ES2234673T3

ES2234673T3 - Prueba in vivo para verificar la estabilidad fenotipica.

Info

Publication number: ES2234673T3
Application number: ES00967443T
Authority: ES
Inventors: Frank Luyten; Cosimo De Bari; Francesco Dell'accio
Original assignee: Tigenix NV
Current assignee: Tigenix NV
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2020-10-06
Also published as: EP1498146A3; ATE285797T1; US7479367B1; ES2488240T1; US9089598B2; DE122010000021I1; EP1218037A2; PT1218037E; US20090162328A1; EP1218037B1; LU91672I2; WO2001024833A2; EP1498146A2; WO2001024833A3; DE20023659U1; DE60017159T2; AU7764200A; CY2010007I2; CA2397610C; DE60017159D1

Abstract

Método para identificar los marcadores moleculares asociados a la estabilidad fenotípica de una población celular de condrocitos que comprende: a) inyectar vía intramuscular o subcutánea en un mamífero no humano una suspensión de células aisladas o multiplicadas en un líquido iso-osmótico, comprendiendo dicha suspensión un equivalente de al menos 1 x 10 6 condrocitos articulares aplicados a ratones inmunodeficientes b) evaluar histológicamente si el cartílago formado in vivo es estable, cartílago exento de cualquier signo de vascularización, e c) identificar uno o más marcadores moleculares positivos y/o negativos de dichas células aisladas o multiplicadas que en la fase b) se encontró que formaban in vivo cartílago estable exento de cualquier signo de vascularización.

Description

Prueba in vivo para verificar la estabilidad fenotipica.

La presente invención está relacionada con el campo de la reparación del cartílago en general, y más específicamente con la generación de una población celular óptima adecuada para la reparación de anomalías de la superficie articular y la reparación del esqueleto cartilaginoso en general.

Antecedentes de la invención

El cartílago es un tejido formado por un componente celular, los condrocitos, y por una matriz extracelular típicamente rica en colágeno tipo II y conjuntos de proteoglicanos de alto peso molecular. Éstos últimos confieren al cartílago sus peculiares características histoquímicas que son: alta capacidad de tinción con azul alcián a pH bajo (de 0,2 a 2,5) y metacromasia con azul de toluidina y safranina O. La abundancia de colágeno tipos II, proteínas de enlace, agracán de proteoglicanos, junto con la presencia de colágenos menores tales como los de tipo IX y de tipo XI son características distintivas del tejido cartilaginoso.

En mamíferos en fase postnatal, el cartílago contribuye a formar la estructura de diversos órganos y sistemas tales como la superficie articular de las diartrosis y otras estructuras asociadas con las articulaciones (tales como los meniscos), la oreja, la nariz, la laringe, la tráquea, los bronquios, las estructuras de las válvulas cardíacas, parte de las costillas, sincondrosis, entesis, etc. En algunos de los lugares mencionados (por ejemplo, las entesis, los anillos fibrosos de los discos intervertebrales, en los meniscos, la inserción de ligamentos, etc.), debido a la abundancia de colágenos (sobretodo colágeno tipo I) y la peculiar distribución de los fascículos fibrosos se llama fibrocartílago. En otros sitios (por ejemplo, el pabellón de la oreja, la epiglotis, etc.) es particularmente rico en elastina y se llama cartílago elástico. En todas las otras estructuras, debido a su aspecto claro y semitransparente se llama cartílago hialino.

Durante la embriogénesis el cartílago juega un papel importante en el desarrollo de los huesos largos. Las células mesenquimáticas se agregan y se diferencian para formar el primordio de cartílago, el cual proporciona el molde para futuros huesos largos. Estas plantillas en desarrollo evolucionan, experimentan una formación de hueso endocondral mediante una cascada de acontecimientos que comprenden la hipertrofia de los condrocitos, la invasión vascular, la mineralización, y son finalmente remplazados por hueso excepto en una fina capa de las extremidades de los elementos óseos que se diferenciarán en superficies articulares de las diartrosis. En estos lugares, el cartílago permanece en su forma hialina a lo largo de toda la vida del individuo. Con la edad, se conoce muy bien que el cartílago experimenta un proceso de senescencia, afectando a sus propiedades mecánicas y a su elasticidad intrínseca.

Las anomalías de las superficies articulares pueden ser el resultado de diversas etiologías tales como procesos inflamatorios, neoplasias, sucesos post-traumáticos y degenerativos, etc. Cualquiera que sea la causa, los mecanismos de reparación y la evolución posterior son en buena parte comunes.

Las anomalías osteocondrales (o de espesor total) de las superficies articulares comprenden lesiones en el cartílago articular, el tejido óseo subcondral subyacente, y la capa calcificada de cartílago situada entre el cartílago articular y el hueso subcondral. Típicamente se presentan durante traumas graves a la articulación o durante las etapas finales de enfermedades de las articulaciones, por ejemplo, durante la osteoartritis. Estas lesiones deterioran la congruencia entre las superficies articulares y, por lo tanto, pueden conducir a una OA, que puede resultar dolorosa y limitar enormemente la función de la articulación. Las anomalías osteocondrales pueden ser reparadas mediante un mecanismo extrínseco. La curación extrínseca emplea elementos mesenquimáticos del hueso subcondral para que participen en la formación de nuevo tejido conectivo. El tejido de reparación, sin embargo, a menudo consiste en fibrocartílago o tejido fibroso. Este tejido cicatricial no comparte las mismas propiedades biomecánicas que el cartílago hialino y con el tiempo degenera con el desarrollo de osteoartritis.

Las heridas superficiales o de espesor parcial del cartílago articular que no penetran en el hueso subcondral pueden repararse solamente mediante un mecanismo intrínseco. Los condrocitos adyacentes a las superficies lesionadas proliferan y aumentan la síntesis y el depósito de matriz extracelular. A pesar de estos intentos de reparación, no se aprecia un aumento de la masa de matriz cartilaginosa y este proceso de reparación resulta raramente efectivo en la curación de las anomalías. A pesar de que inicialmente a veces resultan indoloros, las anomalías de espesor parcial a menudo degeneran en una osteoartritis de la articulación implicada.

La reparación de las anomalías en los cartílagos articulares con suspensiones de condrocitos ha sido llevada a cabo en una variedad de modelos animales (Brittberg et al. (1996) Clin. Orthop. (326): 270-83) y actualmente se emplea en humanos (Brittberg et al. N. Engl. J. Med. 1994 Oct 6;331(14);889-95. Los condrocitos autólogos obtenidos a partir de una área sin afectar de la articulación son liberados, multiplicados in vitro en presencia de suero autólogo y posteriormente inyectados bajo una hoja perióstica suturada para cubrir la anomalía cartilaginosa. Se ha demostrado que este procedimiento conducía a una mejora, al menos sintomática. Este método conceptualmente prometedor presenta todavía amplios campos para su mejora, ya que resulta conocido que la multiplicación in vitro de los condrocitos acaba produciendo, después de un número limitado de divisiones celulares, una pérdida de su estabilidad genotípica (definida como la capacidad de los condrocitos para formar cartílago hialino in vivo) haciendo que la suspensión celular que se ha de inyectar sea poco fiable.

Estos métodos alternativos han sido desarrollados en un intento de mejorar el índice de éxitos en el tratamiento de las anomalías cartilaginosas articulares de los mamíferos. En el primer método, unas matrices transportadoras sintéticas son impregnadas con condrocitos alogénicos y luego implantadas en la anomalía cartilaginosa donde es de esperar que produzcan y secreten los componentes de la matriz extracelular para formar el cartílago articular en el lugar de la anomalía. Una variedad de matrices transportadoras sintéticas han sido empleadas hasta la fecha y comprenden geles de colágeno tridimensional (por ejemplo, la patente U.S No. 4.846.835), geles de fibrina-trombina reconstituidos (por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 4.642.120; 5.053.050 y 4.904.259), matrices poliméricas sintéticas que contienen polianhídrido, poliortoéster,, ácido poliglicólico y copolímeros del mismo (patente U.S. No. 5.041.138), y polímeros basados en el ácido hialurónico. Una vez se obtiene la población de condrocitos multiplicada por mitosis, se pueden implantar las células tanto de nuevo en el mismo paciente a partir del cual se obtuvieron las células originales (implante autólogo), o en un paciente distinto (implante heterólogo). Además, el implante heterólogo puede emplear condrocitos obtenidos a partir de un individuo emparentado o no de la misma especie (alogénico) o de una especia distinta (xenogénico). Como forma alternativa, los condrocitos pueden ser obtenidos a partir de una línea celular consolidada a largo plazo que puede ser tanto alogénica como xenogénica.

La introducción de materiales no autólogos en el paciente, sin embargo, puede estimular una respuesta inmune no deseada dirigida contra el material implantado, conduciendo a un rechazo potencial del tejido cartilaginoso formado de nuevo e injertado. Además, el implante heterólogo presenta el riesgo de la transmisión al paciente de agente(s) infeccioso(s) presente(s) en el tejido o en la línea celular. El neo-cartílago puede formarse alrededor de la periferia del implante y de ese modo impedir la integración del implante en la anomalía del cartílago. La verificación de la formación y el desarrollo del cartílago sintético resultante in situ es difícil de llevar a cabo y habitualmente implica un examen mediante artroscopia o de articulación abierta. Además, los implantes que contienen componentes poliméricos sintéticos pueden resultar inadecuados para reparar anomalías en el cartílago de grandes dimensiones ya que la hidrólisis del polímero in situ inhibe la formación del cartílago y/o su integración en la anomalía.

En el segundo método, la anomalía se llena con una matriz biocompatible y biodegradable que contiene factores de crecimiento quimiotácticos y mitogénicos para estimular la afluencia de células progenitoras de condrocitos en la matriz in situ. Las matrices óptimamente contienen poros de dimensiones suficientes para permitir la afluencia en su interior, y la proliferación de las células progenitoras de los condrocitos dentro de la matriz. La matriz también puede contener factores de crecimiento diferenciadores para estimular la diferenciación de las células progenitoras en los condrocitos los cuales a su vez es de esperar que secreten los componentes de la matriz extracelular para formar el cartílago en el lugar de la anomalía in situ (por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 5.206.023 y 5.270.300 y EP-A-830.804). Este método, sin embargo produce problemas similares a aquellos asociados con el primer método explicado anteriormente. Además, hasta la fecha no hay datos que corroboren el hecho de que el cartílago articular contenga células progenitoras condrocíticas disponibles para la reparación de anomalías de espesor parcial.

En el tercer método, los condrocitos pueden ser cultivados y multiplicados in vitro y de ese modo formar un material sintético pseudocartilaginoso que se implanta posteriormente en la anomalía cartilaginosa. Éste presenta la ventaja sobre los métodos previos en el hecho que el desarrollo del material cartilaginoso sintético puede ser controlado mediante su caracterización morfológica, bioquímica y molecular, previa al implante. Las células condrogénicas pueden ser multiplicadas tanto en un sistema de cultivo dependiente de anclaje como en uno independiente de anclaje. En este último, las células condrogénicas pueden ser cultivadas como colonias en un gel de agarosa. Hasta el momento, solamente han sido preparadas pequeñas piezas de tejido cartilaginoso de forma indefinida empleando este método. Además, los restos de cartílago se incrustan en una matriz de gel que hace que sea menos adecuado para su implante en mamíferos. De una manera alternativa, en otro método independiente de anclaje, los condrocitos pueden ser cultivados como colonias en un cultivo en suspensión. Sin embargo, las partículas resultantes que contienen un material sintético pseudocartilaginoso son habitualmente pequeñas y presentan una forma indefinida y, además, no se integran las unas con las otras ni con el cartílago que rodea la anomalía. Esto hace que sean inadecuadas para el implante y reparación de una anomalía articular predeterminada.

En el método dependiente de anclaje, los cultivos primarios de células condrogénicas aisladas a partir de tejido primario se hacen crecer en monocapa unidas a la superficie de un matraz de cultivo celular (por ejemplo, la patente U.S. No. 4.326.261). Las células primarias que derivan directamente del tejido explantado continúan siendo capaces de producir y secretar componentes característicos del cartílago natural, específicamente colágeno de tipo II y proteoglicanos sulfatados. Sin embargo, resulta bien conocido que durante la multiplicación in vitro en monocapas, los condrocitos se desdiferencian y pierden su capacidad para formar cartílago hialino in vivo. Hasta ahora no ha sido posible preparar grandes parches de cartílago articular a partir de piezas pequeñas de tejido de biopsia empleando los procedimientos dependientes de anclaje de la patente U.S. No. 4.356.261.

A fin de resolver los problemas anteriores, la patente U.S. No. 5.723.331 proporciona un método para preparar in vitro grandes cantidades de cartílago sintético a partir de pequeñas muestras de tejido de biopsia el cual, basándose en el descubrimiento que las células condrogénicas pueden ser aisladas a partir de toda una variedad de tejidos, por ejemplo, cartílago pre-existente, tejido pericondrial o médula ósea, y multiplicadas in vitro previamente a la formación del cartílago, comprendiendo células condrogénicas sacadas de una primera siembra (por ejemplo, aisladas a partir de un tejido disgregado enzimática o mecánicamente), proliferadas ex vivo, en un pocillo al que se ha dado forma previamente y que presenta una superficie de contacto celular adhesiva, y entonces cultivando las células condrogénicas proliferadas en un pocillo durante un tiempo suficiente para permitir que las células secreten una matriz celular y, de ese modo, formen un parche de cartílago sintético tridimensional, con múltiples capas celulares. Este método no produce una integración óptima entre el implante y el cartílago circundante. Hasta el momento, no hay evidencia de estabilidad fenotípica de las células en dichas preparaciones.

El empleo de células mesenquimáticas también ha sido propuesto para la reparación del cartílago. Las células mesenquimáticas son una fuente alternativa potencial de células productoras de cartílago.

Habitualmente se las reconoce como células pluripotenciales capaces de dividirse muchas veces para producir células progenitoras que posteriormente pueden originar diversos tejidos, entre ellos tejidos esqueléticos tales como el cartílago, el hueso, el tendón, el ligamento, el estroma de médula ósea y tejido conectivo. Por definición, pueden sufrir muchas más divisiones. Las células progenitoras de condrocitos y osteocitos, las cuales son bipotentes y presentan la capacidad de diferenciarse en cartílago o hueso, cuando fueron aisladas de la médula ósea (por ejemplo en la patente U.S. No. 5.226.914), y posteriormente del músculo, corazón y tejido granular. Su pluripotencialidad se demuestra empleando diferentes condiciones de cultivo y añadiendo inductores más o menos específicos, los cuales provocan la diferenciación de las células madre en condrocitos (cartílago), osteoblastos (hueso), miotúbulos (músculo), adipocitos (tejido adiposo).

Resultaría muy deseable disponer de células progenitoras que fuesen fácilmente obtenibles a partir de una biopsia muscular, cultivadas para producir un gran número de ellas, y pudieran ser usadas como fuente de condrocitos, osteoblastos o miocitos. Sin embargo, la pluripotencialidad misma que les hace atractivas, comporta el riesgo de una diferenciación metaplástica. Dicho en otras palabras, hay el riesgo de que se diferencien en una dirección no deseada (por ejemplo, hueso o tejido adiposo en una anomalía cartilaginosa). En las patentes U.S. 5.226.914 y 5.197.985 las células fueron absorbidas en bloques de cerámica porosa e implantadas, produciendo principalmente hueso. Sin embargo, la patente U.S. No. 5.906.934 describe que bajo condiciones específicas, las células madre mesenquimáticas en un transportador polimérico adecuado (tal como una malla de ácido poliglicólico) implantado en una anomalía de cartílago y/o hueso se diferenciarán para formar cartílago y/o hueso, tal como corresponde. También la patente U.S. No. 5.919.702 describe que las células progenitoras de condrocitos aisladas a partir de fuentes de cordón umbilical, por ejemplo a partir de gelatina de Wharton, y cultivadas de manera que originen condrocitos que pueden producir tejido cartilaginoso. También en otro intento para evitar los inconvenientes de las técnicas actuales para reparar cartílago y hueso que causan hemorragias e implican el uso de material mecánicamente endeble no auto- derivado, la patente U.S. No. 5.866.415 sugiere el tratamiento de las anomalías de cartílago o de hueso con un material biológico obtenido mediante la unión in vitro de células formadoras de cartílago o hueso a un periostio de tamaño suficiente para acomodarse a la anomalía.

WO96/41523 y WO96/41620 describen el empleo del FGFR3 como marcador de células mesenquimáticas progenitoras de esqueleto. Dichas células no muestran un fenotipo estable. Para iniciar la diferenciación de dichas células, se han de añadir factores a las células o in situ, por ejemplo un antagonista del FGF9. Tal como se ha indicado anteriormente, el empleo de células madre para implantarlas en el cuerpo resulta contraindicado debido al peligro de diferenciación metaplástica.

El factor de crecimiento transformante beta ("TGF-\beta") se refiere a una familia de proteínas diméricas que regulan el crecimiento y diferenciación de muchos tipos celulares. Los miembros de esta familia comprenden el TGF-\beta 1, el TGF-\beta 2, el TGF-\beta 3, el TGF-\beta 4, el TGF-\beta 5, las proteínas morfogénicas ("MP") tales como la MP-121 y la MP-52, inhibinas/activinas (tales como las presentadas en EP-A-222.491), las proteínas osteogénicas ("OP"), las proteínas morfogenéticas de hueso (de aquí en adelante indicadas como "BMP"), factores de crecimiento/diferenciación ("GDF") tales como el GDF-1, el GDF-3, el GDF-9 y el Nodal. El TGF-\beta se caracterizó primero por sus efectos en la proliferación celular. Tanto en el crecimiento estimulado de fibroblastos de riñón de rata independiente de anclaje como en el crecimiento inhibido de células de riñón de mono. Los miembros de la familia del TGF-\beta han demostrado poseer diversos efectos biológicos, por ejemplo, regulan la formación del hueso, inducen a las células musculares de rata a producir macromoléculas específicas de cartílago, inhiben el crecimiento de células madre hematopoyéticas incipientes, linfocitos T, linfocitos B, queratinocitos de ratón, y diversas líneas celulares de cáncer humano. Los miembros
de la familia del TGF-\beta aumentan la síntesis y la secreción de colágeno y fibronectina, aceleran la curación de cicatrices quirúrgicas, suprimen la síntesis de caseína en los explantes de glándula mamaria de ratón, inhiben la síntesis de ADN en las células epiteliales de hígado de rata, estimulan la producción de proteoglicanos de unión al factor de crecimiento básico de los fibroblastos "bFGF", modulan la fosforilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico ("EGF") y la proliferación de las células de carcinoma epidermoide y que pueden producir la apoptosis en las células epiteliales uterinas, los hepatocitos cultivados e hígado en regresión. Los TGF-\beta pueden mediar en la protección cardiaca en las heridas por reperfusión inhibiendo la adherencia de los neutrófilos al endotelio y proteger en las enfermedades autoinmunes experimentales en ratones. En definitiva, las proteínas de la familia del TGF-\beta son factores de crecimiento activos, multifuncionales y también presentan actividades biológicas relacionadas como la atracción quimiotáctica de células, el estímulo de la diferenciación celular y las capacidades inductoras de tejido. Las diferencias
en su estructura y su afinidad hacia receptores producen variaciones considerables en su función biológica exacta.

En contraste con los informes precedentes acerca de la capacidad del TGF-\beta para inducir la producción de macromoléculas específicas de cartílago en células musculares y en condrocitos, se ha descubierto que el TGF-\beta actúa sinergísticamente con el factor de crecimiento de los fibroblastos para inhibir la síntesis de colágeno tipo II en condrocitos de esternón de pollo y en condrocitos de rata. De hecho, el TGF-\beta ha surgido como el inhibidor prototípico de la proliferación de los tipos celulares más normales in vitro así como in vivo, presentando una notable diversidad de actividad biológica. El TGF-\beta 1 ha sido purificado a partir de trombocitos humanos y porcinos y actualmente se encuentra disponible TGF-\beta 1 recombinante.

Entre la subfamilia de las BMP, las estructuras de la BMP-1 a la BMP-15 han sido previamente explicadas. Las únicas actividades inductivas de dichas proteínas, junto con su presencia en el hueso, sugieren que son importantes reguladoras de los procesos de reparación del hueso y pueden verse implicadas en el mantenimiento normal del tejido óseo. Recientemente, se demostró que la subfamilia de proteínas relacionadas con la BMP-12, que comprenden la BMP-13 y la MP52 (ver, por ejemplo, WO93/16099 y la patente U.S. No. 5.658.882) resultaba útil en mezclas para la inducción de la formación y reparación de tejido de tipo tendón o ligamento. La patente U.S. No. 5.902.785 descubre que las proteínas relacionadas con la BMP-12 resultan especialmente efectivas para la inducción de tejido cartilaginoso y que la BMP-9 es útil para aumentar la síntesis de matriz de proteoglicano y, por lo tanto, para el mantenimiento del tejido cartilaginoso. También describe mezclas que comprenden una proteína relacionada con la BMP-12 que consta de uno o más miembros de la superfamilia del TGF-\beta del que se ha comprobado su capacidad ostoegénica, preferiblemente la BMP-2, -4, -5, -6 y/o BMP-7 como aplicable en la regeneración de múltiples tipos de tejido (por ejemplo en las superficies de contacto o en las zona de unión entre tejidos) y especialmente útil para el tratamiento de cartílago articular, cuya superficie articular, cartílago, huesosubcondral y/o superficie de contacto entre cartílago y hueso necesita ser reparada. La misma patente describe además mezclas que comprenden una proteína relacionada con la BMP-12 junto con una proteína útil para el mantenimiento de los condrocitos o el tejido cartilaginoso tal como la BMP-9, siendo dichas mezclas especialmente útiles en la inducción y mantenimiento del tejido cartilaginoso en un lugar donde se necesita la reparación del cartílago tal como una anomalía del cartílago articular.

WO96/14335 presenta, empleando RNAm preparado a partir de cartílago articular de recién nacido, el aislamiento de dos miembros de la familia de la BMP, llamados proteínas morfogenéticas derivadas del cartílago -1 y -2 (CDMP-1, CDMP-2). Storm et al. (1994) en Nature 368 649-43 y Chang et al. (1994) en J. Biol. Chem. 269, 287227-34 de manera independiente demostraron que la CDMP-1 mapada cerca del locus del braquiopodismo en el cromosoma 2 en ratones, podría verse implicada en el fenotipo del braquiopodismo. También los patrones de expresión de las CDMP sugieren un papel importante para dichos genes en la morfogénesis de la articulación. WO98/59035 también presenta un método para mantener el fenotipo cartilaginoso en condrocitos in vitro que comprende el cultivo de los condrocitos en un medio sin suero que contiene una CDMP y/o la BMP.

La siguiente tabla resume los miembros de la superfamilia TGF-\beta (Reddi AH, Nature Biotechnol. 1998, 16:247-52).

La familia de la BMP en mamíferos

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Se ha demostrado que otras familias de los factores de crecimiento juegan un papel en la formación/diferenciación del cartílago. Entre ellos, los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGFs) que son una familia de factores de crecimiento polipeptídicos implicados en una variedad de actividades. Se sabe que uno de sus receptores, el receptor 3 del FGF (FGFR-3) (Keegan K. et al., 1991 Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 1095-99), juega un papel crucial en la condrogénesis. Mutaciones puntuales en el gen fgfr3 que producen una proteína constitutivamente activa independiente de ligando (lo cual significa que la señal del FGF se encuentra siempre activa, también en ausencia del ligando) provoca anormalidades esqueléticas como la acondroplastia y la displasia tanatofórica.

Tal como se ha señalado anteriormente, a pesar de que el transplante autólogo de condrocitos ("ACT") está convirtiéndose en una técnica ampliamente aceptada para la reparación de anomalías de las superficies articulares ("JSD") todavía presenta algunos inconvenientes. Entrando en detalles, este procedimiento implica la multiplicación in vitro - en presencia de suero autólogo - de condrocitos autólogos obtenidos a partir de una área no implicada en la superficie articular, seguida del implante de la suspensión de condrocitos bajo una capa perióstica suturada para cerrar la anomalía de la superficie articular. La multiplicación celular es necesaria para obtener a partir de una pequeña biopsia de cartílago un número de células suficiente para reparar la anomalía del cartílago. La multiplicación en monocapa produce la pérdida de características fenotípicas en los condrocitos (Benya y Shaffer. 1982, Cell 30:215-24). Hasta la fecha, sin embargo, no se sabe cuántos ciclos se pueden hacer multiplicar los condrocitos sin obstaculizar su estabilidad fenotípica y por lo tanto su capacidad de formar cartílago hialino in vivo, resistente a la invasión vascular y a la formación de hueso endocondral. Otros factores que pueden afectar la capacidad de los condrocitos para formar cartílago in vivo son las condiciones del cultivo y diversos factores que dependen del donante tales como la edad y artropatías o enfermedades polisistémicas previas. Al final de la multiplicación celular, la población de condrocitos está compuesta por algunas células que mantienen su estabilidad fenotípica y otras que todavía pueden proliferar pero que ya no van a contribuir a la reparación del cartílago. Para obtener una suspensión celular consistente para el ACT, es deseable determinar cuál es la capacidad real de las células para formar cartílago in vivo y, en caso de que sea necesario, seleccionar los condrocitos estables de la población celular multiplicada. La importancia de esta cuestión viene subrayada por la amplia variabilidad en la calidad del tejido de reparación obtenido en una amplia serie (Peerson et al. Clin. Orthop. [374], 212-234, 2000.) comprendiendo toda una variedad que va desde el pseudocartílago hialino al fibrocartílago a ningún signo de reparación.

Los condrocitos son las únicas células normales del esqueleto de las que se conoce que pueden crecer en cultivos de agarosa independientes de anclaje (Benya y Shaffer. 1982, Cell 30:215-224). Este sistema de cultivo permite una recuperación de algunas de las características fenotípicas que se pierden en la multiplicación en mono capa (Benya y Shaffer. 1982, Cell 30:215-224). La expresión del colágeno tipo II y la capacidad de crecer y recuperar las características fenotípicas en un cultivo de agarosa, constituyen unas buenas pruebas para evaluar la diferenciación de los condrocitos y el potencial para diferenciarse, respectivamente. Sin embargo, no miden la capacidad de los condrocitos para formar cartílago in vivo.

Bradham et al., 1988, Clinical Orthopaedics and Related Research 352:232-249, presenta una prueba in vivo para cartílago empleando células suspendidas en matrigel.

Sumario de la invención

Los temas explicados anteriormente muestran claramente que existe una gran necesidad de una prueba para medir la capacidad de los condrocitos multiplicados para formar cartílago estable in vivo después de su multiplicación in vitro independiente de las condiciones de cultivo o los factores relacionados con el donante. Entre las células esqueléticas, el crecimiento independiente de anclaje es característico de los condrocitos y de los precursores condrocíticos. Además, se requiere esta propiedad solamente cuando las células pseudocondrocíticas son de interés. También hay la necesidad de identificar marcadores moleculares asociados con tipos de células específicos que permitirían al médico producir implantes adecuados y regenerar y reparar tejido cartilaginoso con las células apropiadas evitando la formación de cicatrices en el mayor grado posible. Estos y otros propósitos se han conseguido gracias a los siguientes objetivos de la presente invención.

Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar una prueba in vivo para identificar marcadores moleculares asociados a la estabilidad fenotípica de una población celular determinada. Otro objetivo de la invención es la definición de un conjunto de marcadores moleculares asociados a los resultados de la antedicha prueba in vivo empleando condrocitos aislados recientemente y, por lo tanto, a la capacidad de formar cartílago estable in vivo. Otro objetivo de la invención es el empleo de dichos marcadores positivos y negativos de la estabilidad de los condrocitos como herramienta para supervisar, paso a paso, la multiplicación celular in vitro y, más en general, el proceso de producción de la multiplicación de los condrocitos. Esta herramienta resultará útil para optimizar la siguiente generación de técnicas de multiplicación de condrocitos y para predecir cuándo se ha de parar la multiplicación celular, aislar los condrocitos que ya han perdido su estabilidad fenotípica solamente cuando es necesario, y especialmente proporcionar un control de calidad para los condrocitos a usar para el ACT para la aprobación del lanzamiento del lote. Esto significará que las suspensiones de condrocitos para el ACT sean un producto más fiable y consistente. Otro objetivo de esta invención es el empleo del análisis por FACS (selección celular activada por fluorescencia) y de la selección celular en general empleando marcadores positivos y negativos para seleccionar, a partir de una población de condrocitos, solamente aquellas células que mantienen su estabilidad fenotípica.

Breve descripción de los esquemas

La Figura 1 es un conjunto de 6 imágenes presentando las características histológicas e histoquímicas y la expresión del colágeno tipo II de implantes a partir de la prueba in vivo de la invención comparados con el cartílago articular adulto humano.

La Figura 2 consiste en dos diagramas (A, B) presentando el perfil hidrodinámico de los proteoglicanos sulfatados en implantes(A) obtenidos a partir de la prueba in vivo de la presente invención y en el cartílago articular adulto humano (B).

La Figura 3 es un conjunto de cuatro imágenes que presentan la hibridación in situ para las repeticiones Alu (A), repeticiones L1 específicas de ratón (B), una suposición de A y B (C) y la tinción con azul de toluidina (D) de un implante obtenido a partir de la prueba in vivo de la invención.

La Figura 4 consiste en un conjunto de imágenes que presentan el perfil molecular (mediante una RT-PCR) de los condrocitos articulares durante su multiplicación in vitro y la histología respectiva después de dos y cuatro duplicaciones de la población

La Figura 5 consiste en un conjunto de imágenes que presentan el perfil molecular de los condrocitos articulares obtenidos a partir de donantes de diferentes edades durante la multiplicación in vitro.

La Figura 6 es un conjunto de imágenes (B) que presenta los resultados de los análisis mediante RT-PCR para diversos marcadores moleculares de condrocitos articulares mediante pases y en los condrocitos pasados que han sido pasados mediante una prueba de provocación en agarosa. La figura también presenta una imagen de los condrocitos cultivados en agarosa de bajo punto de fusión (A).

La Figura 7 es una imagen que presenta el análisis mediante la RT-PCR para el Fgfr3 y el Alk1 llevado a cabo en el mismo tubo de condrocitos mediante un pase in vitro.

La Figura 8 es un conjunto de dos imágenes que presenta los implantes obtenidos mediante la inyección de condrocitos previamente tratados con o sin la CDMP1.

La Figura 9 es un conjunto de cuatro gráficos obtenidos mediante un análisis por citometría de flujo, (a) sin marcar, (b) marcado con el anticuerpo de conejo anti FGFR3 humano, (c) marcado con el anticuerpo de ratón anti colágeno tipo II humano y (d) con ambos anticuerpos.

Descripción detallada de la invención

Los términos empleados a lo largo de esta descripción se definen como sigue:

Estabilidad de los condrocitos

La capacidad de una suspensión celular (tanto obtenida a partir de tejido cartilaginoso como a partir de cualquier otro tejido que contenga células con potencial condrogénico) para producir mediante una inyección en un mamífero no humano (in vivo), tal como un ratón inmunodeficiente, (en un marco temporal de tres semanas), un implante de cartílago sin signos de invasión vascular o de formación de hueso endocondral.

Condrogénico

La capacidad de facilitar o estimular el crecimiento del cartílago, aplicada a células como los condrocitos y células que se diferencian en condrocitos. El término también se aplica a determinados factores de crecimiento, tales como el TGF-\beta, que facilita la diferenciación del cartílago.

Coexpresión y codetectabilidad

Por coexpresión, en el contexto de la presente invención, se entiende que un segundo factor o marcador se expresa o se hace detectable cuando un primer factor o marcador se expresa o se hace detectable. Por ejemplo, cuando la BMP-2 o el FGFR-3 (marcadores positivos) o el ALK-1 o el colágeno de tipo X (marcadores negativos) se expresan y son detectables. Como tal, el marcador es codetectable con los marcadores positivos y negativos anteriormente mencionados. Dichos factores o marcadores coexpresados o codetectables pueden ser un marcador de superficie celular reconocible, detectable mediante anticuerpos policlonales o monoclonales y/o ligandos específicos.

Tejido conectivo

Tal como se emplea en la presente invención, cualquiera entre diversos tejidos estructurales en el cuerpo de un mamífero comprendiendo hueso, cartílago, ligamento, tendón, menisco dermis, hiperdermis, músculo, tejido adiposo, tejido de la cápsula articular.

Diferenciación

Un proceso biológico mediante el cual células primordiales no especializadas adquieren funcione(s) especializa-
da(s). La diferenciación terminal proporciona una célula altamente especializada que presenta características funcionales, genéticas y fenotípicas únicas.

Proteína marcadora

Un polipéptido que distingue una célula (o conjunto de células) de otra célula (o conjunto de células) entre una población de células y que se encuentra asociado a una función biológica singular. Por ejemplo, el antígeno de superficie CD3 se expresa o es detectable en la superficie de los linfocitos T pero no en otros tipos de linfocitos (por ejemplo linfocitos B o células nulas) y actúa como proteína marcadora para dicho subconjunto de linfocitos. Cuando la proteína marcadora es un antígeno de superficie, como por ejemplo un receptor de una hormona, los anticuerpos que se unen la proteína marcadora pueden ser utilizados en métodos de selección celular, por ejemplo para originar una población de células enriquecidas para células que expresan la proteína marcadora. De una manera alternativa, proteínas intracelulares pueden ser utilizadas como proteínas marcadoras. Por ejemplo, proteínas fluorescentes o luminiscentes, tales como la proteína fluorescente verde (GFP), la ecuorina (GFP o Aequoria victoria) (Tanahashi et al. (1990), Gene 96: 249-255) pueden ser empleadas como proteínas marcadoras y pueden facilitar la selección celular, por ejemplo, mediante FACS. También pueden emplearse enzimas, dado que la actividad del enzima puede ser detectable. Por ejemplo, la \beta-galactosidasa resulta muy adecuada para ser utilizada como proteína marcadora; dicho enzima puede ser detectado mediante la introducción dentro de la célula de un(os) sustrato(s) que libera(n) un(os) producto(s) fluorescente(s) mediante la escisión enzimática (disponible, por ejemplo, de Molecular Probes). Otro enzima adecuado es la pirocatenina 2,3-dioxigenasa, que viene codificada por xy/E de Pseudomonas putida (Domen et al. (1986), Anal. Biochem. 155: 379-384)

Vinculado operativamente

Conexión de una secuencia codificante y una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor) de manera que se permite la expresión genética cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras transcripcionales) se enlazan con la(s) secuencia(s) reguladora(s).

Osteogénico

La capacidad de potenciar o generar la producción de hueso. El término puede ser aplicado a osteoblastos con la capacidad de potenciar el crecimiento del hueso, o células que ellas mismas poseen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos. El término también puede aplicarse a factores de crecimiento con la capacidad de potenciar el crecimiento del hueso.

Estabilidad fenotípica

La capacidad por parte de una célula cualquiera de mantener la capacidad de organizar o reorganizar, in vivo, la estructura de un tejido específico, tanto el tejido original de donde se han extraído las células como de un tejido diferente donde las células han sido forzadas a formarse bajo condiciones específicas.

Promotor

Una secuencia de nucleótidos suficiente para dirigir la transcripción de una secuencia codificante. En la invención se incluyen aquellos promotores que son inducibles mediante señales o agentes externos; dichos elementos pueden ser localizados en las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3' del gen natural. Un "promotor del FGFR-3" es cualquier secuencia contenida en el UTR del gen FGFR-3 endógeno que resulta suficiente para dirigir transcripción del FGFR-3 en células positivas al FGFR-3 tales como condrocitos estables. Por ejemplo, una secuencia de 3 kb inmediatamente adyacente a la secuencia de inicio de la transcripción del FGFR-3 resulta suficiente para dirigir la expresión del gen del FGFR-3. Se sabe que en construcciones genéticas que contienen un promotor del FGFR-3 (por ejemplo, aquellas construcciones que también contienen un gen indicador o un gen que codifica una proteína marcadora), variaciones menores (por ejemplo, supresiones, mutaciones puntuales y similares) pueden ser realizadas en la secuencia del promotor del FGFR-3 sin que pierda la capacidad de ser activo en condrocitos fenotípicamente estables y no en otros condrocitos. Por lo tanto, los promotores FGFR-3 con dichas variaciones menores sin que se pierda la especificidad de célula precursora de esqueleto del promotor se encuentran englobados en el término "promotor del FGFR-3". Además, copias múltiples del promotor del FGFR-3, dispuestas conjuntamente, pueden ser utilizadas para dirigir la expresión del gen.

Gen indicador

Cualquier gen cuya expresión puede ser supervisada. Habitualmente los genes indicadores empleados comprenden, por ejemplo, genes que codifican la cloranfenicol acetiltransferasa, la fosfatasa alcalina, la luciferasa y la proteína fluorescente verde.

Cartílago estable

El cartílago que no acaba convirtiéndose en hueso, es decir, el cartílago que carece de cualquier signo de vascularización. Concretamente, de acuerdo con la presente invención, el cartílago estable es cartílago articular humano adulto o maduro, pero también puede comprender cartílago animal adulto o maduro. El caso contrario al cartílago estable sería el cartílago transitorio que al final acaba convirtiéndose en tejido óseo. En el contexto de la presente invención, el cartílago será considerado como estable si incluso después de, por ejemplo, siete semanas no se presenta ningún signo de formación de hueso.

Célula madre

Célula precursora pluripotente que presenta la capacidad de auto-renovación y de generar una variedad de tipos celulares diferenciados. Las auténticas células madre pueden dividirse indefinidamente. Entendemos por células madre embrionarias las células pluripotentes de cariotipo normal derivados de un blastocisto.

Algunas de las siguientes formas de realización y ejemplos han sido incluidos solamente a modo de referencia y no entran en el ámbito de las reivindicaciones.

Descripción detallada de las formas de realización y ejemplos

La presente invención se basa en la posibilidad de medir y determinar de una forma verificable la capacidad de los condrocitos aislados para producir cartílago in vivo empleando un modelo de ratón atímico. Primero, esta capacidad está relacionada con un conjunto de marcadores moleculares. Segundo, la presencia de marcadores moleculares está asociada con los resultados de la reparación de anomalías en la superficie articular ("JSD") en modelos animales de JSD bien estandarizados. Tercero, los marcadores moleculares asociados a la membrana pueden ser empleados para seleccionar, a partir de una población de condrocitos multiplicados, solamente aquellas células que, manteniendo su estabilidad fenotípica, serán capaces de reparar óptimamente las JSD. Este conjunto de marcadores moleculares (asociados a la membrana y/o no asociados a la membrana) pueden también ser empleados como control de calidad final de la suspensión celular para ser utilizados para el ACT o para la reparación de las estructuras cartilaginosas y, por lo tanto, proporcionando un producto final fiable y consistente.

Una primera forma de realización de la presente invención consiste en una prueba in vivo que permite medir la capacidad de las células aisladas para reproducir in vivo un determinado tejido con todos sus componentes celulares y extra-celulares, es decir, con todas sus características específicas. Esta prueba - concebida para determinar la estabilidad de los condrocitos pero extensible a cualquier población celular implicada en una determinada vía de diferenciación - consiste en una prueba in vivo para determinar el crecimiento independiente de anclaje y la estabilidad fenotípica de una determinada población celular comprendiendo la inyección subcutánea o intramuscular en un mamífero no humano de una suspensión celular de condrocitos articulares en un líquido iso-osmótico, comprendiendo la misma suspensión condrocitos articulares en una cantidad equivalente al menos a 1 x 10^{6} (preferiblemente a partir de 2 x 10^{6} a 20 x 10^{6}) condrocitos para aplicar a ratones inmunodeficientes. En el caso de que el mamífero sea un ratón, la prueba in vivo consiste en la inyección de una única suspensión celular intramuscular en ratones atímicos inmunodeficientes. Después de un periodo de tiempo determinado, de al menos 3 semanas, el ratón es sacrificado, diseccionado y el implante, si es extraído, se pesa, se fija y se evalúa histológicamente. La prueba in vivo de la invención resulta altamente específica ya que alrededor de 5 x 10^{6} condrocitos articulares recientemente aislados inyectados en un volumen de 50 - 100 \mul de cualquier líquido iso-osmótico tal como una solución tamponada de fosfato salino (PBS) o HBSS, son suficientes para producir, después de 3 semanas, un implante de cartílago maduro. El mismo número de células periósticas multiplicadas producen un tejido fibroso histológicamente parecido al tejido perióstico. Sin embargo, las células jóvenes derivadas del periostio (PDC), es decir, PDC de individuos menores de 20 años y preferiblemente menores de 16, cultivadas y multiplicadas bajo condiciones apropiadas, produjeron implantes cartilaginosos estables. Por el contrario, la inyección de líneas celulares de las que se conoce su potencial osteo-condrogénico in vitro - llamadas células ATDC5, CFK2,RCJ y C5.18 - no produjeron un implante recuperable. Un aspecto importante sería que los condrocitos articulares resembrados (P4 y P5) que todavía conservan su crecimiento independiente de anclaje y que mantienen la expresión del colágeno de tipo II en cultivo de agarosa (de acuerdo con el método de Benya et al. (1982) Cell (1):215-24), fracasaron al producir implantes. Este descubrimiento es de gran importancia ya que demuestra que la prueba de la agarosa - hasta ahora considerada como una prueba rigurosa de la estabilidad fenotípica de los condrocitos multiplicados (Brittberg et al. N. Engl. J. Med. 1994 Oct. 6;331(14):889-95) - no resulta suficiente para predecir la capacidad para formar cartílago in vivo. Como consecuencia, esta prueba bien conocida de la agarosa no puede funcionar como método de control de calidad para determinar cuándo el cartílago se encuentra en el estado adecuado para ser implantado. Sorprendentemente, los condrocitos epifisarios (que en un desarrollo embrionario normal experimentan una osificación endocondral y están destinados a ser sustituidos por hueso) producen un implante cartilaginoso en el cual tiene lugar la invasión vascular, la hipertrofia condrocítica y la formación de hueso.

Una segunda forma de realización de la presente invención es el empleo de determinadas condiciones específicas para la prueba in vivo de la primera forma de realización para evaluar la posibilidad de que determinado procedimiento o tratamiento administrado a determinada población celular implicada en determinada vía de diferenciación puedan dificultar su crecimiento independiente de anclaje así como su estabilidad fenotípica. Por ejemplo, mientras la liberación enzimática de las células mediante tratamiento enzimático no induce dicho riesgo, sucede todo lo contrario con la multiplicación celular extensiva (después de 2 - 3 pases) que compromete la capacidad de los condrocitos para producir un implante cartilaginoso en una prueba in vivo. Por otro lado, la prueba in vivo evalúa también si determinado tratamiento, tal como la adición de factores/reactivos de crecimiento, o procedimiento, tal como la estimulación física, mejora la estabilidad fenotípica de las poblaciones celulares. Por ejemplo, tratando la suspensión celular durante 30 minutos con CDMP-1 (100 ng/ml; solución de reserva en un 45% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluoroacético) justo antes de la inyección, seguido por dos lavados en PBS, triplica el peso húmedo del implante extraído comparado con las inyecciones de control, y duplica el número de células. Dicha mejora puede permitir una reducción espectacular de la multiplicación necesaria para la reparación de las JSD (en algunos casos llegando a hacer innecesaria la multiplicación in vitro) y, por consiguiente, la correspondiente reducción del riesgo de producir condrocitos fenotípicamente inestables.

Una tercera forma de realización de la presente invención es el empleo de la prueba in vivo de la primera forma de realización para predecir el resultado del trasplante autólogo de células ("ACT") empleando una determinada población de células implicada en una vía determinada de diferenciación (por ej., condrocitos multiplicados) como método para predecir la estabilidad fenotípica (por ejemplo, la estabilidad de los condrocitos). Esto puede evaluarse tanto empleando modelos animales bien estandarizados para el ACT o bien empleando un sistema ex vivo. Dicho sistema ex vivo consiste en colocar el cartílago articular, con o sin hueso subyacente, en cultivo (líquido, sólido o semisólido), originando una anomalía en el cartílago, con o sin una membrana natural o sintética para cubrir la lesión, y aplicando por debajo de la membrana, una población celular tanto en suspensión como sembrada en un soporte, con o sin factores de crecimiento para imitar in vitro los acontecimientos que tienen lugar in vivo durante la reparación de la JSD.

Una cuarta forma de realización de la presente invención consiste en la utilización de la prueba in vivo de la primera forma de realización para identificar marcadores moleculares relacionados con la estabilidad fenotípica de una determinada población celular implicada en una determinada vía de diferenciación, por ejemplo, condrocitos. Dichos marcadores moleculares pueden ser identificados mediante una RT-PCR semicuantitativa, mediante hibridación Northern (tal como se explica en el ejemplo 4 más adelante), mediante la generación de genotecas extraídas a partir de la población celular que tuvo éxito en la prueba in vivo que se corresponden a poblaciones celulares similares que fracasan (por ejemplo, condrocitos resembrados), mediante la técnica de la expresión diferencial o de la hibridación substractiva (SSH), o mediante arrays de ADN o chips de ADN. Dichos chips de ADN pueden conservar todos los genes conocidos implicados y/o simplemente no implicados en la estabilidad de los condrocitos. Las EST (etiquetas de secuencia expresada) pueden ser empleadas para identificar y proporcionar información sobre genes previamente desconocidos. Un conjunto de estos genes pueden ser identificados comparando el resultado de las poblaciones celulares que forman un buen cartílago y preferiblemente cartílago estable con los resultados de las poblaciones celulares que fracasan en dicho objetivo. Una tercera población empleada en la prueba comparativa puede comprender una población de condrocitos que forma cartílago in vitro mientras se encuentra presente un inductor (por ejemplo el TGF-\beta 1), pero que pierde esta capacidad una vez se extrae del medio de cultivo dicho inductor y falla en la formación de un implante de cartílago reparable in vivo. Para verificar la eficacia y la calidad inequívoca de los condrocitos se necesita un conjunto de marcadores positivos y negativos de la estabilidad fenotípica de los condrocitos, que consiste en al menos 2 y preferiblemente al menos 20 marcadores. Preferiblemente, el resultado se relaciona con los índices de los marcadores o los umbrales para ello (tomando en consideración las diferencias en la expresión y la posible regulación por incremento o por disminución de los marcadores). Preferiblemente el valor predictivo del conjunto de marcadores se ve incrementado mediante el análisis del efecto de variables independientes (edad, género, antecedentes, comorbilidades) en el resultado final del procedimiento del ACT. Esto puede realizarse almacenando en una base de datos todos los datos de los pacientes individuales junto con la expresión de los marcadores moleculares y una puntuación que refleje el resultado del procedimiento (basándose en el dolor, el funcionamiento de la articulación, la rigidez del tejido reparado por indentimetría, y finalmente el análisis histológico y molecular de la biopsia del tejido reparado). La influencia de las variables independientes en el valor predictivo de nuestro conjunto de marcadores será determinado mediante el análisis estadístico de los datos.

Los chips de ADN (o genosensores) consisten en arrays miniaturizados de sondas de ADN(c) ligados a superficie (habitualmente oligonucleótidos pero también sondas de ADN de mayor longitud) con las cuales se hibrida una muestra de ácido nucleico (la secuencia "diana"). En el contexto de la presente invención, los chips de ADN pueden ser empleados como herramientas de diagnóstico para determinar la estabilidad fenotípica de los condrocitos. El objetivo es producir huellas digitales de hibridación que puedan ser interpretadas por un ordenador y para cuyos índices de marcadores "positivos" y "negativos" puedan ser generadas. Los genosensores pueden albergar de cientos a miles (por ejemplo, 12.000) sondas de ADN, útiles para un análisis de alto rendimiento del marcador de ADN y hacer una copia de ARN mensajero (expresión diferencial en un chip). De una manera alternativa, conjuntos más pequeños de sondas, duplicadas en subseries a lo largo del chip, pueden ser empleados para examinar numerosas muestras en paralelo. Los oligonucleótidos son sintetizados tanto in situ en la superficie de soporte del genosensor (estrategia de fijación in situ) o, como manera alternativa, los oligonucleótidos presintetizados son fijados a cada lado de la serie (estrategia de fijación post-síntesis). El método de la fosforamidita de síntesis química de fase sólida se emplea para generar los oligonucleótidos en ambos casos (Matteuci y Caruthers (1981), J. Am. Chem. Soc. 103:3185-91). La estrategia de fijación post-síntesis resulta fácil de llevar a cabo empleando equipo y materiales disponibles comercialmente (Beattie, en Caetano-Anolles, Gresshoff (ed), DNA Markers. Protocols, applications and overviews. Wiley-VCH, New York, p. 213-224). Opciones más avanzadas se encuentran disponibles para la preparación de arrays de mayor densidad (Microfab technologies Inc.: Eggers et al., (1994), BioTechniques 17: 516-525; Accelerator Technology Corp.: McIntyre (1996), IBC Conference on Biochip Array Technologies, Marina del Rey, CA; Mirzabekov group: Yershov et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4913-4918; Khrapko et al. (1991), FEBS left 256: 118-122; Mirzabekov (1994), Trends Biotechnol. 12: 27-32). Las superficies de soporte constan de vidrio, tal como los portaobjetos, y vidrio en microcanal (Tonucci et al. (1992), Science 258: 783-785) o silicona porosa (Lehman (1993), J. Electrochem. Soc. 140: 2836-2843) para utilizar en un genosensor de transparencia (Beattie et al. (1995), Clin. Chem. 41: 700-706). En este último, la hibridación tiene lugar en volúmenes tridimensionales, produciendo una sección transversal de área de superficie por unidad aproximadamente 100 veces mayor comparada con los diseños de superficie plana bidimensional, aumentando en gran medida de ese modo la capacidad de enlace por célula de hibridación y proporcionando una sensibilidad de detección mejorada, etc. (Doktycz and Beattie (1996), en Beugelsdiik A (ed), Automated Technologies for Genome Characterization, John Wiley & Sons, New York; Beattie (1996), en: Slayer GS (ed), Biotechnology in the Sustainable Environment, Plenum Publishing Corp., New York; Beattie et al. (1996), en: Schlegel, J. (ed), Pharmacogenetics: Bridging the Gap between Basic Science and Clinical Application. IBC Biomedical Library, Southborough, MA. Las sondas de oligonucleótidos se unen mediante un enlace covalente a, por ejemplo, superficies de dióxido de silicona aplicando los métodos de Lamture et al. (1994), Nucleic Acid Res. 22: 2121-2125; Beattie et al. (1995), Clin. Chem. 41: 700-706, Mol. Biotechnol. 4: 213-225; Doktycz y Beattie (1996), en: Beugelsdiik A. (ed), Automated Technologies for Genome Characterization. John Wiley & Sons, New York; Beattie (1996), en: Slayer GS (ed), Biotechnology in the Sustainable Environment, Plenum Publishing Corp., New York; o Beattie et al. (1996), en: Schlegel, J. (ed), Pharmacogenetics: Bridging the Gap between Basic Science and Clinical Application. IBC Biomedical Library, Southborough, MA. Los protocolos para la fijación a las superficies de vidrio, empleando oligonucleótidos de 3'-propanolamina (Genosys Biotechnologies, The Woodlands, TX) y los portaobjetos se encuentran disponibles en Beattie (Caetano-Anolles, Gresshoff (ed), DNA Markers. Protocols, applications and overviews. Wiley-VCH, New York, p. 213-224) y Beattie et al. (1995), Mol. Biotechnol. 4: 213-225. Se encuentra comercialmente disponible un sistema automatizado de distribución de fluidos (por ejemplo el sistema Hamilton Microlab 2200 equipado con agujas de 21 G y jeringas de 50 \mul), capaz de preparar gotículas tan pequeñas como de 10 \muL en placas de vidrio con un espaciado de 1 mm de centro a centro (Beattie et al. (1995), Clin. Checo. 41: 700-706, Mol. Biotechnol. 4: 213-225)

Los genosensores y los diagnósticos de acuerdo con la presente invención pueden ser empleados para diagnosticar el estado de las células y de los cultivos celulares pero además pueden ser empleados in situ para determinar la vitalidad del cartílago humano o animal.

Una quinta forma de realización de la invención es la identificación de un conjunto de marcadores moleculares relacionados con el resultado de la prueba in vivo de la primera forma de realización, empleando células recientemente aisladas o resembradas a partir de una población celular determinada implicada en una vía de diferenciación determinada, por ejemplo, condrocitos, y por lo tanto relacionada con la estabilidad fenotípica (por ejemplo de los condrocitos). Por ejemplo, condrocitos humanos recientemente aislados fueron utilizados para la purificación de ARN y cultivados in vitro. Mediante pases una alícuota de células fue empleada para la purificación de ARN, 2 alícuotas de 5 x 10^{6} células fueron inyectadas en la prueba in vivo y el resto, resembradas. Los ARN fueron evaluados mediante una RT-PCR semicuantitativa para la expresión de genes de los que se sabe que juegan un papel importante en la condrogénesis y en el mantenimiento del cartílago.

En el análisis mediante PCR también se incluyeron genes aislados a partir de una población de ADNc substraído que se obtuvo mediante el método substractivo de hibridación: el ADNc obtenido a partir de condrocitos P0 de cerdo (estables en la prueba in vivo) se emparejó contra el ADNc de condrocitos P1 (que fallaron al producir un implante) en una hibridación substractiva bidireccional. ADNc individuales de las dos poblaciones de ADNc substraído (P0-P1 y P1-P0) fueron clonados en un vector PCR-Script Amp SK (+), y secuenciados. Los homólogos humanos, cuando se conocían, fueron incluidos en el análisis mediante RT-PCR. Los ADNc desconocidos fueron evaluados para la expresión diferencial mediante un análisis Northern.

Los resultados indican la alta expresión de la BMP-2, el FGFR-3 y el colágeno de tipo II como asociados a la estabilidad de los condrocitos, mientras que la expresión de la pseudoactivina cinasa (ALK)-1 y el colágeno de tipo X se asocian negativamente. La ausencia de un marcador negativo puede ser interpretada como un marcador positivo.

Otros marcadores coexpresados con el FGF3-R o el BMP-2 y la ALK-1 respectivamente y que por lo tanto predicen su expresión, pueden ser empleados en el control de calidad y entran de lleno en el ámbito de la presente invención. La expresión del marcador molecular puede ser detectada en el nivel del ARNm (por ejemplo, mediante RT-PCR), en el nivel de proteína (por ejemplo mediante anticuerpos específicos, policlonales o monoclonales), mediante ligandos específicos (por ejemplo, el FGF9 es un ligando específico del FGFR-3). El FGF-9 etiquetado con fluorocromo puede ser empleado para seleccionar células que expresen el FGF-3 mediante FACS, o perlas de FGF-9 magnéticas revestidas pueden ser utilizadas para clasificar células que expresen el FGFR-3 mediante un campo magnético (Dynabeads).

Como manera alternativa, la detección de marcadores moleculares (por ejemplo el FGFR-3) puede realizarse de una manera indirecta mediante genes diana específicos o cualquier otro componente de la vía del FGFR-3, mediante construcciones indicadores (método indirecto basado en la detección de la actividad del promotor del FGFR-3 o de los promotores que son específicamente activados al señalar el FGFR-3 controlando la expresión de un gen indicador heterológico). Los anticuerpos policlonales o monoclonales actúan preferiblemente contra el dominio extracelular del receptor de manera que dichos anticuerpos pueden emplearse para la selección de células, por ejemplo mediante FACS (descrito anteriormente). De una forma más específica, sería hidrofílica y por lo tanto accesible de una forma inmediata y sería específica para el FGFR-3. Los anticuerpos IgM/IgG de ratón, conejo o cualquier otra especie adecuada de la presente invención actúan contra un fragmento del FGFR-3, por ejemplo contra la región entre la secuencia de la pseudo-inmunoglobulina I y II del domino extracelular del FGFR-3. Un péptido adecuado para producir anticuerpos adecuados presenta la secuencia de aminoácidos TGLVPSERVLVGPQRLQVLNASHEDSGAYSCRQRLTQRVL. La secuencia entera del receptor del FGFR-3 se encuentra públicamente disponible (número de adquisición a Genbank NM_000142). Los anticuerpos contra otros dominios del receptor del FGFR-3 entran en el ámbito de la presente invención. Los métodos para producir dichos anticuerpos son muy conocidos en la especialidad y se describen por ejemplo en Ausubel et al. (ed), Short Protocols in Molecular Biology, 4ª edición, John Wiley & Sons, New York, y más específicamente en las unidades 11.3, 11.4 y 11.5; en Paul (ed), Fundamental Immunology, 4ª edición, Lippincott-Raven Publishers, New York, y más específicamente en el capítulo 4, p 101 ef; de St. Groth y Scheidegger (1980), J immunol. Methods 35:1-21; French et al. (1986), Immunol. Today 7:344-346; Langone y Vunakis (1986), Methods in Enzymology, vol. 121, Immunochemical Techniques. Part I, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. Orlando: Academic Press; Hámmerling et al. (1981), Monoclonal antibodies and T-cell hybridomas. Perspectives and technical advances. Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biomedical Press; Yokoyama (1995) en Coligan et al. (ed), Current protocols in immunology, Wiley & Sons, New York, 2.5.1-2.2.17; Kohler y Milstein (1975), Nature 256: 495-497. También es posible la derivación de anticuerpos monoclonales a partir de, por ejemplo, genotecas de fagos (Paul (ed), Fundamental immunology, 4ª edición, Lippincott-Raven Publishers, New York, y más específicamente en el capítulo 4, p 101 ef; de Bruin et al. (1999), Nature Biotechnology 17(4): 397-399).

Una sexta forma de realización de la presente invención consiste en el empleo de marcadores positivos y/o negativos de estabilidad fenotípica (por ejemplo, un condrocito) identificados en la quinta forma de realización, tanto individualmente como en combinación, como herramientas para verificar pase a pase la multiplicación celular, concretamente para predecir cuándo la expansión celular ha de ser parada y/o recuperar las células (por ejemplo, condrocitos) que ya han perdido su estabilidad fenotípica sólo cuando sea necesario, y finalmente proporcionar un sistema de control de calidad de las células (por ejemplo, condrocitos) pera que puedan ser empleados en trasplantes celulares autólogos ("ACT"), y por lo tanto, haciendo de las suspensiones de células (por ejemplo, un condrocito) para el ACT un producto más fiable y consistente.

Una séptima forma de realización de la presente invención consiste en la utilización del análisis FACS y otros métodos de separación para seleccionar, a partir de una población celular (por ejemplo, un condrocito), solamente aquéllas que conservan su estabilidad fenotípica. Los marcadores "positivos" asociados a la membrana (por ejemplo, FGFR-3 o marcadores co-detectables con FGFR-3, indicadores de actividad del FGFR-3, o componentes de la vía de señalización del FGFR-3 que dan cuenta de la activación del FGFR-3) se utilizarán para la selección positiva de células con estabilidad fenotípica (por ejemplo, condrocitos estables), mientras que los marcadores "negativos" asociados a la membrana (por ejemplo la ALK-1 o los marcadores co-detectables con la ALK-1) se emplearan para seleccionar células sin estabilidad fenotípica (por ejemplo, condrocitos inestables). Los marcadores positivos y negativos pueden ser utilizados individualmente o combinados. La consistencia de la selección será verificada mediante la detección de marcadores no relacionados y no asociados a la membrana tales como la BMP-2 y el colágeno de tipo II en la población seleccionada, enriqueciendo por lo tanto de una forma significativa la población celular que va a ser utilizada para el ACT con células que presentan estabilidad fenotípica (por ejemplo, condrocitos estables) y por consiguiente aumentando la calidad y la eficiencia de todo el procedimiento. El FACS es uno de los métodos convencionales de selección celular empleado para separar una población celular específica de una suspensión celular heterogénea. Los anticuerpos que actúan contra los marcadores celulares específicos se etiquetan con fluorocromos y se emplean para etiquetar la población celular que expresa dicho marcador. Se emplea la fluorescencia para seleccionar células individuales mediante una tecnología específica (Beckton Dickinson). Los métodos para etiquetar los anticuerpos con fluorescencia son bien conocidos en la técnica y muchos de dichos anticuerpos se encuentran disponibles comercialmente. De una manera alternativa, un anticuerpo sin etiquetar puede ser utilizado para enlazarse específicamente al polipéptido de la superficie celular, y un segundo anticuerpo etiquetado puede ser utilizado para unirse específicamente con el primer anticuerpo. Otras técnicas, tales como el empleo de perlas magnéticas de proteínas conjugadas que se enlazan selectivamente con células en concreto, también pueden ser utilizadas. Equipos (kits) diseñados a tal efecto se encuentran disponibles comercialmente. Generalmente, dichos equipos emplean un anticuerpo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo etiquetado con biotina) para enlazarse a la proteína marcadora de la superficie celular. Las células enlazadas con el anticuerpo entran en contacto con el conjugado perla-proteína, en el cual la porción proteica del conjugado perla-proteína se une específicamente el anticuerpo etiquetado. Por ejemplo, un conjugado entre una perla magnética y la estreptavidina puede ser utilizado para unirse al anticuerpo marcado con biotina para producir un complejo que contenga el conjugado entre la perla magnética y la proteína, el anticuerpo marcado y la célula que expresa la proteína marcadora. Dichos complejos pueden ser separados de las otras células al adherir temporalmente el complejo a un imán separando las células adheridas de las otras células (por ejemplo, una población de células empobrecida por, por ejemplo, condrocitos fenotípicamente inestables). Las perlas magnéticas que se han unido mediante enlace covalente a un anticuerpo secundario se encuentran disponibles comercialmente. Otros métodos de selección celular basados en los anticuerpos, como el uso de la cromatografía de afinidad o la retención de células que expresan proteínas de superficie celular en concreto mediante placas de Petri revestidas con anticuerpos dirigidos contra las cuales están dirigidos, también resultan conocidos en la técnica y pueden ser empleados en la invención. Un práctico equipo de separación celular por afinidad se encuentra disponible comercialmente, "CEPRATE LC", puede obtenerse de CellPro (CellPro, Inc. Bothell WA 98021)

Los métodos de selección celular pueden implicar el tener que seleccionar las células basándose en los índices adecuados, por ejemplo, la relación de células que expresan un marcador positivo mencionado anteriormente respecto con un marcador negativo mencionado anteriormente. Preferiblemente, dicha relación es tal que las células con marcadores positivos son mayoría, es decir, el índice de células con marcadores positivos respecto a las células con marcadores negativos es de 1 o mayor que 1, preferiblemente 2 o mayor que 2.

Otra forma de realización de la presente invención comprende las células, su utilización manteniendo la estabilidad fenotípica y su selección entre una población celular mediante el método descrito anteriormente para una variedad de aplicaciones clínicas. Las células son células típicamente humanas adultas o maduras que presentan estabilidad fenotípica. Las células son en concreto células de cartílago articular humano adultas o maduras pero también pueden ser células adultas o maduras de animales que presenten las mismas propiedades. Dichas células, pueden por ejemplo ser trasplantadas sin un posterior tratamiento para una zona de tejido conectivo en un paciente para originar la reparación o la regeneración del cartílago o hueso dañado. A diferencia de métodos anteriores, la presente invención no requiere necesariamente (tal como ha sido explicado en la segunda forma de realización) un cultivo in vitro para obtener una población celular adecuada (tanto en naturaleza como en cantidad) para ser utilizada en una aplicación in vivo. A modo de ejemplo, dichas células seleccionadas que mantienen la estabilidad fenotípica pueden ser implantadas en cualquier zona de tejido conectivo que necesite una regeneración de cartílago mediante un procedimiento de implante tal como cirugía o una inyección artroscópica. Otra aplicación clínica de dichas células implica la formación de un dispositivo protésico del que se pretende que pueda ser implantado en un mamífero para mejorar la sujeción de dicho dispositivo. Esto incluye dispositivos de artroplastia de rodilla y de cadera fabricados con materiales orgánicos o inorgánicos que presentan baja actividad inmunogénica tales como aleaciones de titanio, hidroxiapatito cerámico, acero inoxidable y aleaciones de cobalto - cromo. Otro ejemplo es el uso de dicha población celular para crear y mejorar la función de un esfínter mediante la formación y mantenimiento de un soporte cartilaginoso, por ejemplo alrededor de la uretra para la incontinencia urinaria de esfuerzo.

En otra forma de realización, la razón Célula^{+} / Célula^{-} de células que expresan la BMP-2 y/o el FGFR-3 y/o los marcadores co-detectables con dichos marcado y/o construcciones indicadoras específicas o moléculas que pertenecen a las vías de señalización intracelular específicas como marcadores moleculares asociados positivamente con la estabilidad fenotípica de los condrocitos a la pseudoactivina cinasa-1 (ALK-1) y/o marcadores co-detectables con dicho marcador y/o construcciones indicadoras específicas o moléculas que pertenecen a las vías de señalización intracelular específicas como marcadores moleculares asociados negativamente con la estabilidad fenotípica de los condrocitos es mayor que 1, preferiblemente mayor que 2. Las células o el cultivo celular pueden encontrarse en una manera adecuada para su implante en un humano o en un animal.

Otra forma de realización de esta invención consiste en una composición terapéutica que comprende células seleccionadas mediante el método descrito anteriormente para ser utilizada en aplicaciones clínicas. Las células son maduras o adultas presentando estabilidad fenotípica. Además de las células seleccionadas la composición comprende al menos un transportador farmacéuticamente aceptable, bien conocido por los expertos en la especialidad y por ejemplo seleccionado a partir de proteínas como el colágeno o la gelatina, carbohidratos tales como el almidón, polisacáridos, azúcares (dextrosa, glucosa y sacarosa), derivados de la celulosa como la carboximetilcelulosa sódica o cálcica, la hidroxipropil celulosa o la hidroxipropilmetil celulosa, almidones pregelatinizados, agar de pectina, carragenina, arcillas, gomas hidrofílicas (goma arábiga, goma guar y goma de Xanthan), ácido algínico, alginatos, ácido hialurónico, ácido poliglicólico y poliláctico, dextrano, pectinas, polímeros sintéticos tales como el polímero acrílico soluble en agua o polivinilpirrolidona, proteoglicanos, fosfato de calcio y similares. Cuando la composición terapéutica está pensada para el trasplante en una zona del cuerpo que necesita repararse, puede comprender adicionalmente al menos un factor de crecimiento de la familia TGF-\beta.

Se obtendrá una interpretación más completa de la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplo 1 Obtención del cartílago y aislamiento celular

El cartílago articular se obtuvo, dentro de las 24 horas posteriores a la muerte, excepto si se ha especificado lo contrario, de donantes humanos que no habían sufrido ninguna patología articular. Después de la inspección macroscópica para descartar patologías articulares evidentes, el cartílago obtenido de los cóndilos femorales fue cortado completamente en láminas de grosor tomográfico e introducido en una solución salina equilibrada de Hank ("HBSS") (se puede conseguir de Life Technologies) complementada con 200 unidades/ml de penicilina, 200 \mug/ml de estreptomicina, y 0,5 \mug/ml de anfotericina B (Life Technologies). Después de dos lavados en HBSS durante 5 minutos a 37ºC, el cartílago fue molido muy fino y colocado en una solución estéril de colagenasa natural al 0,2% (Life Technologies) en medio de Eagle con modificación Dulbecco ("DMEM") con alto contenido en glucosa (Life Technologies) que contiene un 10% de suero fetal bovino ("FBS") (Biowittaker), 200 unidades/ml de penicilina, 200 \mug/ml de estreptomicina, y 0,5 \mug/ml de anfotericina B. Después de incubarlas toda la noche a 37ºC, las células se lavaron dos veces en medio de cultivo - DMEM complementado con un 10% de FBS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, y 0,25 \mug/ml de anfotericina B - y recontadas mediante la prueba de exclusión del azul tripán para ajustar el número de células viables.

Ejemplo 2 Prueba in vivo

Las células aisladas en el ejemplo 1 fueron lavadas dos veces en una solución estéril tamponada salina de fosfato ("PBS"), resuspendidas en un volumen de 100 \mul de PBS e inyectadas vía intramuscular en el muslo de hembras de 4-5 semanas de edad de ratones atímicos inmunodeficientes. Los animales fueron sacrificados después de 3 semanas mediante dislocación cervical y el muslo diseccionado para recuperar el implante en la zona de la inyección. Los implantes se pesaron, se congelaron rápidamente (snap-frozen) y se almacenaron en nitrógeno líquido para su hibridación in situ o se fijaron en formaldehído al 4% recién hecho durante 4 horas para la histología y la inmunohistoquímica. Después de la fijación las muestras se incluyeron en parafina, se cortaron secciones de 5 \mum de espesor y se tiñeron de acuerdo con los protocolos estándar (azul alcián pH 2,5, azul de toluidina, tricoma de Masson, safranina O) (Manual de Técnicas Histológicas). Cantidades diferentes de células, de 20 x 10^{6} a 5 x 10^{5}, se emplearon en la inyección para establecer la cantidad mínima de células que produjeron un implante cartilaginoso. A pesar de que la cantidad mínima de condrocitos recién aislados que produjeron un implante fue de 1 x 10^{6}, nosotros escogimos como cantidad óptima usar 5 x 10^{6} células ya que dicho número siempre produjo al menos un implante en inyecciones duplicadas cuando se utilizaron los condrocitos recién aislados.

La Figura 1 muestra cómo los condrocitos articulares humanos adultos recién aislados o de pase inicial originan tejido cartilaginoso después de la inyección en ratones atímicos. (a) y (b) tinciones en safranina O de cartílago articular humano adulto cultivado a partir del cóndilo femoral. (c) y (d) tinción en safranina O de un implante de cartílago. (b) y (d) son detalles de (a) y (c) tal como se indica en los recuadros en (a) y (b), respectivamente. Comparado con el cartílago articular humano adulto, el implante es hipercelular. La tinción en tricoma de Masson en (e) presenta la ausencia de neoangiogénesis o de formación de hueso endocondral. (f) La inmunofluorescencia para el colágeno de tipo II es claramente positiva en el ECM del implante. Los puntos oscuros son azules. El color más suave es rojo. El tejido muscular adyacente está indicado con un asterisco. Los núcleos se han contrastado con DAPI. La escala gráfica es de 200 \mum.

A fin de verificar que las células viables se necesitaron para organizar el implante de cartílago, se inyectó un número equivalente de células que habían sido inactivadas mediante su congelación y fusión en nitrógeno líquido tres veces. Dichas inyecciones no produjeron ningún tipo de implante. También investigamos si las células podrían proliferar, irradiamos los condrocitos recién aislados con una dosis única de 50 Gy, una dosis que bloquea la proliferación pero que no resulta letal para las células. Exceptuando algunas atipias citológicas, las inyecciones produjeron un implante de cartílago hialino normal.

Sorprendentemente, la inyección de condrocitos epifisarios embrionarios (que en el desarrollo embrionario normal se ven substituidos por hueso) produjo un implante con invasión vascular y formación de hueso endocondral. Estos datos demuestran la excelente especificidad de la prueba in vivo para seguir la vía fenotípica en la cual se coloca la célula inyectada.

Para investigar el perfil hidrodinámico de los proteoglicanos sulfatados (un componente importante de la matriz extracelular del cartílago) llevamos a cabo la incorporación [35S]SO4 y el fraccionamiento por tamaño de macromoléculas tanto en los implantes como en el cartílago articular humano natural. La Figura 2 muestra la presencia en 3 implantes (A) de proteoglicanos de alto peso molecular con las mismas dimensiones hidrodinámicas que en los explantes de cartílago articular humano adulto (B). Los proteoglicanos de alto peso molecular (pico izquierda) se encuentran presentes en ambos implantes y en el cartílago articular. Esta fracción de peso molecular es específica del tejido cartilaginoso.

A fin de investigar si el implante cartilaginoso está compuesto de células de origen humano, es decir, para comprobar que solamente las células inyectadas son las que producen factores que inducen la condrogénesis en el músculo del ratón, realizamos una hibridación in situ para repeticiones Alu específicas de humanos tal como describieron Kutznetsov et al. (1997), J. Bone Miner. Res. (9): 1335-47 y para repeticiones L1 específicas de ratones. Este procedimiento demostró que las células que contribuyen en la formación de cartílago en nuestra prueba in vivo son de origen humano, es decir, derivan de las células inyectadas y no del ratón anfitrión. La Figura 3 presenta el origen del implante. Se hibridaron secciones consecutivas con sondas específicas de humano (a) o de ratón (b) reconociendo repeticiones genómicas (Alu y m-L1 respectivamente). (c) es una superimposición de (a) y (b) empleando colores artificiales. La mezcla de células humanas y de ratón en el extremo izquierdo del implante se debió a la infiltración de condrocitos entre las fibras musculares tal como se muestra en la tinción con azul de toluidina en (d). La escala gráfica es de
200 \mum.

Ejemplo 3 Los pases seriados producen deficiencias en la estabilidad de los condrocitos

Se colocaron en un cultivo en capa monomolecular muestras de 3 donantes humanos independientes. Se realizaron los pases y se destinó una alícuota de células para duplicar la inyección en la prueba in vivo del ejemplo 2 y para el aislamiento de ARN. La estabilidad de los condrocitos, medida al extraer un implante de cartílago en la zona de la inyección, al cabo de 3 semanas, se había perdido entre el pase 1 y el pase 3.

\newpage

Ejemplo 4 Marcadores moleculares asociados con la estabilidad condrocítica

Se obtuvieron los depósitos de condrocitos articulares humanos tal como se describe en el ejemplo 1 y se cultivaron en capa monomolecular. Se realizaron los pases y se inyectaron 2 alícuotas (de 5 x 10^{6} células cada uno) en la prueba in vivo del ejemplo 2, una alícuota menor se empleó para obtener el extracto de ARN y el resto fue recultivado. La totalidad de los ARN fueron retrotranscritos empleando Thermoscript (disponible en Life Technologies) y fue empleado para el análisis de PCR semicuantitativa. Después del 5º pase, se colocaron dos muestras en cultivos de agarosa de bajo punto de fusión, un sistema del que se sabe que produce el rescate de la expresión del colágeno de tipo II por parte de los condrocitos desdiferenciados. Después de 2 meses, la formación de colonias era abundante y se sembraron cultivos para la extracción del ARN. Se llevó a cabo un análisis mediante RT-PCR semicuantitativa para la expresión de los genes implicados en la condrogénesis.

A fin de explorar el papel de los genes de los que se desconoce su implicación en la condrogénesis, realizamos un análisis de expresión diferencial basándonos en el principio de la hibridación substractiva: se sembraron condrocitos articulares de cerdo y se cultivaron en capa monomolecular. Se realizaron los pases celulares y se llevaron a cabo las pruebas de estabilidad de los condrocitos aislándose el ARN. Se purificó ARN Poly A^{+} empleando el Mini Kit Oligotex para ARNm (disponible en Quiagen) del total de ARN obtenido a partir de las células P0 y P1. Nosotros escogimos dichas dos poblaciones ya que las células P0 todavía producían un implante de cartílago en la prueba in vivo del ejemplo 2 mientras que las células P1 no lo hacían. Se extrajo recíprocamente ADNc para obtener especies expresadas de forma diferente por las células P0 (marcadores potenciales positivos de condrocitos estables) y especies expresadas de forma diferente por las células P1 (marcadores negativos). La extracción y la amplificación de los ADNc extraídos se llevó a cabo empleando el equipo de extracción de ADNc PCR-Select^{TM} (disponible de Clontech). Los ADNc fueron clonados en un vector PCR Script amp SK (+) y secuenciados. Los genes de los cuales se conocía el homólogo humano se incluyeron en el análisis semicuantitativo mediante RT-PCR en muestras humanas, mientras que a los genes desconocidos se les controló su expresión diferencial en la población original de ARN mediante análisis Northern. Los procedimientos detallados empleados fueron los siguientes:

Preparación del ARN

La totalidad del ARN obtenido a partir de los condrocitos fue aislado empleando el reactivo Trizol (disponible de Life Technologies), precipitada con etanol y almacenada a -70ºC para su uso posterior. La totalidad del ARN de los cultivos de agarosa fue obtenido homogeneizando el cultivo entero en urea 6M, cloruro de litio 3M con un homogeneizador Polytron, y la mayor parte de agarosa se quitó mediante centrifugación a temperatura ambiente a 3.000 rpm durante 15 minutos. Se permitió que los ácidos nucleicos del sobrenadante precipitaran durante la noche a 4ºC, se sedimentó mediante centrifugación durante 15 minutos a 18.000 rpm a 4ºC y se quitó el sobrenadante, el ARN fue secado con aire y disuelto en agua sin ribonucleasa. Se quitaron los residuos de agarosa y otros contaminantes mediante la extracción por fenol-cloroformo seguido de la precipitación por etanol. Las muestras se redisolvieron en agua sin ribonucleasa y se almacenaron a -70ºC para su uso posterior. Para aquellas muestras que requerían una selección de ARNm, se separó el ARN prolongado con poly A^{+} del ARN total mediante selección doble empleando el Mini Kit Oligotex para ARNm (Quiagen).

Análisis semicuantitativo con RT-PCR

Primero se utilizó 1 \mug del total de ARN para transcribir su cadena empleando Thermoscript (Life Technologies). Previamente al análisis con la PCR, los ADNc se ecualizaron para la actina. La PCR para la \beta actina humana se llevó a cabo en un volumen de 10 \mul parando la reacción después de 18, 19, 20 ciclos para asegurarse que la amplificación de la PCR se encontraba todavía en la fase exponencial. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% en un tampón TBE, teñido con bromuro de etidio y la intensidad de las bandas se analizó por densiometría empleando el software de Image Master (disponible de Pharmacia-Biotech). Se diluyeron los ADNc de acuerdo con la intensidad relativa de las bandas. Para descartar que la \beta actina fuera regulada de una forma diferencial en las distintas muestras a comparar, el mismo análisis fue también llevado a cabo para ARNm GAPDH. Después de la ecualización para la \beta actina, todas las muestras fueron evaluadas simultáneamente para un cierto número de genes de los que se sabe que están implicados en la condrogénesis y en el mantenimiento del cartílago. El mismo análisis se llevó a cabo para aquellas moléculas obtenidas mediante el método de la hibridación substractiva. Para cada gen se optimizaron los ciclos de tal manera que la amplificación se encontrase todavía en una fase exponencial cuando se paraba la PCR para todas las muestras.

La Figura 4 muestra cómo la expansión seriada de los condrocitos articulares adultos humanos producía la pérdida de su capacidad para formar cartílago in vivo. Se multiplicaron muestras obtenidas a partir de 2 donantes independientes (S1 y S2). Se hicieron los pases y los alícuotas de la suspensión celular se inyectaron en ratones atímicos o empleados para el análisis de la expresión de los genes. Después de 2 duplicaciones de la población, los condrocitos todavía podían formar tejido cartilaginoso maduro tal como se evaluó con azul alcián (a y a') y safranina O (c y c'), Después de 4 duplicaciones de la población - flecha negra - la pérdida de capacidad para formar cartílago vino anunciada por la formación de más implantes inmaduros tal como muestran las tinciones con azul alcián (b y b') y safranina O (d y d'). Los condrocitos de pases posteriores - flecha clara - no formaron ningún implante recuperable. La pérdida de potencial para formar cartílago se marcó mediante regulación por disminución del ARNm del colágeno de tipo II, el Fgfr3 y la Bmp2, mientras que la expresión del ARNm de la Alk1 se reguló por incremento. En la figura, por FI entendemos condrocitos recién aislados. La escala gráfica es de 200 \mum. La aparición del marcador negativo ALK-1 se asocia con o anuncia el estado de no formación de un implante recuperable y la aparición de dicho marcador negativo se asocia con la regulación por disminución de los marcadores positi-
vos.

La Figura 5 muestra cómo el conjunto de marcadores moleculares predice la capacidad del AHAC para formar cartílago estable in vivo con independencia de la edad del donante. Los condrocitos recién aislados (FI) y pasados de forma seriada obtenidos de donantes de diferentes edades (comprendiendo entre los 28 y los 86 años de edad) fueron sometidos a una prueba de provocación en nuestra prueba in vivo a lo largo de la multiplicación. La flecha negra señala el pase cuando un descenso de la madurez del implante se detectó por primera vez. La flecha clara señala el primer pase a partir del cual no pudo recuperarse ningún implante. De nuevo la regulación por disminución de los marcadores positivos viene seguida por la regulación por incremento del marcador negativo ALK-1 y, al mismo tiempo, la aparición de la ALK-1 anuncia la fase a partir de la cual ningún implante puede ser recuperado.

La Figura 6 muestra cómo la prueba de la agarosa no predice la capacidad de formar tejido cartilaginoso por parte de los condrocitos multiplicados en nuestra prueba in vivo. Se inyectaron en ratones atímicos condrocitos articulares humanos adultos recién aislados (FI) y pasados en serie y se evaluaron mediante la prueba de la agarosa. (a) A pesar de que las células perdieron su capacidad para formar tejido cartilaginoso in vivo después del segundo pase, todavía podían crecer en condiciones independientes de anclaje en agarosa después del 5º pase (alrededor de 10 duplicaciones de la población). (b) El perfil molecular de los mismos condrocitos a lo largo de los pases y después del cultivo en agarosa se muestra en A(10). FI continúa indicando a los condrocitos recién aislados. La flecha indica el primer pase a partir del cual no se puede recuperar el implante. A pesar de que se ha producido el rescate de los marcadores positivos, el marcador negativo todavía se encontraba regulado por incremento y estas células no formaron cartílago in vivo. Ésta es una demostración clara de que la presencia de un marcador positivo, por ejemplo el FGFR3, es un indicador de un cartílago saludable pero no es indicativo del mismo de una forma exclusiva. De ahí que el uso de marcadores negativos solos para seleccionar o emplear una combinación de marcadores positivos y negativos son formas de realización preferidas de la presente invención.

Ejemplo 5

La Figura 7 muestra cómo la presencia de un marcador negativo para la estabilidad de los condrocitos ofrece la posibilidad de un control interno de los niveles de expresión. Se lleva a cabo la RT-PCR para el FGFR3 y la Alk 1 en el mismo tubo para condrocitos recién aislados (FI) y multiplicados en distintos pases. La aparición de la banda alta correspondiente al Alk1 y la disminución de la banda del Fgfr3 señala la pérdida de capacidad para organizar un implante de cartílago in vivo. La flecha indica el primer pase a partir del cual no se puede recuperar ningún implante. Esto coincide con la aparición del marcador negativo ALK-1 y la desaparición del marcador positivo FGFR3.

Ejemplo 6 La prueba in vivo y el conjunto de marcadores para predecir el resultado del autotrasplante de condrocitos (ACT) en un modelo animal

Machos jóvenes de conejos blancos de Nueva Zelanda o cabras se utilizaron como modelos para el ACT. El cartílago articular de la rótula o de los cóndilos femorales se cortan con un dispositivo que produce una anomalía superficial en el cartílago de 0,3 mm de profundidad y de 3 mm de diámetro y, por lo tanto, sin penetrar en el hueso subyacente. Los condrocitos articulares humanos se multiplican un número diferente de veces tal como se explica en el ejemplo 1, se analizan para encontrar la presencia de marcadores asociados con la estabilidad condrocítica de acuerdo con el ejemplo 4 y se inyectan de nuevo en la lesión del cartílago bajo una lámina de periostio tal como describieron Brittberg et al. (1996) Clin. Orthop. (325): 270-83. Al cabo de tres meses se sacrificaron los animales, se analizó la lesión de la superficie articular y se comprobó histológicamente la extensión y calidad de la curación e integración de los bordes. Se lleva a cabo la hibridación in situ para repeticiones de Alu humana a fin de investigar la contribución de los condrocitos inyectados en la reparación del cartílago.

Mediante un método distinto hemos creado un modelo ex vivo de reparación de JSD mediante ACT. Se extirpó la rótula entera de un macho joven de conejo blanco de Nueva Zelanda, se originó una lesión cartilaginosa y se inyectaron condrocitos previamente aislados bajo una lámina perióstica suturada para cubrir la lesión. Entonces se coloca la rótula en un cultivo en DMEM complementado con FBS al 10% y una solución antibiótica y antimicótica a 37ºC en una atmósfera al 5% de CO_{2}. Después de 2 semanas se fijó en formaldehído al 4%, se realizó la inclusión en parafina y se analizó histológicamente y mediante otras técnicas.

Este sistema permite unas condiciones experimentales más ajustadas y controladas así como un seguimiento mucho más flexible del proceso de curación mediante, por ejemplo el marcado de células, el momento de la biopsia del tejido que se está curando para su análisis histológico y molecular, etc.

Ejemplo 7 Rescate de los condrocitos articulares pasados en serie

Un tratamiento corto con un factor de crecimiento de la superfamilia del TGF-\beta justo antes del implante puede rescatar parcialmente los condrocitos articulares que acaban de perder su estabilidad fenotípica o reducir de manera espectacular el procedimiento de multiplicación celular que tiene lugar antes de que las células puedan ser inyectadas para reparar anomalías de la superficie articular, eliminando de una manera ideal la necesidad de ello. El tratamiento se administra a las células en suspensión durante un corto intervalo de tiempo y se continúa con unos lavados extensos en PBS justo antes de la inyección. De una manera similar, las células tratadas son evaluadas para la expresión de los marcadores moleculares relacionados con la estabilidad fenotípica del condrocito articular.

En una serie de experimentos, condrocitos articulares recién aislados en una única suspensión celular fueron expuestos durante 30 minutos a 100 ng/ml de CDMP-1 en la mezcla de nutrientes de Ham F-12 (Life Technologies) a 37ºC, lavados dos veces en PBS e inyectados en la prueba in vivo del ejemplo 2. Se realizaron inyecciones de control con los condrocitos expuestos al HAM-F12 solo. Después de 3 semanas se pesaron los implantes de cartílago, se digirieron en colagenasa natural al 0,2% a 37ºC y se procedió al recuento de las células aisladas. El implante obtenido de las células tratadas con CDMP-1 presentó un peso húmedo tres veces mayor que el de las muestras tratadas con HAM-F12 solo, y el recuento celular fue dos veces más elevado. Tal como se ilustra en la Figura 8, también la producción de proteoglicanos sulfatados en un nivel alto se vio mejorada tal como se comprobó mediante una tinción metacromática más intensa con safranina \beta en el implante obtenido a partir de los condrocitos tratados con el CDMP-1 (Figura 8B) si se compara con el control (Figura 8A). Esto demuestra que una corta exposición al CDMP-1 en suspensión, justo antes de la inyección, es capaz de mejorar el fenotipo condrocítico tal como se determinó en la prueba in vivo del ejemplo 2. Además, la eficacia de dicho ritmo hace que sean innecesarias las multiplicaciones, caras y potencialmente peligrosas.

Ejemplo 8 Aislamiento de condrocitos estables a partir de una población celular mixta mediante el uso de la citometría de flujo

Durante la expansión celular, tal como se demostró en el ejemplo 4, algunos condrocitos se vuelven fenotípicamente inestables y son incapaces de organizar tejido cartilaginoso in vivo. Como consecuencia de ello, el potencial condrogénico de una población de condrocitos multiplicados depende no sólo del simple número de células sino también del número de condrocitos fenotípicamente estables que contiene. La identificación de marcadores moleculares asociados a la membrana tanto para los condrocitos estables como para los inestables - por ejemplo el FGFR-3 y la ALK-1 respectivamente o cualquier marcador co-detectable con los mismos - ofrece la oportunidad de seleccionar células óptimas para el ACT. La población celular multiplicada entera se incuba con anticuerpos dirigidos contra la ALK-1 y/o el FGFR-3, o cualquier marcador de membrana co-detectables con los mismos, etiquetados con distintos fluorocromos. El análisis FACS en células doblemente etiquetadas o plurietiquetadas muestra la distribución de condrocitos estables e inestables en el grupo total. Si se necesita, se puede realizar una selección celular para separar los condrocitos estables de los inestables (por ejemplo, empleando marcadores positivos) o para separar los inestables de los estables (por ejemplo, empleando marcadores negativos). Una pequeña alícuota de la población de condrocitos estables seleccionados se emplea par realizar el control de calidad empleando, por ejemplo, otros marcadores positivos o negativos de la estabilidad de los condrocitos (por ejemplo, el colágeno de tipo II y la BMP-2 como marcadores positivos y el colágeno del tipo X como marcador negativo). Los condrocitos estables restantes se recuperan en un medio de cultivo que contiene autosuero y se preparan para el ACT. Esto permite obtener una suspensión celular compuesta por un número significativo de condrocitos estables, aptos para el implante o para utilizar en una composición farmacéutica, contribuyendo todas o la mayoría de las células en la reparación del cartílago sin ser una mezcla de células heterogéneas sin tener en cuenta su fenotipo. Esto también permite eliminar del grupo los condrocitos inestables que no solamente son incapaces de generar cartílago in vivo sino que potencialmente dificultan la reparación
apropiada.

Ejemplo 9

La Figura 9 muestra como la mayoría de las células aisladas del cartílago articular adulto humano co-expresan simultáneamente el colágeno de tipo II y el FGFR3. Las células fueron extraídas del tejido cartilaginoso mediante digestión enzimática en colagenasa al 0,2% durante la noche, permeabilizadas empleando el reactivo Fix&Pem (Sigma) y tanto se dejaron sin etiquetar (A) o se etiquetaron con el anticuerpo de conejo anti FGFR3 humano (B), o se etiquetaron con el anticuerpo de ratón anti colágeno de tipo II humano (C), o se etiquetaron con ambos (D). Se utilizaron como anticuerpos secundarios los anticuerpos conjugados de la fluoresceína o la ficoeritrina contra, respectivamente, IgG de conejo o ratón. El análisis mediante citometría de flujo muestra que el 80% de las células son positivas para el FGFR3 (en B) y que el 85% de las células lo son para el colágeno de tipo II (en C.). El panel D muestra que las células individuales son ambas co-expresiones del FGFR3 y del colágeno tipo II indicando que el FGFR3 se encuentra presente en las células totalmente diferenciadas y no es un marcador para las células precursoras de
esqueleto.

Ejemplo 10

La presente invención también comprende células y cultivos celulares que expresan los marcadores positivos y negativos descritos anteriormente en proporciones específicas. Debido a las limitaciones comerciales, prácticas y de tiempo, no siempre es posible llevar a cabo los métodos de selección celular descritos anteriormente para determinar las células que expresan los marcadores positivos y no expresan los marcadores negativos.

A fin de determinar la proporción de células con marcadores positivos (célula^{+}) respecto a aquéllas con marcadores negativos (célula^{-}) la prueba in vivo y los métodos de diagnóstico descritos anteriormente han sido utilizados en poblaciones celulares humanas para determinar cuándo puede esperarse un implante satisfactorio, es decir, que el implante va a producir cartílago estable sano. Dichos experimentos demuestran que cuando la proporción célula^{+}/célula^{-} es de 1 o superior pueden prepararse implantes adecuados a partir de dicha población celular. Preferiblemente, la proporción ha de ser de 2 o más. Una proporción de 5 o más se considera que proporciona un nivel significativo de garantía de que el implante sea satisfactorio. La proporción se puede obtener de una manera favorable a partir del examen de los chips de ADN descritos anteriormente.

<110> Tigenix NV

\hskip1cm

Luyten, Frank De

\hskip1cm

Bari, Cosimo

\hskip1cm

Dell'Accio,Francesco

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Prueba in vivo y marcadores moleculares para evaluar la estabilidad fenotípica de las poblaciones celulares y seleccionar poblaciones celulares para autotrasplantes

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<130> FGFR3

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\vskip0.400000\baselineskip

<140>

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<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP99203273.0

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<151> 1999-10-06

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 1

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 40

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<212> PRT

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<213> Rotavirus G4 serotipo humano

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<400> 1

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2

Claims

1. Método para identificar los marcadores moleculares asociados a la estabilidad fenotípica de una población celular de condrocitos que comprende:

a): inyectar vía intramuscular o subcutánea en un mamífero no humano una suspensión de células aisladas o multiplicadas en un líquido iso-osmótico, comprendiendo dicha suspensión un equivalente de al menos 1 x 10^{6} condrocitos articulares aplicados a ratones inmunodeficientes

b): evaluar histológicamente si el cartílago formado in vivo es estable, cartílago exento de cualquier signo de vascularización, e

c): identificar uno o más marcadores moleculares positivos y/o negativos de dichas células aisladas o multiplicadas que en la fase b) se encontró que formaban in vivo cartílago estable exento de cualquier signo de vascularización.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual la fase de identificación de un marcador molecular positivo o negativo se lleva a cabo empleando una técnica seleccionada entre el grupo de RT-PCR semicuantitativa, hibridación Northern, expresión diferencial, hibridación substractiva, genotecas de substracción, chips de ADNc y arrays de ADNc.

3. Uso del marcador positivo BMP-2 y/o FGFR-3, y/o un marcador co-detectable con la BMP-2 y/o el FGFR-3 identificable mediante el método de la reivindicación 1, o una o más construcciones indicadoras que comprenden un promotor de dicho marcador positivo, como marcador para identificar in vitro una población celular de condrocitos aislados o multiplicados como una población celular capaz de producir cartílago estable no vascularizado in vivo.

4. Uso del marcador negativo pseudoactivina cinasa (ALK-1) expresada, y/o un marcador co-detectable con la ALK-1 identificable mediante el método de la reivindicación 1, o una construcción indicadora que comprende un promotor de dicho marcador negativo, como marcador para identificar in vitro una población celular de condrocitos aislados o multiplicados como una población celular capaz de producir cartílago estable no vascularizado in vivo.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, como herramienta para verificar paso a paso la multiplicación celular y/o predecir cuándo la multiplicación celular ha de pararse y/o proporcionar medios de control de calidad de las células a utilizar en el autotrasplante celular.

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en las cuales dicha identificación se lleva a cabo con conjuntos de sondas de ADN que se hibridan con el ARNm de marcadores positivos o negativos de la estabilidad fenotípica de los condrocitos, encontrándose dichas sondas dispuestas en arrays de ADN o en chips de ADN.

7. Método para identificar y/o seleccionar una población celular in vitro con o sin estabilidad fenotípica de los condrocitos en una población celular de condrocitos aislada o multiplicada empleando como marcador la BMP-2 expresada.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, el cual además comprende la utilización del FGFR-3 como marcador positivo de la estabilidad fenotípica de los condrocitos.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, el cual además comprende la utilización de la ALK-1 como marcador negativo de la estabilidad fenotípica de los condrocitos.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 7, el cual comprende establecer que la población celular expresa una proporción de marcadores positivos de la estabilidad fenotípica de los condrocitos sobre los marcadores negativos de la estabilidad fenotípica de los condrocitos que es mayor que 1, preferiblemente mayor que 2, siendo dicho marcador positivo de la estabilidad fenotípica de los condrocitos positivamente, la BMP-2 expresada o un marcador co-expresado con la BMP-2 co-expresada, y dicho marcador negativo de la estabilidad fenotípica de los condrocitos, siendo la pseudoactivina cinasa (ALK-1) expresada, o un marcador co-expresado con la ALK-1.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual dicha identificación se lleva a cabo mediante conjuntos de sondas de ADN que se hibridan con el ARNm de los marcadores positivos o negativos de la estabilidad fenotípica de los condrocitos, encontrándose dichas sondas dispuestas en arrays de ADN o en chips de ADN.

12. Herramienta de diagnóstico para la identificación de células capaces de producir cartílago estable no vascularizado in vivo, comprendiendo sondas de ADN que se hibridan con el ARNm de al menos dos de los marcadores seleccionados entre la BMP-2, el FGFR-3 y la ALK-1 o marcadores co-detectables con la BMP-2, el FGFR-3 y la ALK-1 identificables mediante el método de la reivindicación 1.

13. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que dicha población celular es pasada.