CN105980859B - 针对溶酶体酶的底物清除测定 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其提供针对溶酶体酶的改进底物清除测定，其特别适用于测量溶酶体酶或其它治疗剂用于治疗溶酶体贮积疾病的效价。特定来说，本发明组合生理相关底物细胞测定和高效的基于闪烁的检测方法。

Description

针对溶酶体酶的底物清除测定
相关申请的交叉引用
本申请根据35USC§119(e)要求2014年2月18日提交的美国临时专利申请序列号61/941,365的权益，所述美国临时专利申请据此以引用的方式整体并入本文。
发明背景
溶酶体贮积病症(LSD)是与溶酶体功能障碍相关的罕见代谢病症，其通常由缺乏为代谢溶酶体酶的底物所需的溶酶体酶所致，所述底物诸如脂质或糖蛋白(也称为粘多糖)。在它们之中，粘多糖贮积症(MPS)是归因于遗传缺乏一种负责降解糖胺聚糖(GAG)的溶酶体酶的一个家族的LSD。GAG是直链以及可变硫酸化寡糖链，其是细胞外基质的关键组分，并且也涉及于广泛范围的过程中的细胞信号传导中。GAG在溶酶体中病原性积累最终导致细胞功能损害和广泛范围的症状。
酶替代疗法(ERT)是一种用于治疗LSD的重要手段。通常，ERT涉及向其中缺乏溶酶体酶的受试者全身性施用天然或重组获得的溶酶体酶。成功的ERT需要可高效清除病原性底物积累并且恢复受损细胞功能的有效力的溶酶体酶。
发明概要
本发明提供一种尤其用以评估溶酶体酶用于酶替代疗法以及任何其它类型的治疗剂(例如生物制剂(例如蛋白质、酶、抗体)、小分子、核酸)用于治疗溶酶体贮积疾病的效价的准确、可靠、简单和高度高效的底物清除测定平台。本发明部分地基于非常规组合用于溶酶体酶和闪烁技术的生理性底物细胞测定。举例来说，本发明已证明细胞，特别是缺乏相关内源性溶酶体酶的那些，可通过例如在待并入底物中的放射性同位素(例如35S)存在下使细胞生长处于所需细胞密度(例如约80-98％汇合)下来合成放射性标记的生理性底物(例如GAG)。所述细胞可成功附着于闪烁基体。细胞内部的放射性标记的底物足够靠近闪烁基体以发射导致闪烁事件的电子。可接着添加目标溶酶体酶至细胞中。如果酶是有效力的(即，被适当内化，递送至溶酶体中，并且具有酶活性)，那么细胞能够代谢积累的底物，从而导致从细胞降解和释放放射性标记，其可被洗除。因此，与细胞相关的信号(即闪烁事件)降低指示溶酶体酶具有效价。如包括实施例章节的本文所述，这个方法在测量和定量目标溶酶体酶的效价(例如相对效价)方面是惊人准确的、可重现的以及高效的。举例来说，生物测定的线性是用以衡量测定获得在给定范围内正比于生物效价的准确测试结果的能力的重要参数。如实施例中所示，这个平台测定已显示在高准确度下出乎意料宽泛的线性范围(例如至少40-250％)。
在本发明之前，作为暴露于丢失酶的效应的积累GAG清除通常需要细胞的胰蛋白酶消化，若干离心和洗涤步骤，溶解收集的细胞以及将溶解产物再混悬于个别管的闪烁流体中。因此，1个样品通常需要16小时的实际操作时间。相比来说，本发明巧妙使用闪烁技术来使过程简化。举例来说，本发明不涉及胰蛋白酶消化、溶解、离心或再混悬步骤。因为生长培养基中的游离放射性标记的衰变对于闪烁基体产生信号来说太远，所以本发明的清除测定通常也不涉及大量洗涤步骤。此外，本发明的测定平台可使用多孔闪烁板，例如通常在β计数器上仅需要每板16分钟读取时间的那些96孔闪烁板。因此，这个测定平台提供显著增加的通量以及显著降低数量的操作步骤和实际操作时间。因此，本发明提供一种用于在制造期间的样品表征和方法开发的简单和可靠的品质控制工具。它也提供一种可用于使溶酶体酶或其它治疗剂的效价标准化以达成产品核准、加标和/或包装的分析工具。本文所述的测定平台也可用于出于诊断和疗法监测目的来评估直接从患者获得的生物样品中的酶效价。
在一个方面，本发明提供一种底物清除测定，其包括以下步骤：使包含目标溶酶体酶的样品与含有所述溶酶体酶的用放射性同位素标记的底物的细胞接触，所述放射性同位素可由所述溶酶体酶在允许所述溶酶体酶从所述底物裂解、降解或移除所述放射性同位素的条件下裂解(或降解)，其中使所述细胞附着于闪烁基体以便闪烁事件指示与所述细胞相关的放射性发射水平；以及通过检测闪烁事件来测量与所述细胞相关的放射性发射水平，其中相较于在接触步骤之前的基线放射性发射水平，放射性发射水平降低指示所述底物由所述目标溶酶体酶清除。
在另一方面，本发明提供一种测量溶酶体酶的效价的方法，其包括以下步骤：使包含目标溶酶体酶的样品与含有所述溶酶体酶的用放射性同位素标记的底物的细胞接触，所述放射性同位素可由所述溶酶体酶在允许所述溶酶体酶从所述底物裂解、降解或移除所述放射性同位素的条件下裂解(或降解)，其中使所述细胞附着于闪烁基体以便闪烁事件指示与所述细胞相关的放射性发射水平；相较于在接触步骤之前的基线闪烁事件，通过检测闪烁事件来测量与所述细胞相关的放射性发射水平的变化；以及相较于对照，基于与所述细胞相关的放射性发射水平的所述变化来确定所述溶酶体酶的所述效价。
在一些实施方案中，细胞缺乏目标内源性溶酶体酶。在一些实施方案中，细胞是由罹患与缺乏目标溶酶体酶相关的溶酶体贮积疾病的患者获得的纤维母细胞。在一些实施方案中，溶酶体酶的用放射性同位素标记的底物是由细胞在放射性同位素存在下合成。
在一些实施方案中，测量溶酶体酶的效价的方法进一步包括以下步骤：使细胞生长至所需汇合度；用放射性同位素处理细胞以使放射性同位素并入溶酶体酶的新合成底物中；以及将细胞接种至具有闪烁基体的孔中以使细胞附着于闪烁基体。在一些实施方案中，底物是糖胺聚糖(GAG)。在一些实施方案中，放射性同位素是35S。在一些实施方案中，通过用35S-硫酸钠处理细胞来标记底物。在一些实施方案中，允许溶酶体酶从底物裂解放射性同位素的条件包括在37℃下在含5％CO2的氛围下孵育细胞和包含溶酶体酶的样品。在一些实施方案中，测量溶酶体酶的效价的方法进一步包括在测量步骤之前洗涤细胞的步骤。在一些实施方案中，通过β计数器来检测闪烁事件。
在一些实施方案中，对照是指示目标溶酶体酶的预定效价和/或剂量-响应曲线的参照标准。在一些实施方案中，确定溶酶体酶的效价的步骤包括使用限定模型计算相对效价。在一些实施方案中，确定溶酶体酶的效价的步骤是定量的。在一些实施方案中，测量溶酶体酶的效价的方法进一步包括确定样品中目标溶酶体酶的总量的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定目标溶酶体酶的比活性。
在一些实施方案中，测量溶酶体酶的效价的方法不涉及细胞的胰蛋白酶消化。在一些实施方案中，该方法不涉及溶解细胞。
在一些实施方案中，测量溶酶体酶的效价的方法包括在甘露糖-6-磷酸(M6P)存在下进行的接触步骤，并且方法进一步包括将清除或效价与在无M6P下测量的对照进行比较以确定细胞摄取是否具有M6P依赖性的步骤。
在一些实施方案中，测量溶酶体酶的效价的方法是以高通量形式执行，其中多个样品被同时测量。在一些实施方案中，该方法包括使用多孔板，并且各个别孔的基体是闪烁基体。在一些实施方案中，多孔板是6、12、24、48或96孔板。在一些实施方案中，溶酶体酶是硫酸酯酶。在一些实施方案中，硫酸酯酶选自由以下组成的组：艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-艾杜糖醛酸酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、乙酰基-CoA N-乙酰基转移酶、α-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶及其组合。在一些实施方案中，硫酸酯酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。在一些实施方案中，硫酸酯酶是肝素N-硫酸酯酶。
在一些实施方案中，测量溶酶体酶的效价的方法包括是含有重组产生的目标溶酶体酶的细胞培养物样品的样品。在一些实施方案中，样品是由纯化方法获得的含有纯化或部分纯化的目标溶酶体酶的洗脱物或汇合洗脱物。在一些实施方案中，样品是含有目标溶酶体酶的配制药物产品。在一些实施方案中，样品是从患者获得的组织样品。在一些实施方案中，组织样品是血液样品、CSF样品、尿样品和/或来自实体器官的活检体样品。
在一个方面，本发明提供一种用于制造目标溶酶体酶的方法，其包括根据本文所述的方法确定溶酶体酶的效价的步骤。在一些实施方案中，确定溶酶体酶的效价的步骤是在签发批次之前进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括基于确定的溶酶体酶的效价来调整制造条件的步骤。
在一些实施方案中，用于纯化目标溶酶体酶的方法包括根据测量溶酶体酶的效价的方法来确定溶酶体酶的效价的步骤。在一些实施方案中，确定溶酶体酶的效价的步骤是在签发纯化批次之前进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括基于确定的溶酶体酶的效价来调整纯化条件的步骤。
如本文所用，术语“约”和“大约”作为等效词加以使用。与或不与约/大约一起用于本申请中的任何数字都意图涵盖由相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。
本发明的其它特征、目标和优势在随后详细描述中是显而易知的。然而，应了解尽管指示本发明的实施方案，但详细描述仅通过说明而非限制方式给出。在本发明的范围内的各种变化和修改将根据详细描述而变得为本领域技术人员显而易知。
附图简述
附图仅出于说明目的而非出于限制目的。
图1说明硫酸乙酰肝素的逐步降解以及为各步骤所需的酶(根据Essentials ofGlycobiology改编)。
图2显示用于以在第B至G行之间分布的一个对照、标准和三个样品进行的底物清除测定的96孔板设置的示意图，其中各行用从第1至12列连续稀释的酶浓度处理。
图3描绘对GAG底物清除测定的数据分析的示例图，其中使用4参数逻辑曲线拟合估计效价。
图4描绘对使用酶乙酰肝素N-硫酸酯酶(图4A)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(图4B)和N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶(图4C)进行的GAG底物清除测定的数据分析的示例图。
图5描绘显示历经宽泛线性范围的相对效价准确度的示例图。
图6描绘显示用酶乙酰肝素-N-硫酸酯酶(图6A)和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(图6B)进行GAG清除的历经宽泛线性范围的相对效价准确度的示例图。
图7描绘显示甘露糖-6-磷酸介导的内化的示例图，其中从硫酸酯酶移除磷酸使它在GAG清除测定中的活性降低。
图8描绘显示在5mM甘露糖-6-磷酸存在下对艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)依赖性GAG清除的完全抑制的示例图。甘露糖-6-磷酸结合甘露糖-6-磷酸受体，从而阻断治疗性酶的结合以及随后内化和迁移至溶酶体中。
图9描绘显示甘露糖-6-磷酸剂量依赖性抑制艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)依赖性GAG清除的示例图。
具体实施方式
本发明尤其提供针对溶酶体酶的改进底物清除测定，其特别适用于测量溶酶体酶或其它治疗剂用于治疗溶酶体贮积疾病的效价。特定来说，本发明组合生理相关底物细胞测定和高效的基于闪烁的检测方法。如本文所用，术语“效价”体现细胞摄取、细胞内溶酶体迁移和/或酶活性。在一些情况下，相较于对照或参照标准的定量效价也被称为“相对效价”。
本发明的各个方面详细描述于以下章节中。章节的使用不意图限制本发明。各章节可适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。
溶酶体酶和底物
在一些实施方案中，本发明的发明方法可用于测量任何溶酶体酶，特别是已牵涉于溶酶体贮积疾病中的那些。在一些实施方案中，溶酶体酶也被称为替代酶或治疗性酶。如本文所用，替代酶或治疗性酶可包括可起替代溶酶体贮积疾病中缺乏或丢失的溶酶体酶的至少部分活性的作用的任何酶或蛋白质。在一些实施方案中，替代酶或治疗性酶能够降低溶酶体中的积累物质或可挽救或改善一种或多种溶酶体贮积疾病症状。
对溶酶体贮积疾病的遗传病因学、临床表现和分子生物学的详细综述详述于Scriver等编,The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease,第7补充版,第II卷,McGraw Hill,(1995)中。它们的相应底物例示于下表中：
表1示例性溶酶体酶和底物
一般来说，溶酶体酶的生理相关底物是脂质和糖蛋白(也称为粘多糖或糖胺聚糖(GAG))。如本文所用，术语“生理相关底物”是指溶酶体酶的在缺乏所述酶的患者中积累的底物。在本申请中，除非明确另外指示，否则术语“底物”和“生理相关底物”可互换使用。
通常，GAG是由重复二糖单元组成的长未分支多糖。如表1中所示，粘多糖贮积症中涉及的一种类型的GAG是硫酸乙酰肝素。正常硫酸乙酰肝素清除需要由许多溶酶体酶在终末非还原性末端逐步降解寡糖链，所述溶酶体酶包括但不限于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-艾杜糖醛酸酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、乙酰基-CoA N-乙酰基转移酶、α-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶。硫酸乙酰肝素的逐步降解连同为各步骤所需的酶一起图解于图1中(根据Essentials of Glycobiology改编)。因此，在一些实施方案中，本发明可用于测量硫酸酯酶，包括但不限于本文所述的各种特定硫酸酯酶。
在一些实施方案中，本发明可用于测量天然存在的溶酶体酶，包括直接从天然来源(例如从细胞、动物、植物或患者)获得的那些内源性酶。在一些实施方案中，本发明可用于测量通过任何可用手段重组或化学产生的溶酶体酶，包括但不限于通过利用被工程改造以表达补充酶编码核酸的宿主细胞系统来重组产生的溶酶体酶，或通过使内源性基因活化来产生的溶酶体酶，或通过化学合成来部分或完全制备的溶酶体酶。在一些实施方案中，本发明可用于测量融合或缀合于溶酶体靶向部分(例如IGF-I、IGF-II、RAP、p97及其变体、同源物或片段)和/或具有改变的糖基化样式(例如增加或降低的M6P或双M6P水平)的溶酶体酶。
标记生理性底物
通常，用可检测信号标记适于本发明的生理相关底物以有助于检测。在一些实施方案中，用可由目标溶酶体酶裂解的可检测信号标记特别适于本发明的生理相关底物。各种方法可用于合成和标记生理性底物。在特定实施方案中，生理相关底物由细胞或生物体合成，并且在合成期间并有可检测信号。作为一非限制性实例，以下说明基于细胞的系统。
细胞
各种细胞类型可用于合成适于本发明的生理性底物。合适的细胞可为粘着细胞类型或非粘着细胞类型两者。这包括原代细胞和永生化细胞系，包括已用于标准重组技术的那些细胞。
一特别适用的细胞类型是其中目标溶酶体酶的底物积累的细胞类型，例如可合成但不能降解或完全降解底物的细胞类型。因此，在一些实施方案中，适于本发明的细胞是缺乏目标溶酶体酶(例如硫酸酯酶)的细胞。举例来说，适于本发明的细胞可缺乏目标溶酶体酶，或具有降低的酶活性或表达。在一些实施方案中，合适的细胞由罹患由缺乏目标溶酶体酶所致的溶酶体贮积疾病的人患者或其它生物体(例如非人动物，诸如灵长类动物、大鼠、小鼠、狗、猪、绵羊等)获得。合适的细胞可由包括但不限于脑、肝、肺、心脏、肾、皮肤、肌肉的组织来源获得。合适的细胞也可为上皮、内皮、间质和神经外胚层细胞。在某些实施方案中，合适的细胞是由人患者或其它生物体获得的纤维母细胞。在某些其它实施方案中，合适的细胞是由人患者或其它生物体获得的神经元。
在一些实施方案中，合适的细胞也可通过标准基因剔除技术或通过反义或干扰RNA技术使目标内源性溶酶体酶消减来产生。所述合适的细胞可为原核(例如细菌)或真核细胞，包括植物、酵母或哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤株系(NSO/l，ECACC编号：85110503)；人视网膜母细胞(PER.C6，CruCell,Leiden,The Netherlands)；由SV40转化的猴肾CV1株系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾株系(被亚克隆来达成悬浮培养生长的293或293细胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如HT1080)；幼小仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤株系(Hep G2)。
标记的细胞合成底物
一般来说，标记细胞合成底物涉及使本文所述的合适的细胞在可并入底物中以提供可检测信号的物质或试剂存在下生长。在一些实施方案中，使细胞从冷冻状态解冻，并且在标准细胞培养条件下扩增达到预定所需细胞密度。合适的细胞密度可通过汇合度来确定。举例来说，合适的细胞密度可为至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％汇合的。在一些实施方案中，合适的细胞密度可在大约25％至100％、30％至95％、35％至90％、40％至85％、45％至80％、50％至75％、50％至99％、50％至98％、50％至97％、50％至96％、60％至99％、60％至98％、60％至97％、60％至96％、70％至99％、70％至98％、70％至97％、70％至96％、80％至99％、80％至98％、80％至97％、80％至96％、40％至50％、45％至55％、50％至60％、55％至65％、60％至70％、65％至75％、70％至80％、75％至85％、80％至90％、85％至95％、或90％至100％汇合的范围内。在一些实施方案中，合适的细胞密度可为多达约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％汇合的。在一些实施方案中，合适的细胞密度可通过每孔(例如6、12、24、48或96孔板的每孔)细胞数目来确定。举例来说，合适的细胞密度可为每孔至少约500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、12,500、15,000、17,500、20,000、22,500、25,000、27,500、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000个细胞。在一些实施方案中，合适的细胞密度可在大约每孔500-100,000个细胞；每孔1,000-90,000个细胞；每孔2,000-80,000个细胞；每孔3,000-70,000个细胞；每孔4,000-60,000个细胞；每孔5,000-50,000个细胞；每孔6,000-40,000个细胞；每孔7,000-30,000个细胞；每孔8,000-27,500个细胞；每孔9,000-25,000个细胞；每孔10,000-25,000个细胞；每孔12,500-25,000个细胞；每孔15,000-25,000个细胞；每孔15,000-22,500个细胞；或每孔15,000-20,000个细胞的范围内。在一些实施方案中，合适的细胞密度可为多达每孔约5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、12,500、15,000、17,500、20,000、22,500、25,000、27,500、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、100,000个细胞。
接着用可并入新合成的底物中，并且发射可检测信号的物质或试剂处理细胞。在一些实施方案中，所述合适的物质或试剂提供可并入新合成的底物中的放射性同位素。在一些实施方案中，合适的放射性同位素包括在水性介质中发射具有多达2000μm的平均射程的电子的那些同位素。作为非限制性实例，合适的放射性同位素包括3H、125I、14C、35S、45Ca、33P、32P、55Fe、109Cd和51Cr。
在一些实施方案中，含有35S的物质或试剂用于产生由细胞合成的放射性标记的生理性底物，诸如GAG。作为一非限制性实例，可在所需细胞密度(例如约95％汇合)时添加35S-硫酸钠至生长培养基中以产生放射性标记的GAG(例如放射性标记的硫酸乙酰肝素)。
附着于闪烁基体
可将含有放射性标记的底物的细胞接种至含有闪烁基体的容器中以便细胞可附着于所述闪烁基体。可用于使细胞生长，并且具有闪烁基体的任何容器都适于本发明。这包括烧瓶、陪替氏培养皿(Petri dish)、锥形小瓶、抛弃式袋和多孔板。容器的至少一个表面充当闪烁基体(也被称为闪烁基板或闪烁层)，其含有当由电离辐射激发时展现发光的闪烁体物质。通常，闪烁基板或盘(如全塑组织培养器皿)需要表面改性以适合于细胞附着和/或生长。处理优选涉及使用高电压等离子体放电，即一种明确确定的用于产生带负电荷的塑性表面的方法(Arnstein,C.F.和Hartmann,P.A,J.Clinical Microbial.,2,1,46-54,(1975))。对于许多细胞类型，这个表面适于生长目的与测定目的两者。然而，可通过将一定范围的额外涂料涂覆于装置的培养表面来进一步改进细胞附着或生长。这些可包括：(i)带正电荷或负电荷的化学涂料，诸如聚赖氨酸或其它生物聚合物(McKeehan,W.L.和Ham,R.G.,J.Cell Bioi.,71,727-734,(1976))；(ii)细胞外基质的组分，包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维结合蛋白(Kleinman,H.K.等,Anal.Biochem.,166,1-13,(1987))和(iii)由在塑性表面上培养的细胞敷设的天然分泌的细胞外基质(Freshney,R.I.)。此外，闪烁基板可用诸如凝集素或粘着分子的试剂涂布以使得能够附着细胞膜或通常悬浮生长的细胞类型。先前已描述用于用所述试剂涂布塑性器皿的方法，参见例如Boldt,D.T.和Lyons,R.D.,J.Immunol.,123,808,(1979)。
合适的闪烁基体优选是透光的，以允许使用倒置相差显微镜观察培养的细胞，以及使得物质能够以最大效率传输在给定波长下的光。此外，即使在暴露于来自放射性同位素的入射β辐射之后以及在为使板灭菌所需的严格辐射条件下，基体也保留它的光学性质。
合适的闪烁基体可由含有闪烁体的任何透明材料，例如基于镧系金属化合物的闪烁玻璃组成。在某些形式中，基板由任何塑性材料组成，其中构成聚合物的单体单元通常包括苯基或萘基部分，以吸收来自与表面紧密邻近的放射性核素的入射辐射能量。一示例性塑性基板由向其中并入闪烁物质的聚苯乙烯或聚乙烯基甲苯组成。合适的闪烁物质可包括芳族烃，诸如对三联苯、对四联苯和它们的衍生物，以及噁唑和1,3,4-噁二唑的衍生物，诸如2-(4-叔丁基苯基)-5-(4-联苯基)-1,3,4-噁二唑和2,5-二苯基噁唑。也包括在聚合组合物中的可为波长转换剂，诸如1,4-双(5-苯基-2-噁唑基)苯、9,10-二苯基蒽、1,4-双(2-甲基苯乙烯基)-苯等。波长转换剂的功能在于吸收由闪烁物质发射的光，并且再发射更好匹配于闪烁计数器中使用的光敏感性检测器的波长更长的光。
具有适于本发明的闪烁基体的额外装置以及其制备和使用方法例如描述于美国专利号5,665,562和美国专利号5,989,854中，所述美国专利各自以引用的方式并入本文。
根据本发明，由附着或粘着于闪烁基体的细胞合成的放射性标记的生理性底物发射的放射性发射物足够靠近闪烁基体以导致发光，其可通过用于观察闪烁事件的检测手段来检测。在一些实施方案中，由细胞合成的放射性标记的生理性底物的衰变在水性介质中发射电子(例如具有多达2000μm(例如多达1800μm、1600μm、1400μm、1200μm、1000μm、800μm、600μm、400μm或200μm)的平均射程)，其足以导致可通过诸如β计数器的标准检测手段检测的闪烁事件。生长培养基中的未结合或游离放射性标记通常太远离于孔的闪烁基体的表面，辐射能量消散至水性环境中，并且放射性蜕变将保持未被检测器检测。因此，由闪烁基体产生的闪烁事件指示与附着或粘着于基体的细胞相关的放射性发射水平，其转而指示细胞内放射性标记的生理性底物的量。可在添加溶酶体酶之前测量与含有放射性标记的底物的细胞相关的基线放射性发射水平。
用于测量闪烁事件的装置和方法可涉及使用非侵袭性技术，即不损害细胞的完整性或活力的技术进行实时测量。各种β计数器，诸如Microbeta 2β计数器(由PerkinElmer制造)，可用于实施本发明。
底物清除测定
一旦一层细胞粘着或附着于闪烁基体，即可添加含有目标溶酶体酶的样品以进行底物清除测定。在一些实施方案中，合适的样品可含有纯化溶酶体酶。举例来说，合适的样品可为含有目标溶酶体酶的配制药物产品的样品。合适的样品也可含有部分纯化或未纯化的溶酶体酶。举例来说，由重组制造方法获得的含有从培养的细胞分泌的目标溶酶体酶的细胞培养基样品可直接用于本发明的清除测定中。或者，可使用产生目标溶酶体酶的重组细胞的溶解产物。在一些实施方案中，可使用由纯化方法获得的样品，例如像来自色谱法和/或过滤步骤的洗脱物或汇合洗脱物。在一些实施方案中，合适的样品可为直接取自患者的生物样品，包括但不限于血液样品、脑脊髓液(CSF)样品、尿样品和来自实体器官(例如脑、肝、肺、心脏、肾、皮肤或肌肉)的组织提取物。在一些实施方案中，可同时测定具有滴定量的酶的多个样品以产生剂量-响应曲线来有助于计算酶的相对效价。
通常，在允许溶酶体酶被内化，并且适当递送至溶酶体中的条件下孵育含有溶酶体酶的样品和细胞以便溶酶体酶可起降解积累的底物以从底物移除放射性同位素的作用。通常，标准细胞培养条件可用于这个目的。举例来说，可在37℃下在含有含湿气的95％空气/5％CO2氛围的孵育器中持续预定时期(例如约5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、60分钟、2小时、6小时、8小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时或更久)孵育细胞。
预期降解放射性标记的底物(例如35S标记的GAG)导致放射性同位素(例如35S)从底物裂解。因此，裂解的放射性同位素从细胞释放至生长培养基中。进一步预期生长培养基中的游离放射性标记的衰变太远离于闪烁基体以致不能产生信号(例如闪烁事件)，并且仅有细胞内剩余的未降解的放射性标记的底物的衰变将继续发射信号。因此，与细胞相关的放射性发射水平的降低指示溶酶体酶具有效价。与细胞内剩余底物相关的较低放射性信号指示较大量的内化活性酶(即较高效价)。
因为生长培养基中的游离放射性标记太远离于闪烁基体以致不能产生信号(例如闪烁事件)，所以本发明不涉及在测量剩余放射性发射信号之前的大量洗涤步骤。然而，在一些实施方案中，在测量剩余放射性发射信号的步骤之前进行洗涤步骤。
在一些实施方案中，本发明的清除研究可用于表征细胞摄取、细胞内溶酶体迁移和/或酶活性。举例来说，为表征细胞摄取(即内化)过程，可在候选摄取抑制剂存在下进行本发明的清除测定。在一些实施方案中，为确定细胞摄取(即内化)是否通过甘露糖-6-磷酸受体而发生，可在或不在连同样品一起添加M6P残余物至生长培养基中的情况下进行本文所述的清除测定。如果M6P残余物的存在使与细胞相关的放射性发射水平的降低减小，那么这指示细胞摄取过程依赖于甘露糖-6-磷酸受体。类似地，IGF-I、IGF-II、RAP或p97可作为候选抑制剂用于确定细胞摄取(即内化)是否分别通过这些肽靶向部分中的任一个而发生。在一些实施方案中，本发明的清除测定可用于表征通过其它受体而发生的细胞摄取，所述受体包括但不限于胰岛素受体或LDL受体。
高通量形式
在一些实施方案中，本发明的底物清除测定可在高通量平台上进行。高通量平台特别适用于以多个样品同时进行测定。在某些实施方案中，高通量测定可包括以下步骤：(a)向具有闪烁基体的多个孔中提供如本文所述的其中GAG积累的细胞以便所述细胞附着或粘着于所述闪烁基体，(b)向含有所述细胞的所述多个孔同时或依序提供多个含有目标溶酶体酶的样品，(c)进行如本文所述的底物清除测定，以及(d)同时或依序测量和收集来自所述多个孔中的各个的放射性发射信号以测定溶酶体酶的相对效价。在一些实施方案中，例如6、12、24、48、96、384或1536孔板的多孔板可用于高通量测定。在一些实施方案中，可使用96孔Cytostar T TM闪烁板(由PerkinElmer制造)。
数据分析和定量
在一些实施方案中，在添加酶至各孔中之前和之后，从含有已将放射性同位素并入新形成的底物(例如GAG)中的细胞的闪烁板收集闪烁数据。当酶由细胞内化时，它裂解放射性标记的GAG，其从细胞被释放。一般来说，相较于基线信号，在酶处理之后由闪烁检测器检测的放射性同位素信号降低指示有效力的酶被内化并递送至溶酶体酶。较低信号指示较大量的内化和功能性酶(例如较大效价)。
在一些实施方案中，可相较于对照来定量溶酶体酶的效价。如本文所用，相对于对照的定量效价也被称为相对效价。在一些实施方案中，合适的对照是指示目标溶酶体酶的预定效价的参照标准。可通过获取样品的效价与参照批次的效价的比率来测定相对效价。这可通过独立地测定参照批次的效价和样品的效价，接着获取比率，或通过使用等效性或f检验进行平行线分析来实现。可用的标准曲线拟合软件，诸如Graph Pad Prism、Excel-fit、Stegmann PLA、StatLIA等，可用于数据分析。在一些实施方案中，合适的对照是使用相同测定由含有已知量的目标溶酶体酶的对照样品获得的放射性发射水平。在一些实施方案中，合适的对照是通过以滴定量的酶操作相同测定所获得的剂量-响应曲线。在一些实施方案中，使用一种或多种以上对照的组合。
在一些实施方案中，使用多孔板以便可同时从一个或多个测试样品、一个或多个对照或标准样品和/或多个具有连续稀释的酶浓度的滴定样品收集闪烁数据(即放射性同位素信号)。用于数据分析的各种软件在本领域中是可用的，并且可用于分析数据，定量和计算相对效价。在一些实施方案中，多参数逻辑曲线拟合可用于分析数据。在一些实施方案中，曲线的可用于分析数据的合适的参数包括但不限于曲线的顶点、弯曲的底点、曲线的斜率、曲线的拐点、由曲线确定的EC 50或这些参数的组合。可使用任何2、3、4、5个或更多个合适的参数。举例来说，4参数逻辑曲线可适于各参照标准、对照和测试样品。进行基于来自所比较的各对曲线的斜率参数之间的差异的平行性等效性检验。如果通过平行性检验，那么受限模型(共有斜率以及上部和下部渐近线参数)适于两个曲线，从而允许计算相对效价。
生物测定的线性是测定获得在给定范围内正比于生物效价的测试结果的能力。为确定线性，可通过预先稀释参照标准至指定浓度来产生具有各种效价的“已知”样品。以这个方式，稀释线性用作效价的替代。将来自具有预期相对效价值的稀释线性样品的数据绘制在X轴上并将观察相对效价绘制在Y轴上，以及相对于线性回归来拟合数据提供对线性的估计。如实施例中所示，本发明的平台测定具有出乎意料宽泛范围的线性范围。在一些实施方案中，本发明的测定在约10-400％、20-350％、30-300％、40-250％、或50-200％相对效价的范围内是线性的。在其它实施方案中，本发明的测定在约40-240％相对效价的范围内是线性的。
在一些实施方案中，确定各样品中溶酶体酶的总量以使计算的效价标准化。
应用
本发明尤其提供一种用于样品表征和/或方法开发的简单和可靠的品质控制工具。举例来说，本发明可特别适用于在制造和/或纯化过程期间评估溶酶体酶或其它生物制剂的效价。在一些实施方案中，用于制造溶酶体酶的方法可包括通过使用本文所述的底物清除测定来测定溶酶体酶的效价所进行的品质控制步骤。举例来说，基于测定溶酶体酶的效价的所述品质控制步骤可在签发由制造方法获得的批次之前进行。本发明也可用于比较或评估通过方法开发过程获得的酶效价变化。可使用本文所述的底物清除测定在多个时间点多次测试由不同培养方法获得的两个或更多个样品。在这个情况下，由一种制造方法获得的样品可用作由不同方法获得的另一样品的对照。在一些实施方案中，基于根据本发明测定的酶效价，可调整一个或多个制造条件。
类似地，用于纯化溶酶体酶的方法可包括使用本文所述的底物清除测定来确定溶酶体酶的效价的步骤。举例来说，可在签发纯化批次之前进行这种步骤。本发明也可用于比较或评估通过纯化方法开发过程获得的酶效价变化。可使用本文所述的底物清除测定在多个时间点多次测试由不同纯化方法获得的两个或更多个样品。在这个情况下，由一种纯化方法获得的样品可用作由不同方法获得的另一样品的对照。在一些实施方案中，基于根据本发明确定的酶效价，可调整一个或多个纯化条件。
此外，本发明可用于表征溶酶体酶或其它治疗剂的效价和/或使所述效价标准化以达成产品核准、加标和/或包装。
此外，本发明也可用于出于诊断和疗法监测目的来评估直接从患者获得的生物样品中的酶效价。
实施例
实施例1–GAG底物清除测定
这个实施例说明用于标记细胞合成的生理性底物(例如GAG)的示例性方法、酶清除测定、以及用于根据本发明确定相对效价的数据分析。
标记细胞合成的GAG
在测定的第一周，解冻患者纤维母细胞(其中GAG积累的细胞类型)，接着使其生长直至细胞已扩增至预定细胞密度。接着，在第14天开始，用1mCi 35S–硫酸钠处理95％汇合的患者细胞48小时以便它们将放射性同位素并入新形成的GAG中。接着在25,000个细胞/孔下将细胞接种至96孔Cytostar T TM(PerkinElmer)闪烁板中。一旦附着于闪烁板，即用滴定量的酶同时对细胞给药。接着在37℃下以及在5％CO2下孵育它们。一旦酶被内化，它即裂解放射性标记的GAG，其从细胞被释放并被洗除。较低35S信号指示较大量的内化功能性酶。
数据分析
这个底物清除测定测量相对效价，其体现摄取、适当细胞内溶酶体迁移和酶活性。在一个96孔板上，对照、多个标准和多个样品可在连续稀释的酶浓度下操作(图2)。4参数逻辑曲线适于各参照标准、对照和测试样品。进行基于来自所比较的各对曲线的斜率参数之间的差异的平行性等效性检验，并且如果通过平行性检验，那么受限模型(共有斜率以及上部和下部渐近线参数)适于两个曲线，此允许计算相对效价(图3和4)。
线性
生物测定的线性是测定获得在给定范围内正比于生物效价的测试结果的能力。为确定线性，可通过预先稀释参照标准至指定浓度来产生具有各种效价的“已知”样品。以这个方式，稀释线性用作效价的替代。将来自具有预期相对效价值的稀释线性样品的数据绘制在X轴上并将观察相对效价绘制在Y轴上，以及相对于线性回归来拟合数据提供对线性的估计。如图5和6中以及表2中所见，这个测定在出乎意料宽泛的线性范围内显示准确度。从41％RP至243％RP的样品可彼此进行比较。
为确定测定的精确度，即尽管存在操作间和操作内偏差，但测定获得准确结果的能力，多个分析员进行稀释线性检验。根据各次操作考虑的因素包括进行测定的时日、分析员、细胞收集浓度和35S批次。计算各稀释线性水平下的％GCV，并且确定这个特定测定的中间精确度是10.3％。操作间差异取决于诸如进行测定的时日、分析员、细胞收集浓度和35S批次的因素，而操作内差异取决于诸如测试样品在板上的位置的影响和吸移连贯性的因素，对于所有稀释线性水平，>75％以及直至95％的差异归因于操作内因素。由41％RP至243％RP计算的％GCV确认这个方法跨越线性范围是精确的，从而支持41-243％RP的方法范围。
表2
预期RP(％) 观察RP(％) 准确度(％)
41 39 95
64 64 100
100 100 100
156 165 106
243 264 109
可重现性和特异性
表3中的数据显示在极小可变性下的可重现性，如可以低标准偏差所见。确定的测定对照在历经长久时期的多个实验中重现预期效价值。另外，当使确定的对照暴露于应激条件，诸如H2O2、低pH(例如4.0)或光暴露时，RP％降低。这证明测定是可重现的，并且能够指示酶历经延长时期具有稳定性。
表3
n 样品1RP(％) 样品2RP(％) 样品2应激RP(％)
1 98.7 82.0 39.5
2 103 84.0 41.8
3 107 86.1 41.8
4 114 87.7 46.2
平均值 106 84.9 42.2
标准偏差 6.5 2.48 2.82
甘露糖-6-磷酸依赖性细胞摄取
在用以确定内化(或细胞摄取)是否通过甘露糖-6-磷酸受体而特异性发生的这个特定实施例中，添加5mM甘露糖-6-磷酸(M6P)至生长培养基中，并且如上所述进行GAG清除测定。甘露糖-6-磷酸结合甘露糖-6-磷酸受体，从而阻断酶的结合以及随后内化和迁移至溶酶体中。如图7和8中所示，观察到在5mM甘露糖-6-磷酸存在下对硫酸酯酶依赖性GAG清除的完全抑制。
在用以显示受体特异性的另一实施例中，一定范围的可溶性M6P剂量用于与I2S竞争摄取。特异性测试显示使用50、5、0.5、0.05和0mM M6P达成的剂量依赖性摄取抑制(图9)。当高浓度的可溶性M6P占据M6P受体时，发生较少重组功能性I2S酶摄取，从而导致35S标记的GAG从细胞的清除较低，如根据高测定信号显而易知。在高M6P浓度下观察到对GAG清除的抑制确认I2S摄取主要由表面表达的M6P受体介导。
配制影响
为确定配制缓冲液是否影响35S标记的GAG的清除，将重组I2S混悬于三种不同配制缓冲液中，并且如上所述进行GAG清除测定。下表4中所示，测试的制剂都未显示对GAG的清除具有可测量影响。
表4
稳健性
为评估本发明的测定的稳健性，实验设计(DOE)研究被设计以考查因素变化对该方法的影响。这个研究包括以下三种不同因素的变化：细胞数目/孔、35S放射性标记孵育时间和剂量处理孵育时间。在研究中，评估最大信号/最小GAG清除。各次操作包括四个板，其测试测定对照和样品相对于测定阳性对照的覆盖该方法的线性范围的三个效价水平(41％RP、100％RP和243％RP)。确定几何平均值、95％CI、％GCV和％相对准确度。在稳健性评估内观察到的％GCV值与10.3％的观察精确度GCV一致。另外，平均％相对准确度在97.8-107％内，其与由稀释线性数据测量的％相对准确度一致。这些数据指示所有测试条件都显示对观察相对效价不具有影响，因此测定是稳健的和准确的。
因此，本发明的底物清除测定可用于有效表征细胞摄取过程。
尽管本文所述的某些化合物、组合物和方法已根据某些实施方案特定描述，但以下实施例仅用于说明本发明化合物而非意图限制本发明化合物。
除非明确相反指示，否则如本文在说明书中以及在权利要求中所用的冠词“一(a,an)”应被理解为包括复数个指示物。除非相反指示或另外根据上下文显而易知，否则如果一个、超过一个或所有群组成员存在于、用于给定产品或过程中或另外与给定产品或过程相关，那么在群组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被视为是符合的。本发明包括其中群组的恰好一个成员存在于、用于给定产品或过程中或另外与给定产品或过程相关的实施方案。本发明也包括其中超过一个或整个群组成员存在于、用于给定产品或过程中或另外与给定产品或过程相关的实施方案。此外，应了解除非另外指示或除非将为本领域普通技术人员显而易知将出现矛盾或不一致，否则本发明涵盖其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等被引入附属于同一基础权利要求(或当相关时任何其它权利要求)的另一权利要求中的所有变化形式、组合和排列。当要素呈现为清单(例如呈马库什(Markush)群组或类似形式)时，应了解也公开具有要素的各子群组，并且任何要素都可从群组移除。应了解，一般来说，当本发明或本发明的方面被提及为包含特定要素、特征等时，某些本发明的实施方案或本发明的方面由所述要素、特征等组成，或基本上由所述要素、特征等组成。出于简明的目的，那些实施方案尚未在每种情况下都在本文中一字不差地明确阐述。也应了解本发明的任何实施方案或方面都可从权利要求明确排除，无论是否在说明书中叙述特定排除。本文引用来描述发明背景以及提供关于它的实施的额外细节的出版物、网站和其它参考资料据此以引用的方式并入本文。

Claims (39)

1.一种非诊断治疗目的的测量溶酶体酶的效价的方法，其中所述溶酶体酶选自艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-艾杜糖醛酸酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、乙酰基-CoA N-乙酰基转移酶、α-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、和/或N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，其包括以下步骤：
使包含目标溶酶体酶的样品与含有所述溶酶体酶的用放射性同位素标记的底物的细胞接触，所述放射性同位素可由所述溶酶体酶在允许所述溶酶体酶从所述底物裂解所述放射性同位素的条件下裂解，其中使所述细胞附着于闪烁基体以便闪烁事件指示与所述细胞相关的放射性发射水平；
相较于在接触步骤之前的基线闪烁事件，通过检测闪烁事件来测量与所述细胞相关的放射性发射水平的变化；以及
相较于对照，基于与所述细胞相关的放射性发射水平的所述变化来确定所述溶酶体酶的所述效价。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞缺乏目标内源性溶酶体酶。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是由罹患溶酶体贮积疾病的患者获得的纤维母细胞，其中所述溶酶体贮积疾病与缺乏所述目标溶酶体酶相关。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体酶的用所述放射性同位素标记的所述底物是由所述细胞在所述放射性同位素存在下合成。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：
使细胞生长至所需汇合度；
用所述放射性同位素处理所述细胞以便所述放射性同位素并入所述溶酶体酶的新合成的底物中；以及
将所述细胞接种至具有所述闪烁基体的孔中以便所述细胞附着于所述闪烁基体。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述底物是糖胺聚糖(GAG)。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述放射性同位素是35S。
8.如权利要求7所述的方法，其中通过用35S-硫酸钠处理所述细胞来标记所述底物。
9.如权利要求1所述的方法，其中允许所述溶酶体酶从所述底物裂解所述放射性同位素的所述条件包括在37℃下在含5％CO2的氛围下孵育所述细胞和包含所述溶酶体酶的所述样品。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括在测量步骤之前洗涤所述细胞的步骤。
11.如权利要求1所述的方法，其中通过β计数器来检测所述闪烁事件。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述对照是指示所述目标溶酶体酶的预定效价和/或剂量-响应曲线的参照标准。
13.如权利要求1所述的方法，其中确定所述溶酶体酶的所述效价的步骤包括使用受限模型计算相对效价。
14.如权利要求1所述的方法，其中确定所述溶酶体酶的所述效价的所述步骤是定量的。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述样品中的所述目标溶酶体酶的总量的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述目标溶酶体酶的比活性。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述方法不涉及所述细胞的胰蛋白酶消化。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述方法不涉及所述细胞的溶解。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤是在甘露糖-6-磷酸(M6P)存在下进行，并且其中所述方法进一步包括将底物清除或效价与在无M6P下测量的对照进行比较以确定细胞摄取是否具有M6P依赖性的步骤。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述方法是以高通量形式执行，其中多个样品被同时测量。
21.如权利要求20所述的方法，其中使用多孔板，并且其中各个孔的基体是所述闪烁基体。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述多孔板是6、12、24、48、96、384或1536孔板。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体酶是乙酰肝素N-硫酸酯酶。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是含有重组产生的所述目标溶酶体酶的细胞培养物样品。
26.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是由纯化方法获得的含有纯化的目标溶酶体酶的洗脱物。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是由纯化方法获得的含有纯化的目标溶酶体酶的汇合洗脱物。
28.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是由纯化方法获得的含有部分纯化的目标溶酶体酶的洗脱物。
29.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是由纯化方法获得的含有部分纯化的目标溶酶体酶的汇合洗脱物。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是含有所述目标溶酶体酶的配制药物产品。
31.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是从患者获得的组织样品。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述组织样品是血液样品、CSF样品和/或来自实体器官的活检体样品。
33.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是尿样品。
34.一种用于制造目标溶酶体酶的方法，其包括根据权利要求1至33中任一项所述的方法确定所述溶酶体酶的效价的步骤。
35.如权利要求34所述的方法，其中确定所述溶酶体酶的所述效价的步骤是在签发批次之前进行。
36.如权利要求34或35所述的方法，其进一步包括基于确定的所述溶酶体酶的效价来调整制造条件的步骤。
37.一种用于纯化目标溶酶体酶的方法，其包括根据权利要求1至30中任一项所述的方法确定所述溶酶体酶的效价的步骤。
38.如权利要求37所述的方法，其中确定所述溶酶体酶的所述效价的步骤是在签发纯化批次之前进行。
39.如权利要求37或38所述的方法，其进一步包括基于确定的所述溶酶体酶的效价来调整纯化条件的步骤。
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