JP2017508148A - 組織の放射線感受性を判定するための予測的方法 - Google Patents

組織の放射線感受性を判定するための予測的方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2017508148A
JP2017508148A JP2016552289A JP2016552289A JP2017508148A JP 2017508148 A JP2017508148 A JP 2017508148A JP 2016552289 A JP2016552289 A JP 2016552289A JP 2016552289 A JP2016552289 A JP 2016552289A JP 2017508148 A JP2017508148 A JP 2017508148A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ph2ax
hours
cells
minutes
tdntbe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2016552289A
Other languages
English (en)
Inventor
ニコラス フォレイ
ニコラス フォレイ
アドリーヌ グランゾット
アドリーヌ グランゾット
クレマン デビック
クレマン デビック
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Original Assignee
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR1451216A external-priority patent/FR3017625B1/fr
Priority claimed from FR1451215A external-priority patent/FR3017624B1/fr
Application filed by Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL filed Critical Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
Publication of JP2017508148A publication Critical patent/JP2017508148A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6881—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from skin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

患者の非照射部位またはわずかに照射を受けた部位からサンプリングされた細胞から、患者の有する電離放射線に対する細胞放射線感受性を予測するための方法であって、(i)サンプリングされた細胞は増幅され、この増幅された細胞が前記「細胞サンプル」を構成し、(ii)細胞サンプルについて、マーカーｐＨ２ＡＸを使用して、０分（ｔ０、非照射状態）および吸収線量Ｄでの照射後の観察時間ｔ４である観察時間ｔにおいて得られた核病巣の平均個数を判定し（この平均個数をＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）とする）、（ｉｉｉ）グレイ（Ｇｙ）で表される、超過すべきでない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）が、少なくともパラメータＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）を使用して判定され、ｔ４は、ＤＮＡ切断の比率がその残留値に到達するまでの所要時間を表す固定値である。

Description

本発明は、医療用放射線生物学の分野に関し、より具体的には、放射線生物学的臨床検査方法の分野に関する。本発明は、複数のパラメータと細胞的酵素的基準の判定および相関に基づいて、細胞的、組織的、且つ臨床的な放射線感受性を予測するための新規な方法に関する。
放射線治療を受けるがん患者の約１〜１５％には、組織反応（例えば、皮膚炎または直腸炎）が現われる。この組織応答は、治療に影響を及ぼし得、計画されたプロトコルが終了する前に、医師が放射線治療の中止を決定してしまうこともある。また、上記の組織反応は、患者が電離放射線に対して特に高い感受性をもつことの指標でもある。さらに、放射線治療は、目に見える最初の組織兆候が現われたときに中断したとしても、治療後の合併症の罹患率だけでなく、患者の死亡率さえも上昇させ得る。この原因は、治療を早期に中止したために治療対象のがんを完全に根絶することができなかったことに加え、放射線自体によって健康な組織に付帯的な損傷が誘発されることである。
電離放射線に対する組織の感受性の問題が、ＤＮＡ損傷の修復メカニズムの問題と切り離すことができないことも知られている。実際、細胞レベルでは、電離放射線はフリーラジカルを発生することにより（特に、過剰酸化により）およびＤＮＡ損傷に起因するその他の反応種を発生することにより、複数種の化学結合を切断し得る。内因性または外因性ストレス（例えば、電離放射線およびフリーラジカル）が引き起こすＤＮＡの損傷は、特に印加されたエネルギーに応じて、塩基の損傷、一本鎖切断、および二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢ）といった、さまざまな種類のＤＮＡ損傷につながり得る。未修復のＤＳＢは、細胞の死滅、毒性、および、より具体的には放射線感受性に関係する。不十分に修復されたＤＳＢは、ゲノム不安定性、変異促進性現象、およびがん素因に関係する。生体は、ＤＮＡ損傷の種類ごとに特定の修復システムを備えている。ほ乳類は、２つの主要なＤＳＢ修復様式、すなわち、縫合（ｓｕｔｕｒｅ）による修復（鎖の結紮）と、組替えによる修復（相同鎖または非相同鎖の挿入）とを備える。
電離放射線に対する組織の感受性は、器官ごとに大きく変化し、また、個人差も大きいことが知られている。１９８１年に、FertilおよびMalaiseにより、「固有放射線感受性」の概念化された。したがって、放射線治療の治療効果と副作用についての各種の研究により、放射線抵抗性が特に高い個人と、これとは対照的に、臨床的に認識できるが重大ではない副作用から、致命的な副作用までの放射線感受性をもつ個人とが存在することが分かっている。その遺伝的起源が認識されたと思われる、極端な放射線感受性をもつ特定のまれな例を除いても、放射線感受性は概して遺伝的素因に由来し、したがって、個人に特有のものであると考えられている。このため、任意の患者がリスクを伴わずに受けることができる最大蓄積線量を判定できるように、予測的検査方法があることが望ましい。この問題は、主に高電離線量の放射線治療において起こるものである。しかし、放射線治療に使用されるものと同様に、これ以外の強電離線量のあらゆる種類の被ばくについても、問題となりやすい。
一般にＡＴＭおよびＡＴＲとして呼ばれる、キナーゼのファミリーのうちの２つのタンパク質が、ＤＳＢの検出、修復、およびシグナリングに関係していることが知られている。これらの作用には、少なくとも、ＢＲＣＡ１という呼称で知られるタンパク質の存在と、種々のＡＴＭ基質の順序づけられたリン酸化のカスケード（cascade de phosphorylations ordonnee)の存在が必要である(N. Foray他、“A subset of ATM-and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA 1 protein”、TheEMBOJournal、2003年、vol. 22(11), p.2860-2871を参照）。細胞の放射線感受性の説明モデルにＡＴＭ酵素を使用する試みが行われ（Joubert他、“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity?”、lnt.J.Radiat.Biol.2008年、vol. 84(2)、p. 107-125を参照）、これにより、３種類の放射線感受性の識別が可能になった。すなわち、放射線抵抗性を有する細胞（グループI放射線感受性）、中等度の放射線感受性を有する細胞（グループII放射線感受性）、および、極端に放射線感受性が高い細胞（グループIII放射線感受性）の３種類である。しかし、これに基づく予測モデルは提案されていない。特に、臨床データ（組織重症度）と放射線生物学的データとの間の関係は確立されていない。同様に、“Rencontres Nucleaire & Sante” (2008年1月25日 (XP55131242)におけるN. Forayの発表“Les reparatoses: nouveaux concepts sur la prediction de la radiosensibilite”, delivered during “Rencontres Nucleaire & Sante”では、放射線起因の二本鎖切断の数を説明するために、異なるマーカーｐＨ２ＡＸおよびＭＲＥ１１の役割とその経時的変化が示唆されている。この発表では、臨床レベルで観察される放射線感受性レベルを定量化および識別する組織重症度については言及されていない。
ＡＴＭがＤＮＡ損傷の検出と修復に寄与可能となる条件については、多くの文献に記載されている。国際公開第２００４／０１３６３４号（KUDOS Pharmaceuticals Ltd）には、ＭＲＥ１１／Ｒａｄ５１／ＮＢＳ１複合体を含む他の応答因子と相互作用する、ＡＴＭ依存性ＤＮＡ損傷のシグナル伝達経路の識別が記載されている。米国特許出願公開第２００７／００７２２１０号明細書（OuchiおよびAglipay）には、ＤＮＡ損傷への応答を促進する有力な治療剤をスクリーニングする方法が提案されている。この方法では、ＢＡＡＴ１として知られるタンパク質（ＢＲＣＡ１遺伝子と関連するがん素因に関係する）と、ＡＴＭタンパク質と、候補化合物とが混合され、候補化合物を含まない対照混合物に対して、ＡＴＭのリン酸化が増大すれば、後者がＤＮＡ修復を促進する潜在的な有効成分として識別される。欧州特許出願公開第２４６６３１０号明細書（Helmholtz Zentrum Muenchen）には、Ｈ２ＡＸヒストンのリン酸化型（ｇａｍｍａ−Ｈ２ＡＸまたはｇ−Ｈ２ＡＸと呼ばれる）存在下での、ＤＮＡの二本鎖切断の修復が記載されている。国際公開第００／４７７６０号および米国特許第７２７９２９０号明細書（St. Jude’s Children’s Research Hospital）には、ＤＮＡ修復における、ＡＴＭのキナーゼ官能基の役割について記載されている。
したがって、これらの文献には修復経路についての記載はあるものの、臨床的関連を確証する相関については何らの提示もない。
欧州特許第１６１６０１１号明細書（International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology）には、ＤＮＡ修復における遺伝的欠陥を診断する方法が開示されている。この方法は、検査対象のサンプルから分離した細胞の培養、キメラポリペプチドを使用しての上記細胞のインキュベーション、および細胞応答の特性判定の、３つの工程に基づく。この細胞応答は、細胞内タンパク質、具体的には、ｐ５３、ＡＴＭ，Ｃｈｋ１，Ｃｈｋ２，ＢＲＣＡ１，ＢＲＣＡ２，Ｎｂｓ１，ＭＲＥ１１，Ｒａｄ５０，Ｒａｄ５１タイプおよびヒストンからなる生化学的マーカーの発現率である。しかし、放射線起因の発現では、上記タンパク質の官能性を予測することはできない（ある種の症候群は、タンパク質が変異していても、正常な発現率を示す）。これらの手順は、機能的な検査とは言えない。
国際公開第０１／９０４０８号、国際公開第２００４／０５９００４号、および国際公開２００６／１３６６８６号（French Atomic Energy Commission）には、電離性放射線照の結果生じるＤＮＡ損傷の観察方法が記載されている。最初の文献は、ＤＮＡ損傷切開活性を開示しているが、ＤＮＡの除去と再合成の酵素活性の定量化や、ＤＳＢ修復の定量化を可能にするものではない。その他の２つの文献には、超らせん状円形二本鎖ＤＮＡを使用した、生物培地のＤＮＡの修復性能についての定量的評価の記載がある（３番目の文献によれば、多孔性ポリアクリルアミドヒドロゲル膜における固定）。これらの方法は、生理学的環境における生体内原位置の（ｉｎ ｓｉｔｕ）ＤＳＢには直接関連せず、これらの方法の臨床的適用を評価するための相関は存在しない。
韓国公開特許第２００３００３３５１９号公報には、触媒活性またはスーパーオキシドジスムターゼの活性から放射線感受性を推定することが提案されており、韓国公開特許第２００３００３３５１８号公報では、グルタチオンペルオキシダーゼまたはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼが使用されている。このような方法は、ＤＮＡの損傷または修復に直接関連したマーカーを検出するものではない。
米国特許出願公開第２０１１／３１２５１４号明細書（Dana Farber Cancer Institute）には、ＦＡＮＣＤ２病巣の検出をマーカーとして利用することが提案されている。米国特許出願公開第２００７／０２６４６４８号明細書（National Institute of Radiological Sciences）には、ＤＮＡオリゴマーを利用して、放射線治療中の副作用の出現を予測することが提案されている。しかし、ＦＡＮＣＤ２病巣のレベルが正常なときにも、ある種の放射線感受性が観察され得る。
米国特許出願公開第２００８／２３４９４６号明細書および米国特許出願公開第２０１２／０４１９０８号明細書（University of South Florida他）は、健康な細胞ではなく、がん細胞の放射線感受性を予測する方法が記載されているが、これはゲノムデータに基づくものであり、機能試験に基づくものではない。
国際公開第２０１４／１５４８５４号（Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier）には、対象の放射線感受性を、少なくとも１種の放射線感受性バイオマーカーを使用して予測する方法が記載されている。この方法は、ＤＮＡの損傷または修復に直接関連したマーカーを検出するものではなく、また、プロテオミクスデータに基づくものである。さらに、この特許出願は、放射線生物学的データと組織反応との重症性の定量的関係については説明していない。
国際公開第２０１３／１８７９７３号（University of California）には、細胞の放射線感受性および／または対象の放射線感受性を、対照群に比して判定するためのシステムと方法とが記載されている。より具体的には、この方法は、生物学的サンプルへの照射と、赤血球内、リンパ球内、および一次細胞内の放射線起因病巣の検出および定量化とを含む。これらは、抗ｐＨ２ＡＸ、抗ＭＲＥ１１、および抗ＡＴＭを含む一組のマーカーから選択される１種以上の検出マーカーを使用して、血液サンプルから得られる結果である。照射後の各観察時間（２時間以内）における放射線起因病巣の定量化により、その修復動態の判定ができ、これが実験的に対象の放射線感受性と相関される。しかし、リンパ球内の病巣の分析は、その核が小さいために、非常に困難である。さらに、上記の方法では、医師は患者の治療について決断をすることができない。
米国特許第８２６９１６３号明細書（New York University School of Medicine）には、トリアージによって患者に適切な緊急治療を受けさせることを目的として、人を対象とした電離放射線への偶発的暴露の重大性を簡単且つ迅速に評価する際にマーカーとして使用可能な多数のタンパク質が記載されている。この特許は、生物学的線量測定（偶発的線量の判定）に関し、一方、放射線感受性は、分かっている線量を使用して検出される。
国際公開第２０１０／８８６５０号（University of Texas）には、特定の放射線治療に対して感受性または耐性を有するがん細胞を識別するための方法および組成物が記載されている。したがって、この文献は、すべての放射線治療に適用可能ではない。
国際公開第２０１０／１３６９４２号（Philips）には、バイオマーカーを使用して、放射線治療中に患者をモニタリングするための包括的方法が記載されている。この方法は、撮像装置から抽出された画像から少なくとも１つのディスクリプタを得る工程を含む。このディスクリプタは、放射線治療の関心組織か、この目標部位の近傍の組織に属するものである。この方法は、さらに、関心組織領域における放射線治療の副作用の検出または定量化が可能な、疾病に特有の生物学的マーカーを少なくとも１種選択する工程を含む。この方法は、さらに、選択した疾病に特有のバイオマーカーのインビトロでの測定値を少なくとも１つ回収する工程を含む。さらには、上記少なくとも１種のバイオマーカーのインビトロ測定値の少なくとも１つのディスクリプタを、相関技術により処理する工程を含み、関心組織領域における放射能毒性を示すシグナルが出力される。しかし、この特許の教示は、組織依存の毒性を考慮するのみであって、個人の毒性については考慮しないものであり、主に画像解析に基づいている。
国際公開第２０１０／１０９３５７号には、正常な組織における合併症の確率と、各患者に特有のマーカーに従った腫瘍制御の確率との最適化に基づいて、適用性のある放射線治療プロトコルを計画するための方法および装置が記載されている。正常な組織に関連するマーカーの値は、インビトロ検査値と、タンパク質の質量分析シグネチャーと、患者の履歴データとを含む。インビトロ検査値は、細胞的、プロテオミクス的、および遺伝的起源のものであってもよく、種々の細胞計数、ＨＢ、ＣＲＰ、ＰＳＡ、ＴＮＦ−アルファ、フェリチン、トランスフェリン、ＬＤＨ、ＩＬ−６、へプシジン、クレアチニン、グルコース、ＨｂＡｌｃ、およびテロメアの長さなどであるが、これに限定されない。患者の履歴マーカーは、これまでの腹部手術、ホルモン薬剤または抗凝固剤の投与、糖尿病、年齢、および腫瘍増殖に関連する測定値を含む。各種の切除または化学療法薬剤に関連するバイオマーカーなどの、放射線毒性に関連しないバイオマーカーも想定される。しかし、個人の放射線感受性は考慮されていない。
出願人は、このような多彩な従来技術が存在するにもかかわらず、上記の特許には、放射線治療後の組織反応のリスクの評価を可能にし、且つ、どんな患者にも、また、ＤＳＢを誘発可能ないかなる種類の電離放射線にも使用され得る、予測可能な、個人の放射線感受性の定量化の方法が記載されていないことに注目した。すなわち、個人の放射線感受性を予測する方法を提供するという課題には、実効的な解決手段がまだない。本発明は、組織的および臨床的放射線感受性を予測する新規な方法を提供することを目的とする。
発明者らは以下の知見を得、本発明の方法はこの知見から考案された。すなわち、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）は、それが修復されないときには、放射線感受性を最もよく予測する放射線起因の損傷の種類を表し、修復が不十分なときには、ゲノム不安定性を最もよく予測する放射線起因損傷の種類を表す、という知見である。発明者らは、ＤＳＢは、結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）と呼ばれる主要な修復様式により、および／または、ＭＲＥ１１依存性組替えと呼ばれる非主要で不完全な修復様式により対処されることを発見した。これら修復様式は、ＡＴＭタンパク質により制御される。マーカーｐＨ２ＡＸは、結合修復様式により認識されたＤＳＢを示す。マーカーＭＲＥ１１は、不完全なＭＲＥ１１依存性組替えにより処置されたＤＳＢ部位を示す。マーカーｐＡＴＭは、Ｈ２ＡＸのリン酸化とＭＲＥ１１依存性経路の阻害とによる結合経路の活性化についての情報を提供する。
発明者らは、また、ＡＴＭタンパク質の細胞質型が、酸化的ストレス、特に、ＤＳＢを誘発する電離放射線に関係するストレスの後に、細胞核内に移動することを観察した。
外因性ストレスによるＤＮＡ損傷を観察するためには、ＤＮＡの自然な状態と放射線起因の状態との両方を考慮する必要がある。さらに、放射線照射後には、ＤＮＡ修復を考慮する必要があるが、このＤＮＡ修復の動態は、修復メカニズムに依存するため、放射線起因損傷の種類に依存する。さらには、ＤＮＡ修復の有効性とスピードには個人差があること、また、例外的な放射線感受性につながる特定の遺伝的条件が存在することも知られている。
本発明によれば、上記の問題は、１）非形質転換細胞、特に、皮膚生検材料の細胞の増幅と、２）ヒトの休止期細胞に有効な機構モデルと、３）治療方法の如何に関わらず有効な、ＤＳＢの認識、修復、およびシグナリングの機能検査とに基づく方法により解決される。
本発明の第１の主題は、患者の非照射部位またはわずかに照射を受けた部位からサンプリングされた細胞から得られた細胞サンプルの有する、電離放射線に対する細胞放射線感受性を予測するための方法である。この方法においては、
(i) サンプリングされた上記細胞は増幅され、当該増幅された細胞が上記「細胞サンプル」を構成し、
(ii) 上記細胞サンプルについて、マーカーｐＨ２ＡＸを使用して、得られた核病巣の平均個数を観察時間ｔにおいて判定し(この平均個数をＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）とする)、上記観察時間ｔが０分（ｔ０、非照射状態）と、吸収線量Ｄでの照射後のｔ４（および好ましくはｔ１、ｔ２、およびｔ３）とであり、
（ｉｉｉ） グレイ（Ｇｙ）で表される、超過すべきでない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）が、少なくともパラメータＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）を使用して判定され、
（ｉｖ） 上記細胞サンプルに関し、マーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭ、およびＭＲＥ１１のうちの少なくとも２種を使用して、核病巣の平均個数を観察時間ｔにおいて判定し、これらの平均個数をそれぞれ、ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、ＮＭＲＥ１１（ｔ）とし、上記観察時間ｔは、０分すなわち非照射状態をあらわすｔ０と、吸収線量Ｄでの照射後の観察時間ｔ１とｔ２とｔ３とｔ４から選択される少なくとも１つであり、
（ｖ） 上記サンプルの放射線感受性グループが、少なくとも上記平均個数ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、およびＮＭＲＥ１１（ｔ）を使用して判定され、
上記ｔ４は、ＤＮＡ切断のレベルがその残留値に到達するまでの所要時間を表す固定値であり、好適には、ｔ３の６倍〜８倍となるよう、但し、１２時間以上、好ましくは１２時間〜４８時間、より好ましくは約２４時間となるよう選択され、
上記ｔ３は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞のＤＳＢの約２５％が修復される時間を表す固定値であり、好適には、ｔ２の３倍〜５倍となるよう、ただし、２．５時間以上６時間以下、好ましくは３時間〜５時間、より好ましくは約４時間となるよう選択され、
上記ｔ２は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した上記対照細胞のＤＳＢの約５０％が修復される時間を表す固定値であり、好適には、ｔ１の５倍〜７倍となるよう、ただし、３５分以上９０分以下、好ましくは４５分〜７５分、より好ましくは約６０分となるよう選択され、
ｔ１は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した上記対照細胞内で、認識されたＤＳＢの数が最大値に達する時間を表す固定値であり、好適には、照射の停止から５分〜１５分、好ましくは７．５分〜１２．５分、より好ましくは約１０分となるよう選択される。
好適な実施形態では、マーカーｐＨ２ＡＸを使用して観察時間ｔ１、ｔ２、およびｔ３において得られた核病巣の平均個数が、ＤＳＢ動態認識の形状および修復曲線を検証するために使用される。
グレイ（Ｇｙ）で表される、超過すべきでない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）は、放射線治療医にとって重要なパラメータであり、これによって、任意の患者が潜在的な致命的反応を起こさずに吸収できる最大線量を予測できる。このパラメータによって、放射線感受性が特に高い患者に対する放射線治療を排除することもできる。
ＴＤＮＴＢＥは、理想的には、皮膚等価物として表される。試験は皮膚線維芽細胞について行われるので、ＴＤＮＴＢＥを他の組織に直接的に定量的外挿することはできない。そのため、予測は、実質的には、皮膚または生物学的に等価な組織（例えば、肺線維芽細胞）の放射線起因応答に関連する。しかし、内皮や星状細胞や上皮等の他の組織への外挿が、質的に行われてもよい。とはいえ、各組織に特有の是正的要因のより正確な定義が待たれる。
本発明によれば、ＴＤＮＴＢＥを、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）］により、または、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＋ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）］により判定可能である。
本発明の方法の変形例では、上記細胞サンプルに関し、時間ｔにおいて細胞１００個について観察された核病巣の平均個数（％で表す）も判定され（この平均個数をＮＭＮ（ｔ）をとする）、時間ｔは少なくとも、ｔ０（非照射）および吸収線量Ｄでの照射後のｔ４であり、パラメータＮＭＮ（ｔ４）が、上記ＴＤＮＴＢＥを判定するために使用される。しかし、実験に基づく小核測定の統計的不確実性は、免疫蛍光検査で観察される核病巣の個数の統計的不確実性よりも高いため、病巣測定の予測的数値は、小核の予測的数値よりも好ましいといえるであろう。
したがって、例えば、次式により、ＮＭＮ（ｔ）に基づいてＴＤＮＴＢＥを判定することができる。
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［０．４×ＮＭＮ（ｔ４）］、または
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［２＋（０．４×ＮＭＮ（ｔ４））］
本発明の方法の変形例の一方または他方を使用すると、小数が得られる。上記式の一方または他方の使用後に得られる、最終のＴＤＮＴＢＥの値は、計算で得られた値を算術的に丸めたものに相当する整数である。本発明により判定されたＴＤＮＴＢＥは、この整数に相当する。
本発明の方法の変形例の１つによれば、好適には、タイプII放射線感受性グループ（中程度の放射線感受性）に属する患者については、正確なＴＤＮＴＢＥを患者に割り当てることを目的に、患者の放射線感受性グループが、上記ＴＤＮＴＢＥよりも前に判定される。
サンプルの放射線感受性は、上記の式によって、以下の方法で判定される。
（ａ） ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＜２、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つ、Ａ＜１０、且つ、Ｂ＜５、且つ、Ｃ＜２であり、但し、
Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のｔ０におけるパーセンテージ；
Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣数
であるとき、サンプルは放射線抵抗性を有すると見なされ、
（ｂ） （ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）であるとき、サンプルは高い放射線感受性を有すると見なされ、
（ｃ） その他のすべての条件の場合は、サンプルは中等度の放射線感受性を有すると見なされる。
一部の患者については、がんに罹患しやすい患者に一般的に見られる高頻度組替え現象が原因となって、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）が連続的に自然発生することにより、ＤＮＡの修復が阻害され得る。ＤＳＢの自発的な過剰生産は、矛盾しない２つの影響をもち得る。すなわち、自然状態において、ｐＨ２ＡＸによる標識により、通常見られるｐＨ２ＡＸ病巣よりも小さい核病巣が出現し得るが、これらは多数のＤＳＢの存在を反映する（「小巣」現象）。同様に、ＳＳＢの過剰生産はクロマチンの脱凝縮につながることがあり、これにより、細胞核が大きくなる（概して、１５０μｍ２を超える大きさ；「大核」現象に相当）。これらの２つの現象は、ゲノム不安定性が高いことを反映している。
次いで、放射線感受性グループIIの患者について、上記２つの変形例を介して、ＴＤＮＴＢＥが判定される。具体的には、次式の通りである。
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）］により、または、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＋ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）］により判定される。
あるいは、第２の変形例によれば、数式：ＴＤＮＴＢＥをＮＭＮ（ｔ）に基づいて、次式により判定できる。
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［０．４×ＮＭＮ（ｔ４）］により、または、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［２＋（０．４×ＮＭＮ（ｔ４））］により判定できる。
本発明の方法の変形例の一方または他方を使用すると、小数が得られる。上記式の一方または他方を使用後に得られる、最終のＴＤＮＴＢＥの値は、計算で得られた値を算術的に丸めたものに相当する整数である。本発明により判定されたＴＤＮＴＢＥは、この整数に相当する。
本発明の方法は、好ましくは線維芽細胞である健康な組織サンプルを少なくとも１つ使用する。この線維芽細胞は、好ましくは、患者の結合組織からサンプリングされる。このサンプリングは、生検により行ってもよい。したがって、好適な実施形態においては、上記のサンプリングされた細胞は、患者の皮膚生検材料から採取された線維芽細胞である（典型的には、「皮膚パンチ生検」として知られる方法に従ってサンプリングされる）。この組織サンプルを、適切な培地で培養する。
細胞のサンプリング（具体的には、好ましい実施形態では、線維芽細胞株の生検の確立を介する）の後に行われる本発明の方法の第１の工程では、ＤＮＡの自然状態（ｔ０における状態）、言い換えれば、照射を受けない状態の特徴を特定する。この工程は、特に、核の大きさ、小核の存在、自発的アポトーシス体および複数の損傷を有する複数の細胞についての調査を含んでいてもよい。細胞は、蛍光顕微鏡で観察される。ＤＡＰＩ染料（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩についてはＣＡＳ Ｎｏ． ２８７１８−９０−３）を使用すると、ゲノム不安定性の指標である、細胞１００個についての小核のレベルが判定される。アポトーシス体も判定される。その存在がクロマチンの脱凝縮を示す、異常に大きい核の集団も判定される。
電離放射線は、吸収線量（Ｄと呼称され、グレイで表されるパラメータ）により定義される。本発明によれば、吸収線量Ｄは、０．５Ｇｙ〜４Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、より好ましくは１．７Ｇｙ〜２．３Ｇｙ、さらに好ましくは２Ｇｙである。これらの範囲は、典型的には、個別の放射線治療セッション、部位に応じたセッションの回数、および、腫瘍の進行のタイプと状態に対応する。
本発明の方法においては、すべての時間値ｔ１、ｔ２、ｔ３、およびｔ４を、一連の検査の開始時に（つまり、少なくとも１人の任意の患者につき、好ましくは、この方法を統計的に意義のある一群の観察に対して較正するためには、複数の患者につき）定義すること、および、これら時間値が上記時間間隔を表す全パラメータの判定すべてについて同じであることが重要である。
本発明の方法では、ｔ１は、好適には８分〜１２分であり、および／または、ｔ２は、好適には５０分〜７０分であり、および／または、ｔ３は、好適には３．５時間〜４．５時間であり、および／または、ｔ４は、好適には２２時間〜２６時間である。４つの条件すべてが満足されるのが好ましい。
本発明の方法における、特に有利で、また、標準化が簡単な変形例では、ｔ１が１０分、ｔ２が６０分、ｔ３が４時間、ｔ４が２４時間であり、Ｄが２Ｇｙである。
好適には、ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）の判定には、免疫蛍光試験を伴う。
放射線抵抗性を有する患者からの対照細胞が、臨床的検査を通じて、放射線治療中または治療後に重大な組織反応を示さなかった患者として選択された患者からの細胞として選択され得る。上記対照細胞は、また、吸収線量２Ｇｙでの照射の後に示すインビトロのクローン原性生存率が、５５％よりも高い細胞として選択されてもよい。
以下、典型的な実施形態について説明する。
細胞は、マーカーｐＨ２ＡＸを使用して、観察する。マーカーｐＡＴＭおよび／またはＭＲＥ１１を使用した、観察時間ｔにおける観察（これらの平均個数を、それぞれ、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、ＮＭＲＥ１１（ｔ）と呼ぶ）と、吸収線量Ｄでの照射後のｔ１、ｔ２、ｔ３およびｔ４から選択される少なくとも１つの観察時間における観察とを、追加することもできる。ある実施形態では、マーカーｐＨ２ＡＸと、複数溶解細胞の存在とによって、病巣の個数が判定される。ｐＡＴＭタンパク質の位置とＭＲＥ１１タンパク質の位置（核内（ｎｕｃｌｅａｒ）または細胞質内（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ））が記録される。
この第１の工程により、自然状態における潜在的なゲノム不安定性が識別できる。
本発明の方法の第２の工程は、所望の吸収線量Ｄ（例えば２Ｇｙ）での放射線照射と、電離放射線に対する細胞応答の評価とを含む。
ａ） 第１の実施形態では、放射線起因ＤＳＢの結合（ｊｏｉｎｉｎｇ，）による修復を調べる。結合は、ＤＳＢの主要な修復様式である。細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ病巣の個数がｔ４において判定され、さらに、必要に応じてｔ１、ｔ２において、場合によってはｔ３においても判定される。ｔ３での判定により、ｔ１からｔ４までの動態速度の定義を強固にできる。好適な実施形態においては、ｔ４の後、放射線起因の小核のレベルを推定するために、小核のレベルの判定も行う。これにより、未修復ＤＳＢの優位性に基づいた放射線感受性の推定ができる。
ｂ） 第２の実施形態では、ＡＴＭ依存性のキナーゼ活性化の機能性の測定を通して、電離放射線に対する細胞応答についてより詳細な調査が行われる。放射線抵抗性の対照細胞においては、ＡＴＭタンパク質のリン酸化型（ｐＡＴＭ）は、自然状態では、細胞質内にある（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）ことが知られている。出願人は、照射後状態では、ＡＴＭタンパク質のリン酸化型が、核内にある（ｎｕｃｌｅａｒ）傾向があることを発見した。一旦、核に移動すると、ｐＡＴＭ型は、結合による修復メカニズムを活性化し、不完全なＭＲＥ１１依存性修復の経路を阻害する。
一例として、放射線照射（例えば、吸収線量２Ｇｙ）の後、ｐＡＴＭ型が細胞質局在性を示す場合には、ｐＡＴＭ型は細胞質から核に移行しない、または、正常に移行できないと結論づけることができる。この理由としては、ＡＴＭの変異、または、放射線照射後にＡＴＭが核に移行するのを補助するＡＴＭのパートナータンパク質いずれかの変異が考えられる。いずれにせよ、このことは、相当高い放射線感受性を示すものである。
このｐＡＴＭタンパク質の位置判定は、少なくともｔ１およびｔ２において行われ、必要に応じて、ｔ３およびｔ４においても行われる。
ｃ） 第３の実施形態は、上記の実施形態と組み合わせ可能であり、電離放射線に対する細胞応答の、ＭＲＥ１１依存性経路を介しての調査が拡大される。結合による主要な修復経路については、その能力をｐＨ２ＡＸ免疫蛍光検査により定量化可能であるが、この修復経路に加え、出願人は、別の修復経路を識別した。この別の修復経路は、結合の代替手段であり、遺伝子欠損の場合には、結合に代わって使用される。これが、ＭＲＥ１１依存性組替えによる修復である。この経路の能力は、ＭＲＥ１１病巣の免疫蛍光検査の動態研究により定量化可能である。この測定は、少なくともｔ１、ｔ２、およびｔ３において行われ、必要に応じてｔ４においても行われる。出願人が得た知見によると、放射線抵抗性の対照株においては、ＭＲＥ１１は細胞質内にあり、ＭＲＥ１１病巣の個数は、線量２Ｇｙの後４時間までは、非常に少ない（典型的には、ＭＲＥ１１病巣の個数は７±２）。放射線照射後約２４時間で、標識（ｍａｒｋｉｎｇ）は細胞内となる。
最後の工程では、放射線起因の損傷の状態および／または患者の放射線感受性、特に、患者に特有のＴＤＮＴＢＥを予測するために、結果がスコア計算によって評価される。
図１Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ、非照射細胞からの（Ａ）小核病巣の個数の変化、（Ｂ）マーカーｐＨ２ＡＸの個数の変化、（Ｃ）マーカーｐＡＴＭの個数の変化を、ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度と関連させて示す。非照射細胞の小核、ｐＨ２ＡＸ病巣、およびｐＡＴＭ病巣からは、放射線感受性は予測できない。
組織反応の重症度については、２つの異なる尺度、すなわち、ＣＴＣＡＥ分類とＲＴＯＣ分類がある。
いわゆるＣＴＣＡＥ（Common Terminology Criteria for Adverse Events）分類は、米国国立がん研究所（National Cancer Institute of the United States of America）によって２００６年に発表された、がん治療における有害事象（特に、副作用）の用語基準である。
有害事象とは、有害で意図的でない何らかの兆候、症状、または疾病に相当し、医学的治療または医学的処置の使用に時間的に関連し、当該治療または当該医学的処置に関係があると見なされる場合も見なされない場合もある。有害事象は、医療用文書管理のため、また、科学的分析中に使用される、特定の事象を独自の形で表したものである。
ＣＴＣＡＥでは、有害事象の意味を明確にする目的で、各有害事象が簡潔に定義されている。この尺度は、他の遺伝毒性ストレス（例えば、火傷）にも有効であるが、特に放射線治療において使用される。
グレードは、有害事象の重症度を示す。ＣＴＣＡＥには５つの重症度グレード（１〜５）があり、各有害事象の重症度について、独自の臨床的説明がされている。これを以下の表１に示す。各重症度グレードは、特定された組織反応により定義される。
これら５つのグレードに、組織への影響がないことに相当するグレード０が加わる。
１９８４年に放射線治療腫瘍学グループ（Radiation Therapy Oncology Group、RTOC）により提案された、歴史的な分類である、いわゆるＲＴＯＧ分類は、放射線治療後に発生するすべての種類の毒性を実質的に網羅している。
しかし、ＲＴＯＧ分類はある種のがんには適用不可であり、一方、ＣＴＣＡＥ分類はあらゆる種類のがんに使用される。
図２Ａおよび図２Ｂには、放射線照射後２４時間の小核の個数の変化を、ＣＴＣＡＥ（図２Ａ）またはＲＴＯＧ（図２Ｂ）の重症度グレードと関連させて示す。小核は、ＤＡＰＩ蛍光マーカーを使用して標識し、その後、蛍光シグナル分析によって定量化した。図２中、放射線感受性グループ（I、II、III）は、ローマ数字で示す。
放射線照射後２４時間の小核の個数によって予測できるのは、グループIIIの放射線感受性のみである。
図３Ａ，Ｂ，およびＣには、放射線照射後２４時間のｐＨ２ＡＸ病巣の個数の変化を、ＣＴＣＡＥ（図３Ｂ）またはＲＴＯＧ（図３Ｃ）の重症度グレードと関連させて示す。図３Ａは、マーカーｐＨ２ＡＸを使用して得られた平均病巣数の経時的動態を示す。
放射線照射後２４時間にＣＴＣＡＥまたはＲＴＯＧ（組織反応の２つの異なる重症度尺度）の重症度グレードと関連させて得られたｐＨ２ＡＸ病巣数によって予測できるのは、グループI、II、またはIIIの放射線感受性のみであり、重症度グレードの予測はできない。
図４Ａは、収集した患者のサンプル（皮膚線維芽細胞）のすべての細胞株について、２Ｇｙでの放射線照射後１０分にマーカーｐＨ２ＡＸを使用して得られた平均病巣数を示す。点線は、ＤＳＢの正常な発生率、すなわち、細胞１個についての、１Ｇｙあたりの４０のＤＳＢを示す。
図４Ａは、グループIIの放射線感受性を有する患者由来のすべての細胞が、２Ｇｙの後に予想されたよりも少ないｐＨ２ＡＸ病巣（ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ））で特徴付けられることを示している。このことは、ＤＳＢが不十分にしか認識されていない事実により説明される。
図４Ｂは、線量２Ｇｙの放射線照射の後の各時間（０分、１０分、および１時間）での、細胞質内および核内でのｐＡＴＭの発現を示している。非照射細胞と、２Ｇｙの放射線照射後１０分の細胞とについて、対応する免疫蛍光法データが示されている。
図４Ｂに示すデータは、ｐＡＴＭ病巣の個数に関連し、ＡＴＭの「細胞−核移行（ｃｙｔｏ−ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｉｔ）」を示唆している。
図４（Ｃ）は、マーカーｐＡＴＭを使用して上記の収集した細胞に基づき経時的に得られた平均病巣数の動態を示す。便宜上、１０分、１時間、４時間、および２４時間にて実施された測定に関連するエラーバーは省略した。図４Ａおよび図４Ｃにおいて、各点は、個別の３回の繰返しの平均を表し、エラーバーは各カテゴリーについての標準偏差を表す。
図５は、２Ｇｙの放射線照射後１０分でのｐＡＴＭ病巣の個数の変化（図５Ａ）と、１時間でのｐＡＴＭ病巣の個数の変化（図５Ｂ）とを、ＣＴＣＡＥ重症度グレードと関連させて示す。図５Ｃは、図５Ａと５Ｂとにそれぞれ示した、２Ｇｙの放射線照射後１０分および２４時間に得られた２つの値の間のｐＡＴＭ病巣数の最大数を、ＣＴＣＡＥ重症度グレードと関連させて示す。
図５Ｂには、グレード０、すなわち、組織への影響がないことが示されている。
図５Ｃは、患者１００人について、放射線生物学的パラメータとＣＴＣＡＥ分類に準じた重症度グレードとの関連を示す。つまり、図５Ｃは、ＣＴＣＡＥ重症度グレードと、２Ｇｙの放射線照射後１０分および１時間に得られた２つの値の間のｐＡＴＭ病巣数の最大数との間に存在する相関関係の臨床評価を表している。
図５中、放射線感受性グループ（I、II、IIIaおよびIIIb）は、ローマ数字で示されている。図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃについては、各点は、各カテゴリーにおける個別の３回の繰返しの平均を示す。
（２Ｇｙ＋１０分）中のｐＡＴＭ病巣の最大数、または、（２Ｇｙ＋１時間）中のｐＡＴＭ病巣の最大数により、反応の重症度グレードのみならず、すべてのグループをも予測することができる。
図６Ａには、マーカーｐＡＴＭを使用して得られた病巣の最大数を、先ほど図３Ｂおよび図５Ｃに示したｐＨ２ＡＸ病巣数と関連させて表している。
図６Ｂは、図６Ａのものと同じデータを示し、様々なヒト放射線感受性グループ（グループI、グループII、およびグループIII）を表す、明確に画定された信頼区間が図示されている。放射線感受性は、二本鎖切断の認識と修復により判定される。
図６Ｃには、グループ種類ごとのグループ発生数を示す。任意のグループへの所属確率は対応する信頼区間の反転に比例すると考られ、各グループの正規化頻度が図６Ｃ中の棒グラフで表されている。点線は、最良なデータ調整（ｒ＝０．９）を生成するガウスに相当する。
発明の説明
Ａ．全般的な定義
「放射線起因の損傷」、「放射線起因の」「放射線感受性」「放射線抵抗性」「放射線毒性」、および「放射線治療」という用語はすべて、電離放射線、特に、アルファ（α）粒子またはベータ（β）粒子からなる粒子放射線、あるいは、高エネルギー電磁放射線、特に、ガンマ（γ）線放射またはＸ線放射について言う。
「ＡＴＭの細胞−核移行」という用語は、ＡＴＭタンパク質の、特に放射線照射後の、細胞質から核への移動のことを言う。
Ｂ．詳細な説明
以下、複数の変形例を有する実施形態について説明する。この実施形態は、ヒト患者に適する。
１．検査準備
細胞のサンプリングおよびサンプリングされた細胞の操作の前に、（例えば、細胞学的分析研究施設に所属する）各オペレータは、（典型的には、医師から）患者のＨＩＶまたはＣ型肝炎への感染の可能性について通知を受ける。この通知の目的は、オペ−レータが、サンプリング中、操作中、および細胞培養の管理中に、適切な生物学的安全対策を取ることができるようにすることである。
次に、オペレータは、患者から細胞サンプルを採取する。オペレータは、皮膚サンプルの生検によりサンプルを採取することが好ましい。このサンプリングは、好適には、「皮膚パンチ生検」として公知の方法により実施可能である。細胞サンプルは、２０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ無菌培地（sterile fetal bovine serum DMEM+20% medium）に置く。直ちに、サンプルを専門検査室に移す。これは、サンプルを３８時間を越える時間、室温に置いてはならないからである。
検査室へ移動するとすぐに、細胞サンプル（典型的には生検材料）を、ウイルス性または化学的転換剤を使用せずに、増幅可能な細胞株として樹立させる。この操作は、Elkin M.他による刊行物“The radiobiology of cultured mammalian cells”(Gordon and Breach (1967年)）で強調されたような、培養検査室では公知の補助的手技に従って行う。細胞の個数が十分になったら（１〜３週間）、本発明の方法を使用して、最初の試験を行う。細胞を、ペトリ皿内のスライドガラスに接種する。上記スライドガラスのうちの一部には、医療用照射器内で、公認線量測定法に従い、吸収線量Ｄ（例えば、２Ｇｙ）で照射を行う。他のスライドガラスには照射を行わず、自然状態を表すものとする（吸収線量は０Ｇｙ）。
放射線照射は、例えば、３Ｇｙ ｍｉｎ−１の吸収線量率で、６ＭＶの光子を送出する医療用加速装置を使用して実施可能である。照射後は、後述する修復時間を経るために、細胞は培養インキュベーター内で３７℃に維持される。
照射済みの細胞について、放射線起因の状態に対応する特徴を、複数の修復時間（照射後修復時間）の後に取得する。好ましくは、少なくとも２つの時点、さらに好ましくは少なくとも３つの時点、具体的には、ｔ１、ｔ２、ｔ３およびｔ４が獲得される。上記の特徴は、マーカーｐＨ２ＡＸに対応する病巣により表される。
次いで、スライドガラス上の細胞を固定し、溶解し、ハイブリダイズする。これには、公知の手順（引用のBodgi他の刊行物を参照）が使用できる。具体的に、細胞を、３％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロース中で、室温で１５分間固定し、２０ｍＭのｐＨ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（化学式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（式中ｘ＝９〜１０）で表される非イオン界面活性剤、ＣＡＳ Ｎｏ． ９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３分間透過処理した。その後、カバースライドを、免疫学的染色の前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳとして知られる）中で洗浄した。インキュベーションは、２％ウシ血清アルブミン（頭文字のＢＳＡまたはフラクションＶで知られる；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加したＰＢＳ中で、３７℃で４０分間行った。インキュベーションの後、ＰＢＳで洗浄を行った。抗ｐＨ２ＡＸ一次抗体は１：８００の濃度で使用し、他の一次抗体は１：１００の濃度で使用した。抗マウス二次抗体ＦＩＴＣまたは抗ウサギ二次抗体ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したインキュベーションを、２％ＢＳＡ中で、３７℃で２０分間行った。核を標識するために、スライドガラスをＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄTMで処理した。ＤＡＰＩを使用した染色も、間接的に、フェーズＧ１にある細胞（ＤＡＰＩ染色が均一な細胞）の個数、フェーズＳにある細胞（多数のｐＨ２ＡＸ病巣を有する細胞）の個数、フェーズＧ２にある細胞（ＤＡＰＩ染色が不均一な細胞）の個数、および中期（染色体が見える状態）の判定を可能にする。
免疫蛍光顕微鏡（例えばオリンパスモデル）を用いて、これらのスライドガラスから結果を得る。読取りは、直接的（典型的には、各点につき、Ｇ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞の病巣をカウントする）であってもよく、専用の画像解析ソフトウェアを使用してもよく、または、自動顕微鏡で行ってもよい。ソフトウェアまたは自動顕微鏡方法は、手動作業で較正されることが好ましい。
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を有する結果を得るために、少なくとも３回の個別の一連の試験（照射）を行い、規定の時間につき、各病巣数の平均を計算する。
２．生物学的および臨床的パラメータの判定
２．１ 概説および使用するマーカー
本発明は、とりわけ、マーカーｐＨ２ＡＸについて、非照射の細胞（自然状態）および照射済み細胞（放射線起因状態）に関して得られたデータの使用に基づく。本発明の方法は、修復の継続時間と関連した、上記マーカーによる標識の動態調査に基づく。つまり、サンプルは、放射線照射の停止からの規定の時間の経過後に標識され、サンプルの免疫蛍光が調査される。例えば、ｔ０、ｔ１（好ましくは１０分）、ｔ２（好ましくは１時間）、ｔ３（好ましくは４時間）、およびｔ４（好ましくは２４時間）に位置する５つの点で表される全動態曲線を計測できる。ここで、ｔ０は照射前の状態（自然状態）である。好適には、他の２種のマーカー、具体的にはｐＡＴＭおよびＭＲＥ１１、を使用して得られたデータを関連付ける。
しかし、出願人は、ある特定の点（ある特定の修復時間に相当する）は、その他の点よりも重要であり、ある特定の点は予測的ではない、ということを発見した。任意の時間に判定されたパラメータを適切に選択することで、測定の回数を減らすことができ、よって、本方法の予測性能を低減させることなく、診断にかかるコスト全体が削減される。この簡便化された方法が、本発明の予測的方法の基本を成す。
サンプリングがｎ＝３（ガウス標準誤差ＳＥではない）であれば、それぞれのマーカーによる各点と各線量の平均は、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を使用して計算される。
（ｉ） ｐＨ２ＡＸは、ヒストンＨ２ＡＸのＸ変異体のセリン４３９におけるリン酸化型を指し、本願出願人の知見によれば、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）の数を標識する。ＤＳＢは、主要な修復様式、すなわち、結合により認識される。実質的に、マーカーｐＨ２ＡＸは、もっぱら核病巣の形で核内にあり、病巣の個数と大きさのみが分析される。
（ｉｉ） ｐＡＴＭは、ＡＴＭキナーゼタンパク質のセリン１９８１におけるリン酸化型を指す。本願出願人の知見によると、ＡＴＭは、放射線照射後、正常な条件下（放射線抵抗性状態）では、細胞質から核に移動する。ｐＡＴＭは、主に細胞質において濃縮され、ＤＳＢ部位を標識する。マーカーｐＡＴＭは、局在により特徴付けられるが、これは核病巣を伴わない均一な細胞質内局在（細胞質病巣はない）か、核病巣のみの形でもっぱら核内にある局在（均一な核内局在はない）か、あるいは、細胞質病巣および核病巣であり得る。
（ｉｉｉ） ＭＲＥ１１は、ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。本願出願人の知見によれば、ＭＲＥ１１は、修復プロセス完了時に修復が不十分なＤＳＢを標識する。マーカーＭＲＥ１１は、病巣を伴わず細胞質内にあるか、または、病巣を伴わず細胞質内および核内にあるか、または、病巣を伴って細胞質内および核内にある。
ＤＡＰＩ（当業者には公知のＤＮＡマーカー）による対比染色により、細胞質内局在化または核局在化の位置特定をするための、核の位置特定が可能になる（この分布は、電離放射線の影響下で、ＭＲＥ１１およびｐＡＴＭについて変更される）。これの目的は、病巣についてのデータに対する相補的な細胞マーカーである、小核、アポトーシス体、および核の大きさを定量化することである。
２．２ 生物学的パラメータ
次の事項が、以下のように定義および判定される。
・ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）、ＮｐＡＴＭ（ｔ）、ＮＭＲＥ１１（ｔ）：マーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭ、およびＭＲＥ１１を使用して、観察時間ｔ０（非照射）または放射線照射（吸収線量：２Ｇｙ）後の観察時間ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４において、得られる核病巣の平均個数。但し、パラメータＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）の判定は本発明の方法において必須であるのに対し、他のパラメータＮｐＡＴＭ（ｔ）およびＮＭＲＥ１１（ｔ）の判定は任意であるが、好適である。
・自然状態（ｔ＝ｔ０、すなわち、放射線照射なし）、または、吸収線量２Ｇｙでの放射線照射後のｔ＝ｔ４のときに、細胞１００個につき観察される小核の個数（％）。
２．３ 予測的評価
測定された生物学的データに基づき、臨床的パラメータまたは放射線治療パラメータを予測することを目的としている。これには、スコアの数学的値またはスコアを関連付ける数式に直接的に基づく、定量的分析を含む。この分析は、潜在的な致命的反応を避けるために、超過すべきではない合計線量（ＴＤＮＴＢＥと呼ばれる基準）に関する。この基準は、放射線治療を受ける予定または放射線治療中の患者に適用できる。
この超過すべきではない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）は、グレイ（Ｇｙ）で表され、放射線治療医にとって重要なパラメータである。これによって、任意の患者が潜在的な致命的反応を起こさずに吸収できる最大線量を予測できる。このパラメータによって、放射線感受性が特に高い患者に対する放射線治療を避けることもできる。
本発明によれば、ＴＤＮＴＢＥを、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）］により、または、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＋ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）］により判定可能である。
本発明の方法の変形例では、上記細胞サンプルについて、時間ｔにおける細胞１００個についての核病巣の平均個数（％で表す）が観察され（この平均個数をＮＭＮ（ｔ）と称する）、時間ｔは、少なくともｔ０（非照射）および吸収線量Ｄでの照射後のｔ４であり、パラメータＮＭＮ（ｔ４）が、上記ＴＤＮＴＢＥを判定するために使用される。しかし、実験による小核測定の統計的不確実性は、免疫蛍光検査で観察される核病巣の個数の統計的不確実性よりも高いため、病巣測定の予測的数値は、小核の予測的数値よりも好ましいといえるであろう。
したがって、ＴＤＮＴＢＥを、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［０．４×ＮＭＮ（ｔ４）］、または
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［２＋（０．４×ＮＭＮ（ｔ４））］により判定する。
この定量的分析に基づき、より質的な診断が行われうる。この診断は、上記定量的分析に影響されるが、医師の注意を喚起するあらゆる臨床要素を考慮するであろう。
ＴＤＮＴＢＥと、ｐＨ２ＡＸ病巣数と、２Ｇｙでの放射線照射後２４時間に得られた小核の個数との相関を、自然状態のｐＨ２ＡＸ病巣数と関連付けて検証した。この検証は、１９７０年代に、１、２回の放射線治療セッションで照射を受け、ＡＴＭ遺伝子の変異が起こった、高い放射線感受性を有する患者について収集された一群の遡及的データにより行った。照射後の死亡ケース（ＣＴＣＡＥ分類に沿った重症度グレード５）については、１９７０年代から今日に至るまで文献に記載があり、系統的には、毛細血管拡張性失調症のケースか、リガーゼ４の突然変異が生じた患者のケースに相当する（A. Joubert他、“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response: At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity?”, published in the International Journal of Radiation Biology, 2008年、vol. 84(2), p107-125を参照）。 これらの遡及的データに基づき、且つ、これらの放射線治療セッション中の合計蓄積線量を考慮して、対応する未修復二本鎖切断（ＤＳＢ）の数を対比できた。実際には、未修復二本鎖切断の数は、多数の失調株において、および、ＬＩＧ４突然変異（１８０ＢＲ細胞株）ケース１つについて計測した。これらの細胞株は、系統的に、１回の照射量後の致死限界値を超える未修復切断の比率を示した。表２に示した、ＡＴ患者および１８０ＢＲ患者からの細胞株との値には、そこを超えると未修復切断の数が患者にとって致命的となる閾値を判定するための証拠が含まれている。これらの特殊なケースに相当するＣＴＣＡＥ重症度グレードは５（＝死亡）である。従って、ＴＤＮＴＢＥは、この未修復ＤＳＢの数に到達可能な、合計蓄積線量であると定義できる。
本発明の方法の別の変形例では、細胞サンプルについて、まず放射線感受性グループが判定される。
放射線感受性グループ（ＧＲＯＵＰ）の定義は、本発明によるスコアおよび患者の臨床像から、医師が既知の遺伝的症候群との類似性を判定する際の手助けになる。これらのグループは、上記で引用したJoubert他による刊行物に定義された。
・本発明によれば、次のように考えられる：
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＜２、且つ
ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ
ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つ
Ａ＜１０、且つ
Ｂ＜５、且つ
Ｃ＜２であり、
但し
Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のｔ０におけるパーセンテージ；
Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞1個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣の個数；
であれば、放射線感受性グループ（ＧＲＯＵＰ基準）は、「グループI」と見なされ、当該の細胞は、放射線抵抗性を有する。
（ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）であれば、
放射線感受性グループ（ＧＲＯＵＰ基準）は、「グループIII」と見なされ、当該の細胞の放射線感受性は高い。
その他すべての条件については、ＧＲＯＵＰ基準が「グループII」であると見なされ、当該の細胞は、中等度の放射線感受性を示す。
患者の放射線感受性グループを判定したのち、上記の変形例の一方または他方に従って、ＴＤＮＴＢＥが判定される。
実際には、これらの数式は、タイプIIの放射線感受性グループ（中程度の放射線感受性）に属する患者、標準的な治療を受けることができる、放射線抵抗性を有する患者（グループI）、および、いかなる条件においても照射を受けない、放射線感受性が高い患者のＴＤＮＴＢＥを判定するのに特に適している。
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、これらの実施例は本願をなんら限定するものではない。これらの実施例は、患者の細胞株の分析に関連し、超過すべきではない合計線量の判定を可能にするものである。
実施例
１．検査準備
当業者に公知の「皮膚パンチ生検」法を使用した生検により、皮膚細胞サンプルを患者から採取した。この細胞サンプルを、２０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ無菌培地に置いた。その後、細胞サンプルが３８時間を越えて室温に置かれることを避けるため、サンプルを直ちに専門検査室に移動させた。
検査室へ移動するとすぐに、培養研究機関と当業者とには公知の方法で、生検で得られた細胞サンプルを増幅可能な細胞株として樹立させた。特に、トリプシン分散によって、細胞は、新しい培地内で再度希釈され、所望の個数の細胞が得られるまでこれを繰り返す。十分な個数の細胞を得たのち（概して１〜３週間後）、本発明の方法を使用して最初の試験を行った。細胞を、ペトリ皿内のスライドガラスに接種した。上記スライドガラスのうちの一部には、医療用照射器内で、公認線量測定法に従い、２Ｇｙの吸収線量Ｄで照射を行った。他のスライドガラスには照射を行わず、自然状態を表すものとした（吸収線量は０Ｇｙ）。
その後、スライドガラス上の細胞を、固定し、溶解し、ハイブリダイズした。これら細胞を、３％パラホルムアルデヒドおよび２％スクロース中で、室温で１５分間固定し、２０ｍＭのｐＨ ７．４のＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、３００ｍＭのスクロース、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（化学式ｔ−Ｏｃｔ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘＯＨ（式中ｘ＝９〜１０）で表される非イオン界面活性剤、ＣＡＳ Ｎｏ． ９００２−９３−１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で３分間透過処理した。その後、カバースライドを、免疫学的染色の前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳとして知られる）中で洗浄した。インキュベーションは、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡまたはフラクションＶで知られる；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加したＰＢＳ中で、３７℃で４０分間行い、その後、ＰＢＳでの洗浄を行った。抗ｐＨ２ＡＸ一次抗体は１：８００の濃度で使用し、他の一次抗体は１：１００の濃度で使用した。抗マウス二次抗体ＦＩＴＣまたは抗ウサギ二次抗体ＴＲＩＴＣ（１：１００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用したインキュベーションを、２％ＢＳＡ中で、３７℃で２０分間行った。
次に、核を標識するために、スライドガラスをＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）含有のＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄTMで処理した。ＤＡＰＩを使用した染色によっても、間接的に、休止期Ｇ０／Ｇ１にある細胞（ＤＡＰＩ染色が均一な細胞）の個数、合成期Ｓにある細胞（多数のｐＨ２ＡＸ病巣を有する細胞）の個数、休止期Ｇ２にある細胞（ＤＡＰＩ染色が不均一な細胞）の個数、および有糸分裂期Ｍ（染色体が見える状態）の判定が可能ある。ＤＡＰＩでの対比染色により、特に、細胞質内局在化または核局在化の位置特定をするための、核の位置特定ができ、したがって、存在する小核の定量化ができた。
免疫蛍光顕微鏡（例えばオリンパスモデル）を用いて、スライドガラスから結果を得た。読取りは、異なるマーカーｐＨ２ＡＸ、ｐＡＴＭ、およびＭＲＥ１１を使用して、各点においてＧ０／Ｇ１にある少なくとも５０個の細胞で得られた病巣をカウントすることにより直接的に行うとともに、専用の画像解析ソフトウェア（ｉｍａｇｅＪ）を使用して行った。
２．自然状態および吸収線量２Ｇｙの照射後修復の１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、および２４時間後（ｔ４）におけるｐＨ２ＡＸ病巣、ＭＲＥ１１病巣、およびｐＡＴＭ病巣の個数、自然状態および吸収線量２Ｇｙの照射後の修復時間２４時間で細胞１００個について観察された小核の個数Ｎ ＭＮ （ｔ）（％で表す）、自然状態での細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣の個数、ならびに、ｔ０における大核（１５０μｍ ２ よりも大きい核）のパーセンテージの判定
非照射細胞（自然状態、すなわちｔ０）については、これら細胞の免疫蛍光分析により、自然状態のｐＨ２ＡＸの平均個数、自然状態の細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣の個数、ｔ０における大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のパーセンテージ、および自然に観察された小核の個数を得た。
照射済みの細胞については、放射線照射は、３Ｇｙ ｍｉｎ−１の吸収線量率で、６ＭＶの光子を送出する医療用加速装置を使用して実施した。吸収線量２Ｇｙでの照射の後、細胞を培養インキュベーター内で３７℃で維持した。照射済み細胞（放射線起因状態）については、サンプルを規定の期間後、具体的には、放射線照射の停止から１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、２４時間後（ｔ４）に標識した。マーカーｐＨ２ＡＸ、ＭＲＥ１１、およびｐＡＴＭを使用して、上記の各照射後修復時間（１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、および２４時間後（ｔ４））において獲得した核病巣の、平均個数を得た。上記サンプルの免疫蛍光分析によって、吸収線量２Ｇｙでの照射後２４時間後に観察された、細胞１００個あたりの小核の個数ＮＭＮ（ｔ）（％で表す）も判定した。
診断の根拠として使用するのに十分な統計的信頼度を備える結果を得るために、一連の照射を個別に３回実施した。自然状態（ｔ０）、照射後修復の１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、および２４時間後（ｔ４））における各病巣数の平均と平均標準誤差（ＳＥＭ）とを計算した。各種の患者皮膚細胞サンプルについての計算結果を、次の表に示す（表２参照）。
表２：ある患者の放射線感受性およびＴＤＮＴＢＥの判定。判定は、患者の種々の皮膚細胞サンプルについて、自然状態（ｔ０）および／または、２Ｇｙで照射後の１０分後（ｔ１）、１時間後（ｔ２）、４時間後（ｔ３）、および２４時間後（ｔ４）におけるｐＨ２ＡＸ病巣、ｐＡＴＭ病巣、およびＭＲＥ１１病巣の個数、自然状態および吸収線量２Ｇｙでの照射後の修復期間２４時間後（ｔ４）に細胞１００個について観察された小核の個数ＮＭＮ（ｔ）（％で表す）、自然状態での細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣の個数、および、ｔ０における大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のパーセンテージと関連させて行った。（＊この患者は放射線抵抗性を有し、したがって標準的な放射線治療プロトコルを受けることができる。すなわち、前立腺がん治療のための７０Ｇｙ、乳がん治療のための４０Ｇｙの照射を受けることができる。）
２．３ 超過すべきではない合計線量の予測的評価
患者の種々の皮膚細胞サンプル（表２参照）に関し、放射線治療を受ける予定または放射線治療中の患者の、潜在的な致命的反応を避けるためには超過すべきではない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）が判定された。
グレイ（Ｇｙ）で表される超過すべきではない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）は、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）により、
または
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＋ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）］により判定した。
本発明の別の変形によれば、グレイ（Ｇｙ）で表される超過すべきではない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）を、時間ｔにおいて観察される細胞１００個あたりの小核の個数（％で表される）を考慮して、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［０．４×ＮＭＮ（ｔ４）］
または、
ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［２＋（０．４×ＮＭＮ（ｔ４））］によっても判定した。
時間ｔ０およびｔ４は、それぞれ、自然状態すなわち非照射と、吸収線量Ｄでの照射後の時間ｔ４に対応する。
グレイ（Ｇｙ）で表される超過すべきではない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）の定量的値を表２に示す。
重症度グレード２〜４は、組織反応（例えば、皮膚炎、直腸炎、など）に対応する。重症度グレード１は、耐えられる程度の副作用であり、医師によっては、グレード０（影響なし）と混同されることも多い。

Claims (14)

  1. 患者の非照射部位またはわずかに照射を受けた部位からサンプリングされた細胞から得られた細胞サンプルの有する、電離放射線に対する細胞放射線感受性を予測するための方法であって、
    (i) サンプリングされた前記細胞は増幅され、当該増幅された細胞が前記「細胞サンプル」を構成し、
    (ii) 前記細胞サンプルについて、マーカーｐＨ２ＡＸを使用して、観察時間ｔにおいて得られた核病巣の平均個数を判定し、この平均個数をＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）とし、前記観察時間ｔが、０分すなわち非照射状態を表すｔ０および、吸収線量Ｄでの照射後の観察時間ｔ１と、好ましくはｔ２とｔ３とｔ４から選択される少なくとも１つであり、
    （ｉｉｉ）グレイ（Ｇｙ）で表される、超過すべきでない合計線量（ＴＤＮＴＢＥ）が、少なくともパラメータＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）を使用して判定され、
    前記ｔ４は、ＤＮＡ切断のレベルがその残留値に到達するまでの所要時間を表す固定値であり、好適には、ｔ３の６倍〜８倍となるよう、但し、１２時間以上、好ましくは１２時間〜４８時間、より好ましくは約２４時間となるよう選択され、
    前記ｔ３は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した対照細胞のＤＳＢの約２５％が修復される時間を表す固定値であり、好適には、ｔ２の３倍〜５倍となるよう、ただし、２．５時間以上６時間以下、好ましくは３時間〜５時間、より好ましくは約４時間となるよう選択され、
    前記ｔ２は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した前記対照細胞のＤＳＢの約５０％が修復される時間を表す固定値であり、好適には、ｔ１の５倍〜７倍となるよう、ただし、３５分以上９０分以下、好ましくは４５分〜７５分、より好ましくは約６０分となるよう選択され、
    ｔ１は、その終了時に、放射線抵抗性を有する患者から採取した前記対照細胞内で、認識されたＤＳＢの数が最大値に達する時間を表す固定値であり、好適には、照射の停止から５分〜１５分、好ましくは７．５分〜１２．５分、より好ましくは約１０分となるよう選択される
    ことを特徴とする方法。
  2. 請求項１において、
    時間ｔに細胞１００個について観察された核病巣の平均個数（％で表す）が判定され、この平均個数をＮＭＮ（ｔ）をとし、前記時間ｔは少なくとも、非照射であるｔ０および吸収線量Ｄでの照射後のｔ４であり、前記パラメータＮＭＮ（ｔ４）が、ＴＤＮＴＢＥを判定するために使用される
    ことを特徴とする方法。
  3. 請求項１または２において、
    ＴＤＮＴＢＥが、
    ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）により、または、
    ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＋ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）］により判定される
    ことを特徴とする方法。
  4. 請求項２または３において、
    前記ＴＤＮＴＢＥが、
    ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）≦３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［０．４×ＮＭＮ（ｔ４）］により、または、
    ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＞３であれば、数式：ＴＤＮＴＢＥ＝６０／［２＋（０．４×ＮＭＮ（ｔ４））］により判定される
    ことを特徴とする方法。
  5. 請求項１から４のいずれか１つにおいて、
    前記サンプリングされた細胞が、患者の皮膚生検材料から採取された線維芽細胞である
    ことを特徴とする方法。
  6. 請求項１から５のいずれか１つにおいて、
    前記吸収線量Ｄが０．５Ｇｙ〜４Ｇｙ、好ましくは１Ｇｙ〜３Ｇｙ、より好ましくは１．７Ｇｙ〜２．３Ｇｙ、さらに好ましくは２Ｇｙである
    ことを特徴とする方法。
  7. 請求項１から６のいずれか１つにおいて、
    ｔ１が８分〜１２分であり、ｔ２が５０分〜７０分であり、ｔ３が３．５時間〜４．５時間であり、ｔ４が２２時間〜２６時間である
    ことを特徴とする方法。
  8. 請求項６または７において、
    ｔ１が１０分、ｔ２が６０分、ｔ３が４時間、ｔ４が２４時間であり、Ｄが２Ｇｙである
    ことを特徴とする方法。
  9. 請求項１から８のいずれか１つにおいて、
    ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ）の判定には、免疫蛍光試験を伴う
    ことを特徴とする方法。
  10. 請求項１から９のいずれか１つにおいて、
    放射線抵抗性を有する患者から採取した前記対照細胞は、吸収線量２Ｇｙでの照射の後に示すインビトロのクローン原性生存率が５５％よりも高い細胞として選択される
    ことを特徴とする方法。
  11. 請求項１から１０のいずれか１つにおいて、
    放射線抵抗性を有する患者から採取した前記対照細胞は、放射線治療中または治療後に重大な組織反応を示さなかった患者から採取した細胞として選択される
    ことを特徴とする方法。
  12. 請求項３から１１のいずれか１つにおいて、
    前記マーカーｐＨ２ＡＸを使用して観察時間ｔ１、ｔ２、およびｔ３において得られた核病巣の前記平均個数が、ＤＳＢ部位認識の動態曲線の形状を検証するために使用される
    ことを特徴とする方法。
  13. 請求項１から１２のいずれか１つにおいて、
    マーカーｐＡＴＭおよびＭＲＥ１１のうち少なくとも一方を使用した、観察時間ｔと、吸収線量Ｄでの照射後のｔ１、ｔ２、ｔ３、およびｔ４から選択される少なくとも１つの観察時間とにおいて得られた核病巣の平均個数が判定され、これら平均個数をそれぞれＮｐＡＴＭ（ｔ）およびＮＭＲＥ１１（ｔ）とする
    ことを特徴とする方法。
  14. 請求項１から１３のいずれか１つにおいて、
    ＴＤＮＴＢＥよりも前に、患者の放射線感受性グループが、
    （ａ） ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＜２、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞ＮｐＡＴＭ（ｔ２）、且つ、ＮｐＡＴＭ（ｔ１）＞３０、且つＡ＜１０、且つ、Ｂ＜５、且つ、Ｃ＜２であり、但し
    Ｃ＝ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ０）＋ＮＭＮ（ｔ０）；
    Ｂ＝大核（１５０μｍ２よりも大きい核）のｔ０におけるパーセンテージ；
    Ａ＝ＮＭＲＥ１１（ｔ０）＋ｔ０における細胞１個あたりのｐＨ２ＡＸ小病巣数
    であるとき、サンプルは放射線抵抗性を有する（グループI）と見なされ、
    （ｂ） （ＮｐＨ２ＡＸ（ｔ４）＞８、または、ＮＭＮ（ｔ４）＞２４）
    であるとき、サンプルは高放射線感受性を有する（グループIII）と見なされ、
    （ｃ） その他のすべての条件の場合は、サンプルは中等度の放射線感受性を有する（グループII）と見なされる、手順に従い判定される
    ことを特徴とする方法。
JP2016552289A 2014-02-17 2015-02-16 組織の放射線感受性を判定するための予測的方法 Pending JP2017508148A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1451215 2014-02-17
FR1451216A FR3017625B1 (fr) 2014-02-17 2014-02-17 Methode predictive pour determiner la radiosensibilite tissulaire
FR1451215A FR3017624B1 (fr) 2014-02-17 2014-02-17 Methode predictive pour caracteriser la radiosensibilite et la reaction tissulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant therapeutique
FR1451216 2014-02-17
FR1402282 2014-10-10
FR1402281 2014-10-10
FR1402282 2014-10-10
FR1402281 2014-10-10
PCT/FR2015/050370 WO2015121597A1 (fr) 2014-02-17 2015-02-16 Methode predictive pour determiner la radiosensibilite tissulaire

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2017508148A true JP2017508148A (ja) 2017-03-23

Family

ID=52649051

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016552289A Pending JP2017508148A (ja) 2014-02-17 2015-02-16 組織の放射線感受性を判定するための予測的方法
JP2016552303A Active JP6524108B2 (ja) 2014-02-17 2015-02-16 治療用電離放射線に対する患者の放射線感受性および組織反応の特徴を特定するための予測的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016552303A Active JP6524108B2 (ja) 2014-02-17 2015-02-16 治療用電離放射線に対する患者の放射線感受性および組織反応の特徴を特定するための予測的方法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US10180437B2 (ja)
EP (2) EP3108253B1 (ja)
JP (2) JP2017508148A (ja)
CN (2) CN106255883B (ja)
AU (1) AU2015216822A1 (ja)
CA (2) CA2939700A1 (ja)
HK (2) HK1231556A1 (ja)
IL (1) IL247043A0 (ja)
WO (2) WO2015121596A1 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3045070A1 (fr) * 2015-12-11 2017-06-16 Neolys Diagnostics Methode predictive pour caracteriser la sensibilite d'une tumeur en reponse a un traitement cassant l'adn
FR3067467B1 (fr) * 2017-06-13 2019-08-02 Neolys Diagnostics Methode predictive rapide pour caracteriser la radiosensibilite et/ou la reaction tissulaire d'un individu envers une irradiation
CA3073239A1 (fr) 2017-06-13 2018-12-20 Alara Expertise Methode predictive rapide pour caracteriser la radiosensibilite et/ou le risque de toxicite tissulaire d'un individu envers une irradiation
EP3578974A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-11 Novagray Bleomycin for mimicking the effect of ionizing radiations on t cells
US20210252308A1 (en) * 2018-06-11 2021-08-19 Indiana University Research And Technology Corporation Direct measurement of immune system radiosensitivity and radiotherapy treatment plan optimization
WO2022058472A1 (en) 2020-09-17 2022-03-24 Lxrepair Method for predicting the risk of radiation-induced toxicity
FR3120446A1 (fr) 2021-03-05 2022-09-09 Neolys Diagnostics Procede pour estimer le niveau de toxicite d’un traitement par radiotherapie sur un patient
WO2024149703A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Diagnosis of alzheimer disease
CN117077625B (zh) * 2023-08-15 2024-05-14 普蕊斯(上海)医药科技开发股份有限公司 一种不良事件等级判定方法、电子设备和存储介质

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2466310A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-20 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH Means and methods for detecting double-strand breaks
WO2013187973A1 (en) * 2012-03-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Devices and methods for determining sensitivity to radiation

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6348311B1 (en) 1999-02-10 2002-02-19 St. Jude Childre's Research Hospital ATM kinase modulation for screening and therapies
FR2809417B1 (fr) 2000-05-24 2004-07-30 Commissariat Energie Atomique Detection et caracterisation de l'activite de proteines impliquees dans la reparation de lesions de l'adn
KR20030033519A (ko) 2001-10-23 2003-05-01 박영미 항산화효소의 활성에 의한 동물의 방사선에 대한 감응성을결정하는 방법
KR20030033518A (ko) 2001-10-23 2003-05-01 박영미 글루타티온 관련 효소의 활성에 의한 동물의 방사선에대한 감응성을 결정하는 방법
WO2004013634A2 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Kudos Pharmaceuticals Ltd Dna damage repair polypeptide and uses thereof
US6916627B2 (en) 2002-11-27 2005-07-12 St. Jude Children's Research Hospital ATM kinase compositions and methods
FR2849058B1 (fr) 2002-12-20 2005-02-25 Commissariat Energie Atomique Procede d'evaluation quantitative des capacites globales et specifiques de reparation de l'adn d'au moins un milieu biologique, ainsi que ses applications
ITMI20030821A1 (it) 2003-04-18 2004-10-19 Internat Ct For Genetic En Gineering And Polipeptidi chimerici e loro uso.
JP2007521811A (ja) 2004-01-30 2007-08-09 ダナ ファーバー キャンサー インスティテュート 放射線又は遺伝毒性物質曝露の測定及び定量方法
FR2887261B1 (fr) 2005-06-20 2007-09-14 Commissariat Energie Atomique Procede d'immobilisation de l'adn superenroule et utilisation pour analyser la reparation de l'adn
US20070072210A1 (en) 2005-08-11 2007-03-29 Ouchi Toru Use of brca1-associated protein to treat and screen for dna damage and to identify therapeutics that promote a dna damage response
US20070264648A1 (en) 2005-09-22 2007-11-15 National Institute Of Radiological Sciences Dna Oligomer, Genetic Marker and Dna Oligomer Set for Prediction of Onset of Side-Effect from Radiation Therapy, and Method for Predicting Onset of Side-Effect
US20080234946A1 (en) 2007-03-22 2008-09-25 University Of South Florida Predictive radiosensitivity network model
WO2009137015A2 (en) 2008-05-03 2009-11-12 New York University School Of Medicine Biomarkers of ionizing radiation
WO2010088650A2 (en) 2009-02-02 2010-08-05 University Of Texas M. D. Anderson Cancer Center Biomarker signature to predict cancer treatment response
RU2564077C2 (ru) 2009-03-27 2015-09-27 Конинклейке Филипс Электроникс Н.В. Вероятность повреждения здоровых тканей, адаптированная с учетом маркеров
CN102369530B (zh) 2009-05-28 2016-05-18 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于副作用预后和监测的装置
CN102914495B (zh) * 2012-10-10 2015-04-15 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种电离辐射致外周血淋巴细胞dna损伤的评价方法
JP6469074B2 (ja) 2013-03-28 2019-02-13 サントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ド モンペリエ 放射線感受性を判定するための方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2466310A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-20 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH Means and methods for detecting double-strand breaks
WO2013187973A1 (en) * 2012-03-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Devices and methods for determining sensitivity to radiation

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COLIN C: "MRE11 AND H2AX BIOMARKERS IN THE RESPONSE TO LOW-DOSE EXPOSURE: BALANCE BETWEEN INDIVIDUAL SUSCEPTI", INTERNATIONAL JOURNAL OF LOW RADIATION, vol. 8, no. 2, JPN5017000769, 13 December 2011 (2011-12-13), pages 96 - 106, XP009179289, ISSN: 0004247188, DOI: 10.1504/IJLR.2011.044191 *
JOUBERT A: "RADIOSENSIBILITE INTRINSEQUE ET CASSURES DOUBLE-BRIN DE L'ADN DANS LES CELLULES HUMAINES", CANCER RADIOTHERAPIE, vol. VOL:11, NR:3, JPN5017000764, 23 February 2007 (2007-02-23), FR, pages 129 - 142, ISSN: 0004074496 *
MARTIN W L: "CRYSTAL STRUCTURE AT 2.8 A OF AN FCRN/HETERODIMERIC FC COMPLEX: MECHANISM OF PH-DEPENDENT BINDING", MOLECULAR CELL, vol. 7, JPN5017000076, 1 April 2001 (2001-04-01), US, pages 867 - 877, XP003027710, ISSN: 0004074497, DOI: 10.1016/S1097-2765(01)00230-1 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1231560A1 (zh) 2017-12-22
JP2017505630A (ja) 2017-02-23
EP3108253B1 (fr) 2019-09-11
WO2015121597A1 (fr) 2015-08-20
JP6524108B2 (ja) 2019-06-05
EP3108252B1 (fr) 2019-10-09
CN106255883A (zh) 2016-12-21
CN106164671A (zh) 2016-11-23
CA2939694A1 (en) 2015-08-20
WO2015121596A1 (fr) 2015-08-20
US10197578B2 (en) 2019-02-05
AU2015216822A1 (en) 2016-09-01
CA2939700A1 (en) 2015-08-20
CN106255883B (zh) 2019-10-08
EP3108252A1 (fr) 2016-12-28
US20170010279A1 (en) 2017-01-12
EP3108253A1 (fr) 2016-12-28
US10180437B2 (en) 2019-01-15
IL247043A0 (en) 2016-09-29
US20170010254A1 (en) 2017-01-12
HK1231556A1 (zh) 2017-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6524108B2 (ja) 治療用電離放射線に対する患者の放射線感受性および組織反応の特徴を特定するための予測的方法
Redon et al. γ-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin
Granzotto et al. Influence of nucleoshuttling of the ATM protein in the healthy tissues response to radiation therapy: toward a molecular classification of human radiosensitivity
Rothkamm et al. DNA damage foci: Meaning and significance
Horn et al. Gamma-H2AX-based dose estimation for whole and partial body radiation exposure
Martin et al. Statistical analysis of kinetics, distribution and co-localisation of DNA repair foci in irradiated cells: cell cycle effect and implications for prediction of radiosensitivity
Colin et al. DNA double-strand breaks induced by mammographic screening procedures in human mammary epithelial cells
US20200041492A1 (en) Biomarkers for cellular senescence
Muslimovic et al. Measurement of H2AX phosphorylation as a marker of ionizing radiation induced cell damage
Reitsema et al. DNA-PK is responsible for enhanced phosphorylation of histone H2AX under hypertonic conditions
Antonelli et al. Induction and repair of DNA double-strand breaks in human cells: dephosphorylation of histone H2AX and its inhibition by calyculin A
Zorin et al. Spontaneous γH2AX foci in human dermal fibroblasts in relation to proliferation activity and aging
Simonsson et al. Low-dose hypersensitive γH2AX response and infrequent apoptosis in epidermis from radiotherapy patients
Han et al. Quantitative analysis reveals asynchronous and more than DSB-associated histone H2AX phosphorylation after exposure to ionizing radiation
Vandersickel et al. Early increase of radiation-induced γH2AX foci in a human Ku70/80 knockdown cell line characterized by an enhanced radiosensitivity
FR3017625A1 (fr) Methode predictive pour determiner la radiosensibilite tissulaire
FR3017624A1 (fr) Methode predictive pour caracteriser la radiosensibilite et la reaction tissulaire d'un patient envers un rayonnement ionisant therapeutique
EP3387436B1 (fr) Méthode prédictive rapide pour caractériser la radiosensibilité d'un patient envers une irradiation avec un rayonnement ionisant
Bensimon Etzol et al. DosiKit, a new immunoassay for fast radiation biodosimetry of hair and blood samples
Leskovac et al. Radiation-induced mitotic catastrophe in FANCD2 primary fibroblasts
US20180238860A1 (en) Individual method predictive of the dna-breaking genotoxic effects of chemical or biochemical agents
RU2801094C1 (ru) Способ определения группы риска для пациентов с множественной миеломой, осложненной плазмоцитомой
Mollaee et al. The role of intrinsic radiosensitivity in the low-dose adaptive response induction in human peripheral blood mononuclear cells
KR102222521B1 (ko) 약물 반응성을 예측하는 방법
US20180238859A1 (en) Predictive method for characterizing the sensitivity of a tumour in response to a dna-breaking treatment

Legal Events

Date Code Title Description
RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20161128

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180115

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20181024

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20181106

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190206

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190716

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20191010

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20191212

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200407