NO342020B1 - Markørgener for anvendelse ved identifisering av kondrocyttfenotypisk stabilitet og ved screening av faktorer som innvirker på bruskdannelse - Google Patents

Abstract

Det beskrives et sett av gener som kan benyttes for å predikere potensialet for en cellepopulasjon til å danne brusk etter implantering in vivo. Settet av markører benyttes blant annet som en kvalitetskontroll for celler og i screeninganalyser for å evaluere innvirkningen av forbindelser og betingelser på cellenes bruskdannende evne.

Description

MARKØRGENER FOR ANVENDELSE VED IDENTIFISERING AV KONDROCYTT-FENOTYPISK STABILITET OG VED SCREENING AV FAKTORER SOM INN-VIRKER PÅ BRUSKDANNELSE

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter og verktøy for å bestemme kondrocyttfenotypisk stabilitet og screeningsystemer for å identifisere forbindelser for anvendelse ved behandling av bruskdefekter og bruskrelaterte sykdommer.

Reparering av bruskdefekter kan hovedsakelig oppnås ved kirurgiske metoder som beinmargstimuleringsteknikker eller implantering av bruskdannende celler (kondrocytter,

(kondro-)progenitorer og forløpere for disse eller stamceller som utvikler seg til brusk). I lys av dette er identifiseringen av faktorer som er i stand til positivt å påvirke in vivo bruskdannelse, av interesse. Det er således ønskelig å identifisere kirurgiske prosedyrer eller terapeutiske metoder eller forbindelser i stand til positivt å påvirke bruskdannelse mediert av lokale celler som er til stede i nærheten av defekten. I tillegg er det for cellebaserte terapier av interesse å identifisere faktorer eller behandling som positivt kan påvirke evnen for isolerte cellepopulasjoner som har vært ekspandert eller ført in vitro, å produsere stabil brisk in vivo.

Forskjellige analyser er beskrevet der ekspresjonen av gener involvert i bruskdannelse benyttes som en parameter for screeningforbindelser. US2002/061514 beskriver en metode der et rapportørgen er ansvarlig for transkripsjonsfaktoren SOX9.

SOX9 er en høymobilitetsgruppe-(HMG-)domenetranskripsjonsfaktor som uttrykkes i kondrocytter, kondroprogenitorer og annet vev som er funnet å være vesentlig for kondrocyttdifferensiering og bruskdannelse. Andre metoder er basert på ekspresjonsnivåer av individuelle gener som er involvert i bruskmetabolisme og osteokondrale defekter [for eksempel osteoporoserelaterte gener i WO02/081745].

Screeningmetoder er også beskrevet, basert på in vitrodifferensieringen av celler til brusk. Imidlertid er den prediktive verdi av slike modeller funnet å være begrenset, og disse analyser krever store mengder celler og er tidkrevende.

WO2004/66723 gir en in vivo-modell der effekten av forbindelser på bein- og bruskdannelse i zebrafisk evalueres in vivo. En av de mest pålitelige modeller for å bedømme evnen hos celler til å danne stabil brusk er den intramuskulære implantering av celler i nakne mus fulgt av histologisk evaluering av de genererte implantater. Bruken av denne nakenmusmodell som i seg selv er tidkrevende og upraktisk for screening i stor målestokk, ble unngått med den teknologi som er beskrevet i WO01/24833. Denne søknad beskriver bruken av molekylære markører, identifisert basert på nakenmusmodellen for bruskdannelse, for å evaluere det kondrogenpotensialet av ekspanderte eller førte celler for transplantasjonsformål. Tilsvarende er et sett av egnede markører for kondrocytt-fenotypisk stabilitet beskrevet i US2003/235813. Imidlertid, mens identifiseringen av disse markører ga en basis for identifisering av cellepopulasjoner i stand til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo, er det fremdeles behov for ytterligere forbedring.

US 2002009730 A1 beskriver probesammensetninger av polynukleotider som tilsvarer humane stressgener.

Foreliggende oppfinnelse er basert på det nye konsept med tilveiebringelse av en spesifikk markørprofil som er indikerende for bruskdannelse under enhver omstendighet, det vil si uansett nativ til cellene eller indusert, og som kan anses som målprofilen i identifiseringen av faktorer i stand til å påvirke bruskdannelse.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et sett av markører som på pålitelig måte kan benyttes til å forutsi det bruskdannende potensialet for en populasjon av celler. Ekspresjonsnivået for disse markører kan benyttes for å forutsi hvorvidt en cellepopulasjon, for eksempel in vitro eller in vivo, er i stand til å produsere brusk in vivo ved implantering eller stimulering. Dette er av interesse for å bestemme det terapeutiske potensialet for en cellepopulasjon. Settet av markører gir også et pålitelig verktøy for å bestemme innflytelsen av en gitt behandling på kondrocyttfenotypisk stabilitet for en populasjon av celler før implantering. Videre tilveiebringer oppfinnelsen kombinerte behandlingsregimer omfattende administrering av stamceller eller osteokondrale celler til et ledd og administrering av et medikament som påvirker det kondrogene potensialet av den administrerte cellepopulasjon.

I henhold til oppfinnelsen blir den fenotypiske stabilitet for en cellepopulasjon in vitro benyttet i screeningsanalyser for identifisering av faktorer i stand til å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet in vitro og/eller in vivo. Oppfinnelsen tilveiebringer et sett av markører som er indikerende for kondrocyttfenotypisk stabilitet hvis ekspresjon benyttes for å forutsi effekten in vitro eller in vivo av forbindelser og/eller tilstander på evnen for en cellepopulasjon til å gi brusk in vivo. Bruken av disse markører i screeningsanalyser tillater screening av et stort antall forbindelser og/eller tilstander på kondrocytter uten å gjennomføre tidskrevende og omstendelige dyreforsøk.

I et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen metoder for å bestemme evnen for en cellepopulasjon til å produsere stabil hyalinbrusk. Mer spesielt tilveiebringes det metoder for å bestemme in vitro evnen for en cellepopulasjon til å produsere en stabil hyalinbrusk in vivo. I spesielle utførelsesformer tilveiebringes det metoder som omfatter bestemmelse av ekspresjonen av cellepopulasjonen av et sett på minst tre markørgener omfattende FRZB (Frizzled-relatert protein 1), ALK1 (aktivin A-reseptor, type II-liknende kinase 1) og en eller flere markører valgt fra gruppen bestående av PEDF (pigmentepitelavledet faktor), COL11 (kollagen type XI A1), COL2 (kollagen type II α1), FGFR3 (fibroblastvekstfaktorreseptor 3), OPN (osteopontin), BMP-2 (beinmorfogenetisk protein 2) og RASF-PLA (fosfolipase A2, gruppe IIA).

I spesielle utførelsesformer av oppfinnelsen blir cellepopulasjonen brakt i kontakt med en forbindelse eller tilstand.

I spesielle utførelsesformer tilveiebringes det metoder som omfatter å bringe en populasjon av celler i kontakt med en forbindelse eller tilstand og så å bestemme ekspresjonsnivået i populasjonen av celler av et sett av minst tre markørgener omfattende FRZB, ALK1 og ett eller flere markørgener valgt fra gruppen bestående av PEDF, COL11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 og RASF-PLA. I disse metoder er ekspresjonsnivået av settet av minst tre markører indikerende for evnen hos cellene til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo, for eksempel ved implantering i en pasient.

Ytterligere utførelsesformer av fremgangsmåtene som beskrevet her, omfatter trinnene, før kontakt mellom cellepopulasjonen med en forbindelse eller tilstand, bestemmelse i populasjonen av celler av ekspresjonsnivået av settet av minst tre markørgener og, etter kontakttrinnet, bestemmelse hvorvidt nærvær av forbindelsen eller tilstanden påvirker ekspresjonen i cellepopulasjonen av en eller flere av settet av minst tre markørgener. Mer spesielt tilveiebringes det metoder omfattende bestemmelse av, basert på effekten av nærværet av forbindelsen eller tilstanden på ekspresjonsnivået av settet av minst tre markørgener i cellepopulasjonen, effekten av forbindelsen eller tilstanden på evnen hos cellepopulasjonen til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo. I spesielle utførelsesformer av metodene som beskrevet her, blir forbindelsene eller tilstandene i stand til å øke ekspresjonen av ett eller flere positive markørgener valgt fra gruppen bestående av FRZB, COL11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 og RASF-PLA identifisert som positivt å påvirke bruskdannelse og forbindelser i stand til å øke ekspresjonen av enten PEDF og/eller ALK-1, identifiseres som negativt å påvirke bruskdannelse, mer spesielt evnen hos celler til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo.

I ytterligere spesielle utførelsesformer av metodene som beskrevet her, er settet av markører et sett på minst 4, 5 eller 6 markørgener omfattende FRZB, ALK1 og omfattende respektivt 2, 3 og 4 markørgener valgt fra gruppen bestående av PEDF, COL11, COL2 og FGFR3. Mer spesielle utførelsesformer av metoder som beskrevet her, angår metoder der markørgenene er et sett på minst seks markørgener omfattende FRZB, ALK1, PEDF, COL11, COL2 og FGFR3.

I spesielle utførelsesformer av de her beskrevne metoder blir evnen for en forbindelse eller tilstand til å påvirke bruskdannelse bestemt basert på den kumulative effekt av forbindelsen eller tilstanden på ekspresjonen av settet av minst tre markørgener. Mer spesielt er den kumulative effekt av forbindelsen eller tilstanden på ekskresjonen av de positive markørgener valgt fra gruppen bestående av FRZB, COL11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 og RASF-PLA og den kumulative effekt av forbindelsen eller tilstanden på ekspresjonen av negative markørgener PEDF og/eller ALK-1, er indikerende for evnen hos forbindelsen eller tilstanden til å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon.

I spesielle utførelsesformer av metodene som beskrevet her, oppnås populasjonen av celler fra et ledd. Populasjonen av celler oppnås fra en frisk donor eller fra et individ med en osteokondral defekt. I spesielle analyser tas det sikte på effekten av en forbindelse eller tilstand på begge typer celler. I spesielle utførelsesformer av metoder som beskrevet her, blir ekspresjonsnivået for en eller flere av markørene bestemt ved en kvantitativ metode.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen angår bruken av et sett av markører for å identifisere en forbindelse som er i stand til å påvirke evnen hos celler og mer spesielt kondrocytter eller kondrocyttforløperceller, til å produsere brusk in vivo. I spesielle utførelsesformer blir anvendelsen karakterisert ved at settet av markører omfatter et sett av minst tre markørgener omfattende FRZB, ALK1 og en eller flere markører valgt fra gruppen bestående av PEDF, COL11, COL2, FGFR3, OPN, BMP-2 og RASF-PLA. I spesifikke utførelsesformer involverer anvendelsen et sett av minst seks markørgener omfattende FRZB, ALK1, PEDF, COL11, COL2 og FGFR3.

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes det sett omfattende prober for detektering av ekspresjonen av sett av gener i bruskdannende celler der settet av gener omfatter et sett av minst tre markørgener bestående av FRZB, ALK1, PEDF, COL11, COL2 og FGFR3.

Spesielle utførelsesformer av settene som tilveiebringes her, er sett der prøvene er oligonukleotider som hybridiserer med mRNA der probene er antistoffer og/eller der probene er sett av PCR-primere som er spesifikke for markørene som skal testes. Det tas sikte på sett som omfatter forskjellige typer prober. I ytterligere spesielle utførelsesformer av settene tilveiebringes det merkede prober.

I nok et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes innretninger for detektering av ekspresjonen av et sett av markørgener i celler som typisk er i stand til bruskdannelse, hvor settet av markørgener er et sett på seks markørgener bestående av FRZB, ALK1, PEDF, COL11, COL2 og FGFR3. I spesielle utførelsesformer av slike innretninger tilveiebringes det en enhet for detektering av ekspresjonen av markørgener og prober for nevnte sett av seks markørgener.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjoner

Uttrykket "kondrogenisk", anvendt på en celle eller en populasjon, henviser til den inherente kapasitet for cellen eller populasjonen til å produsere brusk eller stimulere bruskvekst, under egnede betingelser.

En "kondrogenisk forbindelse" som benyttet her, henviser til en forbindelse som induserer en stabil kondrocyttfenotype og/eller fremmer bruskdannelse.

Uttrykket "kondrocyttfenotypisk stabilitet" eller "kondrogenisk potensiale" henviser, når det gjelder en cellepopulasjon, til evnen for cellepopulasjonen til å produsere brusk in vivo. Denne evne kan testes ved (ektopisk) å injisere en fraksjon av cellepopulasjonen (minst rundt 1-20 x 10<6>celler) i et pattedyr (in vivo), for eksempel immundefekte mus, og så å bestemme (innen en tidsramme på rundt 3 uker) utviklingen av et bruskimplantat uten tegn på vaskulær invasjon, mineralisering eller erstatning med bein eller fibrøst vev. Alternativt kan en fraksjon av cellepopulasjonen (minst 1-20 x 10<6>celler per cm<2>) såes på eller innkapsles i en biokompatibel matriks og implanteres subkutant under huden i rundt 6-8 uker før bestemmelse av utviklingen av et stabilt bruskimplantat uten tegn på vaskulær invasjon eller endokondral beindannelse. I henhold til foreliggende oppfinnelse karakteriseres en populasjon av celler som er i stand til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo, karakterisert ved nærværet av en spesifikk kombinasjon av markører for fenotypisk stabilitet som beskrevet her. Kondrocyttfenotypisk stabilitet går gradvis tapt i mature kondrocytter ved føring.

Uttrykket "nyisolerte celler" (FI) som benyttet her henviser til cellepopulasjonen oppnådd fra en biopsi etter vevdigestering. Uttrykket "nyisolerte bruskceller" som benyttet her henviser således til cellepopulasjonen som direkte er oppnådd fra et kondrocyttholdig vev som brusk, ved digestering, uten føring.

Uttrykket "ekspandert" indikerer, når det henvises til en cellepopulasjon oppnådd fra et vev som brusk, at cellepopulasjonen er anbrakt under betingelser der antallet celler er økt ved proliferering. I sin enkleste versjon blir ekspansjonen gjennomført ved å tilveiebringe cellepopulasjonen i en dyrkningsresipient med et dyrkingsmedium, eventuelt inntil konfluens. Populasjonen som oppnås som et resultat av ekspandering av nyisolerte celler angis som P0.

Uttrykket "førte" henviser til celler som er ekspandert og som etter ekspansjon er høstet fra dyrkningsresipienten ved bruk av enzymatiske, kjemiske og/eller fysiske metoder og anbrakt ved en lavere densitet i en ytterligere dyrkingsresipient. Førte celler angis ved sitt førings- eller passasjetall (P1, P2, etc.), deres tid under dyrking eller alternativt ved antallet av populasjonsfordoblinger (PD1, PD2, etc.).

Uttrykket "bruskdefekt" som benyttet her henviser til en hvilken som helst tilstand som skyldes tap eller skade av brusk eller enhver syk del av brusken.

Uttrykket "markørbedømmelse" blir som sådan benyttet for å henvise til en numerisk verdi som kan tilskrives ekspresjonen av en markør ifølge oppfinnelsen. Den 'kumulative markørbedømmelse' henviser til kombinasjonen av markørbedømmelse for de forskjellige markører i settet av markører ifølge oppfinnelsen. Dette kan være resultatet av en sum av de individuelle markører. Alternativt tar den kumulative markørbedømmelse med i betraktning bidraget fra hver markør når det gjelder evnen til å prediktere kondrocyttfenotypisk stabilitet og er i henhold til dette basert på en mer kompleks, matematisk formel.

Uttrykket "histologibedømmelse" henviser til en kvalitativ eller semi-kvalitativ verdi tilskrevet brusk, basert på en histologisk analyse (for eksempel ingen brusk, fibrobrusk, hyalinbrusk).

Forkortelsene som benyttes for genene innen foreliggende oppfinnelses kontekst er:

FRZB: Frizzled-relatert protein 1 [OMIM 605083, Genbank U91903]

ALK1: Aktivin A reseptor, type II-liknende kinase 1

[OMIM 601284, Genbank Z22533]

PEDF: pigmentepitelavledet faktor [OMIM 172860, Genbank M76979]

COL11: kollagen, type XI A1 [OMIM 120280, Genbank J04177] COL2: kollagen, type II, α 1 [OMIM 120140, Genbank

L10347]

FGFR3: fibroblastvekstfaktorreseptor 3 [OMIM 134934, Genbank M58051]

BMP-2: beinmorfogenetisk protein 2 [OMIM 112261, Genbank M22489]

RASF-PLA2: fosfolipase A2, gruppe IIA [OMIM 172411, Genbank M22430]

OPN: osteopontin [OMIM 166490, Genbank X13694]

Foreliggende oppfinnelse er basert på identifiseringen av et valgt sett av markørgener hvis ekspresjon er funnet å være indikerende for evnen til bruskdannelse av celler in vivo. Mer spesielt er det bestemt at ved å gi hver av disse markører en verdi, reflekterer den kumulative verdi som kan uttrykkes som en kumulativ markørbedømmelse, evnen for en cellepopulasjon til å produsere fenotypisk stabil brusk in vivo.

Markørgenene som er identifisert ifølge oppfinnelsen som nyttige ved bedømmelse ved bedømmelsen av evnen for en cellepopulasjon til å sikre bruskdannelse, er valgt fra gruppen som inkluderer de positive markørgener FRZB, COL11, COL2, FGFR3, BMP-2, RASF-PLA2 og OPN og de negative markørgener ALK1 og PEDF. Ytterligere markører kan inkluderes i settet, for eksempel som kontroller.

Ifølge oppfinnelsen er således et sett av 9 markører identifisert, omfattende både positive og negative markører. Positive markører uttrykkes sterkt av populasjoner i stand til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo, mens negative markører uttrykkes i lave nivåer eller uttrykkes ikke av populasjoner i stand til å produsere stabil hyalinbrusk. I henhold til foreliggende oppfinnelse kan fraværet av ekspresjon av en negativ markør tjene som en positiv markør. Innen foreliggende oppfinnelses kontekst er imidlertid slike markører hvis fravær av ekspresjon er indikerende på evnen til kondrocyttfenotypisk stabilitet, angitt som negative markører.

Ekspresjon av markørgenene ifølge oppfinnelsen er et trekk som er karakteristisk for en cellepopulasjon og består typisk av rundt 0,2x10<5>-1,0x10<6>celler.

Forskjellige metoder for å bestemme ekspresjon av gener er velkjent på området. Mest typisk blir ifølge oppfinnelsen RNA isolert fra en fraksjon av cellepopulasjonen (typisk mellom 0,2 x 10<5>og 1,0 x 10<6>celler og særlig mellom 0,2 x 10<6>og 1 x 10<6>) og forsterket ved bruk av revers PCR. Slik forsterking kan gjennomføres på en semi-kvantitativ måte via elektroforese av forsterkede fragmenter og måling av deres relative intensitet sammenliknet med den til et husholdningsgen som βaktin. Imidlertid kan lavere mengder av celler og sågar individuelle celler analyseres for ekspresjon av celler ved bruk av nukleotidforsterkingsteknikker. I tillegg eller alternativt måles mengden DNA på en kvantitativ måte ved bruk av for eksempel Taqman-teknologien. Primere som er egnet for markørene som nevnes her, kan lett identifiseres av fagmannen basert på kjente sekvenser av markørgenene.

Alternativt eller i tillegg kan ekspresjonen av markørene måles på proteinnivået. Proteinnivåer kan bestemmes ved immunologiske metoder som Western blot eller ELISA.

I spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen blir ekspresjonen av markører evaluert ved å sammenlikne ekspresjonen av markører i en kontrollpopulasjon og en eksperimentell populasjon, for eksempel via mikroarrayteknologi eller analyse etter 1D- eller 2D-proteinelektroforese. Her migrerer markørproteinene i en gel i henhold til deres Mr (1D) og deres isoelektriske punkt (IEP) (2D). Forskjeller i ekspresjonen på proteinnivået kan måles ved å detektere mengden av protein som er til stede på posisjonen som tilsvarer dens Mr og/eller IEP. Proteiner kan kvantiteres etter farging med Coomassie Brilliant Blue eller en ekvivalent farge eller kan kvantiteres ved innarbeiding av en radioaktiv, metabolsk merkelapp (for eksempel<35>S-metionin).

Avhengig av den benyttede teknologi kan antistoffer, oligonukleotidprober eller proteinprober (som antistoffer) merkes, for eksempel med kromofore eller magnetiske eller radioaktive merkelapper, for å tillate detektering av ekspresjon.

I spesifikke utførelsesformer tas det sikte på å detektere forskjellige markører ved forskjellige teknikker. For eksempel blir et antall markører detektert ved ELISA, mens andre detekteres via PCR.

Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringer en innretning som er egnet for detektering av et sett av minst seks markørgener omfattende FRZB, ALK1, PEDF, COL11, COL2 og FGFR3, idet innretningen omfatter en enhet for direkte eller indirekte å detektere markørene ifølge oppfinnelsen (på DNA-, RNA- eller proteinnivå). Enheten kan være basert på RNA, DNA-hybridering eller basert på immunologisk detektering. En slik enhet kan være en (kvantitativ) PCR-apparatur, en innretning for å gjennomføre immunologiske analyser eller en innretning for å bestemme proteiner (for eksempel HPLC, massespektrometer, elektroforeseapparatur), men kan også være en (engangs) mikroarrayinnretning eller brikke. En slik enhet er, der det er hensiktsmessig, utstyrt med prober eller antistoffer for detektering av markørgenene eller proteinene ifølge oppfinnelsen. Eventuelt kan en slik innretning videre omfatte en celledyrkingsenhet der to eller flere cellepopulasjoner kan dyrkes under identiske eller forskjellige betingelser (for eksempel densitet, passasje- eller føringstall, mediumsammensetning). Videre kan innretningen ifølge oppfinnelsen omfatte en enhet for avlevering av en eller flere testforbindelser til celledyrkningsenheten (hvilken avlevering individuelt kan varieres i mengde- eller tidsprofil). Til slutt kan innretningen omfatte en enhet for samling av celler og isolering av cellulært materiale (DNA, RNA, proteiner).

I tillegg er det tatt sikte på engangspatroner omfattende prober eller spesifikke reagenser for markørene som beskrevet her og som kan benyttes for å bestemme ekspresjonen av disse markører for en hurtig og effektiv bestemmelse av status for en cellepopulasjon. I henhold til dette tar oppfinnelsen sikte på automatiserte innretninger som eventuelt kombineres med engangspatroner og som tillater effektiv kvalitetskontroll av celler for bruk i in vivo- eller in vitro-anvendelser.

Det blir tilveiebrakt subsett av de identifiserte markørgener som tillater en pålitelig bedømmelse av den kondrocyttfenotypiske stabilitet for en cellepopulasjon eller av evnen for en forbindelse eller tilstand til å påvirke bruskdannelse av en cellepopulasjon in vivo. Mer spesielt omfatter egnede sett av markørgener minst 3, spesielt minst 4, helst minst 5 og aller helst minst 6 av de identifiserte markørgener.

Generelt gjelder at desto lavere antall markørgener som tas med i betraktning, desto større er innvirkningen av både målefeil og potensiell feilaktig ekspresjon av en spesiell markør. De forskjellige markører reflekterer også de forskjellige prosesser (for eksempel anabolske prosesser, katabolske prosesser, osv.) og veier som er involvert i kondrocyttcellemetabolisme (signalveier, reseptorer og ligander, matrikskomponenter, prosesseringsenzymer, osv.), og hver av disse prosesser kan ha en individuell innvirkning på kondrocyttfenotypisk stabilitet. Derfor gjelder at jo flere markørgener som tas med i betraktning, desto mer representativ blir analysene for den fullstendige omgivelse som sikrer stabil bruskdannelse. På den annen side er det slik at desto flere markørgener som må bestemmes, jo mer teknisk komplisert blir analysen, på bekostning av enkel bruk i høygjennomløpsscreening. For videre å opprettholde relevansen av bidraget av hvert av markørgenene til den totale bedømmelse, bør antallet markørgener holdes under 10. Således vil forandring av ekspresjonen av et enkelt markørgen i et stort sett av markørgener være av liten innflytelse på den totale ekspresjonsbedømmelse av markørgenene. Basert på disse argumenter og på det observerte, relative bidrag av de forskjellige identifiserte markører, er det bestemt at ethvert antall av markører mellom 3 og 9 er egnet for å bestemme kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon eller å bedømme innvirkningen av en forbindelse eller tilstand på kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon. I henhold til en utførelsesform er et sett på 5, 6 eller 7 markører et optimalt kompromiss mellom nøyaktigheten av den oppnådde bedømmelse fra et slikt sett av markører og den praktiske nytte av analysen i screening med høyt gjennomløp.

Det beskrives et sett på minst tre markører som er representative for bruskdannelse, valgt fra gruppen bestående av de positive markørgener FRZB, COL11, COL2, FGFR3, BMP-2, RASF-PLA2 og OPN og de negative markørgener ALK1 og PEDF.

Settet av minst tre markører som utgjør de kondrogeniske potensielle markører, det vil si er representative for bruskdannelse, kan inkludere FRZB, ALK1 og et markørgen valgt fra gruppen bestående av PEDF, COL11, COL2, FGFR3, BMP-2, RASF-PLA2 og OPN. Mer spesielt inkluderer settet av minst tre markører som er representative for bruskdannelse, FRZB, ALK1 og et markørgen valgt fra gruppen bestående av PEDF, COL11, COL2 og FGFR3. Det beskrives sett på minst 4, 5 eller 6 markørgener omfattende FRZB, ALK1 og respektivt 2, 3 og 4 markører valgt fra gruppen bestående av PEDF, COL11, COL2, FGFR3, BMP-2, RASF-PLA2 og OPN. Mer spesielt omfatter settet av minst 4, 5 eller 6 markørgener FRZB, ALK1 og respektivt 2, 3 og 4 markører valgt fra gruppen bestående av PEDF, COL11, COL2 og FGFR3. I henhold til en spesiell utførelsesform blir et sett på seks markørgrener benyttet for å bedømme evnen til å produsere stabil brusk in vivo der settet består av FRZB, ALK1, PEDF, COL11, COL2 og FGFR3. Den kumulative bedømmelse av dette sett av markørgener som beskrevet i eksempel 1, angis her som "ChondroCelect<TM>markører" (CC markører) og angis også som "ChondroCelect<TM>bedømmelse". Alternativt omfatter settet av markører en variasjon av dette sett av kondrogeniske potensielle markører der en av markørene PEDF, COL11, COL2 og FGFR3 er erstattet med en markør valgt fra gruppen RASF-PLA2, OPN og BMP-2. Mer spesielt omfatter settet av markører en variasjon av de ovenfor beskrevne, kondrogeniske potensielle markører der en av de positive markører COL11, COL2 er erstattet med enten RASF-PLA, OPN eller BMP-2. Eksempeldelen her viser at markørbedømmelser basert på ekspresjonen av settene av markører som beskrevet her av en kondrogenisk cellepopulasjon på pålitelig måte forutsier arten av brusk som produseres av cellepopulasjonen (som bestemt ved histologisk analyse).

I henhold til et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for å bestemme kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon. Mer spesielt tilveiebringer oppfinnelsen anvendelsen av settet av markørgener som beskrevet her som et verktøy ved bedømmelse av kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon. Dette er av betydning for eksempel ved kvalitetskontroll av cellepopulasjoner som benyttes ved transplantering av celler innen konteksten behandling av bruskdefekter. Disse metoder karakteriseres ved at de omfatter et trinn med bestemmelse av ekspresjonen av cellepopulasjonen av et sett av markørgener som beskrevet her. Mer spesielt blir ekspresjonen av et sett av markørgener ifølge oppfinnelsen, eventuelt uttrykt som en kumulativ markørbedømmelse og mer spesielt kondrogenisk potensialbedømmelse, benyttet som en indikasjon på kvaliteten av en cellepopulasjon for implanteringsformål. Typisk blir kvalitetsbedømmelse av en cellepopulasjon gjennomført i et laboratorium ved bruk av standardteknikker slik som de som er beskrevet her, og resultatet av bedømmelsen genereres i en rapport eller oppsummeres i et kvalitetskontrollark. Cellepopulasjonen kan være P0 eller enhver passasje av en cellepopulasjon oppnådd fra et human- eller animalvev. I henhold til en utførelsesform er cellepopulasjonen mellom P2 og P6 av en populasjon oppnådd fra en humanbruskbiopsi. Alternativt kan antallet populasjonsdoblinger tas med i betraktning. For de fleste cellepopulasjoner som betraktes innen foreliggende oppfinnelses kontekst, involverer hver passasje 2-3 populasjonsfordoblinger. I henhold til foreliggende oppfinnelses kontekst blir cellepopulasjonen bedømt etter 1 eller 2 populasjonsfordoblinger (P0). Eventuelt er cellepopulasjonen en kombinasjon av forskjellige passasjer (eventuelt inkludert P0) av celler fra en eller forskjellige biopsier. Der autolog transplantering av celler er tilsiktet, blir cellene oppnådd fra en eller flere biopsier fra en spesifikk pasient eventuelt kombinert og kontrollert på kondrocyttfenotypisk stabilitet (før og/eller etter kombinasjon derav). Typisk blir kvalitetsbedømmelsen gjennomført til forskjellige tidspunkter, for eksempel før implantering (som celler eller 2D- eller 3D-vev i et stillas eller en matriks), før lagring (for eksempel frysing) og/eller henting fra lagring, før og/eller etter å ha underkastet cellepopulasjonen spesifikke behandlinger og/eller betingelser.

Således er formålet ved et aspekt ved oppfinnelsen å bestemme evnen for en cellepopulasjon til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo før enten direkte implantering, eller såing på eller innkapsling i en biokompatibel matriks og etterfølgende implantering. Markørbedømmelse er indikerende på evnen for cellepopulasjonen eller cellene til å sikre et bruskimplantat uten tegn på vaskulær invasjon eller endokondral beindannelse.

Typisk blir ekspresjonen av markørene for bestemmelse av markørbedømmelsen ifølge oppfinnelsen gjennomført på en cellepopulasjon som en helhet hvorved en representativ prøve tas for å bestemme, ved metoder som de som er beskrevet her, hvorvidt eller ikke markørene uttrykkes av cellepopulasjonen som undersøkes. Alternativt kan individuelle celler kontrolleres for ekspresjonen av spesifikke gener ved bruk av i og for seg kjente, cellespesifikke metoder.

I henhold til et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen metoder for å bestemme effekten av en forbindelse eller tilstand på evnen hos kondrogeniske celler til å produsere stabil hyalinbrusk in vivo der metodene benyttes som screeningsverktøy. Disse metoder omfatter å bringe en kondrogenisk cellepopulasjon i kontakt med en forbindelse eller tilstand og så å bestemme ekspresjonen av et sett av markørgener ifølge oppfinnelsen av denne cellepopulasjon.

I henhold til dette tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter og analyser for å identifisere forbindelser eller tilstander som påvirker den kondrogeniske kapasitet for en populasjon av celler. I henhold til en utførelsesform blir fremgangsmåten benyttet for å identifisere adekvate betingelser for dyrking, lagring og/eller administrering av cellepopulasjoner for transplantering innen konteksten av behandlingen av bruskdefekter. I slike metoder blir en kondrogenisk cellepopulasjon underkastet spesifikke betingelser, og ekspresjonen av markørgenene bestemmes. Typiske tilstander er spesifikke dyrkingsmedier, dyrkingstemperaturer, dyrkingstider, dyrkingsdensitet, osv., så vel som kombinasjoner med andre celletyper. I tillegg eller alternativt benyttes metodene og analyser for identifisering av molekylærfaktorer i stand til å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet for kondrogene celler. Slike faktorer kan inkludere vekstfaktorer, mitogener, additiver, små kjemiske molekyler, osv. Formålet med screeningen kan være å identifisere faktorer som er nyttige ved dyrking, lagring eller administrering av cellepopulasjoner for transplantasjoner innen konteksten behandling av bruskdefekter. Typisk er faktorer av interesse er slike som er i stand til positivt å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon, og/eller faktorer som positivt påvirker andre trekk ved cellene (for eksempel celleantall, -stabilitet, osv.), og/eller parametere for dyrkingsbetingelsene (for eksempel lagringstid, antall passasjer som kan benyttes, osv.) uten negativt å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet for cellepopulasjonen.

Ytterligere eller alternativt er analysene og metodene ifølge oppfinnelsen nyttige ved screening og identifisering av forbindelser med en potensiell effekt in vivo på bruskdannelse av kondrogeniske celler. Bruken av screeningmetodene ifølge oppfinnelsen er tatt sikte på for identifisering av forbindelser som påvirker bruskdannelse av lokale celler i kroppen hos en pasient som skal behandles, og/eller bruskdannelser av celler som benyttes innen konteksten celletransplantering. Screeningmetodene kan benyttes for å identifisere og/eller evaluere forbindelser som kan motvirke faktorer eller tilstander som opptrer i patologiske situasjoner. For eksempel kan celler stimuleres, for eksempel med IL-1 (for å stimulere inflammatoriske tilstander, for å forsterke katabolske veier og for å nedregulere anabolske prosesser) før tilsetning av forbindelser som potensielt motvirker denne effekt.

Også tatt sikte på innen rammen av oppfinnelsen er bruken av markørgenene for bedømmelse av de potensielle bivirkninger av de terapeutiske forbindelser inkludert de som benyttes utenfor konteksten bruskreparasjon, på evnen hos kondrogeniske celler til å produsere brusk in vivo. Metodene ifølge oppfinnelsen tillater potensielt den direkte identifisering av effekter av forbindelser på beindannelse som, når de testes direkte in vivo, kun kan merkes over lengre tid.

Fremgangsmåtene relatert til screening av forbindelsene vil typisk omfatte et trinn med å bringe en kondrogenisk cellepopulasjon i kontakt med en eller flere forbindelser av interesse og så å bestemme ekspresjonen av et sett av markørgener som beskrevet her av den kondrogeniske cellepopulasjon. Metodene tillater høygjennomløpsscreening av for eksempel biblioteker av kjemiske forbindelser, peptidbiblioteker, ekspresjonsbiblioteker, osv.

Det beskrives fremgangsmåter som omfatter trinnet med sammenlikning av ekspresjonen av et sett av markørgener ifølge foreliggende oppfinnelse i en cellepopulasjon hvortil en eller flere forbindelser er satt som har vært underkastet en spesiell betingelse med ekspresjonen av settet av markørgener i fravær av forbindelsen eller tilstanden i den samme eller en annen cellepopulasjon. I en typisk utførelsesform blir en eller flere forskjellige fraksjoner som stammer fra de samme cellepopulasjoner underkastet forskjellige betingelser og/eller forbindelser for sammenlikning med hverandre og/eller med en positiv og/eller negativ kontroll. Den negative kontroll kan være en blank eller en forbindelse som er kjent for ikke å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet. Den positive kontroll kan være en forbindelse eller tilstand som er kjent for (positivt eller negativt) å påvirke den fenotypiske stabilitet for en cellepopulasjon.

I screeningmetodene kan forskjellige parametere bedømmes. Celler kan såes i individuelle resipienter eller i flersjiktsplater ved forskjellige densiteter. Celler kan inkuberes i forskjellige tidsrom før tilsetning av en forbindelse/faktor eller legge på en tilstand eller begge deler.

Forskjellige regimer og kombinasjoner av forbindelser og dyrkingsbetingelser kan kombineres. Forbindelser/faktorer kan føyes til ved forskjellige konsentrasjoner og forbli i kontakt med cellene for forskjellige tidsrom. Det samme gjelder dyrkingsbetingelser.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den observasjon at evnen hos en cellepopulasjon til å produsere hyalinbrusk in vivo etter implantering kan forutsies basert på ekspresjonen av spesifikke gener (markørgenene) av den cellepopulasjon in vitro, før implantering. Således blir ekspresjonen av markørgenene benyttet for å overvåke den kondrogeniske "kvalitet" av cellene før implantering og effektene av forbindelser og tilstander derpå. Som detaljert nedenfor kan ekspresjonen av genene uttrykkes som en markørbedømmelse hvorved det (relative) ekspresjonsnivå for de forskjellige markørgener adderes opp for å oppnå en verdi som kan sammenliknes med den optimale verdi (det vil si høy ekspresjon av alle positive markører, lav ekspresjon av alle negative markører som studeres). I tillegg eller alternativt kan screeningen ta med i betraktning evnen for forbindelsene eller tilstandene til å innvirke på en hvilken som helst markør innen dette sett av gener.

Ekspresjonen av markørgenene ifølge oppfinnelsen kan bedømmes basert på absolutte eller relative verdier. Typisk benyttes ekspresjonen av markørgenet sammenliknet med et "husholdnings"-gen. Dette eksemplifiseres her med aktin. Da ekspresjonsnivåene for forskjellige husholdningsgener kan være forskjellige, vil fagmannen på området forstå at den relative ekspresjon av markørgenene sammenliknet med det avlagte husholdningsgen vil måtte etableres på forhånd i en populasjon med kondrocyttfenotypisk stabilitet for hvert benyttet husholdningsgen. I henhold til oppfinnelsen er den kombinerte informasjon når det gjelder ekspresjonen av de valgte markører indikerende for hvorvidt eller ikke cellene er i stand til bruskdannelse in vivo.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på anvendelsen av markørkombinasjonene som beskrevet her både innen konteksten bedømmelse av kvaliteten av en gitt cellepopulasjon og for evaluering av innflytelsen av faktorer/tilstander på evnen hos cellene til å produsere brusk etter implantering in vivo. Der settet av markører benyttes for å bestemme effekten av en forbindelse, celle eller tilstand på evnen for en cellepopulasjon til å produsere hyalinbrusk in vivo, kan effekten være basert på å bestemme 'økt' eller 'redusert' ekspresjon av markørgenene ifølge oppfinnelsen i forhold til en kontroll eller i forhold til ekspresjonsnivået før kontakt mellom cellepopulasjonen og forbindelsen eller tilstanden. I denne forbindelse kan forbindelser, celler eller tilstander som øker ekspresjonen av ett eller flere positive markørgener og/eller reduserer ekspresjonen av ett eller flere negative markørgener ifølge oppfinnelsen, betraktes som i stand til positivt å påvirke bruskdannelse. Forbindelser, celler eller betingelser som reduserer ekspresjonen av ett eller flere positive markørgener og/eller øker ekspresjonen av ett eller flere negative markørgener ifølge oppfinnelsen, kan anses som i stand til negativt å påvirke bruskdannelse.

Ekspresjonen av de forskjellige markørgener i settet av markører av en cellepopulasjon er representert ved en 'kumulativ markørbedømmelse' som korrelerer med og er indikerende for kondrocyttfenotypisk stabilitet for cellepopulasjonen. Den kumulative markørbedømmelse benyttes for den kvalitative og/eller kvantitative tolking av resultatene i metodene og analysene ifølge oppfinnelsen.

Forskjellige typer markørbedømmelser tas sikte på innen oppfinnelsens kontekst. Ekspresjonsnivået for et sett av markører kan representeres ved en numerisk verdi som er/tilsvarer summen av det absolutte ekspresjonsnivå av hvert av genproduktene i markørsettet. En slik beregningsmetode kan benyttes når en kvantitativ detektering av ekspresjonen av markørgenene gjennomføres for eksempel ved kvantitativ PCR eller ELISA.

Alternativt kan ekspresjonsnivået for hvert av genene i markørsettet representeres ved et forhold, det vil si at ekspresjonsnivået av et gen sammenliknes med det til et annet gen som et husholdningsgen som anses å ha et likt ekspresjonsnivå uansett behandling av en celle eller der ekspresjonen anses som relativt stabil, uavhengig av evnen hos cellen til å produsere stabil hyalinbrusk. Dette vil resultere i at verdiene for ekspresjonsnivåene for de forskjellige markører blir mer sammenliknbare (og som oftest innen 0,001- til 10-området). I henhold til dette kan den kumulative markørbedømmelse være summen av forholdene for hvert markørgen.

Under visse betingelser er imidlertid den kumulative markørbedømmelse ikke basert på de absolutte eller relative verdier av ekspresjonen for hvert av markørgenene, men på den kvalitative bedømmelse av denne ekspresjon.

I henhold til en spesifikk utførelsesform blir kvalitativ bedømmelse av markørgenene vilkårlig gitt en numerisk verdi, for eksempel '1'. Mer spesielt blir økt/høy ekspresjon av de positive markører tilskrevet verdien '1' og fravær av ekspresjon av en negativ markør tilskrives også verdien '1'. Mest spesielt blir områder for ekspresjonsnivåer (eller forhold mellom ekspresjon) definert både for ekspresjonsnivåer av positive markørgener og for negative markører av kondrocyttfenotypisk stabilitet, hvorved ekspresjonsnivåer som ligger innenfor de på forhånd bestemte områder, tilskrives en verdi. I henhold til en ytterligere utførelsesform blir ekspresjonsnivåer som faller utenfor de på forhånd bestemte områder for ekspresjon av positive og/eller negative markørgener (for eksempel når meget lav ekspresjon av et positivt markørgen observeres eller meget høy ekspresjon av et negativt markørgen) også tilskrevet en verdi.

Når man bestemmer den relative innvirkning av hvert av markørgenene i den kumulative markørbedømmelse, kan ekspresjonen av hvert gen ha den samme vekt. Alternativt kan ekspresjonsnivået for ett eller flere gener anses å ha en sterkere innvirkning på kondrocyttfenotypisk stabilitet enn andre gener, noe som kan innarbeides i den relative innvirkning av markørgenene på beregning a den kumulative markørbedømmelse. I henhold til en spesifikk utførelsesform er den relative innvirkning av de forskjellige markører den samme og tilskrives verdien '1' når den faller innen de på forhånd bestemte områder for ekspresjon (eller ekspresjonsforhold), og tilskrives verdien '-1' når den faller utenfor områdene (under eller over de på forhånd bestemte områder for positive henholdsvis negative markører). Eventuelt kan ekspresjonsnivåene innen et visst område anses å tilsvare verdien '0', som tilsvarer et ekspresjonsnivå for de positive eller negative markørgen som ikke positivt eller negativt innvirker på kondrocyttfenotypisk stabilitet i cellen.

I eksempeldelene nedenfor beskrives en ytterligere spesiell utførelsesform av oppfinnelsen. Den kumulative markørbedømmelse som er representativ for en stabil bruskfenotype bestemmes ved et oppsett av opptil seks markører, hver av hvilke tilskrives samme betydning. Ekspresjonen av hver av markørene kvantiteres, og en bedømmelsestilnærmelse basert på ekspresjon relativt et markørgen benyttes. I denne utførelsesform blir bedømmelsen som beregnes fra disse markører, angitt som "den kondrogeniske potensialbedømmelse", det vil si en kumulativ markørbedømmelse som reflekterer den totale ekspresjon av et definert sett av seks markører av bruskfenotypisk stabilitet. I henhold til denne utførelsesform av oppfinnelsen blir ekspresjonsnivået for hvert gen bestemt via semikvantitativ metode, og de oppnådde verdier normaliseres ved sammenlikning med et referansegen (for eksempel β-aktin). Således henviser et ekspresjonsnivå på 1 til en ekspresjon som er den samme som den til aktin, et ekspresjonsnivå under 1 henviser til en ekspresjon som er lavere enn den til aktin (0,1 tilsvarer et ekspresjonsnivå som er 10x lavere enn det til β-aktin), og et ekspresjonsnivå over 1 henviser til et ekspresjonsnivå som er høyere enn det til aktin.

I denne spesifikke utførelsesform av oppfinnelsen tilsvarer ekspresjonsnivået for hvert av markørgenene en av tre mulige bedømmelser. Når det gjelder en positiv markør (FRZ, COL11, COL2, FGFR3), er et meget lavt ekspresjonsnivå (0-0,1) representert ved en bedømmelse på -1, et lavt ekspresjonsnivå (0,1-1) er representert ved en bedømmelse 0, og et høyt ekspresjonsnivå (>1) er representert ved en bedømmelse på 1. For en negativ markør (ALK1, PEDF) gjelder omvendt at et meget lavt ekspresjonsnivå (0,1-1) er representert ved en bedømmelse 1, et lavt ekspresjonsnivå (0,1-1) ved en bedømmelse 0 og et høyt ekspresjonsnivå (>1) ved en bedømmelse -1. Summen av alle disse individuelle bedømmelser representerer ekspresjonsnivået for hele settet av markører som en helhet. For et sett på 6 markører kan bedømmelsen således ligge fra -6 (alle positive markører uttrykt ved et nivå som er lavere enn det til referansen, og alle negative markører uttrykt ved et nivå som er høyere enn det til referansegenet) til 6 (alle positive markører uttrykt ved et nivå som er høyere enn det til referansegenet, og alle negative markører uttrykt ved et nivå som er lavere enn det til referansegenet). Der denne bedømmelse er basert på ekspresjonen av markørene FRZB, COL11, COL2, FGFR3, ALK1 og PEDF av en cellepopulasjon, angis denne bedømmelse her som Chondrocelect<TM>bedømmelsen.

Som vist i eksemplene ifølge oppfinnelsen er det mulig å korrelere ekspresjonsnivåene av et sett av markører så vel som den kumulative markørbedømmelse som oppnås derfra, med kondrocyttfenotypisk stabilitet for en kondrocyttcellepopulasjon. I henhold til dette kan evalueringen av ekspresjonsnivåene av et definert sett markører, eller den (kumulative) markørbedømmelse av en kondrogenisk cellepopulasjon ved administrering av visse forbindelser dertil, benyttes for å evaluere evnen for forbindelsen til å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet av celler og/eller evnen hos cellene til å danne brusk in vivo. Mer spesielt påvises det at tilsetning av spesielle forbindelser til en ekspandert kondrocyttcellepopulasjon forbedrer den kondrogeniske potensialbedømmelse og fenotypen av denne cellepopulasjon. Negative kontroller, for eksempel tilsetning av forbindelser som fremmer beindannelse, reduserer den kondrogeniske potensialbedømmelsen.

I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse kumulative markørbedømmelser som kan benyttes i en cellebasert screeninganalyse for å bedømme innvirkningen av en hvilken som helst faktor eller tilstand på kapasiteten for en kondrogenisk populasjon til å fremstille stabil brusk. I lys av det faktum at den bruskfenotypiske stabilitet for en cellepopulasjon som er identifisert in vitro, er representativ for aktiviteten av cellene in vivo, kan analysen pålitelig benyttes for å identifisere forbindelser i stand til å påvirke bruskdannelse av lokale, kondrogeniske celler ved administrering til bruskdefekten. Viktig er at analyse og markøranalyse som beskrevet ifølge oppfinnelsen, ikke krever noen etterfølgende parallell in vitro- eller in vivobruskdannelsesanalyse for å validere resultatene, noe som dramatisk forkorter og forenkler storskalascreening av forbindelser.

I henhold til oppfinnelsen er bruken av en kumulativ markørbedømmelse et pålitelig og effektivt verktøy for å evaluere kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon og/eller å bedømme effekten av tilstander eller forbindelser på kondrocyttfenotypisk stabilitet for kondrogeniske celler. Påliteligheten av bedømmelsen bestemmes på den ene side av korrelasjonen mellom positive bedømmelser og evnen til å generere fenotypisk stabil brusk in vivo og korrelasjonen mellom negative bedømmelser, og det faktum at cellene ikke er i stand til å generere fenotypisk stabil brusk in vivo. Et ytterligere ønsket krav for en pålitelig, kumulativ markørbedømmelse er dens effektivitet, det vil si evnen til effektivt å atskille populasjoner som er og populasjoner som ikke er i stand til å generere fenotypisk stabil brusk in vivo. Der for eksempel antallet markører er seks og bedømmelsessystemet varierer mellom 6 og -6, som beskrevet ovenfor, er det typisk en "gråsone" (populasjoner som karakteriseres ved en kumulativ markørbedømmelse med et område som ligger mellom 6 og -6), for hvilket den kumulative markørbedømmelse ikke er entydig og som, ved testing, ville finnes å omfatte både populasjoner som er og populasjoner som ikke er i stand til å danne stabil hyalinbrusk. Ideelt vil markørbedømmelsen resultere i et minimalt antall populasjoner i denne gråsone, men vil tillate en maksimalt effektiv klassifisering av populasjoner enten som "positive" eller som "negative".

Mer spesielt kan innen konteksten bestemmelse av kondrocyttfenotypisk stabilitet for en cellepopulasjon som benyttes for transplantasjon, både påliteligheten og effektiviteten av den kumulative markørbedømmelse, være kritisk for å tillate en grei og korrekt bestemmelse av skjebnen for cellepopulasjonen. Således er bruken av en kumulativ markørbedømmelse med en relativt lav prediktiv verdi for karakterisering av en populasjon av celler som er ment for transplantering, av begrenset verdi da den ikke tillater å avgjøre implantering eller ikke. For slike anvendelser anses bruken av den kondrogeniske potensialbedømmelse ifølge oppfinnelsen som et bedømmelsesverktøy som er spesielt egnet, i lys av den høye pålitelighet og effektivitet. Det er imidlertid tatt sikte på at for bruk ved screening kan effektiviteten av den prediktive verdi være mindre kritisk. Som antydet ovenfor er et potensielt formål med screeninganalysene å identifisere farmasøytiske forbindelser som påvirker, mer spesielt forbedrer den kondrocyttfenotypiske stabilitet for en cellepopulasjon. Ved slike screeningmetoder kan således den relative forbedring av kondrocyttfenotypisk stabilitet tas sikte på som det kritiske krav heller enn evnen for forbindelsene til å indusere eller opprettholde en perfekt kondrocyttfenotypisk stabilitet. For eksempel er det tatt sikte på at ved gjennomføring av en screeninganalyse vil forbindelser som er i stand til å konvertere lavkvalitetsceller (ingen brusk etter implantering) til mellomkvalitetsbrusk (celler med en bedømmelse som ikke kan benyttes for å prediktere utvetydig resultatet etter implantering), også anses som av interesse.

Cellepopulasjonene som benyttes i metodene, og analysene ifølge oppfinnelsen inkluderer alle celler som antas å være i stand til å produsere brusk eller som kan utvikle seg til bruskproduserende celler. Typisk er cellene osteokondrale celler som kondrocytter og deres forløper- eller progenitor celler oppnådd fra kunstig brusk, meniskus eller synovialfluid. I henhold til en utførelsesform er cellene som benyttes innen foreliggende oppfinnelses kontekst de forløperceller som er beskrevet i WO01/25402. I noen utførelsesformer er cellepopulasjonen forløperceller eller stamceller som er avledet fra andre vev som blod, beinmarg eller fett og som kan induseres inn i den osteokondrale cellelinje. Analysene ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å bestemme hvorvidt disse celler er gitt til den osteokondrale cellelinje.

Cellene som benyttes ved screeningmetodene og analysene ifølge oppfinnelsen, kan være nyisolerte, ekspanderte eller ført i en eller flere passasjer. Cellene kan være til stede som cellekulturer enten i kulturkolber eller til stede på en matriks eller et skjelett. Ekspresjonen av settet av markører fra celler på en matriks kan bestemmes ved å oppløse matriksen og å bestemme ekspresjonen av cellene. Cellene kan være av human eller animalsk opprinnelse. Eksempler på dyr som har vært benyttet for studiet av brusk er Xenopus, zebrafisk, kylling, mus, rotte, kanin, sau og geit.

Metodene og analysene ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres med celler som har en stabil kondrocyttfenotype som et resultat av deres opprinnelse og/eller dyrkingsbetingelser. Slike celler er av spesielle nytte for å analysere skadelige effekter av en gitt forbindelse, behandling eller tilstand.

I henhold til en alternativ utførelsesform blir metodene og analysene ifølge oppfinnelsen gjennomført ved bruk av celler som ikke har noen stabil kondrocyttfenotype eller som har mistet den kondrocyttstabile fenotype som et resultat av opprinnelsen og/eller dyrkingsbetingelser. Eksempler på slike er kondrocytter som har undergått ekstensiv føring, og stamceller. Også egnet er kondrocytter avledet fra individer med en osteokondral defekt som (oppstått ved) osteoartritt eller reumatoid artritt, eller fra individer som er predisponert til å erverve en osteokondral forstyrrelse basert på det respektive genetiske opplegg. Også egnet er brusktumorceller eller kondrosarkomceller.

Celler som ikke har kondrocyttfenotypisk stabilitet, er av spesiell nytte i metodene ifølge oppfinnelsen for å screene for forbindelser eller betingelser som forbedrer eller gjenoppretter den stabile bruskfenotype hos celler, eller som kan konvertere visse cellepopulasjoner som stamceller til celler med stabil bruskfenotype.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på bruken av metodene og analysene ifølge oppfinnelsen i et antall forskjellige anvendelser. Som detaljert ovenfor gjør metodene og analysene ifølge oppfinnelsen det mulig å teste dyrkingsbetingelser for celler ment for bruk i ACT slik som celledensitet, passasjeantall, mediumsammensetning, vekst i eller på to- eller tredimensjonale substrater, oksygenkonsentrasjon, trykk, skjærkraft. Særlig tillater analysen testing av innvirkningen av sammensetningen av medium på kondrocyttfenotypisk stabilitet. Faktorer der som potensielt har en innvirkning på kondrocyttfenotypisk stabilitet, inkluderer, men er ikke begrenset til, type og sats av serum, forskjellige formuleringer av syntetiske, serumfrie media og et antall hormoner, vekstfaktorer, vitaminer, proteiner og organiske forbindelser med en påstått effekt på kondrocyttfenotypisk stabilitet.

En anvendelse av metodene og analysene ifølge oppfinnelsen er screening av forbindelser eller tilstander som differensierer forløper- eller stamceller til den osteokondrale og mer spesielt den kondrogeniske linje. En annen anvendelse er screening av forbindelser eller tilstander som kan gjenopprette eller opprettholde den kondrocyttfenotypiske stabilitet for friske celler som har vært eller blir ført mange ganger respektivt for å oppnå et tilstrekkelig antall celler. En ytterligere anvendelse er screening av forbindelser eller tilstander som kan indusere kondrocyttfenotypisk stabilitet i celler som er oppnådd fra individer som har eller er predisponert for en osteokondral defekt.

I en annen anvendelse blir analysen benyttet for å evaluere innvirkningen av matriser, skjeletter, geler eller deres bestanddeler som ofte benyttes i celletransplantasjonsprosedyrer.

Metodene og analysene ifølge oppfinnelsen er også egnet i klassisk screening av peptidbiblioteker, antisensebiblioteker eller forbindelsesbiblioteker. Forbindelsene som utgjør disse biblioteker inkluderer, men er ikke begrenset til, biologika og organiske eller uorganiske forbindelser som produseres syntetisk eller oppnås fra naturlige kilder. Eksempler på slike er biblioteker av forbindelser som kan benyttes, for eksempel antistoffragmentbiblioteker, peptidfagdisplaybiblioteker, peptidbiblioteker (for eksempel LOPAP #, Sigma Aldrich), lipidbiblioteker (BioMol), syntetiske forbindelsesbiblioteker (for eksempel LOPAC@, Sigma Aldrich) eller naturlige forbindelsesbiblioteker (Specs, TimTec).

Screeningsmetodene og analysene som beskrives her, er av spesiell nytte ved identifisering av ledeforbindelser for medikamenter for behandling av osteokondrale forstyrrelser. Osteokondral defekt som er sett på som av interesse innen konteksten for screeningmetodene ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, defekter som opptrer i ledd som, men ikke begrenset til, kne, albue, ankel, vanligvis angitt som artikulære bruskdefekter. Bruskdefekter er også gitt navn etter det proksimale bein som for eksempel defekter av kondylene i femur, humerus, osv. Hyppig opptredende bruskforstyrrelser der screening av forbindelser som er i stand til å påvirke kondrocyttfenotypisk stabilitet som er sett på som av interesse, er osteoartritt, reumatoid artritt, artikulær bruskskade, kondromalasia og spondyloartropatier.

De følgende eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen uten å legge noen begrensning på oppfinnelsen ved de spesifikke utførelsesformer som er beskrevet.

Eksemplene er illustrert ved de følgende figurer der,

Figur 1 viser en punktgraf av histologibedømmelse mot kondrogenisk potensialbedømmelse (hvert punkt er flyttet ved en liten vilkårlig mengde og retning for å unngå at punkter lå på hverandre);

Figur 2 viser effekten av forbindelse A på den kumulative markørbedømmelse (CC-bedømmelsen som bestemt i eksempel 1) bedømt ved sanntidskvantitativ PCR på humankondrocytter dyrket fra P0 til P3 i monosjikt. Resultatene representerer midlere kumulativ markørbedømmelse i forhold til en kontroll (DMSO). *p<0,05 ved sammenlikning med DMSO-kontroll (n=4).

Figur 3 viser effekten av forbindelse A på ekspresjonen av molekylære markører COL2 (A), COL11(B), FRZB (C) og FGFR3 (D) positivt korrelert med det kondrogeniske potensialet av human P3 kondrocytter dyrket i monosjikt som bestemt ved sanntids-kvantitativ PCR. Resultater representerer målgenekspresjon i forhold til DMSO-kontroll som bestemt ved 2<-δδCT>. *p<0,05 ved sammenlikning med DMSO-kontroll (n=4).

Figur 4 viser effekten av en forbindelse A på ekspresjonen av molekylære markører PEDF (A) og ALK1 (B), negativt korrelert med det kondrogeniske potensialet av human P3 kondrocytter dyrket i monosjikt som bestemt ved sanntidskvantitativ PCR. Resultatene representerer målgenekspresjon i forhold til DMSO-kontroll som bestemt ved 2<-δδCT>. *p<0,05 ved sammenlikning med DMSO-kontroll (n=4).

Eksempler

Metodologi

Kondrocyttdyrking

Kondrocytter avledet fra adult humanartikulær brusk ble isolert og ekspandert in vitro ved bruk av standardbetingelser som beskrevet av Dell'Accio et al. (2001), Arthritis Rheum. 44, 1608-1619).

In vivo-analyse

Markørene ifølge oppfinnelsen ble validert ved bruk av et sett på 48 kondrocyttprøver som ble oppnådd fra forskjellige personer og var nyisolert eller ført i 1 til 5 passasjer. En del av kondrocyttene ble brukt for markøranalyse (se eksempel 3) mens en annen del ble benyttet i en in vivo-analyse for å verifisere bruskdannelsesevnen for hver prøve. NMRI nu/nu hunmus ble injisert intramuskulært (posteriørrommet av låret) med rundt 5 millioner humanceller. Implantater samles etter 2 uker. [Lipman et al. (1983) Calcif. Tissue Int. 35, 767-772; Ostrowski et al. (1975) Somatic Cell Genet. 1, 391-395]. Bruskimplantatene ble dissekert fra muskelen og histologi gjennomført ved bruk av hematoksilin-eosin, toluidin blå og Safranin O som fargemidler. En histologisk bedømmelse fra 1 til 3 tilskrives implantatet etter farging. En histologibedømmelse på 3 henviser til hyalinliknende brusk med sterkt sulfaterte proteoglykaner, sterk farging med toluidin blå og Safranin O. En histologibedømmelse på 2 henviser til godt differensiert, hyalinliknende brusk, sterk farging med toluidin blå, svak faring med Safranin O. En histologibedømmelse på 1 henviser til "fibrobrusk", ikke-differensiert fibrøst vev, ingen eller svak farging med toluidin blå. En histologibedømmelse på 0 henviser til forsøk der intet implantat ble gjenvunnet. Brusk med en histologibedømmelse på 2 eller 3 representerer vellykkede implantater. Brusk med en histologibedømmelse på 0 eller 1 representerer mislykkede implanteringer.

Eksempel 1: Markøranalyse

En fraksjon av de injiserte celler ble benyttet for genekspresjonsanalyse. RNA isolering, reverstranskripsjon og PCR ble gjennomført ved bruk av metodene som beskrevet i WO01/24832. PCR primere for disse markører er vist i tabell 1.

Tabell 1: Primere for forsterking av markørgener

Ekspresjonsnivåene for markørene bestemmes ved å måle intensiteten av PCR-produkter etter elektroforese. Alle verdier ble så sammenliknet i forhold til et 600 bp bånd av en DNA-markør, og det oppnås en verdi. Konsentrasjonen av de individuelle markører er representert ved en nummerisk verdi. Når det gjelder en positiv markør (COL11, COL2, FGFR3), er en meget lav ekspresjon (0-0,1) representert ved -1, en lav ekspresjon (0,1-1) ved en 0 og en høy ekspresjon ved 1. Når det motsatt dreier seg om en negativ markør (ALK1, PEDF) er en meget lav ekspresjon (0-0,1) representert ved 1, en lav ekspresjon (0,1-1) ved 0 og en høy ekspresjon ved -1. Summen av alle disse individuelle markører (definert som kondrogenisk potensialbedømmelse) representerer ekspresjonsnivået for hele settet av markører. Dette tall kan ligge fra -6 til 6.

De individuelle data for hver markør, dens kondrogeniske potensialbedømmelse og den histologiske bedømmelse er oppsummert i tabell 2.

Eksempel 2: Dataanalyse

Korrelasjonen mellom kondrogenisk potensialbedømmelse som bestemt i eksempel 1 og histologibedømmelse er angitt i tabell 3 og i figur 1. Korrelasjonskoeffisienten mellom den kondrogeniske potensialbedømmelse og den histologiske bedømmelse er 0,78 og statistisk signifikant (p<0,0001).

Prøver med en kondrogenisk potensialbedømmelse på -3 eller lavere resulterer alltid i fibrobrusk eller ikke brusk i det hele tatt. Prøver med en kondrogenisk potensialbedømmelse på 2 eller mer vil alltid resultere i hyalinbrusk. Prøver med en kondrogenisk potensialbedømmelse på 1 resulterer i 1 av 6 tilfeller i hyalinbrusk.

Som en rettesnor er en prøve med en kondrogenisk potensialbedømmelse på 0 eller mer ansett som egnet for implantering. Basert på det foreliggende datasett er det mulig å forutsi i 77 % (37/48) utbyttet av en transplantering med høy sikkerhet og 64 % uten feil. Basert på dette datasett blir en kondrocyttkultur godkjent for anvendelse i en ACI-prosedyre når den kondrogeniske potensialbedømmelse er 0 eller mer.

Som en oppsummering kan stabil, hyalinliknende brusk kun oppnås med celler med en kondrogenisk potensialbedømmelse på 0 eller høyere. Celler som ikke danner noe brusk i det hele tatt, hadde en negativ bedømmelse. Ytterligere analyse av individuelle gener kan videre understøtte raffinering av modellen.

a) sammenheng mellom kondrogenisk potensialbedømmelse og histologisk bedømmelse

Sammenhengen mellom kondrogenisk potensialbedømmelse og histologibedømmelse er angitt i figur 1 og i tabell 3.

Tabell 3: Frekvenstabell for histologibedømmelse med statistiske oppsummeringer.

I tillegg til frekvenstabellen viser tabell 3 også den midlere histologibedømmelse for hver verdi for den kondrogeniske potensialbedømmelse. Denne middelverdi øker signifikant (fra 1,0 til 2,7) mellom kondrogeniske potensialbedømmelser på -1 og 0. Dette antyder å betrakte prøver med en kondrogenisk potensialbedømmelse på 0 eller høyere som egnet for ACI.

b) Dataanalyse ved bruk av en kategorisk skala

En "ordnet kategorisk skala" er en skala der kategoriene er nummerert kun for å vise sekvensen: de virkelige tall som tilskrives gir ingen annen informasjon. For eksempel har histologiskalaen her verdiene 0, 1, 2 og 3. Tolking av dette som en ordnet kategorisk prøve innebærer at 1 er bedre enn 0, men sier ingenting om hvor mye bedre. For en intervallskala anses imidlertid de aktuelle tall som betydelige der 1 er bedre enn 0 i samme grad som 2 er bedre enn 1, osv. Ved beregning av middelverdier som i tabell 3 foretas den implisitte antakelse at histologibedømmelse på gyldig måte kan behandles som en intervallskala.

Desto flere punkter en skala har, desto mer er det akseptert at en slik skala er en intervallskala. Den kondrogeniske potensialbedømmelse som er representert med 13 datapunkter er i henhold til dette behandlet som en intervallbedømmelse.

En ytterligere analyse er presentert i den siste kolonne i tabell 3 som behandler histologibedømmelsen som en ordnet, kategorisk skala. Her er bedømmelsene slått sammen til to kategorier, 0 eller 1 (ingen eller lav fibrobrusk) og 2 eller 3 (hyalinbrusk) der data representerer sannsynligheten for å observere en histologibedømmelse på 2 eller 3. I de siste to kolonner i tabell 3 viser kolonnen med 'observert' de virkelige tall for prøver i denne kategori (og prosentandelene) for hver kondrogeniske potensialbedømmelse. Denne verdi øker også mellom kondrogeniske potensialbedømmelser -1 og 0 og antyder et terskelverdikuttepunkt. For denne analyse anses den kondrogeniske potensialbedømmelse som en ordnet, kategorisk skala.

c) Dataanalyse ved bruk av en intervallskala

Når den kondrogeniske potensialbedømmelse behandles som en intervallskala, kan de observerte responser jevnes ut ved bruk av logistisk analyse. Denne metode forutsier sannsynligheten for å være i den ønskede kategori (2 eller 3). De tilpassede verdier går ikke utenfor det plausible området (0 til 100 %). Disse tilpassede verdier er vist i den siste kolonne i tabell 3 og viser effekten av utjevning. Disse tilpassede estimater er antatt å tilveiebringe en mer pålitelig prediksjon av sjansen for å oppnå en 2- eller 3-histologibedømmelse ved en hvilken som helst gitt kondrogenisk potensialbedømmelse enn ved andre metoder. Merk at særlig for en kondrogenisk potensialbedømmelse på -1 forutsier den tilpassede modell en sjanse på 41,5 % for å få en 2 eller 3, og som en konsekvens stiller dette spørsmålet om hvorvidt en bedømmelse på -1 skal aksepteres.

Eksempel 3. Innvirkning av individuelle markører Innvirkningen av individuelle markører bedømmes ved å rekalkulere ekspresjonsprofilen for 5 markører i stedet for 6 markører i settet av markører som bestemmer den kondrogeniske potensialbedømmelse i eksempel 1. Det samme bedømmelsessystem anvendes der bedømmelsene nå ligger fra -5 til 5.

Data er vist i tabellene 4 til 9.

Tabell 4: Frekvenstabell for histologibedømmelse uten COL11 markør

Tabell 5: Frekvenstabell for histologibedømmelse uten COL2 markør

Tabell 6: Frekvenstabell for histologibedømmelse uten PEDF markør

Tabell 7: Frekvenstabell for histologibedømmelse uten FRZB markør

Tabell 8: Frekvenstabell for histologibedømmelse uten ALK1 markør

Tabell 9: Frekvenstabell for histologibedømmelse uten FGFR3 markør

Del A i tabell 10 nedenfor indikerer for hvert av datasettene som er presentert i tabell 4 til 9 ovenfor, for en terskel av en markørbedømmelse, hvor mange av prøvene som utvetydig kan klassifiseres til å gi lav kvalitet (histologibedømmelse 0 eller 1 tilsvarende '-' i tabell 10) eller gi en høykvalitetsbrusk (histologibedømmelse 2 eller 3, indikert med '+' i tabell 10). Prøver for hvilke det ikke er noen korrelasjon mellom markørbedømmelse og histologibedømmelse er klassifisert som '?'-prøver. Disse data indikerer at når et sett på 5 markører benyttes der COL11, COL2 eller COL11 utelates, oppnås tilsvarende eller sågar bedre resultater (det vil si færre prøver angitt som '?').

I del B av tabell 10 er kuttverdiene mindre begrenset. Når, for en markørbedømmelse innen det indikerte området, minst 5 av 6 prøver viser en korrelasjon mellom markørbedømmelse og bruskkvalitet, antas området for markørbedømmelsen å være prediktiv. Ved bruk av denne vei resulterer utelatelsen av COL11 i forbedrede resultater mens utelatelsen av enhver annen markør gir verre resultater, særlig når Col2 eller FGFR3 utelates fra markørsettet i eksempel 1.

Tabell 10: Prediktive verdier for et markørsett inneholdende 5 markører

Basert på det foreliggende sett av data og deres tolking syntes det som om den prediktive kraft for ekspresjonsprofilen for et sett markører for in vivo-generering av brusk også eventuelt kan oppnås uten COL11 uansett tolking. På den annen side resulterer utelatelsen av enten ALK1 eller FRZB i en redusert prediktiv kraft for markørene uansett tolking av det foreliggende datasett.

Eksempel 4. Anvendelse av markørbedømmelse i screeninganalyser

Evalueringen av kondrocyttfenotypisk stabilitet ved bruk av en kumulativ markørbedømmelse ble testet i screeningsanalyser for å identifisere forbindelser i stand til å påvirke evnen for celler til å produsere stabil brusk in vivo og å bestemme arten av effekten av slike forbindelser på cellene.

Screeninganalyser ble gjennomført i 96 brønners plater der mellom 10.000 og 100.000 kondrocytter oppnådd fra en bruskbiopsi, ble sådd ut (nyisolert fra passasje 0 til P5). Testforbindelser ble tilsatt i varierende konsentrasjoner og i varierende perioder. Etter inkubering ble kondrocytter høstet, RNA isolert og behandlet med reverstranskriptase. Kvantitativ PCR ble gjennomført i henhold til instruksjonene i forbindelse med TaqMan-prosedyren, og den kondrogeniske potensialbedømmelse for cellene ble bestemt som beskrevet i eksempel 1 (CC-bedømmelse).

1. Testing for molekyler som motvirker dedifferensiering av kondrocytter i monosjiktkultur

Forbindelse A var en kandidatforbindelse som ble forutsagt å ha en kondroprotektiv effekt og å ha en putativ stabiliserende effekt på kondrocyttfenotypen. Bestemmelsen av en kumulativ markørbedømmelse, mer spesielt den kondrogene potensialbedømmelse i eksempel 1, ble benyttet for å bestemme effekten av denne forbindelse på den kondrocyttfenotypiske stabilitet for en kondrocyttmonosjiktkultur.

a) Kondrocyttmonosjiktkulturer

Kondrocytter ble dyrket i monosjiktkultur ved 4x10<4>celler/ml i T25-kolber. Forbindelse A ble satt til cellene direkte etter å ha vært brakt på plate. Et totalt sluttvolum på 5 ml komplett medium (DMEM 10 % FBS) ble tilsatt. Tre kolber ble benyttet for hver betingelse (1 eller 10 µM forbindelse A, DMSO-kontroll). Medium og forbindelser ble erstattet en gang per uke. Ved konfluens ble kondrocytter ved passasje 0 (P0) tryptinisert, tellet og 2x10<5>celler brakt på plate igjen for P1-kultur. De gjenværende celler ble brakt i lyseringsmedium for RNA-ekstrahering. Den samme prosedyre ble gjennomført for P1-, P2- og P3-kondrocyttkulturer. TaqMan RT-PCR ble benyttet for å bestemme ekspresjonen av kondrogeniske markører.

b) RNA-isolering, cDNA-generering

Kondrocytter oppnådd fra monosjiktkultur ble vasket med PBS og lysert ved bruk av RLT-buffer inneholdende 1 % merkaptoetanol (Qiagen). Lyserte celler ble lagret ved -80 °C til bruk. mRNA ble renset ved bruk av RNeasy microkit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert ved bruk av vilkårlige heksamerer ved å følge produsentens instruksjoner (Invitrogen).

c) TaqMan sanntidspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

Sanntidskvantitativ PCR (RT-PCR) ble gjennomført ved bruk av ABI prism 7700 sekvensdetektorsystemet. Mastermix qPCR kit (Eurogentec) ble benyttet for RT-PCR i henhold til produsentens instruksjoner. Primere og prober som ble benyttet for TaqMan-analysen ble bestilt fra Applied Biosystems eller Eurogentec. Sanntids PCR-data ble beregnet ved bruk av 2<-δδCT>(2DDCT)-metoden som er definert som den mengde av målgen som er normalisert til en endogen referanse (β-aktin) og i forhold til en kalibrator som i dette tilfellet er ekspresjonsnivåene for valgte gener under kontrollbetingelser (DMSO).

d) Resultater

Forbindelse A hadde en effekt på ekspresjonen av flere molekylære markører som indikerer den kondrogene kapasitet, fenotypiske stabilitet og homeostase av kondrocytter, og var i stand til å motvirke reduksjonen av kondrogenisk potensialbedømmelse under ekspansjon av kondrocytter i monosjiktkultur (se figur 2). Således var både ved 1 µM- og 10 µM-konsentrasjoner de kondrogeniske potensialbedømmelser for kondrocytter ved P0 og P3 sammenliknbare eller sågar økt sammenliknet med kondrocytter dyrket i fraværet av forbindelsen. I det sistnevnte tilfellet var et fall i kumulativ markørbedømmelse observert for P3- versus P0-kondrocytter.

Forbindelse A hadde en positiv effekt på genekspresjonen av flere av de ekstracellulære matrikskomponenter av kondrocytter. Ved lavere (1 µM), men ikke høyere (10 µM) konsentrasjoner induserte forbindelse A ekspresjon av både kald Col2 og Col11 gentranskripter (figur 3). Forbindelsen øket også ekspresjonen av FGFR-3 markøren selv om økningen ikke var statistisk signifikant. Videre inhiberte forbindelse A sterkt ekspresjonen av PDEF ved begge konsentrasjoner som ble testet (figur 4). Ved 10 µM resulterte tilsetningen av forbindelsen også i redusert ekspresjon av ALK1 (figur 4). Begge markører korrelerte, når de var oppregulert, negativt med den kondrogeniske kapasitet for cellene, noe som indikerer at forbindelse A har en positiv og stimulatorisk effekt på det kondrogeniske potensialet for kondrocyttcellene og således på kondrogenese.

2. Screening av molekyler med henblikk på evnen til å mediere redifferensiering av dedifferensierte kondrocytter i 3D-kultur.

14 forbindelser ble screenet med henblikk på evnen til å øke redifferensiering av dedifferensierte kondrocytter i alginatkulturer. Effekten av molekylene på ekspresjonen av de forskjellige molekylære markører og på den kumulative markørbedømmelse (kondrogenisk potensialbedømmelse som bestemt i eksempel 1) ble bestemt for å bedømme evnen for forbindelsene til å påvirke gjenvinning av den kondrogeniske fenotype av cellene i 3D kulturer.

a) Redifferensiering av kondrocytter i alginatkultur

Etter ekspansjon i monosjiktkultur i fullstendig medium ble humankondrocytter ved passasje 3 (P3) hentet fra kneet til 5 OA-pasienter (alder 50-65), og disse ble frigitt ved trypsinbehandling, tellet og testet med henblikk på levedyktighet ved trypaneksklusjonstesten. Kondrocytter ble suspendert i 2 % alginat, og en lik mengde HBSS ble tilsatt. Cellesuspensjonen ble sugd inn i en 10 ml sprøytenål og dråpevis overført av en 24 Gauge til en kalsiumkloridoppløsning (5 kuler per brønn, totalt celleantall 250-000/brønn). Kulene ble vasket med NaCl, og nytt fullstendig medium (DMEM 10 % FBS) ble tilsatt. Etter 4 dagers kultur ble supernatanten fjernet og nytt medium tilsatt med forbindelsene ved en konsentrasjon på 10 µM. Fire dager etter tilsetning av forbindelsene ble supernatanten fjernet og cellene frigitt fra sine kuler for lysering. mRNA og cDNA ble generert og TaqMan RT-PCR benyttet for å måle ekspresjonen av COL2, COL11, FGR3, FRZB, ALK1, PEDF som beskrevet i eksempel 1.

b) Resultater

De relative effekter av forbindelsene på opp- eller nedregulering av markørgenekspresjon i kondrocytter dyrket i alginat, er oppsummert i tabell 11. Effektene er relative til kondrocytter dyrket i fraværet av molekyler (men nærvær av vehikkel-DMSO). Resultater representerer den midlere ekspresjon (middel av 5 OA-pasienter) i forhold til kontroller (kondrocytter pluss DMSO). IS = ikke signifikant; - = inhiberer; = forsterker; # = p<0,05 signifikant sammenliknet med kontroll-DMSO. Forbindelser ble benyttet ved 10 µM.

Flere molekyler var i stand til å påvirke ekspresjonen av forskjellige markørgener på positiv eller negativ måte. Kun to forbindelser (forbindelse 8 og forbindelse 14) hadde en positiv effekt på den kumulative markørbedømmelse (CC-bedømmelse), noe som indikerer at disse forbindelser kunne forsterke/mediere redifferensiering av kondrocyttene. Imidlertid hadde kun forbindelse 14 den ønskede effekt på hver av de individuelle markører uten noen effekt på BMP2- eller ALK1-genekspresjon. Denne forbindelse ville kunne være nyttig ved stimulering av kondrocyttdedifferensiering ex vivo før re-implantering og vil derfor vippe vekten mot dannelse av leddhyalinbrusk in vivo.

Tabell 11. Virkning av testforbindelser på ekspresjonen av fenotypisk modulering av dedifferensierte kondrocytter dyrket i alginatkulturer.

Eksempel 5. Testing av effekten av kondroprotektive forbindelser in vivo

For de forbindelser fra eksempel 4 som signifikant påvirker den kondrogeniske potensialbedømmelse, ble effekten av forbindelsene på kondrocyttfenotypisk stabilitet av cellene også testet in vivo. For dette formål ble cellepopulasjoner brakt i kontakt med enten testforbindelsen eller buffer og, etter inkubering, injisert i nakenmusmodellen (se ovenfor). Evnen for hver av cellepopulasjonene til å produsere stabil hyalinbrusk evalueres. Det er etablert at effekten av forbindelsen på den kondrogeniske potensialbedømmelse korrelerer med effekten på kondrogenisk potensiale for cellepopulasjonen.