一种过程对软骨细胞的表型稳定性都有其各自的影响。因此，考虑到的标志物基因越多，试验就越能代表确保软骨稳定形成的完整环境。另一方面，分析的标志物基因越多，试验的技术复杂程度就越高，也就越不适合用于高通量筛选。另外，为了维持每一个标志物基因的贡献与整体评价的相关性，标志物基因数应保持在10个以下。确实，在一大组标志物基因内单个标志物基因表达的变化对标志物基因的总表达评分的影响很小。根据这些参数和所观察到的不同基因的相对贡献，研究证实3到9个标志物比较适于确定细胞群的软骨细胞表型稳定性，或适于评价化合物或条件对细胞群软骨细胞表型稳定性的影响。根据一个实施方式，包含5、6或7个标志物的一组是最佳的折中方案，可以兼顾到这组标志物所得评分的精确度和进行高通量分析的实际可行性之间的平衡。
因此，本发明的一个方面提供了包含至少三个代表软骨形成的标志物的一组标志物，其中的标志物选自由正标志物基因FRZB、COL11、COL2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2和OPN以及负标志物基因ALK1和PEDF组成的一组。
根据本发明的一个具体实施方式，组成软骨形成潜在标志物的一组至少三个标志物，即，代表软骨形成，包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2或OPN的一个标志物基因。更具体的是，代表软骨形成的一组至少三个标志物，包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2和FGFR3的一个标志物基因。本发明的其他实施方式涉及至少包含4、5或6个标志物基因的组，其中包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、BMP-2、RASF-PLA2或OPN的2、3和4个标志物。更具体的是，至少包含4、5或6个标志物基因的组包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2或FGFR3的2、3和4个标志物。根据一个具体实施方式，一组6个标志物基因被用于评价在体内生成稳定软骨的能力，该组由FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3组成。在实施例1中被称为“ChondroCelectTM标志物”(CC标志物)的这组标志物基因的累积评分在本文中也被称为“ChondroCelectTM评分”。另外，这组标志物包括这组软骨形成潜在标志物的变体，其中PEDF、COL11、COL2和FGFR3中的一个可被选自RASF-PLA2、OPN和BMP-2的一个标志物替代。更具体的是，这组标志物包括上述软骨形成潜在标志物的变体，其中正标志物COL11、COL2中的一个被RASF-PLA、OPN或BMP-2替代。本文的实施例部分证明，根据软骨细胞群所表达的本文所述的标志物组的水平而计算出的标志物评分可用于可靠地预测细胞群所生成的软骨的特性(如组织学分析所确定的)。
根据另一方面，本发明提供了确定细胞群的软骨细胞表型稳定性的方法。更具体的是，本发明提供了本文所述的这组标志物基因作为一个工具在评价细胞群的软骨细胞表型稳定性中的应用。这一点是非常重要的，例如，对于软骨缺损治疗中细胞移植所用的细胞群的质控来说。这些方法的特征在于，它们包括确定一组本文所述的标志物基因在细胞群内的表达水平的步骤。更具体的是，本发明的一组标志物基因的表达水平，任选表示为累积标志物评分，更具体的是表示为软骨形成潜能评分，可用作用于移植目的的细胞群质量的指示因子。一般来说，细胞群的质量评价利用标准方法如本文所述的那些方法在试验室完成，评价结果以报告的形式产生，或者总结在质控表中。细胞群可以是获自人或动物组织的细胞群的P0或任一代。根据一个实施方式，细胞群是P2到P6之间的获自人软骨活检组织的细胞群。另外，可以考虑细胞群的群体倍增次数。对于本发明上下文所述的大多数细胞群来说，每一代包括2-3次群体倍增。相应的在本发明的上下文中，细胞群在经过一次或两次群体倍增(P0)后进行评价。任选的是，细胞群是一个活检组织或不同活检组织来源的不同代次(任选包括P0)细胞的组合。细胞如果打算进行自体移植，那么获自一个特殊患者的一个或多个活检组织的细胞任选组合在一起，然后检测其软骨细胞表型稳定性(在组合前和/或后)。一般来说，质量评价在特定时间点进行，即，植入前(以细胞或者放入支架或基质内的二维或三维组织的形式)、储存前(例如，冷冻)和/或储存后取出、在对细胞群进行特殊处理和/或置于特殊条件下之前和/或之后。
本发明一个方面的目的确实是在直接植入前，或者接种到或包裹进生物相容性基质然后植入前，确定细胞群在体内生成稳定透明软骨的能力。标志物评分是细胞群或细胞能形成软骨植入物而不发生血管侵入或软骨内骨化迹象的指示因子。
一般而言，根据本发明，用于计算标记物评分的标志物表达水平可以细胞群作为一个整体来进行，其中利用代表性的样品来确定被研究的细胞群是否表达标志物，例如，通过本文所述的那些方法。另外，可以利用本领域熟知的细胞特异性方法检测单个细胞内特殊基因的表达。
根据另一方面，本发明提供了用于确定化合物或条件对软骨形成细胞在体内生成稳定透明软骨的能力的影响的方法，该方法可用作筛选工具。这些方法包括步骤：使软骨形成细胞群与化合物或条件接触，以及确定该细胞群内本发明所述的一组标志物基因的表达水平。
相应的，本发明提供了用于鉴定能够影响一群细胞的软骨形成能力的化合物或条件的方法和试验。根据一个实施方式，该方法被用于鉴定适于培养、储存和/或给予细胞群的合适条件，其中的细胞群可用于治疗软骨缺损。在这种方法中，软骨形成细胞群被施加以特殊条件，然后测定标志物基因的表达水平。常见的条件包括特殊培养基、培养温度、培养时间、培养密度等，以及与其他类型细胞的组合。另外，方法和试验被用于鉴定能够影响软骨形成细胞的软骨细胞表型稳定性的分子因子。这种因子包括生长因子、丝裂原、添加物、小化学分子等。筛选的目的可以是鉴定可用于培养、储存或给予用于移植以治疗软骨缺损的细胞群的因子。一般来说，感兴趣的因子是能够对细胞群的软骨细胞表型稳定性产生正面影响的因子，和/或对细胞的其他特性(例如，细胞数、稳定性等)产生正面影响的因子，和/或对细胞群的软骨细胞表型稳定性没有负面影响的培养条件参数(例如，储存时间，可用的传代次数等)。
另外或择一地，本发明的试验或方法可用于筛选和鉴定对软骨形成细胞在体内形成软骨有潜在效应的化合物。本发明涉及筛选方法在鉴定化合物中的应用，其中化合物可影响被治疗患者体内的局部细胞生成软骨和/或细胞移植所用细胞生成软骨。筛选方法可用于鉴定和/或评价能够抵消病理状态下所产生的因子或状况的化合物。例如，在添加能够潜在抵消这种效应的化合物前用IL-1刺激细胞(刺激炎症状态、增强代谢通路以及抑制分解代谢过程)。
在本发明的范围内还涉及标志物基因在评价治疗性化合物对软骨形成细胞在体内生成软骨的能力的潜在副作用中的应用，其中包括用于软骨修复之外的那些化合物。本发明的方法有可能用于直接鉴定化合物对骨形成的效应，当在体内直接检验时，可能需要较长的时间才能观察到这种效应。
本发明涉及化合物筛选的方法一般包括步骤：使软骨形成细胞与一种或多种目的化合物接触，以及确定本文所述的一组标志物基因在软骨形成细胞群内的表达水平。本发明的方法可用于高通量筛选，例如，化学化合物文库、肽文库、表达文库等。
根据一个实施方式，本发明的方法包括步骤：比较已添加一种或多种化合物/已经过特定条件处理的一个细胞群与未经过这种化合物或条件处理的相同或不同细胞群内本发明所述的一组标志物基因的表达水平。在一个典型实施方式中，(a)来源于同一细胞群的不同组分用不同条件和/或化合物处理以彼此比较和/或与阳性和/或阴性对照比较。阴性对照可以是空白或已知不影响软骨细胞表型稳定性的化合物。阳性对照可以是已知可(正面或负面)影响()细胞群表型稳定性的化合物或条件。
在本发明的筛选方法中，评价了不同参数。以不同的密度将细胞接种到不同的容器内或者接种到多孔培养板内。在添加化合物/因子或施加条件或二者同时进行之前培养细胞以不同的时间。不同方案以及化合物和培养条件的组合可以结合使用。化合物/因子以不同的浓度添加，与细胞接触以不同的时间。培养条件同样适用。
本发明的基础在于我们观察到，在植入前，根据特殊基因(标志物基因)在一个细胞群内的体外表达水平可以预测该细胞群在植入到体内后生成透明软骨的能力。因此，标志物基因的表达水平可用于监测细胞在植入前的软骨形成“质量”以及化合物和条件对其的效应。如下文所详细描述的，基因的表达水平可表示为标志物评分，其中不同标志物基因的(相对)表达水平累加起来就得到了一个数值，该数值可与最佳值(即，所选择的所有正标志物都高表达，所有负标志物都低表达)比较。另外，筛选试验也可把化合物或条件影响该组基因内的任何一个标志物的能力考虑进去。
本发明的标志物基因的表达可基于绝对值或相对值来评价。一般而言，采用标志物基因的表达水平与看家基因的表达水平进行比较。例如与本文所述的肌动蛋白基因比较。由于不同看家基因的表达水平是不同的，技术人员应当理解，对于每一个所使用的看家基因来说，需要预先在具有软骨细胞表型稳定性的细胞群内确立标志物基因与所选择的看家基因之间的相对表达。根据本发明，由所选标志物表达水平得到的综合信息可作为细胞是否能在体内形成软骨的指示因子。
本发明涉及本文所述的标志物组合在评价一个给定细胞群的质量以及评价因子/条件对细胞在植入到体内后生成透明软骨的能力的影响中的应用。当一组标志物被用于确定化合物、细胞或条件对细胞群在体内生成透明软骨的能力的影响时，效应可以确定为本发明标志物的表达水平相对于对照或相对于细胞群与化合物或条件接触前的表达水平“升高”或“下降”。因此，能够提高一个或多个本发明的正标志物基因的表达水平和/或降低一个或多个本发明的负标志物基因的表达水平的化合物、细胞或条件被认为能够对软骨形成产生正面影响。能够降低一个或多个本发明的正标志物基因的表达水平和/或提高一个或多个本发明的负标志物基因的表达水平的化合物、细胞或条件被认为能够对软骨形成产生消极影响。
根据本发明的一个方面，细胞群内一组标志物中不同标志物基因的表达水平可表示为“累积标志物评分”，该评分与细胞群的软骨细胞表型稳定性相关，并且是细胞群的软骨细胞表型稳定性的指示因子。累积标志物评分可用于定性和/或定量阐释本发明的方法和试验所得到的结果。
本发明涉及不同类型的标志物评分。一组标志物的表达水平可表示为该标志物组中每一个基因产物的绝对表达水平之和相应的数值。在进行定量检测标志物基因的表达水平时，如通过定量PCR或ELISA，可以使用这种计算方法。
另外，标志物组中每一个基因的表达水平可以比例的形式表示，即，一个基因的表达水平与另一个基因如看家基因的表达水平之比，后者被认为无论细胞是否经过处理其表达水平都是相同的，或者其表达被认为是相对稳定的，与细胞生成稳定透明软骨的能力无关。这样可以使不同标志物的表达水平数值更具有可比性(最常见的是在0.001到10的范围内)。相应的，累积标志物评分可以是每一个标志物基因的比例之和。
但是，根据本发明的一个具体实施方式，累积标志物评分不是根据每一个标志物基因表达水平的绝对值或相对值计算出来的，而是根据该表达的定性分析得出的。
根据本发明的一个具体实施方式，主观地给标志物基因的定性分析结果赋予一个数值，例如，“1”。更具体的是，根据本发明，正标志物的表达升高/高表达被赋予数值“1”，负标志物不表达也被赋予数值“1”。最特殊的是，根据本发明，软骨细胞表型稳定性的正标志物基因表达水平和负标志物表达水平都被定义一个表达水平范围(或表达水平之比)，其中表达水平处于预先设定的范围内时被赋予一个数值。根据另一实施方式，表达水平值处于正标志物基因和/或负标志物基因的预先设定的表达水平范围之外时(例如，当正标志物基因的表达水平很低或负标志物基因的表达水平很高时)也被赋予一个数值。
在确定每一个标志物基因在累积标志物评分中的相对影响力时，每一个基因的表达都具有相同的权重。另外，一个或多个基因的表达水平可以被认为对软骨细胞表型稳定性的影响比其他基因更强，这一点在计算标志物基因对累积标志物评分的相对影响力时也要考虑进去。根据本发明的一个具体实施方式，不同标志物的相对影响力可以是相同的，当处于预先设定的表达水平(或表达比)的范围内时被赋予数值“1”，而当处于该范围之外(正标志物和负标志物的表达水平分别低于或高于预先设定的范围)被赋予数值“-1”。任选的是，处于某一范围之内的表达水平被认为相当于数值“0”，该数值相对应的是正标志物或负标志物基因的表达水平对细胞的软骨细胞表型稳定性既没有正面影响也没有消极影响。
在本文所述的实施例部分描述了本发明的另一个具体实施方式。代表稳定软骨表型的累积标志物评分根据最多包含6个标志物的一组标志物确定，其中每一个标志都具有同等重要的作用。定量测定每一个标志物的表达水平，所采用的记分方法是根据标志物基因相对应的表达水平来计算的。在这个具体实施方式中，根据这些标志物计算出的评分被称为“软骨形成潜能评分”，即，反映包含6个软骨表型稳定性标志物的一个给定标志物组的总体表达水平的累积标志物评分。根据本发明的这个实施方式，利用半定量方法确定每一个基因的表达水平，得到的数值通过与参照基因(例如β肌动蛋白)比较进行标准化。因此，表达水平为1是指与肌动蛋白表达水平相同的表达，表达水平低于1是指比肌动蛋白表达水平低的表达(0.1相对应的表达水平比β肌动蛋白的表达水平低10倍)，表达水平高于1是指比肌动蛋白表达水平高的表达水平。
在本发明的这个具体实施方式中，每一个标志物基因的表达水平都对应于三个可能的评分中的一个。对于正标志物(FRZ、COL11、COL2、FGFR3)来说，评分-1代表极低的表达水平(0-0.1)，评分0代表低表达水平(0.1-1)，评分+1代表高表达(＞1)。与此相反，对于负标志物(ALK1，PEDF)来说，评分+1代表极低的表达水平(0-0.1)，评分0代表低表达水平(0.1-1)，评分-1代表高表达(＞1)。所有这些单个评分的和代表一组标志物作为一个整体的表达水平。因此，对于含6个标志物的一组来说，评分的范围可以从-6(所有正标志物的表达水平都低于参照基因，所有负标志物的表达水平都高于参照基因)到+6(所有正标志物的表达水平都高于参照基因，所有负标志物的表达水平都低于参照基因)。如果这个评分是根据标志物FRZB、COL11、COL2、FGFR3、ALK1和PEDF在细胞群内的表达水平而计算出来的，那么这个评分在本文中就被称为ChondrocelectTM评分。
如本发明的实施例所示，一组标志物的表达水平以及从中计算出的累积标志物评分可能是与软骨细胞群的软骨细胞稳定性相关的。相应的，检测一组特定标志物的表达水平或计算软骨形成细胞群在接触某些化合物后的(累积)标志物评分可用于评价化合物影响细胞的软骨细胞表型稳定性的能力和/或细胞在体内形成软骨的能力。更具体的是，实施例已经证实将特定化合物添加到扩增的软骨细胞群中可以提高软骨形成潜能评分以及改善该细胞群的表型。负对照，例如，添加可促进骨形成的化合物，可降低软骨形成潜能评分。
相应的，本发明提供了可用于以细胞为基础的筛选试验以评价任一因子或条件对软骨形成细胞群在体内生成稳定软骨的能力的影响的累积标志物评分。考虑到在体外确定的细胞群软骨表型稳定性可代表细胞在体内的活性的事实，因此该分析能够可靠地用于鉴定化合物，其中化合物能够影响局部软骨形成细胞在给予软骨缺损时的软骨形成。重要的是，本发明所公开的试验和标志物分析不需要进行随后的或平行的体外或体内软骨形成试验来验证其结果，这将大大缩短和简化化合物大规模筛选试验。
根据本发明，累积标志物评分是一个可靠而有效的工具，可用于评价细胞群的软骨细胞表型稳定性和/或评价条件或化合物对软骨形成细胞的软骨细胞表型稳定性的影响。评分的可靠性一方面取决于正评分和体内生成表型稳定性软骨能力之间的关系以及负评分和细胞不能在体内生成表型稳定性软骨的事实之间的关系。对可靠的累积标志物评分的其他理想要求是其效率，即，其有效区分能够和不能在体内生成表型稳定性软骨的细胞群的能力。例如，当标志物的数目是6，评分系统在上述+6到-6之间变化时，通常会有一个“灰色区”(以累积标志物评分范围在+6到-6之间为特征的细胞群)，其累积标志物评分是不明确的，当进行检测时会发现其中既包含能生成稳定透明软骨的细胞群，也包含不能生成稳定软骨的细胞群。比较理想的是，标志物评分可使处于该灰色区的细胞群数目最少，但是又可以最有效地将细胞群分类为“正的”或“负的”。
更具体的是，在确定移植所用的细胞群的软骨细胞表型稳定性时，累积标志物评分的可靠性和效率都是非常重要的，这样才能直接而正确地确定细胞群的命运。确实，使用相对较低预测值的累积标志物评分来确定用于移植的细胞群的特征，其价值有限，因为无法确定是否能够植入。在这种情况下，使用本发明的软骨形成潜能评分作为记分工具被认为是特别合适的，这是因为其具有较高的可靠性和效率。但是，在用于筛选时，预测值的效率可能不是太重要。如上所述，本发明的筛选试验的潜在目的是鉴定能影响，更具体的是能改善，细胞群的软骨细胞表型稳定性的药用化合物。因此，在这种筛选方法中，软骨细胞表型稳定性的相对改善被认为是关键要求，而不是化合物诱导或维持软骨细胞良好表型稳定性的能力。例如，可以预计通过筛选试验以后，能将低质量细胞(植入后不能生成软骨)转化成中等质量软骨(其评分不能用于准确预测植入后的结果的细胞)的化合物也被认为是本发明感兴趣的化合物。
可用于本发明的方法和试验的细胞群包括被认为能够生成软骨或能发育成软骨生成细胞的任何细胞。一般而言，细胞是骨软骨细胞，如获自关节软骨、关节液或滑膜液的软骨细胞及其前体细胞或祖细胞。根据一个实施方式，本发明所用的细胞是WO01/25402所述的前体细胞。在某些实施方式中，细胞群是获自其他组织如骨髓或脂肪的前体细胞或干细胞，以及能诱导分化成骨软骨细胞系的前体细胞或干细胞。本发明的试验可用于确定这些细胞是否属于骨软骨细胞系。
用于本发明的方法和试验的细胞可以是新鲜分离的、扩增的或者传代一次或多次的。细胞可以细胞培养物的形式存在于培养瓶中或者存在于基质或支架上。基质上的细胞所表达的标志物组的水平可通过溶解基质并测定细胞的表达来确定。细胞可以是人的或动物的。已被用于软骨研究的动物的例子包括非洲爪蟾、斑马鱼、鸡、小鼠、大鼠、兔、绵羊和山羊。
本发明的方法和试验可用细胞进行，其中细胞本来就具有稳定的软骨细胞表型，和/或经过培养条件的诱导后产生了稳定的软骨细胞表型。这种细胞特别适用于确定一个给定化合物、治疗或条件的效应的试验。
根据另一实施方式，本发明的方法和试验用不具有稳定的软骨细胞表型或丢失了软骨细胞稳定表型的细胞完成，其中不具有或丢失软骨细胞稳定表型是其固有的和/或由培养条件诱导的。本文中的例子是经过多次传代的软骨细胞和干细胞。另外，合适的细胞可以是获自具有骨软骨缺损如(由此导致的)骨关节炎或风湿性关节炎的个体来源的软骨细胞，或者是基于其基因构成而进行预处理使其产生骨软骨损伤的个体来源的软骨细胞。其他合适的细胞可以是软骨肿瘤细胞或软骨肉瘤细胞。
不具有软骨细胞表型稳定性的细胞特别适用于本发明的方法来筛选能够改善或恢复细胞的稳定软骨表型，或者能够将某些细胞群如干细胞转化成具有稳定软骨表型的细胞的化合物或条件。
本发明涉及本发明的方法或试验在多种不同应用中的应用。如上所述，本发明的方法和试验使检测细胞的培养条件如细胞密度、传代次数、培养基组成、在二维或三维基质上培养、氧浓度、气压、切应力是否适用于ACT成为可能。试验特别适用于检测培养基组合物对软骨细胞表型稳定性的影响。其中对软骨细胞表型稳定性具有潜在影响的因子包括而不限于血清的类型和批次、合成的无血清培养基的不同剂型以及各种激素、生长因子、维生素、蛋白质和已知可影响软骨细胞表型稳定性的有机化合物。
本发明的方法和试验的一个应用是筛选化合物或条件，这些化合物或条件可诱导前体细胞或干细胞分化成骨软骨细胞，更具体的是分化成软骨形成细胞系。另一个应用是筛选能够恢复或维持健康细胞的软骨细胞表型稳定性的化合物或条件，其中为了获得足够的细胞数健康细胞已传代多次或正在传代。另一个应用是筛选能够诱导细胞的软骨细胞表型稳定性的化合物或条件，其中细胞获自己患有或易患软骨缺损的个体。
在另一个应用中，试验用于评价基质、支架、凝胶或其组成的影响，这些细胞通常被用于移植过程。
本发明的方法和试验还适于筛选经典肽文库、反义文库或化合物文库。组成这些文库的化合物包括而不限于生物制品和有机或无机化合物，这些化合物可以通过合成制备，或者获自天然资源。在本文中可以使用的例子是化合物文库，如抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如，LOPAP#，西格玛公司(Sigma Aldrich))、脂质文库(拜膜公司(BioMol))、合成的化合物文库(例如，LOPAC@，西格玛公司)或天然化合物文库(Specs，TT公司(TimTec))。
本文所述的筛选方法和试验特别适用于鉴定先导化合物，其中的先导化合物可用于制备骨软骨疾病治疗药物。在本发明的筛选方法中，本发明感兴趣的骨软骨缺损包括而不限于关节所发生的缺损，例如而不限于膝关节、肘关节、踝关节，通常被称为关节软骨缺损。软骨缺损也可以按骨端命名，如股骨髁的缺损、肱骨髁的缺损等。可用于筛选本发明感兴趣的能影响软骨细胞表型稳定性的化合物的常见软骨疾病包括骨关节炎、风湿性关节炎、关节软骨损伤、软骨软化、脊椎关节病。
附图简述
下面的实施例用于阐释本发明，并不意味着将本发明限制于其中所述的具体实施方式。这些实施例利用下图阐释，其中，
图1显示的是组织学评分对软骨形成潜能评分的散点图(为了避免点发生重叠，在距离和方向上每一个点都被随机移动了一些)。
图2显示的是利用实时定量PCR确定的化合物A对累积标志物评分的效应(如实施例1所确定的CC评分)，其中PCR是用从P0培养到P0的人软骨细胞单层培养物完成的。结果代表相对于对照(DMSO)的平均累积标志物评分。*与DMSO对照比较时p＜0.05(n＝4)。
图3显示的是化合物A对分子标志物COL2(A)、COL11(B)、FRZB(C)和FGFR3(D)表达的影响，其中分子标志物的表达水平与以单层培养的人P3软骨细胞的软骨形成潜能正相关，如实时定量PCR所测定的。结果代表相对于DMSO对照的根据2-deltadeltaCT计算出的靶基因表达水平。*与DMSO对照比较时p＜0.05(n＝4)。
图4显示的是化合物A对分子标志物PEDF(A)和ALK1(B)表达的影响，其中分子标志物的表达水平与以单层培养的人P3软骨细胞的软骨形成潜能负相关，如实时定量PCR所测定的。结果代表相对于DMSO对照的根据2-deltadeltaCT计算出的靶基因表达水平。*与DMSO对照比较时p＜0.05(n＝4)。
实施例
方法学
软骨细胞培养
从成人关节软骨中分离软骨细胞，利用Dell’Accio等((2001)，ArthritisRheum.44，1608-1619)所述的标准条件在体外扩增。
体内试验
利用一组48个软骨细胞样品验证本发明的标志物，其中软骨细胞样品获自不同的人，是新鲜分离的或者已经传代1到5次。一部分软骨细胞用于标志物分析(参见实施例3)，而另一部分用于体内分析以验证每一个样品的软骨形成能力。将约5百万个人细胞肌内注射到雌性NMRI nu/nu小鼠体内(大腿后部)。2周后收集植入物。[Lipman等(1983)Calcif.Tissue Int.35，767-772；Ostrowski等(1975)Somatic Cell Genet.1，391-395]。从肌肉中切下软骨植入物，通过苏木精-伊红、甲苯胺蓝和番红O染色进行组织学分析。将1到3的组织学评分分别赋予染色后的植入物。组织学评分为3是指含有高度硫酸化蛋白聚糖，甲苯胺蓝和番红O强染色的透明样软骨。组织学评分为2代表良好分化的透明样软骨，甲苯胺蓝强染色，而番红O弱染色。组织学评分为1是指“纤维软骨”，未分化的纤维组织，甲苯胺蓝不染色或弱染色。组织学评分为0是指为回收到植入物的试验。组织学评分为2或3的软骨代表了成果的植入。而组织学评分为0或1的软骨代表失败的植入。
实施例1：标志物分析
一部分注射的细胞用于基因表达分析。利用WO0124832所述的方法进行RNA分离、反转录和PCR。这些标志物的PCR引物列于表1中。
表1：扩增标志物基因所用的引物
  引物   序列   SEQ ID.NO：
β肌动蛋白   正向 5′-tgacggggtcacccacactgtgcccatcta-3′   1
  反向 5′-ctagaagcatttgcggtggacgatggaggg-3′   2
  胶原11   正向   5′-gaactccatctctccctgc-3′   3
  反向   5′-gagactggatttcaaggcaag-3′   4
  胶原2   正向   5′-ccctgagtggaagagtggag-3′   5
  反向   5′-gaggcgtgaggtcttctgtg-3′   6
  PEDF   正向   5′-ttcaaggggcagtgggtaac-3′   7
  反向   5′-taaggtgatagtccagcggg-3′   8
  Frzb1   正向   5′-tgtaagtctgtgtgcgagcg-3′   9
  反向   5′-gatttagttgcgtgcttgcc-3′   10
  ALK1   正向   5′-cgacggaggcaggagaagcag-3′   11
  反向   5′-tgaagtcgcggtgggcaatgg-3′   12
  FGFR3   正向   5′-gctgaaagacgatgccactg-3′   13
  反向   5′-aggaccccaaaggaccagac-3′   14
通过测定PCR产物电泳后的光亮度来确定标志物的表达水平。然后将所有数值与DNA分子量标准的600bp的条带进行比较，得到数值。一个数值代表一个标志物的浓度。对于正标志物(COL11、COL2、FGFR3)来说，-1代表极低表达(0-0.1)，0代表低表达(0.1-1)，+1代表高表达。与此相反，对于负标志物(ALK1、PEDF)来说，+1代表极低表达(0-0.1)，0代表低表达(0.1-1)，-1代表高表达。所以这些单个标志物的总和(定义为软骨形成潜能评分)代表整个一组标志物的表达水平。这个数值可以是-6到+6。
每一个标志物的各自数据，其软骨形成潜能评分和组织学评分列于表2中。
Figure A20078004344000251
Figure A20078004344000261
实施例2：数据分析
表3和图1描述了实施例1所确定的软骨形成潜能评分和组织学评分之间的关系。软骨形成潜能评分与组织学评分之间的相关系数为0.78，具有统计学意义(p＜0.0001)。
软骨形成潜能评分≤-3的样品会形成纤维软骨，或者根本不能形成软骨。软骨形成潜能评分≥2的样品总能形成透明软骨。软骨形成潜能评分为1的6个样品中有1个形成了透明软骨。
作为一个标准，软骨形成潜能评分≥0的样品被认为适于植入。根据本发明的数据集，可以预测77％(37/48)的移植结果是能够高度确定的，其中64％无误差。根据这个数据集，当软骨形成潜能评分≥0时可以批准软骨细胞培养物用于ACI过程。
总之，只有利用软骨形成潜能≥0的细胞才能获得稳定的透明样软骨。根本不能形成软骨的细胞的评分为负。进一步分析各个基因有助于进一步改进这个模型。
a)软骨形成潜能评分与组织学评分的关系
图1和表3描述了软骨形成潜能评分和组织学评分之间的关系。
表3：利用统计学方法总结出的组织学评分频率表
除了频率表以外，表3还显示了软骨形成潜能评分每一个数值的平均组织学评分。这个平均值在软骨形成潜能评分-1到0之间明显升高(从1.0到2.7)。这说明软骨形成潜能评分≥0的样品被认为适于ACI。
b)利用分类尺度进行数据分析
“顺序分类尺度”是指被赋予数值的类别只表示其次序的尺度：被赋予的实际数字没有其他意义。例如，本文的组织学尺度采用数值0、1、2、3。以顺序分类尺度解释这一数值意味着1好于0，但是并未说明好多少。然而，对于间隔尺度来说，实际数字被认为是有意义的，其中1好于0与2好于1的程度相同，等等。在计算表3所示的平均值时，已经作出了暗示性的假设，即，组织学评分可以按间隔尺度妥当地处理。
尺度上的刻度越多，这种尺度就约容易被认为是间隔尺度。由13个数据点所代表的软骨形成潜能评分相应地被作为间隔尺度处理。
其他分析被列于表3的最后一列中，在此处组织学评分是按顺序分类尺度处理的。在本文中，评分被合并成两类，0或1(无软骨或低纤维软骨)和2或3(透明软骨)，数据代表了观察到组织学评分为2或3的可能性。
在表3的最后两列，题头为“观察到的”一列显示的是这一类中样品的每一个软骨形成潜能评分的实际值(以及百评分)。在软骨潜能评分-1到0之间这个数值也是升高的，说明了阈值切割点。对于这个分析来说，软骨形成潜能评分被认为是顺序分类尺度。
c)利用间隔尺度进行数据分析
当软骨形成潜能评分按间隔尺度处理时，利用对数分析处理可以使观察到的反应更平滑。该方法可预测处于理想分类(2或3)中的可能性。拟合值不会落到合理的范围(0-100％)之外。这些拟合的数值显示在表3的最后一列，说明了平滑后的效果。这些拟合的估值被认为可以提供更可靠的预测，与其他方法相比，任何一个给定的软骨形成潜能评分更有机会得到2或3的组织学评分。对于-1的软骨形成潜能评分来说，特别要注意的是拟合模型预测得到2或3的机会是41.5％，因此，这就提出了一个疑问，即，评分-1是否应该被接受。
实施例3：各个标志物的影响
通过从新计算一组标志物中5个标志物而不是6个标志物的表达模式来评估各个标志物的影响，其中在实施例1中该组标志物用于确定软骨形成潜能评分。应用相同的评分系统，其中现在的评分范围为-5到+5。
数据列于表4到9中。
表4：无标志物COL11的组织学评分的频率表
Figure A20078004344000291
表5：无标志物COL2的组织学评分的频率表
Figure A20078004344000292
表6：无标志物PEDF的组织学评分的频率表
Figure A20078004344000301
表7：无标志物FRZB的组织学评分的频率表
表8：无标志物ALK1的组织学评分的频率表
Figure A20078004344000303
Figure A20078004344000311
表9：无标志物FGFR3的组织学评分的频率表
Figure A20078004344000312
下面表10的A部分说明了上述表4到9所列的每一个数据集、标志物评分的阈值、有多少样品可被明确地分类为可以形成低质量软骨(在表10中，组织学评分0或1对应于“-”)或高质量软骨(组织学评分2或3对应于表10中的“+”0.标志物评分与组织学评分之间无关的样品被分类为“？”样品。这些数据说明当省略COL11、COL2或COL11而只用含5个标志物的一组时，可以获得相同甚至更好的结果(即，被称为“？”的样品更少)。
在表10的B部分中，甄别阈值很少受到限制。当一个标志物评分处于所示范围内时，6个样品中至少有5个表现出标志物评分和软骨质量之间的相关性，标志物评分的范围假设是可以预测的。利用这种方法，省略COL11可以使结果更佳，而省略其他任何标志物都会使结果变差，尤其是从实施例1的标志物组中省去Col2或FGFR3。
表10：包含5个标志物的标志物组的预测值
  A   6个标志物   -COL11   -COL2   -PEDF   -FRZB   -ALK1   -FGFR3
  -   7   7   5   7   7   5   7
  ？   17   14   17   24   27   27   14
  +   24   27   26   17   14   16   27
  B   6个标志物   -COL11   -COL2   -PEDF   -FRZB   -ALK1   -FGFR3
  -   7   13   10   7   7   5   7
  ？   8   3   12   9   10   11   14
  +   33   32   26   32   27   32   27
根据本发明的数据集及对数据的阐释，好像一组标志物的表达模式在预测体内软骨形成中的能力在不含COL11时也可以获得，无论如何阐释。另一方面，省略ALK1或FRZB会导致标志物的预测能力下降，无论如何阐释本发明的数据集。
实施例4：标志物评分在筛选试验中的应用
利用累积标志物评分进行软骨细胞表现稳定性的评价在筛选试验中加以验证以鉴定能影响细胞在体内生成稳定软骨的能力的化合物以及确定这种化合物对细胞的效应的性质。
筛选试验在96孔板上进行，其中接种10 000到100 000个获自软骨活检组织的软骨细胞(从P0到P5代细胞中新鲜分离)。待测化合物以不同的浓度和不同的时间加入。孵育以后收获软骨细胞，分离RNA并用反转录酶处理。按照TaqMan方法的指导进行定量PCR，按照实施例1所述的方法(CC评分)确定细胞的软骨形成潜能评分。
1.检测能抵消单层培养物内的软骨细胞去分化的分子
化合物A是一个候选化合物，据预测具有软骨保护效应和对软骨细胞表型的稳定效应。测定累积标志物评分，更具体的是实施例1的软骨形成潜能评分，可用于确定这种化合物对软骨细胞单层培养物的软骨细胞表型稳定性的效应。
a)软骨细胞单层培养物
软骨细胞以4×104细胞/ml的浓度在T25培养瓶中进行单层培养。接种后将化合物A直接加到细胞上。完全培养基(DMEM+10％FBS)总体积为5ml。每一种条件(1或10μM化合物A，DMSO对照)用三个培养瓶。培养基和化合物每周更换一次。当细胞汇合后，用胰酶消化0代软骨细胞(P0)，计数，重新接种2×105细胞，为P1培养物。剩余细胞放入裂解介质中提取RNA。P1、P2和P3软骨细胞培养物进行同样的处理。TaqMan RT-PCR用于确定软骨细胞形成标志物的表达。
b)RNA分离，cDNA合成
得单层培养物的软骨细胞用PBS洗涤，用含1％巯基乙醇(恰根公司(Qiagen))的RLT缓冲液裂解。裂解的细胞储存在-80℃备用。按照厂家的说明书用RNeasy微型试剂盒(恰根公司)纯化mRNA。根据厂家(因维曲根公司(Invitrogen))的说明书用随机六聚体引物合成cDNA。
c)TaqMan实时聚合酶链式反应(RT-PCR)
利用ABI prism 7700序列检测系统进行实时定量PCR(RT-PCR)。按照厂家的说明书利用Mastermix qPCR试剂盒(尤金科技公司(Eurogentec))进行RT-PCR。用于TaqMan分析的引物和探针购自应用生物系统公司(AppliedBiosystems)或尤金科技公司。利用2-deltadeltaCT(2DDCT)计算实时PCR数据，这些数据定义为根据内源性参照(β肌动蛋白)进行标准化后相对于校正标准的靶基因的量，在这种情况下校正标准是所选基因在对照条件(DMSO)下的表达水平。
d)结果
化合物A可影响几个作为软骨细胞的软骨形成能力、表型稳定性和内稳态指示因子的分子标志物的表达，能够抵消单层培养物内的软骨细胞在扩增期间软骨形成潜能评分的下降(参见图2)。因此，在1μM和10μM的浓度下，P0和P3代软骨细胞的软骨形成潜能评分与未经化合物处理的软骨细胞相当，甚至更高。在后一种情况下，P3与P0软骨细胞相比累积标志物评分下降。
化合物A对软骨细胞几种细胞外基质组分的基因表达有正面影响。在较低浓度(1μM)而不是较高浓度(10μM)时，化合物A可诱导Col2和Col11基因转录子的表达(图3)。化合物还可增强FGFR-3标志物的表达，尽管这种升高没有统计学意义。另外，两种测试浓度的化合物A都可明显抑制PDEF的表达(图4)。在10μM时，添加化合物也能导致ALK1表达的下降(图4)。在表达上调时，两个标志物与细胞的软骨形成能力呈负相关关系，说明化合物A对软骨细胞的软骨形成潜能有正性的刺激效应，因而对软骨形成也有正性刺激效应。
2.筛选分子介导3D培养物中去分化的软骨细胞再分化的能力
筛选14种化合物增强藻酸盐培养物内去分化的软骨细胞再分化的能力。测定分子对不同分子标志物表达的效应以及对累积标志物评分(如实施例1所确定的软骨形成潜能评分)的效应，用于评价化合物影响3D培养物中细胞的软骨形成表型恢复的能力。
a)藻酸盐培养物内软骨细胞的去分化
单层培养物在完全培养基内扩增以后，用胰酶处理以释放处于3代(P3)的取自5个OA患者(50-65岁)膝部的人软骨细胞，计数并通过台盼蓝排出试验测定其活力。软骨细胞悬浮到2％藻酸盐内，添加等量的HBSS。细胞悬液吸到10ml注射器内，然后通过24号针头滴加到氯化钙溶液中(每孔5滴，每孔的总细胞数为250000个)。用氯化钠溶液洗涤，加入新鲜的完整培养基(DMEM+10％FBS)。培养4天以后，去掉上清液，加入含10μM化合物的新鲜培养基。在加入化合物4天后，去掉上清液，通过裂解将细胞释放出来。制备mRNA和cDNA，利用TaqMan RT-PCR测定COL2、COL11、FGR3、FRZB、ALK1、PEDF的表达，如实施例所述。
b)结果
表11总结了化合物对在藻酸盐中培养的软骨细胞内标志物基因表达的相对上调或下调效应。效应与未用分子处理(但是含有对照DMSO)的软骨细胞比较。结果代表相对于对照(软骨细胞加DMSO)的平均表达水平(5个OA患者的平均值)。NS＝无统计学意义；-＝抑制；+＝增强；#＝与对照DMSO相比时p＜0.05。化合物的使用浓度为10μM。
有几种分子能以正性或负性方式影响各种标志物基因的表达。只有两种化合物(Cpd 8和Cpd 14)对累积标志物评分(CC评分)有正面影响，说明这些化合物可增强/介导软骨细胞的再分化。但是，只有Cpd 14具有对每一个标志物的理想效应，对BMP2或ALK1基因的表达没有影响。这种化合物可用于在重新植入前刺激软骨细胞在体外去分化，因此可诱导平衡向关节透明软骨体内合成倾斜。
表11.待测化合物对藻酸盐培养物中生长的去分化的软骨细胞表型调节因子表达的效应。
  化合物   COL2   FGR3   BMP2   COL11   ALK1   PEDF   CC评分
  Cpd 1   NS   -#   NS   NS   NS   -#   NS
  Cpd 2   -#   NS   -#   NS   NS   -#   NS
  Cpd 3   -#   -#   NS   -#   NS   -#   NS
  Cpd 4   -#   NS   NS   NS   NS   NS   NS
  Cpd 5   -#   -#   -#   NS   NS   -#   -#
  Cpd 6   -#   -#   -#   NS   NS   -#   -#
  Cpd 7   NS   -#   NS   NS   NS   NS   NS
  Cpd 8   NS   NS   NS   -#   -#   NS   +#
  Cpd 9   NS   NS   NS   NS   NS   NS   NS
  Cpd 10   -#   NS   NS   NS   NS   NS   NS
  Cpd 11   -#   -#   +#   NS   NS   -#   -#
  Cpd 12   -#   NS   +#   NS   -#   -#   NS
  Cpd 13   -#   NS   NS   NS   NS   -#   -#
  Cpd 14   +#   +#   NS   +#   NS   -#   +#
实施例5.检测软骨保护性化合物的体内效应
对于实施例4中那些能明显影响软骨形成潜能评分的化合物来说，还要检测其在体内对细胞的软骨细胞表型稳定性的效应。为达到此目的，将细胞群与待测化合物或缓冲液接触，孵育以后注射到裸鼠模型体内(参见上文)。评价每一个细胞群生成稳定透明软骨的能力。结果显示化合物对软骨形成潜能评分的影响与对细胞群的软骨形成潜能的影响相关。
序列表
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     De Bari，Cosimo(C.德巴里)
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<160>14
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>1
tgacggggtc acccacactg tgcccatcta                                    30
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>2
ctagaagcat ttgcggtgga cgatggaggg                                    30
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>3
gaactccatc tctccctgc                                        19
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>4
gagactggat ttcaaggcaa g                                     21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>5
ccctgagtgg aagagtggag                                       20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>6
gaggcgtgag gtcttctgtg                                       20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>7
ttcaaggggc agtgggtaac                                        20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>8
taaggtgata gtccagcggg                                        20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>9
tgtaagtctg tgtgcgagcg                                        20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>10
gatttagttg cgtgcttgcc                                        20
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>11
cgacggaggc aggagaagca g                                    21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>12
tgaagtcgcg gtgggcaatg g                                    21
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>13
gctgaaagac gatgccactg                                      20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>14
aggaccccaa aggaccagac                                      20

Claims (22)

1.一种确定细胞群在体内生成稳定透明软骨的能力的体外方法，该方法包括确定所述群体表达一组至少三个标志物基因的水平，所述标志物基因包括FRZB、ALK1以及选自下组的一个或多个标志物基因：PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2和RASF-PLA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞群与化合物或条件接触。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
-使细胞群与化合物或条件接触，以及
-确定所述细胞群表达一组至少三个标志物基因的水平，其中这一组标志物基因包括FRZB、ALK1以及选自下组的一个或多个标志物基因：PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2和RASF-PLA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
-在所述接触步骤前确定所述这组至少三个标志物基因在所述细胞群内的表达水平，以及
-在所述接触步骤后，确定化合物或条件是否能够影响所述这组至少三个标志物基因中的一个或多个的表达。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少三个标志物的一组是至少4、5或6个标志物基因的一组，其中包含FRZB、ALK1以及选自下组的2、3和4个标志物基因：PEDF、COL11、COL2和FGFR3。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少三个标志物的一组是包括FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3在内的至少6个标志物基因的一组。
7.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，该方法还包括根据化合物的存在对一组至少三个标志物基因的表达的影响来确定化合物对细胞群在体内生成稳定透明软骨的能力的影响能力。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，能增强选自FRZB、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA中一个或多个正标志物基因的表达的化合物被鉴定为对软骨形成有正面影响，能增强PEDF和/或ALK-1表达水平的化合物被鉴定为对软骨形成有负面影响。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，化合物或条件影响软骨形成的能力根据化合物或条件对选自FRZB、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个正标志物基因以及负标志物基因PEDF和/或ALK-1的表达的累积效应而定。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞群获自关节。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞群获自健康供者。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞群获自患有骨软骨缺损的个体。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，其中一组标志物中标志物的表达水平利用定量方法确定。
14.一组标志物在鉴定能够影响细胞在体外生成软骨的能力的化合物中的应用，其特征在于，这组标志物包含一组至少三个标志物基因，其中包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述标志物组包含至少6个标志物，其中包括FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3。
16.一种试剂盒，该试剂盒包含用于检测一组基因在软骨形成细胞内的表达的探针，所述这组基因包括一组至少三个标志物基因，其中包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述一组至少三个标志物基因包括FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2和FGFR3。
18.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测至少一个标志物基因的探针是与mRNA杂交的寡核苷酸。
19.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测至少一个标志物基因的探针是抗体。
20.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测至少一个标志物基因的探针是PCR引物组。
21.如权利要求16-20中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述探针是经过标记的。
22.一种用于检测一组基因在软骨形成细胞内的表达的装置，所述装置包括用于检测标志物基因表达的一个或多个下列单元，标志物基因包括一组至少三个标志物基因，其中包括FRZB、ALK1以及选自PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP-2或RASF-PLA的一个或多个标志物。
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