DE60017159T2 - In vivo assay zur prüfung der phänotypischen stabilität - Google Patents

In vivo assay zur prüfung der phänotypischen stabilität Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der allgemeinen Knorpelreparatur und insbesondere die Erzeugung einer optimalen Zellpopulation, die für die Reparatur von Gelenkoberflächen-Defekten und ganz allgemein die Reparatur des Knorpelskeletts geeignet sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Knorpel ist ein Gewebe, bestehend aus einem zellulären Bestandteil, Chondrozyten und einer extrazellulären Matrix, die typischerweise reich an Collagen-Typ-II sowie hoch sulfatierten, hochmolekularen Proteoglycan-Aggregaten ist. Die letztere Eigenschaft verleiht dem Knorpel seine besonderen histochemischen Eigenschaften, nämlich die folgenden: starke Anfärbung mit Elsassblau bei niedrigem pH (von 0,2 bis 2,5) und Metachromasie mit Toluidin-blau und Safranin O. Der Überfluss an Typ-II-Collagen, Bindungsprotein (link protein), und Proteoglycan-Aggrekan, zusammen mit der Gegenwart von Nebencollagen, wie z.B. Typ-IX- und Typ-XI-Collagen sind typische Eigenschaften von Knorpelgewebe.
  • Bei post-natalen Säugern trägt Knorpel zu der Struktur etlicher Organe und Systeme bei, wie z.B. der artikulären Oberfläche von Diarthroidal-Gelenken und anderen Gelenkassoziierten Strukturen (wie z.B. dem Meniskus), dem Ohr, der Nase, dem Kehlkopf, der Trachea, den Bronchien, Strukturen der Herzventile, Teile der Rippen, Synchondrosen, Enthesen usw. An einigen der erwähnten Stellen (z.B. den Enthesen, dem Annulus fibrosus der Intervertebralscheiben, dem Meniskus, der Insertion von Ligamenten usw.) wird er im Hinblick auf den Überfluss an Collagenen (im wesentlichen Typ-I-Collagen) und der besonderen Verteilung der fibrösen Bündel als Faserknorpel bezeichnet. An anderen Stellen (z.B. der Ohrmuschel, Epiglottis usw.) ist der Knorpel besonders reich an Elastin und wird elastischer Knorpel genannt. Bei allen anderen Strukturen wird er aufgrund seines semitransparenten klaren Aussehens hyaliner Knorpel genannt.
  • Während der Embryogenese spielt Knorpel eine Rolle bei der Entwicklung der langen Knochen. Mesenchymzellen aggregieren und differenzieren, um Knorpelanlagen zu bilden, die die Form der zukünftigen langen Knochen bereitstellen. Diese Knorpel-Matrizen entwickeln sich in der Entwicklung weiter, durchlaufen eine endochondrale Knochenbildung über eine Kaskade von Ereignissen, einschließlich einer Chondrozyten-Hypertrophie, vaskulärer Invasion, Mineralisierung und werden schließlich durch Knochen ersetzt, außer einer dünnen Schicht an den Extremitäten der Knochenelemente, die sich in die artikuläre Oberfläche von Diarthroidalgelenken differenzieren wird. An diesen Stellen bleibt Knorpelgewebe über die gesamte Lebenszeit eines Individuums hyalin. Es ist bekannt, dass im Alter der artikuläre Knorpel einen Prozess der Alterung durchläuft, was seine mechanischen Eigenschaften und innewohnende Elastizität beeinflusst.
  • Gelenkoberflächen-Defekte können das Ergebnis verschiedener Ätiologien sein, wie z.B. entzündlicher Prozesse, Neoplasien, posttraumatischer und degenerativer Ereignisse usw. Was immer der Grund sein mag, sind die Mechanismen der Reparatur und der darauffolgenden Evolution im wesentlichen gleich.
  • Osteochondrale (oder vollschichtige) artikuläre Oberflächendefekte beinhalten Schäden an dem artikulären Knorpel, dem darunterliegenden subchondralen Knochengewebe und der verkalkten Schicht des Knorpels, lokalisiert zwischen dem artikulären Knorpel und dem subchondralen Knochen. Sie ergeben sich typischerweise durch schwere Traumata der Gelenke oder während der späten Stufen von degenerativen Gelenkerkrankungen, z.B. während der Osteoarthritis. Diese Läsionen stören die Kongruenz zwischen den Gelenkoberflächen und können daher zu OA führen, das sehr schmerzhaft sein kann und die Gelenkfunktion deutlich einschränkt. Osteochondrale Defekte können sich auf einen extrinsischen Mechanismus für die Reparatur verlassen. Extrinsische Heilung verwendet Mesenchymelemente für den subchondralen Knochen zum Teilnehmen an der Bildung von neuem Bindegewebe. Das Reparaturgewebe besteht jedoch häufig aus Faser-Knorpel oder fibrösem Gewebe. Dieses Narbengewebe teilt nicht dieselben biomechanischen Eigenschaften wie hyaliner Knorpel und degeneriert schließlich mit der Entwicklung von Osteoarthritis.
  • Oberflächliche oder teilschichtige Verletzungen von artikulärem Knorpel, die nicht in den subchondralen Knochen vordringen, können sich nur auf einen intrinsischen Mechanismus für die Reparatur verlassen. Chondrozyten, die den verletzten Oberflächen benachbart sind, proliferieren und erhöhen die Ablagerung von extrazellulärer Matrix. Trotz dieser Reparaturversuche gibt es keinen deutlichen Anstieg der Masse von Knorpelmatrix und der Reparaturprozess ist bei der Heilung der Defekte nur selten effektiv. Obwohl sie anfänglich oft schmerzlos sind, können teilschichtige Defekte häufig zu einer Osteoarthritis des betroffenen Gelenks degenerieren.
  • Die Reparatur von artikulären Knorpeldefekten mit Suspensionen von Chondrozyten wurde bei einer Vielzahl von Tiermodellen durchgeführt (Brittberg et al. (1996) Clin. Orthop. (326): 270–83) und wird nun bei Menschen verwendet (Brittberg et al. N Engl J Med. 06. Oktober 1994; 331 (14): 889–95). Autologe Chondrozyten, die von dem nicht betroffenen Bereich des Gelenks erhalten wurden, werden freigesetzt, in vitro in Gegenwart von autologem Serum expandiert und darauffolgend unter einem Periostlappen injiziert, der vernäht wird, um den Knorpeldefekt abzudecken. Dieses Verfahren hat zu einer bewiesenen, zumindest symptomatischen Verbesserung geführt. Dieser konzeptuell vielversprechende Ansatz hat jedoch immer noch weite Bereiche, die verbessert werden können, da bekannt ist, dass die in-vitro-Expansion von Chondrozyten nach einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen zu einem Verlust ihrer phänotypischen Stabilität führt (definiert durch die Fähigkeit von Chondrozyten, in vivo hyalinen Knorpel zu bilden), was dazu führt, dass die zu injizierende Zellsuspension nicht verlässlich ist.
  • Drei alternative Ansätze wurden in einem Versuch entwickelt, die Erfolgsrate bei der Behandlung von artikulären Knorpeldefekten bei Säugern zu verbessern. Bei dem ersten Ansatz werden synthetische Trägermatrizes mit allogenen Chondrozyten imprägniert und dann in den Knorpeldefekt implantiert, wo man hofft, dass sie Bestandteile produzieren und sezernieren, die zur extrazellulären Matrix gehören, um artikulären Knorpel an der Stelle des Defekts zu bilden. Eine Vielzahl synthetischer Trägermatrizes wurde bis jetzt verwendet und diese beinhalten dreidimensionale Collagengele (z.B. US-Patent Nr. 4,846,835), rekonstituierte Fibrin-Thrombin-Gele (z.B. US-Patent Nrn. 4,642,120; 5,053,050 und 4,904,259), synthetische Polymermatrizes, enthaltend Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyglykolsäure und Copolymere davon (US-Patent Nr. 5,041,138) und auf Hyaluronsäure basierende Polymere. Sobald eine mitotisch expandierte Population von Chondrozyten erhalten wird, können die Zellen entweder zurück in dasselbe Subjekt implantiert werden, von dem die Elternzellen ursprünglich abstammten (autologe Implantation), oder in ein anderes Subjekt (heterologe Implantation). Zusätzlich kann die heterologe Implantation Chondrozyten verwenden, die von verwandten oder nicht verwandten Individuen derselben Art (allogen) oder von einer anderen Art (xenogen) erhalten wurden. Alternativ können Chondrozyten von einer etablierten Langzeitzellinie, die entweder allogen oder xenogen ist, erhalten werden.
  • Die Einführung von nicht-autologen Materialien in einen Patienten kann jedoch eine nicht erwünschte Immunreaktion stimulieren, die gegen das implantierte Material gerichtet ist, was zu einer potenziellen Abstoßung des neu gebildeten und transplantierten Knorpelgewebes führt. Zusätzlich riskiert man mit der heterologen Implantation die Übertragung von infektiösen Mitteln, die in dem Gewebe oder der Zellinie vorliegen, auf das Subjekt. Neu-Knorpel kann um die Peripherie des Implantats gebildet werden, was die Integration des Implantats in den Knorpeldefekt verhindert. Die Überwachung der Bildung und Entwicklung von resultierendem synthetischem Knorpel in situ ist schwierig in der Durchführung und involviert in der Regel eine arthroskopische oder offene Gelenküberprüfung. Weiterhin können Implantate, die synthetische Polymerbestandteile enthalten, für die Reparatur großer Knorpeldefekte ungeeignet sein, da die In-situ-Polymerhydrolyse die Bildung von Knorpel und/oder die Integration in den Defekt inhibiert.
  • In dem zweiten Ansatz wird der Defekt mit einer biokompatiblen, bioabbaubaren Matrix gefüllt, die chemotaktische und mitogene Wachstumsfaktoren enthält, um das Einwandern von Chondrozyten-Vorläuferzellen in die Matrix in situ zu stimulieren. Die Matrizes enthalten optimalerweise Poren von ausreichenden Dimensionen, um das Einwandern und die Proliferation der Chondrozyten-Vorläufer in die Matrix zu erlauben. Die Matrix kann auch differenzierende Wachstumsfaktoren enthalten, um die Differenzierung von Chrondrozyten-Vorläuferzellen zu Chondrozyten zu stimulieren, von denen man wiederum hofft, dass sie extrazelluläre Matrixbestandteile sezernieren, um Knorpel an der Stelle des Defekts in situ zu bilden (z.B. US-Patente Nrn. 5,206,023 und 5,270,300 und EP-A-530,804). Dieser Ansatz führt jedoch zu ähnlichen Problemen wie denen, die mit dem oben beschriebenen ersten Ansatz assoziiert sind. Weiterhin gibt es bis jetzt keine Daten, dass artikulärer Knorpel chondrozytische Vorläufer enthält, die für eine Reparatur von Teildicke-Defekten zur Verfügung stünden.
  • In einem dritten Ansatz können die Chondrozyten in vitro kultiviert und expandiert werden, um dadurch synthetisches knorpelähnliches Material zu bilden, das darauffolgend in den Knorpeldefekt implantiert wird. Dies hat gegenüber den vorherigen Verfahren den Vorteil, dass die Entwicklung von synthetischem Knorpelmaterial durch morphologische, biochemische und molekulare Charakterisierung vor der Implantation überwacht werden kann. Chondrogene Zellen können entweder in anchor-abhängigen oder anchor-unabhängigen Kultursystemen expandiert werden. In den letzteren können die chondrogenen Zellen als Kolonien in einem Agarosegel kultiviert werden. Bis jetzt wurden nur kleine Stücke von Knorpelgewebe von undefinierter Form unter Verwendung dieser Art und Weise hergestellt. Weiterhin verbleiben die resultierenden Knorpel in einer Gelmatrix eingebettet, was sie für die Implantation in Säuger weniger geeignet erscheinen läßt. Alternativ können in einem anderen anchorunabhängigen Verfahren Chondrozyten als Kolonien in Suspensionskultur kultiviert werden. Die resultierenden Teilchen, die synthetisches, knorpelähnliches Material enthalten, sind jedoch in der Regel klein und von undefinierter Form und integrieren nicht miteinander und mit dem umgebenden Knorpel innerhalb des Defekts. Das macht sie für die Implantation und Reparatur von einem bestimmten artikulären Knorpeldefekt ungeeignet.
  • Bei dem anchor-abhängigen Verfahren werden Primärkulturen von chondrogenen Zellen, isoliert aus Primärgewebe, als Monolayer, angehaftet an die Oberfläche einer Zellkulturflasche, gezüchtet (z.B. US-Patent Nr. 4,356,261). Die direkt von Explantatgewebe abgeleiteten Primärzellen behalten ihre Fähigkeit, extrazelluläre Bestandteile zu produzieren und zu sezernieren, die für natürlichen Knorpel charakteristisch sind, insbesondere Typ-II-Collagen und sulfatierte Proteoglycane. Es ist jedoch wohlbekannt, dass während der in-vitro-Expansion als Monolayer die Chondrozyten dedifferenzieren und ihre Fähigkeit zur in-vivo-Bildung von hyalinem Knorpel verlieren. Bis jetzt war es nicht möglich, große Bereiche von artikulären Knorpeln aus kleinen Stücken von Biopsiegewebe während der anchor-abhängigen Verfahren von US-Patent Nr. 4,356,261 herzustellen.
  • Um die obigen Probleme zu lösen, stellt US-Patent Nr. 5,723,331 ein Verfahren zur in-vitro-Herstellung von großen Mengen synthetischer Knorpel aus kleinen Proben von Biopsiegewebe bereit, das, basierend auf der Entdeckung, dass chondrogene Zellen aus einer Vielzahl von Geweben isoliert werden können, z.B. vorher existierendem Knorpel, perichondrialem Gewebe oder Knochenmark und in-vitro vor der Knorpelbildung expandiert werden können, eine erste Aussaat beinhaltet und zwar von nackten (d.h. von enzymatisch oder mechanisch desaggregiertem Gewebe isolierten) chondrogenen Zellen, proliferiert ex vivo, in eine vorher geformte Vertiefung mit einer zellkontaktierenden, Zell-adhäsiven Oberfläche und dann Kultivierung der proliferierenden chondrogenen Zellen in der Vertiefung für eine ausreichende Zeit, damit die Zellen eine extrazelluläre Matrix sezernieren können, um dadurch einen dreidimensionalen, vielzellschichtigen Flecken aus synthetischem Knorpel zu bilden. Dieser Ansatz führt nicht zu einer optimalen Integration zwischen dem Implantat und dem umgebenden Knorpel. Bis jetzt gibt es keinen Beweis für die phänotypische Stabilität von Zellen in solchen Präparationen.
  • Die Verwendung von Mesenchymzellen wurde ebenfalls für die Knorpelreparatur vorgeschlagen. Mesenchymzellen sind eine potenzielle alternative Quelle für Knorpel-produzierende Zellen. Sie sind im allgemeinen als pluripotente Zellen anerkannt, die sich vielfach teilen können, um Vorläuferzellen zu erzeugen, die schließlich zu vielen Geweben werden können, einschließlich Skelettgeweben, wie Knorpel, Knochen, Sehnen, Ligamenten, Knochenmarkstroma und Bindegewebe. Per definitionem können sie viele zusätzliche Teilungen durchlaufen. Chondro/Osteovorläufer-Zellen, die bipotent sind, mit der Fähigkeit, sich zu Knorpel oder Knochen zu differenzieren, wurden aus Knochenmark isoliert (z.B. in dem US-Patent Nr. 5,226,914) und darauffolgend aus Muskel-, Herz- und Granulationsgewebe. Die Pluripotenz wird unter Verwendung unterschiedlicher Kulturbedingungen und der Zugabe von mehr oder weniger spezifischen Induktoren demonstriert, die eine Differenzierung der Stammzellen in Chondrozyten (Knorpel), Osteoblasten (Knochen), Myoblasten (myotubes) (Muskeln) und Adipozyten (Fett) hervorrufen.
  • Es wäre sehr wünschenswert, Vorläuferzellen zu haben, die einfach erhalten werden können, wie z.B. durch eine Muskelbiopsie, kultiviert werden können, um zu großen Zahlen zu führen und als Quelle für Chondrozyten oder Osteoblasten oder Myozyten verwendet werden können. Dieselbe Pluripotenz, die sie attraktiv macht, birgt jedoch das Risiko einer metaplastischen Differenzierung. Anders ausgedrückt besteht das Risiko, dass sie sich in eine unerwünschte Richtung differenzieren würden (z.B. Knochen oder Fett innerhalb eines Knorpeldefekts). In den US-Patenten Nrn. 5,226,914 und 5,197,985 wurden die Zellen in poröse Keramikblöcke absorbiert und implantiert und ergaben im wesentlichen Knochen. US-Patent Nr. 5,906,934 offenbart jedoch, dass unter sehr spezifischen Bedingungen Mesenchym-Stammzellen in einem geeigneten polymeren Träger (wie z.B. einem Polyglykolsäuresieb), implantiert in einen Knorpel und/oder Knochendefekt, genau nach Wunsch zur Bildung von Knorpel und/oder Knochen differenzieren. Außerdem offenbart US-Patent Nr. 5,919,702 Chondrozyten-Vorläuferzellen, isoliert aus Nabelschnurquellen, z.B. von Wharton's Jelly, die kultiviert werden, um zu Chondrozyten zu werden, die Knorpelgewebe produzieren können. In einem weiteren Versuch, die Nachteile von den gegenwärtigen Knorpel- und Knochen-Reparaturtechniken zu vermeiden, die zu Blutungen führen und die Verwendung von mechanisch schwachen, nicht selbst abgeleitetem Material involvieren, schlägt US-Patent Nr. 5,866,415 die Behandlung von Knorpel- oder Knochendefekten mit einem biologischen Material vor, erhalten durch in-vitro-Anbindung von Knorpel- oder Knochen-bildenden Zellen an ein Periost von geeigneter Größe, um den Defekt zu behandeln.
  • WO96/41523 und WO96/41620 beschreiben die Verwendung von FGFR3 als Marker für Mesenchymskelett-Vorläuferzellen. Solche Zellen zeigen keinen stabilen Phänotyp. Um die Differenzierung dieser Zellen zu initiieren, können Faktoren den Zellen zugefügt werden oder in situ z.B. ein FGF9-Antagonist. Wie oben angegeben, ist die Verwendung von Vorläuferzellen für die Implantation in den Körper aufgrund der Gefahr von einer metaplastischen Differenzierung nicht indiziert.
  • Transformations-Wachstumsfaktor-beta ("TGF-β") bezeichnet eine Familie verwandter dimerer Proteine, die das Wachstum und die Differenzierung vieler Zelltypen regulieren. Mitglieder dieser Familie beinhalten TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, TGF-β 4, TGF-β 5, morphogene Proteine ("MP") wie z.B. MP-121 und MP-52, Inhibine/Aktivine (wie offenbart z.B. in EP-A-222,491), osteogene Proteine ("OP"), Knochenmorphogenetische Proteine (hiernach bezeichnet als "BMP"), Wachstums/Differenzierungsfaktoren ("GDF"), wie z.B. GDF-1, GDF-3, GDF-9 und Nodal. TGF-β wurde zunächst im Hinblick auf seine Wirkungen auf die Zellproliferation charakterisiert. Es stimulierte sowohl das anchor-unabhängige Wachstum von Rattennieren-Fibroblasten als auch, dass es das Wachstum von Affen-Nierenzellen inhibierte. Es wurde gezeigt, dass TGF-β-Familienmitglieder viele unterschiedliche biologische Wirkungen zeigen, z.B. regulieren sie die Knochenbildung, induzieren Ratten-Muskelzellen zur Produktion von knorpelspezifischen Makromolekülen, inhtbieren das Wachstum früher hämatopoetischer Vorläuferzellen, T-Zellen, B-Zellen, Maus-Keratinozyten und etlicher menschlicher Krebszellinien.
  • TGF-β-Familienmitglieder erhöhen die Synthese und Sekretion von Collagen und Fibronektin, beschleunigen die Heilung van Schnittwunden, unterdrücken die Caseinsynthese bei Maus-Brust-Explantaten, inhibieren die DNA-Synthese bei Rattenleber-Epithelzellen, stimulieren die Produktion von bFGF-Bindungs-Proteoglykanen, modulieren die Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktor ("EGF")-Rezeptors und die Proliferation von Epidermoid-Karzinomzellen und können zu einer Apoptose bei Gebärmutter-Epithelzellen, kultivierten Hepatozyten und sich rückbildender Leber führen. TGF-βs können eine Kardioprotektion gegen eine Reperfusionsverletzung durch Inhibition der neutrophilen Adhärenz an das Endothel vermitteln und schützen gegen experimentelle Autoimmunerkrankungen bei Mäusen. Insgesamt sind die Proteine der TGF-β-Familie multifunktionelle, aktive Wachstumsfaktoren und weisen auch verwandte biologische Aktivitäten auf, wie z.B. eine chemotaktische Attraktion von Zellen, eine Unterstützung der Zelldifferenzierung und gewebsinduzierende Fähigkeiten. Unterschiede in ihrer Struktur und in ihrer Affinität für Rezeptoren führen zu bemerkenswerten Variationen im Hinblick auf ihre exakte biologische Funktion.
  • Gegenüber den vorstehenden Berichten über die Fähigkeit von TGF-β zur Induktion der Erzeugung von Knorpel-spezifischen Makromolekülen in Muskelzellen und Chondrozyten wurde festgestellt, dass TGF-β synergistisch mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor zur Inhibition der Synthese von Collagen-Typ-II durch Hühner Sternum-Chondrozyten und bei Ratten-Chondrozyten wirkt. Tatsächlich hat sich TGF-β als prototypischer Inhibitor der Proliferation der meisten normalen Zelltypen in vitro wie auch in vivo erwiesen und übt eine bemerkenswerte Diversität einer biologischen Aktivität aus. TGF-β 1 wurde aus menschlichen und Schweineblut-Thrombozyten gereinigt und rekombinantes TGF-β 1 ist zur Zeit erhältlich.
  • Innerhalb der Subfamilie von BMPs wurden die Strukturen von BMP-1 bis BMP-15 bereits früher erhellt. Die einzigartigen induktiven Aktivitäten dieser Proteine, zusammen mit ihrer Gegenwart im Knochen, legen nahe, dass sie wichtige Regulatoren von Knochen-Reparaturprozessen sind und an dem normalen Erhalt von Knochengewebe beteiligt sein könnten. Kürzlich wurde gezeigt, dass die BMP-12-verwandte Unterfamilie von Proteinen, einschließlich BMP-13 und MP52 (siehe z.B. WO93/16099 und US-Patent Nr. 5,658,882) in Zusammensetzungen für die Induktion von Sehnen/Ligamentähnlicher Gewebsbildung und Reparatur geeignet sind. Das US-Patent Nr. 5,902,785 offenbart, dass BMP-12-verwandte Proteine insbesondere für die Induktion von Knorpelgewebe nützlich sind und dass BMP-9 für die Erhöhung der Proteoglykan-Matrix-Synthe und daher den Erhalt von Knorpelgewebe nützlich ist. Es beschreibt auch Zusammensetzungen, umfassend ein BMP-12-verwandtes Protein und zusätzlich beinhaltend ein oder mehr TGF-β-Superfamilienmitglieder, die sich als osteogen erwiesen haben, vorzugsweise BMP-2, -4, -5, -6 und/oder BMP-7 als nützlich für die Regeneration von multiplen Gewebstypen (z.B. an einer Grenzfläche oder Bindung zwischen Geweben) und insbesondere für die Behandlung von artikulären Knorpeln, worin die artikuläre Oberfläche, Knorpel, subchondraler Knochen und/oder "Tidemark"-Grenzfläche zwischen Knorpel und Knochen repariert werden müssen. Dasselbe Patent beschreibt weiterhin Zusammensetzungen, umfassend ein BMP-12-verwandtes Protein, zusammen mit einem Protein, das für den Erhalt von Chondrozyten oder Knorpelgewebe geeignet ist, wie z.B. BMP9, wobei diese Zusammensetzungen insbesondere für die Induktion und den Erhalt von Knorpelgewebe an einer Stelle, die einer Knorpelreparatur bedarf, wie z.B. an einem artikulären Knorpeldefekt, nützlich ist.
  • WO96/14335 offenbart unter Verwendung einer mRNA, hergestellt von artikulärem Knorpel von Neugeborenen, die Isolierung von zwei Mitgliedern der BMP-Familie, bezeichnet als Knorpel abgeleitete morphogenetische Proteine-1 und -2 (CDMP-1, CDMP-2). Storm et al. (1994) in Nature 368, 639–43 und Chang et al. (1994) in J. Biol. Chem. 269, 28227–34 etablierten unabhängig, dass CDMP-1 nahe an dem Brachypodismus-Locus auf Chromosom 2 bei Mäusen kartiert werden konnte und an dem Brachypodismus-Phänotyp beteiligt sein kann. Die Expressionsmuster von CDMP's legen auch eine wichtige Rolle für diese Gene in der Gelenk-Morphogenese nahe. WO98/59035 offenbart auch ein Verfahren zum Erhalt eines knorpelartigen Phänotyps bei Chondrozyten in vitro, umfassend das Kultivieren der Chondrozyten in serumfreiem Medium, enthaltend ein CDMP und/oder BMP.
  • Die Tabelle unten, die die TGF-β-Superfamilienmitglieder zusammenfasst, folgt (Reddi AH, Nature Biotechnol. 1998, 16:247–52).
  • The BMP-Familie bei Säugern
    Figure 00120001
  • Figure 00130001
  • Andere Familien von Wachstumsfaktoren spielen offensichtlich eine Rolle bei der Knorpelbildung/Differenzierung. Unter diesen sind die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) eine Familie von Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die in einer Vielzahl von Aktivitäten involviert sind. Einer ihrer Rezeptoren, FGF-Rezeptor 3 (FGFR-3) (Keegan K. et al., 1991 Proc. Nat. Acad. Sci. 88: 1095–99) spielt bekanntlich eine Schlüsselrolle bei der Chondrogenese. Punktmutationen im fgfr3-Gen, die zu einem Liganden-unabhängigen konstitutiv aktiven Protein führen (was bedeutet, dass die FGF-Signalbildung auch in Abwesenheit des Liganden immer aktiv ist) führen zu Skelett-Abnormalitäten, wie einer Achondroplasie und einer thanatophore Dysplasie.
  • Wie bereits oben ausgeführt, hat die autologe Chondrozyten-Transplantation ("ACT"), obwohl sie zu einer breit akzeptierten Technik zur Reparatur von Gelenkoberflächen-Defekten ("JSD") führt, immer noch etliche Nachteile. Im Detail impliziert dieses Verfahren eine in-vitro-Expansion – in Gegenwart von autologem Serum – von autologen Chondrozyten, erhalten aus einem nicht betroffenen Bereich der Gelenkoberfläche, gefolgt von einer Implantation der Chondrozyten-Suspension unter einem Periostlappen, vernäht, um den Gelenkoberflächen-Defekt zu versiegeln. Eine Zellexpansion ist notwendig, um aus einer kleinen Knorpel-Biopsie eine Anzahl von Zellen zu erhalten, die für die Reparatur des Knorpeldefekts ausreicht. Eine Expansion in einem Monolayer führt zu einem Verlust der phänotypischen Eigenschaften bei Chondrozyten (Benya und Shaffer, 1982, Cell 30:215–24). Bis jetzt ist jedoch nicht bekannt, wie weit es möglich ist, die Chondrozyten zu expandieren, ohne ihre phänotypische Stabilität negativ zu beeinflussen und dadurch ihre Fähigkeit zur Bildung von stabilem hyalinem Knorpel in vivo, der gegenüber einer vaskulären Invasion sowie einer endochondralen Knochenbildung resistent ist. Andere Faktoren, die die Fähigkeit von Chondrozyten zur Bildung von Knorpel in vivo beeinflussen können, sind die Kulturbedingungen und etliche Faktoren, abhängig vom Donor, wie z.B. Alter und vorher existierenden Gelenk- oder systemischen Erkrankungen. Nach dem Abschluss der Zellexpansion besteht die Chondrozyten-Population aus einigen Zellen, die ihre phänotypische Stabilität erhalten konnten und anderen, die noch proliferieren können, jedoch nicht mehr zur Knorpelreparatur beitragen können. Um eine konsistente Zellsuspension für die ACT zu erhalten, ist es wünschenswert zu bestimmen, was die aktuelle Fähigkeit der Zellen zur Bildung von Knorpel in vivo ist und, falls nötig, stabile Chondrozyten innerhalb der expandierten Zellpopulation zu selektieren. Die Wichtigkeit dieses Punkts wird durch die große Variabilität in der Qualität der Reparaturgewebe unterstrichen, die in großen Reihen erhalten werden. (Peterson et al. Clin Orthop [374], 212–234, 2000), bestehend aus einem Bereich, der sich von Hyalin-ähnlichem Knorpel bis zu Faserknorpel bis zu keinem Zeichen einer Reparatur erstreckt.
  • Chondrozyten sind die einzigen normalen Skelettzellen, von denen bekannt ist, dass sie anchor-unabhängig in Agarosekulturen wachsen (Benya und Shaffer, 1982, Cell 30:215–224). Dieses Kultursystem ermöglicht eine Gewinnung einiger der phänotypischen Zeichen, die durch die Expansion in einem Monolayer verloren gehen (Benya und Shaffer, 1982, Cell 30:215–224). Die Expression von Typ-2-Collagen und die Fähigkeit zum Wachstum und zur Rettung phänotypischer Zeichen in Agarosekultur sind gute Assays, um die Chondrozyten- Differenzierung bzw. ihr Potenzial zur Differenzierung zu bewerten. Sie messen jedoch nicht die Fähigkeit der Chondrozyten zur in vivo Bildung von Knorpel.
  • Bradham et al., 1998, Clinical Orthopaedics and Related Research 352:239–249, offenbaren einen in-vivo-Knorpel-Assay unter Verwendung von Zellen, die in einer Matrix suspendiert sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die oben erklärten Punkte zeigen deutlich, dass seit langem ein Bedarf an einem Assay zur Messung der Fähigkeit von expandierten Chondrozyten zur Bildung von stabilen Knorpel in vivo nach einer in-vitro-Expansion besteht, unabhängig von den Kulturbedingungen und Donor-bezogenen Faktoren.
  • Unter den Skelettzellen ist das anchor-unabhängige Wachstum für die Chondrozyten und Chondrozyten-Vorläufer einzigartig. Daher wird diese Eigenschaft nur benötigt, wenn Chondrozytenähnliche Zellen von Interesse sind. Es besteht auch ein Bedarf, molekulare Marker zu identifizieren, die mit spezifischen Zelltypen assoziiert sind, die dem praktizierenden Arzt in seiner Klinik ermöglichen würden, geeignete Implantate zu erzeugen und Knorpelgewebe mit den geeigneten Zellen zu regenerieren und zu reparieren und eine Narbenbildung im größtmöglichen Ausmaß zu verhindern. Diese Ziele und andere Zwecke werden durch die folgenden Aufgaben der vorliegenden Erfindung erreicht.
  • Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines in-vivo-Assays zur Identifikation von molekularen Markern, verbunden mit der phänotypischen Stabilität einer bestimmten Zellpopulation. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Definition eines Satzes molekularer Marker, die mit dem Ausgang des vorstehenden in-vivo-Assays verbunden sind unter Verwendung von frisch isolierten Chondrozyten und daher der Fähigkeit zur Bildung von stabilem Knorpel in vivo. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung dieser positiven und negativer Marker der Chonärozyten-Stabilität als ein Werkzeug, um die in-vitro-Zellexpansion Passage für Passage zu überwachen und allgemeiner das Herstellungsverfahren der Chondrozyten-Expansion. Dieses Mittel wird geeignet sein, um die Chondrozyten-Expansionstechnologien der nächsten Generation zu optimieren und vorherzusagen, wann eine Zellexpansion beendet werden muss, um Chondrozyten zu gewinnen, die bereits ihre phänotypische Stabilität verloren haben, nur nach Bedarf, und insbesondere um eine Qualitätskontrolle für Chondrozyten bereitzustellen, die für ACT verwendet werden sollen, für eine Lot-Freigabezustimmung. Dies wird dazu führen, dass die Chondrozyten-Suspensionen für ACT verlässlicher und konsistenter sind. Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Verwendung der FACS (Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung)-Analyse und allgemein einer Zellsortierung unter Verwendung positiver und negativer Marker, um aus einer Chondrozyten-Population nur diejenigen Zellen zu selektieren, die ihre phänotypische Stabilität erhalten.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Satz von 6 Bildern, die die histologischen und histochemischen Eigenschaften und die Expression von Collagen-Typ-2 von Implantaten von dem in-vivo-Assay der Erfindung, verglichen mit menschlichem artikulärem Knorpel von Erwachsenen zeigen.
  • 2 sind zwei Grafiken (A, B), die das hydrodynamische Profil von sulfatierten Proteoglykanen bei Implantaten (A) von dem in-vivo-Assay der vorliegenden Erfindung und in menschlichem artikulärem Knorpel (B) von Erwachsenen zeigen.
  • 3 ist ein Satz von vier Bildern, die eine in-situ-Hybridisierung für human-spezifische Alu-Repeats (A), Maus-spezifische L1-Repeats (B), eine Überlagerung von A und B (C) und eine Toluidin-blau-Färbung (D) eines Implantats von dem in-vivo-Assay der Erfindung darstellen.
  • 4 ist ein Satz von Bildern, die das molekulare Profil (durch RT-PCR) von artikulären Chondrozyten während einer in-vitro-Expansion und die respektive Histologie nach 2 und 4 Populationsverdoppelungen zeigen.
  • 5 ist ein Satz von Bildern, die das molekulare Profil von artikulären Chondrozyten von Donoren unterschiedlicher Altersstufen während einer in-vitro-Expansion zeigen.
  • 6 ist ein Satz von Bildern (B), die die Ergebnisse einer RT-PCR-Analyse für verschiedene molekulare Marker in artikulären Chondrozyten während der Passagen zeigen, und durch Passagen geführte Chondrozyten, die dem Agarose-Assay ausgesetzt wurden. Die Figur zeigt auch ein Bild von Chondrozyten, kultiviert in niedrigschmelzender Agarose (A).
  • 7 ist ein Bild, das eine RT-PCR-Analyse für Fgfr3 und Alk1 zeigt, durchgeführt in demselben Rohr für Chondrozyten während einer in-vitro-Passage.
  • 8 ist ein Satz von zwei Bildern, die Implantate zeigen, die durch Injektion von Chondrozyten erhalten wurden, die vorher mit oder ohne CDMP1 behandelt wurden.
  • 9 ist ein Satz von vier Grafiken, erhalten durch flusszvtometrische Analyse, (a) nicht markiert, (b) markiert mit Kaninchen-humanem FGFR3-Antikörper, (c) markiert mit Maus-antimenschlichem Collagen-Typ-2-Antikörper und (d) beiden Antikörpern.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bezeichnungen, die in dieser Offenbarung verwendet werden, sind wie folgt definiert:
  • Chondrozyten-Stabilität
  • Die Fähigkeit einer Zellsuspension (entweder von einem Knorpelgewebe oder von irgendeinem anderen Gewebe erhalten, das Zellen mit chondrogenem Potenzial enthält), um bei Injektion in einen nicht-menschlichen Säuger (in vivo), wie z.B. immundefiziente Mäuse (in einem Zeitrahmen von 3 Wochen) ein Knorpelimplantat ohne Zeichen einer vaskulären Invasion oder einer endochondralen Knochenbildung zu erzeugen.
  • Chondrogen
  • Die Fähigkeit, das Knorpelwachstum zu unterstützen oder zu stimulieren, wie angewandt auf Zellen, wie z.B. Chondrozyten oder auf Zellen, die sich in Chondrozyten differenzieren. Die Bezeichnung betrifft auch bestimmte Wachstumsfaktoren, wie z.B. TGF-β, die die Knorpel-Differenzierung unterstützen.
  • Co-Expression und Co-Nachweisbarkeit
  • Unter Co-Expression wird im Kontext der vorliegenden Erfindung verstanden, dass ein zweiter Faktor oder Marker exprimiert wird oder nachweisbar ist, wann immer ein erster Faktor oder Marker exprimiert wird oder nachweisbar ist. Zum Beispiel, wann immer BMP-2 oder FGFR-3 (positive Marker) oder ALK-1 oder Collagen-Typ-X (negative Marker) exprimiert werden und nachweisbar sind. Als solches ist der Marker mit den vorher erwähnten positiven und negativen Markern co-nachwelsbar. Ein solcher co-exprimierter oder co-nachweisbarer Faktor oder Marker kann ein erkennbarer Zelloberflächenmarker sein, nachweisbar über polyklonale oder monoklonale Antikörper und/oder spezifische Liganden.
  • Bindegewebe
  • Wie hier verwendet jede Zahl von Strukturgeweben im Körper eines Säugers, einschließlich Knochen, Knorpel, Ligamenten, Sehnen, Meniskus, Dermis, Hyperdermis, Muskel, Fett, Gewebe, Gelenkkapsel.
  • Differenzierung
  • Ein biologischer Prozess, durch den primitive, nicht spezialisierte Zellen spezialisierte Funktion(en) annehmen. Terminale Differenzierung stellt eine hoch spezialisierte Zelle mit einzigartigen funktionellen, genetischen und phänotypischen Eigenschaften bereit.
  • Markerprotein
  • Ein Polypeptid, das eine Zelle (oder einen Satz von Zellen) von einer anderen Zelle (oder einen Satz von Zellen) in einer Population von Zellen unterscheidet und mit einer bestimmten biologischen Funktion assoziiert ist. Das Oberflächenantigen CD3 wird z.B. auf der Oberfläche von T-Lymphozyten, jedoch nicht auf anderen Typen von Lymphozyten (z.B. B. oder Null-Lymphozyten) exprimiert oder ist dort nachweisbar und dient als Markerprotein für diese Untergruppe von Lymphozyten. Wenn das Markerprotein ein Zelloberflächenantigen ist, wie z.B. ein Hormonrezeptor, können Antikörper, die das Markerprotein binden, in Zellsortierungsverfahren verwendet werden, um z.B. eine Population von Zellen zu produzieren, in der Zellen angereichert sind, die das Markerprotein exprimieren.
  • Alternativ können intrazelluläre Proteine als Markerproteine verwendet werden. Fluoreszierende oder lumineszierende Proteine, wie z.B. grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Äquorin (GFP von Aequoria victoria) (Tanahashi et al (1990), Gene 96:249–255) können z.B. als Markerprotein verwendet werden und können die Zellsortierung erleichtern, z.B. durch FACS. Es können auch Enzyme verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass die Aktivität des Enzyms nachgewiesen werden kann. β-Galactosidase ist z.B. gut zur Verwendung als Markerprotein geeignet; dieses Enzym kann durch Einführung eines Substrats (von Substraten) in die Zelle nachgewiesen werden, das ein fluoreszierendes Produkt (Produkte) bei Spaltung durch das Enzym freisetzt (erhältlich z.B. von Molecular Probes). Ein anderes geeignetes Enzym ist Catechol-2,3-dioxygenase, das von xylE von Pseudomonas putida kodiert wird (Domen et al (1986), Anal Biochem 155:379–384).
  • Operabel gebunden
  • Die Verbindung einer Kodierungssequenz und (einer) regulatorischen Sequenz (Sequenzen) (z.B. einem Promotor) auf derartige Weise, dass eine Genexpression möglich wird, wenn die geeigneten Moleküle (z.B. transkriptionale Aktivatorproteine) an die regulatorische Sequenz (Sequenzen) gebunden sind.
  • Osteogen
  • Die Fähigkeit, die Produktion von Knochen zu unterstützen oder zu erzeugen. Die Bezeichnung kann aus Osteoblasten angewendet werden, die die Fähigkeit zur Unterstützung des Knochenwachstums aufweisen oder auf Zellen, die selbst in der Lage sind, sich in Osteoblasten zu differenzieren. Die Bezeichnung würde auch auf Wachstumsfaktoren angewandt werden, die die Fähigkeit zur Unterstützung des Knochenwachstums aufweisen.
  • Phänotypische Stabilität
  • Erhalt der Fähigkeit von jeder Zelle, in vivo die Struktur eines spezifischen Gewebes zu organisieren oder wieder zu organisieren, entweder des ursprünglichen Gewebes, aus dem die Zellen entnommen wurden oder eines anderen Gewebes, das die Zellen unter spezifischen Bedingungen gezwungen werden, zu bilden.
  • Promotor
  • Eine Nukleotidsequenz, die genügt, um eine Transkription einer Kodierungssequenz zu dirigieren. Eingeschlossen innerhalb der Erfindung sind diejenigen Promotoren, die durch externe Signale oder Mittel induzierbar sind; solche Elemente können in den 5'- oder 3'-nicht-translatierten Bereichen (UTR) des nativen Gens lokalisiert sein. Ein "FGFR-3-Promotor" ist jede Sequenz, enthalten innerhalb der UTR des endogenen FGFR-3-Gens, die ausreicht, um die Transkription von FGFR-3 in FGFR-3-positiven Zellen, wie stabilen Chondrozyten, zu dirigieren. Eine 3-kb-Sequenz, die direkt zu der FGFR-3-Transkriptions-Startstelle benachbart lokalisiert ist, ist z.B. ausreichend, um die FGFR-3-Genexpression zu dirigieren. Es wird anerkannt, dass in genetischen Konstrukten, die einen FGFR-3-Promotor enthalten (z.B. denjenigen Konstrukten, die auch ein Reportergen enthalten oder ein Gen, kodierend ein Markerprotein), geringe Abweichungen (z.B. Deletionen, Punktmutationen und ähnliches) in der Sequenz des FGFR-3-Promotors durchgeführt werden können, ohne seine Fähigkeit in den phänotypisch stabilen Chondrozyten und nicht in anderen Chondrozyten aktiv zu sein, nachteilig zu beeinflussen. Daher sind FGFR-3-Promotoren, die solche geringfügigen Variationen aufweisen, ohne die Spezifität des Promotors nachteilig zu beeinflussen, von der Bezeichnung "FGFR-3-Promotor" umfasst. Zusätzlich können multiple Kopien des FGFR-3-Promotors, die in Tandem angeordnet sind, verwendet werden, um die Genexpression zu dirigieren.
  • Reportergen
  • Jedes Gen, für das eine Expression überwacht werden kann. Allgemein verwendete Reportergene beinhalten, z.B. Gene, die die Chloramphenicol-Acetyltransferase, die alkalische Phosphatase, die Luciferase und grün fluoreszierendes Protein kodieren.
  • Stabiler Knorpel
  • Knorpel, der sich nicht schließlich in Knochen umwandelt, d.h. Knorpel, der frei ist von irgendwelchen Zeichen einer Vaskularisierung. Insbesondere ist der stabile Knorpel gemäß der vorliegenden Erfindung ein humaner erwachsener oder reifer artikulärer Knorpel, kann jedoch auch Knorpel von erwachsenen Tieren oder reifen Knorpel beinhalten. Im Gegensatz zu dem stabilen Knorpel wird transienter Knorpel am Ende Knochengewebe werden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird Knorpel als stabil betrachtet, wenn nach z.B. sieben Wochen alle Zeichen einer Knochenbildung abwesend sind.
  • Stammzelle
  • Pluripotente Vorläuferzelle mit der Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und eine Vielzahl von differenzierten Zelltypen zu erzeugen. Echte Stammzellen können sich unbegrenzt teilen. Unter embryogenen Stammzellen werden die pluripotenten Zellen mit normalem Karyotyp verstanden, abgeleitet von einem Blastozyst.
  • Einige der folgenden Ausführungsformen und Beispiele sind nur zu Referenzzwecken enthalten und fallen nicht unter den Umfang der Ansprüche.
  • Detaillierte Beschreibung der Ausführungsformen und Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Möglichkeit, die Fähigkeit isolierter Chondrozyten, in vivo Knorpel zu erzeugen, unter Verwendung eines Nackt-Maus-Modells zu messen und verifizierbar sicherzustellen. Zunächst ist diese Fähigkeit mit einem Satz molekularer Marker verbunden. Zweitens ist die Gegenwart der molekularen Marker mit dem Ausgang einer Gelenkoberflächen-Defekten ("JSD")-Reparatur in gut standardisierten Tiermodellen von JSD assoziiert. Drittens können die Membran-assoziierten molekularen Marker verwendet werden, und aus einer expandierten Chondrozyten-Population nur diejenigen Zellen zu selektieren, die, während sie ihre phänotypische Stabilität beibehalten, in der Lage sein werden, JSD optimal zu reparieren. Der Satz molekularer Marker (sowohl Membran-assoziiert als auch Nicht-Membran-assoziiert) kann als endgültige Qualitätskontrolle für die für ACT oder die Reparatur von knorpelartigen Strukturen zu verwendende Zellsuspension verwendet werden, und stellt so ein verlässliches und konsistentes Endprodukt bereit.
  • Eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus in-vivo-Assays, die die Kapazität isolierter Zellen zur in-vivo-Reproduktion eines bestimmten Gewebes mit all seinen zellulären und extrazellulären Bestandteilen, d.h. all seinen spezifischen Eigenschaften misst. Dieser Assay, entworfen, um die Chondrozyten-Stabilität zu messen, jedoch ausdehnbar auf jede Zellpopulation, die sich in einem bestimmten Differenzierungsweg befindet, besteht aus einem in-vivo-Assay zur Messung von anchor-unabhängigem Wachstum und einer phänotypischen Stabilität einer bestimmten Zellpopulation, umfassend eine subkutane oder intramuskuläre Injektion in einen nicht-menschlichen Säuger, einer Zellsuspension von artikulären Chondrozyten in einer iso-osmotischen Flüssigkeit, wobei dieselbe Suspension artikuläre Chondrozyten in einer Menge umfasst, äquivalent zu mindestens 1 × 106 (vorzugsweise 2 × 106 bis 20 × 106) Chondrozyten, wie an immundeffiziente Mäuse verabreicht. In dem Fall, dass der Säuger eine Maus ist, besteht der in-vivo-Assay aus der Injektion einer Einzelzellsuspension intramuskulär an immundefiziente Nacktmäuse. Nach einer bestimmten Zeitspanne, mindestens 3 Wochen, wird die Maus geopfert, seziert und das Implantat, falls erhalten, gewogen, fixiert und histologisch beurteilt. Der in-vivo-Assay der Erfindung ist hoch spezifisch, da ungefähr 5 × 106 frisch isolierte artikuläre Chondrozyten, injiziert in einem Volumen von 50 bis 100 μl jeder iso-osmotischen Flüssigkeit, wie z.B. phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder HBSS ausreichen, um nach 3 Wochen ein Implantat von reifem Knorpel zu erhalten. Dieselbe Zahl expandierter Periostzellen ergeben ein fibröses Gewebe, das histologisch einem Periostgewebe ähnelt. Junge, Periost-abgeleitete Zellen (PDCs), d.h. PDCs von Individuen, die jünger sind als 20 und vorzugsweise jünger als 16, kultiviert und expandiert unter geeigneten Bedingungen, ergaben jedoch stabile Knorpelimplantate. Demgegenüber führte die Injektion von Zellinien, von denen bekannt ist, dass sie ein in-vitro-osteochondrogenes Potenzial aufweisen – nämlich ATDC5-, CFK2-, RCJ- und C5.18-Zellen nicht zu einem gewinnbaren Implantat. Es ist wichtig, dass seriell durch Passagen geführte (P4 und P5) artikuläre Chondrozyten, während sie ihr anchor-unabhängiges Wachstum und die Rettung der Expression von Typ-2-Collagen in Agarosekultur (gemäß dem Verfahren von Benya et al. (1982) Cell (1):215–24) erhielten, nicht zu einem Implantat führten. Diese Feststellung ist von besonderer Wichtigkeit, da sie demonstriert, dass der Agarose-Assay, der bis jetzt als stringenter Assay für die phänotypische Stabilität expandierter Chondrozyten angesehen wurde (Brittberg et al. N Engl J Med., 6. Okt. 1994; 331(14):889–95), nicht genügt, um die Fähigkeit zur in-vivo-Bildung von Knorpel vorherzusagen. Daher ist dieser wohlbekannte Agarose-Assay nicht in der Lage, als Qualitätskontrollverfahren zur Bestimmung zu funktionieren, ob sich der Knorpel in einem geeigneten Zustand für eine Implantation befindet. Deutlich epiphyseale Chondrozyten (die in einer normalen embryonischen Umgebung eine endochondrale Verknöcherung durchlaufen und durch Knochen ersetzt werden sollen) ergeben ein knorpelähnliches Implantat, worin vaskuläre Invasion, Chondrozyten-Hypertrophie und Knochenbildung stattfinden.
  • Eine zweite Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung bestimmter spezifischer Bedingungen des in-vivo-Assays der ersten Ausführungsform zur Überprüfung der Möglichkeit, dass ein bestimmtes Verfahren oder eine Behandlung, die auf eine bestimmte Zellproliferation angewendet werden, involviert in einem bestimmten Differenzierungsweg, das anchor-unabhängige Wachstum wie auch die phänotypische Stabilität negativ beeinflussen können. Während eine enzymatische Freisetzung der Zellen durch enzymatische Behandlung z.B. ein solches Risiko nicht induziert, kompromitiert demgegenüber eine extensive Zellexpansion (nach 2 bis 3 Passagen) die Fähigkeit von Chondrozyten zum Erhalt eines knorpeligen Implantats in dem in-vivo-Assay. Andererseits überprüft der in-vivo-Assay auch, ob eine bestimmte Behandlung, wie z.B. Zugabe von Wachstumsfaktoren/Reagenzien oder ein Verfahren, wie z.B. eine physikalische Stimulation, die phänotypische Stabilität von Zellpopulationen verstärkt. Die Behandlung der Zellsuspension für 30 Minuten mit CDMP-1 (100 ng/ml; Lagerlösung in 45 % Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure) direkt vor der Injektion, gefolgt von einem zweifachen Waschen in PBS, führte z.B. zu einem dreifachen Anstieg des Feuchtgewichts des gewonnenen Implantats im Vergleich zu Kontrollinjektionen und einem zweifachen Anstieg der Zellzahlen. Eine solche Erhöhung kann eine dramatische Reduktion der für die JSD-Reparatur benötigten Expansion (in einigen Fällen und endgültig kann eine in-vitro-Expansion gar nicht mehr benötigt werden) ermöglichen und dementsprechend eine korrespondierende Reduktion des Risikos, dass Chondrozyten phänotypisch instabil werden.
  • Eine dritte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung des in-vivo-Assays der ersten Ausführungsform zur Vorhersage des Ausgangs einer autologen Zelltransplantation ("ACT") unter Verwendung einer bestimmten Zellpopulation, involviert in einem bestimmten Differenzierungsweg (z.B. expandierte Chondrozyten) als Mittel zur Vorhersage der phänotypischen Stabilität (z.B. Chondrozyten-Stabilität).
  • Dieses kann entweder unter Verwendung wohl standardisierter Tiermodelle für die ACT oder unter Verwendung eines ex-vivo-Systems bewertet werden. Dieses ex-vivo-System besteht daraus, dass artikulärer Knorpel; mit oder ohne darunterliegenden Knochen, in Kultur platziert wird (flüssig, fest oder halbfest), ein Knorpeldefekt erzeugt wird, mit oder ohne eine natürliche oder synthetische Membran zur Abdeckung der Läsion und Anwendung einer Zellpopulation, entweder in Suspension oder ausgesät in einen Träger, mit oder ohne Wachstumsfaktoren, unterhalb der Membran, um in vitro die Ereignisse nachzuahmen, die in vivo während einer JSD-Reparatur stattfinden.
  • Eine vierte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung des in-vivo-Assays der ersten Ausführungsform zur Identifikation von molekularen Markern, die mit der phänotypischen Stabilität einer bestimmten Zellpopulation, involviert in einem bestimmten Differenzierungsweg, verbunden sind, z.B. Chondrozyten. Diese molekularen Marker können durch semi-quantitative RT-PCR, durch Northern-Hybridisierung (wie in Beispiel 4 unten erklärt), durch Erzeugung von Subtraktions-Bibliotheken aus einer Zellpopulation, die in dem in-vivo-Assay erfolgreich sind, gepaart mit ähnlichen Zellpopulationen, die nicht erfolgreich sind (z.B. seriell durch Passagen geführten Chondrozyten), durch Differenzial-Display oder subtraktive Hybridisierungsansätze oder durch DNA-Arrays oder DNA-Chips identifiziert werden. Solche DNA-Chips können alle bekannten involvierten Gene und/oder nicht-involvierten Gene mit Chondrozyten-Stabilität enthalten. ESTs (exprimierte Sequenz-tags) können verwendet werden, um Informationen über vorher unbekannte Gene zu identifizieren und bereitzustellen. Ein Satz solcher Gene kann identifiziert werden, indem der Ausgang von Zellpopulationen verglichen wird, die guten Knorpel bilden und vorzugsweise stabilen Knorpel mit dem Ausgangs von Zellpopulationen, die dies nicht tun. Eine dritte Population, verwendet in dem Vergleichstest, kann eine Chrondrozyten-Population umfassen, die Knorpel in vitro bildet, solange ein Trigger vorliegt (z.B. TGF-β1), die diese Fähigkeit jedoch verliert, sobald der Trigger aus dem Kulturmedium entfernt wird und die kein gewinnbares Knorpelimplantat in vivo bilden kann. Ein Satz positiver und negativer Marker für die phänotypische Chondrozyten-Stabilität, bestehend aus mindestens 2 und vorzugsweise mindestens 20 Markern, wird benötigt, um die Chondrozyten-Qualität effizient und unzweifelhaft zu überwachen. Vorzugsweise ist der Ausgang mit dem Verhältnis von Markern oder deren Grenzwerten verbunden (wobei Unterschiede in der Expression und eine mögliche graduelle Aufregulierung oder Abregulierung von Markers mit in die Betrachtung einbezogen werden). Vorzugsweise ist der vorhergesagte Wert des Satzes von Markern weiter durch die Analyse der Wirkung von unabhängigen Variablen (Altern, Geschlecht, Hintergrund, Co-Morbiditäten) auf den endgültigen Ausgang des ACT-Verfahrens erhöht. Dies kann durchgeführt werden, indem in einer Datenbank alle Daten des individuellen Patienten zusammen mit der Expression der molekularen Marker gespeichert werden, mit einer Bewertung, die den Ausgang des Verfahrens beschreibt (basierend auf Schmerz, Funktion des Gelenks, Steifheit des Reparaturgewebes durch Indentometrie und eventuell histologische und molekulare Analyse der Biopsie des Reparaturgewebes). Der Einfluss unabhängiger Variablen auf den vorhergesagten Wert unseres Satzes von Markern wird durch eine statistische Analyse der Daten bestimmt.
  • DNA-Chips (oder Genosensoren) sind Miniaturarrays von an Oberflächen angebundener (c)DNA-Sonden (typischerweise Oligonukleotiden, jedoch auch längere DNA-Sonden), an die eine Nukleinsäureprobe (die "Ziel"-Sequenz) hybridisiert wird. Im Kontext der vorliegenden Erfindung können DNA-Chips als diagnostische Mittel verwendet werden, um schnell einen Schluss im Hinblick auf die phänotypische Chondrozyten-Stabilität ziehen zu können. Das Ziel ist die Produktion von digitalen Hybridisierungs-Fingerabdrücken, die durch einen Computer interpretiert werden können und für die Verhältnisse von "positiven" und "negativen" Markern erzeugt werden können. Genosensoren können hunderte bis tausende (z.B. 12.000) DNA-Sonden beherbergen, die für eine DNA-Markeranalyse mit hohem Durchsatz und ein Profiling von Messenger-RNA geeignet sind (Differenzialdisplay auf einem Chip). Alternativ können kleinere Sätze von Sonden, dupliziert in Unterarrays über den Chip, verwendet werden, um mehrere Proben parallel zu untersuchen. Oligonukleotide werden entweder in situ auf der Trägeroberfläche des DNA-Chips (in situ Anbindungsstrategie) synthetisiert oder alternativ werden präsynthetisierte Oligonukleotide auf jede Stelle im Array angebunden (Postsynthese-Anbindungsstrategie). Das Phosphoramidit-Verfahren der Festphasen-Chemiesynthese wird verwendet, um die Oligonukleotide in beiden Fällen zu erzeugen (Matteuci und Caruthers (1981), J Am Chem Soc 103:3185–91). Es ist einfach, die Postsynthese-Anbindungsstrategie zu implementieren, wobei kommerziell erhältliche Ausrüstungen und Materialien verwendet werden (Beattie, In Caetano-Anolles, Gresshoff (Herausgeber), DNA Markers, Protocols, applications and overviews, Wiley-VCH, New York, Seiten 213–224). Weiter fortgeschrittene Optionen sind für die Herstellung von Arrays mit einer höheren Dichte erhältlich (Microfab technologies Inc.: Eggers et al. (1994), BioTechniques 17:516–525; Accelerator Technology Corp.: McIntyre (1996), IBC Conference on Biochip Array Technologies, Marina del Rey, CA; Mirzabekov group: Yershov et al (1996), Proc Natl Acad Sci USA 93:4913–4918; Khrapko et al (1991), FEBS lett 256: 118–122; Mirzabekov (1994), Trends Biotechnol 12: 27–32).
  • Trägeroberflächen umfassen Glas, wie z.B. Mikroskopieträger und Mikrokanalglas (Tonucci et al (1992), Science 258: 783–785) oder poröses Silizium (Lehmann (1993), J Electrochem Soc 140: 2836–2843) für die Verwendung in einem Durchfluss-Genosensor (Beatti et al. (1995), Clin Chem 41: 700–706). Bei dem letzteren tritt die Hybridisierung in dreidimensionalen Volumina auf, und stellt einen ungefähr hundertfach größeren Oberflächenbereich pro Einheits-Querschnittsbereich bereit, verglichen mit zweidimensionalen flachen Oberflächendesigns und erhöht dadurch deutlich die Bindungskapazität pro Hybridisierungszelle und stellt eine verbesserte Detektions-Sensitivität bereit usw. (Doktycz und Beattie (1996), in: Beugelsdiik A (Herausgeber), Automated Technologies für Genome Characterization. John Wiley & Sons, New York; Beattie (1996), In: Sayler GS (Herausgeber), Biotechnology in the Sustainable Environment. Plenum Publishing Corp, New York; Beattie et al (1996), In: Schlegel J (Herausgeber); Pharmacogenetics: Bridging the Gap between Basic Science and Clinical Application, IBC Biomedical Library, Southborough, MA. Oligonukleotidsonden werden kovalent z.B. an Siliziumdioxid-Oberflächen gebunden, indem die Verfahren von Lamture et al (1994), Nucleic Acid Res22: 2121–2125; Beattie et al (1995), Clin Chem 41:700–706, Mol Biotechnol 4: 213–225; Doktycz und Beattie (1996), In: Beugelsdiik A (Herausgeber), Automated Technologies for Genome Characterization. John Wiley & Sons, New York; Beattie (1996), In: Sayler GS (Herausgeber), Biotechnology in the Sustainable Environment. Plenum Publishing Corp. New York; oder Beattie et al (1996), In: Schlegel J (Herausgeber), Pharmacogenetics: Bridging the Gap between Basic Science and Clinical Application. IBC Biomedical Library, Southborough, MA angewendet werden. Protokolle für die Anbindung an Glasoberflächen unter Verwendung von 3'-Propanolamin-Oligonukleotiden (Genosys Biotechnologies, The Woodlands, TX) und auf Mikroskopieträger sind von Beattie (Caetano-Anolles, Gresshoff (Herausgeber), DNA Markers. Protocols, applications and overviews, Wiley-VCH, New York, Seiten 213–224) und Beattie et al (1995), Mol Biotechnol 4: 213–225 erhältlich. Ein Roboter-Fluid-Dispensionssystem ist kommerziell erhältlich (z.B. Hamilton Microlab 2200 system, ausgerüstet mit 21G-Nadeln und 50 μl Spritzen), und ist in der Lage, durch Roboter Tröpfchen mit 1 mm Zentrum-zu-Zentrum-Beabstandung abzugeben, die so klein wie 10 nl sind und zwar auf Glasträger (Beattie et al (1995), Clin Chem 41: 700–706, Mol Biotechnol 4: 213–225).
  • Genosensoren und Diagnostika gemäß der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um den Zustand von Zellen und Zellkulturen zu diagnostizieren, können jedoch auch in situ zur Bestimmung der Vitalität von menschlichem oder tierischem Knorpel verwendet werden.
  • Eine fünfte Ausführungsform der Erfindung ist die Identifizierung eines Satzes molekularer Marker, verbunden mit dem Ausgang des in-vivo-Assays der ersten Ausführungsform, unter Verwendung von frisch isolierten oder seriell durch Passagen geführten Zellen von einer bestimmten Zellpopulation, involviert in einem bestimmten Differenzierungsweg, z.B. Chondrozyten und daher verbunden mit der phänotypischen (z.B. Chondrozyten) Stabilität. Frisch isolierte menschliche Chondrozyten wurden z.B. für eine RNA-Reinigung verwendet und in vitro kultiviert. Während der Passagen wurde ein Aliquot von Zellen für eine RNA-Reinigung verwendet, zwei Aliquots von 5 × 106 Zellen wurden in den in-vivo-Assay injiziert und der Rest wieder ausplattiert. Die RNAs wurden durch eine semi-quantitative RT-PCR auf die Expression von Genen überprüft, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Chondrogenese und dem Erhalt des Knorpels spielen.
  • In der PCR-Analyse waren auch Gene enthalten, isoliert aus einer Subtraktions-DNA-Population, erhalten durch einen subtraktiven Hybridisierungsansatz: cDNA von Schweine-PO-Chondrozyten (stabil in dem in-vivo-Assay) wurden gegen cDNA von P1-Chondrozyten (die kein Implantat ergaben) in einer Zwei-Wege-substraktiven Hybridisierung gepaart. Individuelle cDNAs von beiden Subtraktions-cDNA-Populationen (PO-P1 und P1-PO) wurden in einem PCR-Script Amp SK(+)-Vektor kloniert und sequenziert, Die menschlichen Homologe, wenn bekannt, wurden in die RT-PCR-Analyse eingeschlossen. Unbekannte cDNAs wurden im Hinblick auf ihre differenzielle Expression durch Northern-Analyse überprüft.
  • Die Ergebnisse zeigen an, dass eine hohe Expression von BMP-2, FGFR-3 und Typ-II-Collagen positiv mit der Chondrozyten-Stabilität assoziiert ist, während eine Aktivinähnliche Kinase (ALK)-1 und Collagen-Typ-X-Expression negativ assoziiert sind. Die Abwesenheit eines negativen Markers kann als positiver Marker interpretiert werden.
  • Andere Marker, die mit FGFR-3 oder BMP-2 und ALK-1 jeweils coexprimiert werden und die daher ihre Expression vorhersagen können für die Qualitätskontrolle verwendet werden und fallen in den Umfang der vorliegenden Erfindung. Die molekulare Marker-Expression kann auf dem mRNA-Niveau (z.B, über RT-PCR), auf dem Protein-Niveau (z.B. über spezifische Antikörper – polyklonal oder monoklonal) – über spezifische Liganden (z.B. FGF9 ist ein spezifischer Ligand von FGFR3) nachgewiesen werden. Fluorchrom-markiertes FGF-9 könnte auch verwendet werden, um FGFR-3 exprimierende Zellen über FACS zu selektieren oder FGF-9-beschichtete magnetische Kügelchen könnten verwendet werden, um FGFR-3 exprimierende Zellen über ein magnetisches Feld zu sortieren (Dynabeads).
  • Alternativ kann der Nachweis der molekularen Marker (z.B. FGFR-3) indirekt über spezifische Zielgene oder jede andere Komponente des FGFR-3-Stoffwechselwegs geschehen, über Reporterkonstrukte (indirektes Verfahren, basierend auf dem Nachweis einer FGFR-3-Promotor-Aktivität oder Promotoren, die spezifisch bei einer FGFR-3-Signalbildung aktiviert werden, die die Expression eines heterologen Reportergens kontrollieren). Polyklonale oder monoklonale Antikörper werden vorzugsweise gegen die extrazelluläre Domäne des Rezeptors gezüchtet, so dass die Antikörper für eine Zellsortierung, wie FACS verwendet werden können (siehe oben). Insbesondere ist dies hydrophil und daher einfach zugänglich und spezifisch für FGFR-3. Mäuse, Kaninchen oder andere geeignete Arten von IgM/IgG-Antikörpern der vorliegenden Erfindung werden gegen ein Fragment von FGFR-3 gezüchtet, z.B. gegen die Region zwischen der I- und II-Immunoglobulin-ähnlichen Schleife der extrazellulären Domäne von FGFR-3. Ein Peptid, das für die Anzüchtung geeigneter Antikörper geeignet ist, hat die folgende Aminosäuresequenz TGLVPSERVLVGPQRLQVLNASHEDSGAYSCRQRLTQRVL. Die vollständige Nukleotidsequenz des FGFR-3-Rezeptors ist öffentlich erhältlich (Genbank, Zugangsnummer NM_000142). Antikörper, die gegen andere solche Domänen des FGFR-3-Rezeptors gezüchtet werden, liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung. Verfahren zur Züchtung solcher Antikörper sind auf dem Gebiet wohlbekannt und z.B. beschrieben in Ausubel et al (Herausgeber), Short Protocols in Molecular Biology, 4. Auflage, John Wiley & Sons, New York, und insbesondere den Einheiten 11.3, 11.4 und 11.5; in Paul (Herausgeber), Fundamental Immunology, 4. Auflage, Lippincott-Raven Publishers, New York, und ganz besonders spezifisch Kapitel 4, Seite 101 ef; de St. Groth und Scheidegger (1980), J Immunol Methods 35:1–21; French et al (1986), Immunol Today 7:344–346; Langone und Vunakis (1986), Methods in Enzymology, Band 121, Immunochemical Techniques. Part I, Hybridoma technology and monoclonal antibodies. Orlando: Academic Press; Hämmerling et al (1981), Monoclonal antibodies and T-cell hybridomas. Perspectives and technical advances. Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biomedical Press; Yokoyama (1995) In Coligan et al (Herausgeber), Current protocols in immunology, Wiley & Sons, New York, 2.5.1–2.2.17; Kohler und Milstein (1975), Nature 256: 495–497. Ebenfalls ist eine Derivatisierung monoklonaler Antikörper von z.B. Phagen-Display-Bibliotheken möglich (Paul (Herausgeber), Fundamental immunology, 4. Auflage, Lippincott-Raven Publishers, New York, und insbesondere Kapitel 4, Seite 101 ef; de Bruin et al (1999), Nature Biotechnology 17(4): 397–399).
  • Eine sechste Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von positiven und/oder negativen Markern der phänotypischen (z.B. Chondrozyten) Stabilität, identifiziert in der fünften Ausführungsform, entweder einzeln oder in Kombination, als Mittel, um die Passage durch Passage-Zellexpansion zu überwachen, insbesondere vorherzusagen, wenn eine Zellexpansion beendet werden muss und/oder Zellen, nur wenn nötig, zu gewinnen (z.B. Chondrozyten), die bereits ihre phänotypische Aktivität verloren haben, und schließlich ein Mittel für die Qualitätskontrolle von Zellen (z.B. Chondrozyten) bereitzustellen, die für eine autologe Zell-Transplantation ("ACT") verwendet werden sollen, was Zell (z.B. Chondrozyten)-Suspensionen für die ACT zu einem verlässlichen und konsistenten Produkt macht.
  • Eine siebte Ausführungsform dieser Erfindung ist die Verwendung der FACS-Analyse und anderer Zellsortierungsverfahren, um aus einer Zell (z.B. Chondrozyten)-Population nur diejenigen Zellen zu selektieren, die ihre phänotypische Stabilität erhalten. "Positiv"-Membran-assoziierte Marker (z.B. FGFR-3 oder Marker, co-nachweisbar mit FGFR-3, FGFR-3-Reporteraktivität oder Bestandteilen des FGFR-3-Signalweges, die über eine FGFR-3-Aktivierung berichten) werden für die positive Selektion von Zellen mit einer phänotypischen Stabilität (z.B. stabilen Chondrozyten) verwendet werden, während "negative" Membran-assoziierte Marker (z.B. ALK-1 oder Marker, co-nachweisbar mit ALK-1) verwendet werden, um Zellen ohne phänotypische Stabilität (z.B. instabile Chondrozyten) auszusortieren. Die positiven und negativen Marker können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Die Konsistenz der Selektion wird durch den Nachweis von nicht betroffenen, nicht Membran-assoziierten Markern, wie z.B. BMP-2 und Typ- II-Collagen in der sortierten Population überwacht und erhöht dadurch signifikant die Zellpopulation, die für ACT verwendet werden sollen, an Zellen mit einer phänotypischen Stabilität (z.B. stabile Chondrozyten) und dementsprechend erhöht sich die Qualität und Effizienz des gesamten Verfahrens. FACS ist eines der konventionellen Zell-Sortierungsverfahren, die verwendet werden, um eine spezifische Zellpopulation aus einer heterogenen Zellsuspension auszusortieren. Antikörper, die gegen spezifische Zellmarker erhoben werden, werden an Fluorchrome markiert und werden verwendet, um die Zellpopulation zu markieren, die den Marker exprimiert. Die Fluoreszenz wird verwendet, um individuelle Zellen durch eine spezifische Technologie (Beckton Dickinson) zu sortieren. Verfahren, um Antikörper fluoreszent zu markieren, sind auf dem Gebiet bekannt und viele solcher Antikörper sind kommerziell erhältlich. Alternativ kann ein nicht-markierter Antikörper verwendet werden, um spezifisch das Zelloberflächen-Polypeptid zu binden und ein zweiter markierter Antikörper kann dann verwendet werden, um den ersten Antikörper spezifisch zu binden. Andere Verfahren, wie z.B. die Verwendung von Protein-konjugierten magnetischen Kügelchen, die selektiv spezielle Zellen binden, können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Kits sind kommerziell erhältlich. Allgemein verwenden solche Kits einen markierten Antikörper (z.B. einen Biotin-markierten Antikörper), um das Zelloberflächen-Markerprotein zu binden. Diese Antikörpergebundenen Zellen werden mit dem magnetische Kügelchen-Proteinkonjugat kontaktiert, wobei der Proteinanteil des Kügelchen-Proteinkonjugats den markierten Antikörper spezifisch bindet. Zum Beispiel kann ein Streptavidinmagnetisches Kügelchen-Konjugat verwendet werden, um den Biotin-markierten Antikörper zu binden, um einen Komplex zu produzieren, der den magnetischen Kügelchen-Protein-Konjugat, den markierten Antikörper und die Zelle, die das Markerprotein exprimiert, enthält. Solche Komplexe können von anderen Zellen durch temporäre Anhaftung des Komplexes an einen Magneten und Abtrennung der angehafteten Zellen von anderen Zellen getrennt werden (d.h., eine Population von Zellen, denen z.B. phänotypische instabile Chondrozyten fehlen). Magnetische Kügelchen, die kovalent an einen sekundären Antikörper gekoppelt sind, sind kommerziell erhältlich. Andere, auf Antikörpern basierende Verfahren zum Sortieren von Zellen, wie z.B, der Verwendung einer Affinitätschromatographie oder der Rückhalt von Zellen, die bestimmte Zelloberflächen-Proteine exprimieren, über Petri-Schalen, beschichtet mit Antikörpern, die gegen die letzteren gerichtet sind, sind ebenfalls auf dem Gebiet bekannt und können in der Erfindung verwendet werden. Ein nützliches, kommerziell erhältliches Affinitäts-Zellseparations-Kit "CEPRATE LC" kann von CellPro (CellPro, Inc. Bothell, WA 98021) erhalten werden.
  • Verfahren einer Zellsortierung können die Selektion von Zellen involvieren, basierend auf geeigneten Verhältnissen, z.B. das Verhältnis von Zellen, die einen positiven Marker exprimieren, wie oben erwähnt, zu einem negativen Marker, wie oben erwähnt. Vorzugsweise ist das Verhältnis derartig, dass die Zellen mit positiven Markern in der Mehrheit vorliegen, d.h. das Verhältnis von Zellen mit positiven zu Zellen mit negativen Markern beträgt 1 oder mehr als 1, vorzugsweise 2 oder mehr als 2.
  • Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung umfasst Zellen und bei der Verwendung Zellen, die ihre phänotypische Stabilität erhalten und gewählt aus einer Zellpopulation durch das obige Selektionsverfahren für eine Vielzahl klinischer Anwendungen. Die Zellen sind typischerweise von einem menschlichen Erwachsenen oder reife Zellen, die eine phänotypische Stabilität zeigen. Die Zellen sind insbesondere menschliche Erwachsenenzellen oder reife artikuläre Knorpelzellen, können jedoch auch tierische Erwachsenen- oder reife Zellen beinhalten, die dieselben Eigenschaften zeigen. Diese Zellen können z.B. ohne weitere Verarbeitung an eine Bindegewebsstelle in einen Patienten transplantiert werden, um die Reparatur oder Regeneration von beschädigten Knochen oder Knorpeln zu unterstützen. Anders als bei vorherigen Verfahren benötigt die vorliegende Erfindung nicht notwendigerweise (wie erklärt in der zweiten Ausführungsform) eine in-vitro-Kultivierung, um eine geeignete (sowohl in der Art als auch in der Quantität) Zellpopulation zur Verwendung für eine in-vivo-Anwendung zu erhalten. Beispielsweise können die gewählten Zellen, die sich die phänotypische Stabilität erhalten, an jeder Bindegewebsstelle implantiert werden, die einer Knorpel-Regeneration bedarf, durch jedes Implantationsverfahren, wie z.B. Chirurgie oder arthroskopische Injektion. Eine andere klinische Anwendung solcher Zellen involviert das Aussäen von irgendeinem prosthetischen Mittel, das in einem Säugerwirt verankert werden soll, um die Anhaftung des Mittels zu verbessern. Dies beinhaltet Knie- und Hüftersatzmittel, hergestellt aus organischen oder anorganischen Materialien mit einer geringen immunogenen Aktivität, wie z.B. Titanlegierungen, Keramik-Hydroxyapatit, rostfreiem Stahl und Kobalt-Chrom-Legierungen. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung der Zellpopulation zur Erzeugung und Verbesserung der Sphinkterfunktion durch die Bildung und den Erhalt eines knorpeligen Trägers, z.B. um die Urethra für eine durch Stress ausgelöste Inkontinenz.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Verhältnis von Zell+/Zell– von Zellen, die BMP-2 und/oder FGFR-3 und/oder Marker, co-detektierbar mit diesen Markern und/oder spezifische Reporterkonstrukte oder Moleküle, die zu den spezifischen intrazellulären Signalwegen gehören, als molekulare Marker, die mit einer phänotypischen Chondrozyten-Stabilität positiv assoziiert sind zu Aktivin-ähnlicher Kinase-1 (ALK-1) und/oder Markern, co-detektierbar mit diesem Marker und/oder spezifischen Reporterkonstruktoren oder Molekülen, die zu dem spezifischen intrazellulären Signalweg gehören, als molekulare Marker, die mit der phänotypischen Chondrozyten-Stabilität negativ assoziiert sind, größer als 1, vorzugsweise größer als 2. Die Zellen oder die Zellkultur können in einer geeigneten Form für die Implantation in einen Menschen oder ein Tier vorliegen.
  • Noch eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung besteht aus einer therapeutischen Zusammensetzung, beinhaltend Zellen, selektiert durch das obige Verfahren zur Verwendung in diesen klinischen Anwendungen. Die Zellen sind reife oder erwachsene Zellen, die eine phänotypische Stabilität zeigen. Zusätzlich zu den selektierten Zellen beinhaltet die Zusammensetzung in der Regel mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, der dem Fachmann wohlbekannt ist und z.B. aus Proteinen, wie Collagen oder Gelatine, Kohlenhydraten, wie Stärke, Polysacchariden, Zuckern (Dextrose, Glucose und Saccharose), Cellulose-Derivaten, wie Natrium oder Calciumcarboxymethyl-Cellulose, Hydroxypropyl-Cellulose oder Hydroxypropylmethyl-Cellulose, prägelatinierten Stärken, Pektin-Agar, Karragheen, Ton, hydrophilen Gummis (Gummi arabicum, Guargummi, Akaziengummi und Xanthangummi), Alginsäure, Alginaten, Hyaluronsäure, Polyglykol und Polymilchsäure, Dextran, Pectinen, synthetischen Polymeren, wie z.B. wasserlöslichem Acrylsäurepolymer oder Polyvinylpyrrolidon, Proteoglycanen, Calciumphosphat und ähnlichen gewählt wird. Wenn die therapeutische Zusammensetzung für eine Transplantation an eine Stelle in dem Körper, die einer Reparatur bedarf, beabsichtigt ist, kann sie zusätzlich mindestens einen Wachstumsfaktor der TGF-β-Familie beinhalten.
  • Ein vollständigeres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden illustrativen Beispiele erhalten.
  • Beispiel 1 - Knorpelerhalt und Zellisolierung
  • Artikulärer Knorpel wurde innerhalb von 24 Stunden nach dem Tod, falls nicht anders angegeben, von menschlichen Donoren erhalten, die an keiner Knorpelerkrankung gelitten hatten. Nach einer makroskopischen Überprüfung, um schwere Gelenkpathologien auszuschließen, wurde der Knorpel zur vollen Dicke aus Femoral-Gelenkköpfen geschnitten und in Hank's Balance Salt Solution ("HBSS") (erhältlich von Life Technologies) platziert, supplementiert mit 200 Einheiten/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und 0,5 μg/ml Amphotericin B (Life Technologies). Nach zwei Waschgängen in HBSS über 5 Minuten bei 37°C wurde der Knorpel fein zerkleinert und in eine sterile, 0,2%ige rohe Collagenase (Life Technologies) -Lösung in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium ("DMEM") mit hohem Glucosegehalt (Life Technologies), enthaltend 10%iges fötales Rinderserum ("FBS")(Biowittaker), 200 Einheiten/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin und 0,5 μg/m1 Amphotericin B platziert. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Zellen zweimal in Kulturmedium-DMEM, supplementiert mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 0,25 μg/ml Amphotericin B – gewaschen und mit einem Trypan-blau Ausschlußtest zur Einstellung der Zahl lebensfähiger Zellen gezählt.
  • Beispiel 2 - In-vivo-Assay
  • In Beispiel 1 isolierte Zellen wurden zweimal in steriler phosphatgepufferter Salzlösung ("PBS") gewaschen, in einem Volumen von 100 μl PBS resuspendiert und intramuskulär in den Oberschenkel von weiblichen, 4 bis 5 Wochen alten immundefizienten Nacktmäusen injiziert. Die Tiere wurden nach 3 Wochen durch cervikale Dislokation geopfert und der Oberschenkel seziert, um die Gegenwart des Implantats an der Stelle der Injektion zu gewinnen. Die Implantate wurden gewogen und entweder schnell eingefroren und in flüssigem Stickstoff für eine in-situ-Hybridisierung gelagert oder in frisch hergestelltem 4%igem Formaldehyd für 4 Stunden für eine Histologie und Immunhistochemie fixiert. Nach der Fixierung wurden die Proben in Paraffin eingeschlossen, in 5 μm dicke Sektionen geschnitten und gemäß den Standardprotokollen gefärbt (Elsass Blau pH 2,5, Toluidinblau, Masson's-Trichrom, Safranin O) (Manual of Histological Techniques). Unterschiedliche Zellmengen, von 20 × 106 bis 5 × 105 wurden für eine Injektion verwendet, um die minimale Menge von Zellen zu etablieren, die ein Knorpelimplantat ergaben. Obwohl die minimale Menge frisch isolierter Chondrozyten, die ein Implantat ergab, bei 1 × 106 lag, wählten wir als optimale Menge die Verwendung von 5 × 106 Zellen, da diese Anzahl immer zu mindestens einem Implantat bei Duplikatinjektionen führt, wenn frisch isolierte Chondrozyten verwendet wurden.
  • 1 zeigt, dass frisch isolierte oder aus einer frühen Passage stammende erwachsene menschliche artikuläre Chondrozyten ein Knorpelgewebe nach einer intramuskulären Injektion in nackte Mäuse erzeugen. (a) und (b) Safranin O-Färbungen von erwachsenen menschlichem artikulärem Knorpel, geerntet aus dem Femoral-Gelenkkopf. (c) und (d) Safranin O-Färbung des Knorpelimplantats, (b) und (d) sind Details aus (a) und (c), wie durch die Kästen in (a) bzw. (b) angegeben. Im Vergleich mit erwachsenem menschlichem artikulärem Knorpel ist das Implantat hyperzellulär. Die Masson's-Trichrom-Färbung in (e) zeigt die Abwesenheit einer Neoangiogenese oder einer endochondralen Knochenbildung. (f) Immunofluoreszenz auf Collagen-Typ-2 ist hoch positiv in der ECM des Implantats. Dunkle Flecken sind blau. Die hellere Farbe ist rot. Benachbartes Muskelgewebe ist mit einem Sternchen angegeben. Die Kerne sind mit DAPI gegengefärbt. Der Maßstab ist 200 μm.
  • Um zu überprüfen, dass lebensfähige Zellen benötigt wurden, um das Knorpelimplantat zu organisieren, wurde eine gleiche Anzahl von Zellen, die durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen in flüssigem Stickstoff getötet worden waren, injiziert. Diese Injektionen ergaben kein Implantat. Wir untersuchten auch, ob Zellen in der Lage zu einer Proliferation sein würden, und bestrahlten frisch isolierte Chondrozyten mit einer einzelnen Dosierung von 50 Gy, eine Dosis, die die Proliferation blockiert, jedoch für die Zellen nicht letal ist. Außer einigen zytologischen Atypien ergaben die Injektionen ein ansonsten normales hyalines Knorpelimplantat.
  • Bemerkenswerterweise ergibt die Injektion von Embryoepiphyszalen Chondrozyten (die in der normalen Embryo-Entwicklung durch Knochen ersetzt werden) ein Implantat mit einer vaskulären Invasion und einer endochondralen Knochenbildung. Diese Daten demonstrieren die feine Spezifität des in-vivo-Assays bei dem Bericht über den phänotypischen Weg, in den die injizierte Zelle platziert wird.
  • Um das hydrodynamische Profil von sulfatierten Proteoglykanen (einem wichtigen Bestandteil der extrazellulären Matrix von Knorpel) zu überprüfen, führten wird eine [35S]S04-Inkorporation und Größenfraktionierung von Makromolekülen sowohl in Implantaten als auch dem nativen menschlichen artikulären Knorpel durch. 2 zeigt die Gegenwart von hochmolekularen Proteoglykanen in drei Implantaten (A) mit derselben hydrodynamischen Größe wie bei erwachsenen menschlichen artikulären Knorpel-Explantaten (B). Die hochmolekularen Proteoglykane (linker Peak) liegen sowohl in Implantaten als auch artikulärem Knorpel vor. Diese Molekulargewichtsfraktion ist für Knorpelgewebe spezifisch.
  • Um zu untersuchen, ob das Knorpelimplantat aus Zellen von menschlichem Ursprung stammt, d.h. auszuschließen, dass die einzige Rolle der injizierten Zellen die Erzeugung von Faktoren ist, die eine Chondrogenese im Mausmuskel induzieren, führten wird eine in-situ-Hybridisierung für human-spezifische Alu-Repeats durch, wie beschrieben von Kuznetsov et al. (1997), J Bone Miner. Res. (9):1335–47 und für Maus-spezifische L1-Repeats. Dieses Verfahren demonstriert, dass Zellen, die in unserem in-vivo-Assay zur Knorpelbildung beitragen, von menschlichem Ursprung sind, d.h. von den injizierten Zellen und nicht von dem Mäusewirt abstammen. 3 zeigt den Ursprung des Implantats. Konsekutive Sektionen wurden mit menschlichen (a) oder Maus (b) spezifischen Sonden hybridisiert, die genomische Repeats (Alu bzw. m-L1) erkannten. (c) ist eine Überlagerung von (a) und (b) unter Verwendung künstlicher Farben. Die Vermischung von menschlichen und Mauszellen an der linken Kante des Implantats lag an einer Infiltration von Chondrozyten zwischen den Muskelfasern, wie dargestellt durch Toluidin-Blaufärbung in (d). Der Maßstab ist 200 μm.
  • Beispiel 3: Serielle Passagenführung führt zu einer verschlechterten Chondrozyten-Stabilität.
  • Knorpelproben von 3 unabhängigen menschlichen Donoren wurden in einer Monolayerkultur platziert. Bei der Passagenführung war ein Aliquot von Zellen dazu bestimmt, für eine Duplikat-Injektion in dem in-vivo-Assay von Beispiel 2 und eine RNA-Isolierung herzuhalten. Die Chondrozyten-Stabilität, gemessen durch die Gewinnung eines Knorpelimplantats nach 3 Wochen an der Stelle der Injektion, ging zwischen Passage 1 und 3 verloren.
  • Beispiel 4: Molekulare Marker, assoziiert mit einer Chondrozyten-Stabilität
  • Drei Pools menschlicher artikulärer Chondrozyten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten und in Monolayer kultiviert. Bei dem Führen durch Passagen wurden zwei Aliquots (jeweils 5 × 106 Zellen) in den in-vivo-Assay von Beispiel 2 injiziert, ein geringeres Aliquot wurde verwendet, um den RNA-Extrakt zu erhalten und der Rest wurde wiederum plattiert. Gesamt-RNAs wurden unter Verwendung von Thermoscript (erhältlich von Life Technologies) revers transkribiert und für die semi-quantitative PCR-Analyse verwendet. Nach der Passage 5 wurden zwei Proben in niedrigschmelzenden Agarosekulturen platziert, einem System, von dem bekannt ist, dass es zur einer Rettung der Typ-II-Collagen-Expression durch de-differenzierte Chondrozyten führt. Nach 2 Monaten war eine umfassende Koloniebildung beobachtbar und die Kulturen wurden für eine RNA-Extraktion geerntet. Eine semi-quantitative RT-PCR-Analyse wurde für die Expression von Genen, die an der Chondrogenese beteiligt sind, durchgeführt.
  • Um die Rolle von Genen zu untersuchen, von denen nicht bekannt ist, ob sie an einer Chondrogenese beteiligt sind, unternahmen wir auch eine differenziale Expressionsanalyse, basierend auf dem Prinzip der subtraktiven Hybridisierung: artikuläre Schweine-Chondrozyten wurden ausplattiert und in Monolayer kultiviert. Bei der Passage wurden die Zellen im Hinblick auf ihre Chondrozyten-Stabilität überprüft und eine RNA wurde isoliert. Poly A+-RNA wurde unter Verwendung von Oligotex mRNA Mini Kit (erhältlich von Quiagen) gereinigt und zwar aus Gesamt-RNA, abgeleitet von PO- und P1-Zellen. Wir wählten diejenigen zwei Populationen, da PO-Zellen immer noch ein Knorpelimplantat in dem in-vivo-Assay von Beispiel 2 ergaben, während P1-Zellen dies nicht taten. cDNAs wurden reziprok subtrahiert, um Arten zu erhalten, differentiell exprimiert durch PO-Zellen (potenziell positive Marker stabiler Chondrozyten) und Spezies, differenziell exprimiert durch P1-Zellen (negative Marker). Subtraktion und Amplifikation subtrahierter cDNAs wurde unter Verwendung des PCR-SelektTM-cDNA-Subtraktionskits (erhältlich von Clontech) durchgeführt. cDNAs wurden in einen PCR-Script amp SK(+)-Vektor kloniert und sequenziert. Gene, von denen das menschliche Homolog bekannt war, wurden in die semiquantitative RT-PCR-Analyse menschlicher Proben eingeschlossen, während unbekannte Gene im Hinblick auf ihre differentielle Expression in der ursprünglichen RNA-Population durch Northern-Analyse kontrolliert wurden. Die detaillierten Verfahren, die verwendet wurden, waren die folgenden:
  • RNA-Präparation
  • Gesamt-RNA aus Chondrozyten wurde unter Verwendung von Trizolreagenz (erhältlich von Life Technologies) isoliert, mit Ethanol präzipitiert und bei –70°C für die weitere Verwendung gelagert. Gesamt-RNA aus Agarosekulturen wurde durch Homogenisieren der Gesamtkultur in 6M Harnstoff, 3M Lithiumchlorid mit einem Polytron-Homogenisator erhalten und der Hauptteil der Agarose wurde durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 3.000 Upm für 15 Minuten entfernt. Nukleinsäuren im Überstand ließ man über Nacht bei 4°C präzipitieren, bildete Pellets durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 18.000 Upm bei 4°C und der Überstand wurde entfernt, die RNA wurde luftgetrocknet und in RNAse-freiem Wasser gelöst. Reste der Agarose und anderer Kontaminanten wurden durch Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanol-Präzipitation entfernt. Die Proben wurden in RNAse-freiem Wasser wieder gelöst und bei –70°C zur weiteren Verwendung gelagert. Für diejenigen Proben, die eine mRNA-Selektion benötigten, wurde eine mit einem PolyA+-Schwanz versehene RNA aus einer Gesamt-RNA durch Doppelselektion unter Verwendung von Oligotex mRNA Mini Kit (Quiagen) aussortiert.
  • Semi-quantitative RT-PCR-Analyse
  • 1 μg der Gesamt-RNA wurde Erststrang unter Verwendung von Thermoscript (Life Technologies) transkribiert. Vor der PCR-Analyse wurden cDNAs auf β-Actin abgeglichen. PCR für menschliches β-Actin wurde in einem Volumen von 10 μl durchgeführt, wobei die Reaktion nach 18, 19, 20 Zyklen beendet wurde, um sicherzustellen, dass sich die PCR- Amplifikation immer noch in der exponentiellen Phase befand. PCR-Produkte wurden in 1%igem Agarosegel in TBE-Puffer elektrophoretisch behandelt, mit Ethidiumbromid gefärbt und die Intensität der Banden wurde durch Dichtemessung unter Verwendung von Image Master Software (erhältlich von Pharmacia-Biotech) analysiert. cDNAs wurden gemäß der relativen Intensität der Banden verdünnt. Um auszuschließen, dass β-Actin in den unterschiedlichen, zu vergleichenden Proben differenziell reguliert wurde, wurde dieselbe Analyse auch für GAPDH mRNA durchgeführt. Nach einer Abgleichung auf β-Actin wurden alle Proben simultan für eine Anzahl von Genen getestet, von denen bekannt ist, dass sie an der Chondrogenese und dem Knorpelerhalt beteiligt sind. Dieselbe Analyse wurde für diejenigen Moleküle durchgeführt, die mit dem subtraktiven Hybridisierungsansatz erhalten wurden. Für jedes Gen wurde die Zyklisierung derartig optimiert, dass die Amplifikation sich noch in der experimentellen Phase befand, wenn die PCR für alle Proben beendet wurde.
  • 4 zeigt, dass die serielle Expansion menschlicher adulter artikulärer Chondrozyten zu einem Verlust ihrer Fähigkeit führt, in vivo Knorpel zu bilden. Proben von 2 unabhängigen Donoren (S1 und S2) wurden expandiert. Während der Passage wurden Aliquots der Zellsuspension in nackte Mäuse injiziert oder für eine Genexpressionsanalyse verwendet. Nach zwei Populationsduplikationen konnten die Chondrozyten immer noch reifes Knorpelgewebe bilden, wie überprüft durch Elsassblau (a und a') und Safranin O (c und c'). Nach 4 Populationsverdoppelungen – schwarzer Pfeil – zeigte sich der Verlust der Knorpelbildungsfähigkeit durch die Bildung von unreiferen Implantaten, wie dargestellt durch Elsass-Blau (b und b') und Safranin O (d und d')-Färbungen.
  • Chondrozyten aus weiteren Passagen – offener Pfeil – führten nicht zu einem gewinnbaren Implantat. Der Verlust des Knorpelbildungspotenzials wurde durch die Herabregulierung von Typ-2-Collagen, Fgfr3 und Bmp2 mRNA markiert, während die Expression von Alk1 mRNA hoch reguliert war. Fi sind frisch isolierte Chondrozyten. Der Maßstab ist 200 μm. Das Auftreten des negativen Markers ALK-1 ist mit der Nichtbildung von einem gewinnbaren Implantat assoziiert oder zeigt dies an und das Auftreten dieses negativen Markers ist mit der Herabregulierung der positiven Marker assoziiert.
  • 5 zeigt, dass der Satz der molekularen Marker die Fähigkeit von AHAC zur Bildung von stabilem Knorpel in vivo unabhängig vom Alter des Donors vorhersagt. Frisch isolierte (FI) und seriell durch Passagen geführte Chondrozyten von Donoren unterschiedlicher Altersgruppen (im Bereich von 28 bis 86 Jahren) wurden in unserem in-vivo-Assay während der Expansion ausgesetzt. Der schwarze Pfeil markiert die Passage, wenn ein Abfall der Reife des Implantats erstmalig nachgewiesen wurde. Der offene Pfeil markiert die erste Passage, aus der kein Implantat gewonnen werden konnte. Wiederum folgt auf die Herabregulation der positiven Marker die Hochregulation des negativen Markers ALK-1 und gleichzeitig zeigt das Auftreten von ALK-1 die Stufe an, auf der kein Implantat gewonnen werden kann.
  • 6 zeigt, dass der Agarose-Assay die Knorpel-Gewebs-Bildungsfähigkeit expandierter Chondrozyten in unserem in-vivo-Assay nicht vorhersagt. Frisch isolierte (FI) und seriell durch Passagen geführte erwachsene menschliche artikuläre Chondrozyten wurden in Nacktmäuse injiziert und in dem Agarose-Assay überprüft. (a) Obwohl die Zellen ihre in-vivo-Knorpel-Gewebs-Bildungsfähigkeit nach der zweiten Passage verloren, konnten sie immer noch in anchorunabhängigen Bedingungen in Agarose nach Passage 5 wachsen (ungefähr 10 Populationsverdoppelungen). (b) Das molekulare Profil derselben Chondrozyten während der Passage und nach der Agarose-Kultur ist bei A(10) dargestellt. FI steht für frisch isolierte Chondrozyten. Der Pfeil zeigt die erste Passage an, aus der kein Implantat mehr gewonnen werden konnte. Obwohl eine Rettung positiver Marker vorhanden war, war der negative Marker noch immer hochreguliert und diese Zellen konnten in vivo keinen Knorpel bilden. Dies ist eine deutliche Demonstration, dass die Gegenwart positiver Marker, z.B. FGFR3, für gesunden Knorpel indikativ ist, jedoch nicht notwendigerweise in exklusiver Weise. Daher ist die Verwendung von negativen Markern allein zur Sortierung oder die Verwendung einer Kombination aus positiven und negativen Markern die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 5
  • 7 zeigt, dass die Gegenwart eines negativen Markers für die Chondrozyten-Stabilität die Möglichkeit einer internen Kontrolle für Expressionsniveaus bietet. RT-PCR für FGFR3 und Alk1 im selben Rohr wird aus frisch isolierten (FI) und expandierten Chondrozyten nach unterschiedlichen Passagen durchgeführt. Das Auftreten der höheren Bande, korrespondierend zu Alk1 und die Abnahme der Fgfr3-Bande markiert den Verlust der Fähigkeit, ein Knorpel-Implantat in vivo zu organisieren. Der Pfeil zeigt die erste Passage an, aus der kein Implantat mehr gewonnen werden konnte. Dies stimmt mit dem Erscheinen des negativen Markers ALK-1 und dem Verschwinden des positiven Markers FGFR3 überein.
  • Beispiel 6 – der in-vivo-Assay und der Satz von Markern für die Vorhersage des Ausgangs einer autologen Chondrozyten-Transplantation (ACT) in einem Tiermodell
  • Männliche junge weiße Neuseeland Kaninchen oder Ziegen wurden als Modell für ACT verwendet. Artikulärer Knorpel der Patella oder von Femoral-Gelenkköpfen werden mit einem Mittel ausgehöhlt, das einen Oberflächenknorpeldefekt von einer Tiefe von 0,3 mm und einem Durchmesser von 3 mm erzeugt, und daher nicht in den darunterliegenden Knochen eindringt. Menschliche artikuläre Chondrozyten werden in verschiedenem Ausmaß, wie in Beispiel 1 offenbart, expandiert, im Hinblick auf die Gegenwart von Markern gemäß Beispiel 4 analysiert, die mit einer chondrozytischen Stabilität assoziiert sind, und wiederum in die Knorpelläsion unter der Periostklappe injiziert, wie beschrieben von Brittberg et al, (1996) Clin. Orthop. (326):270–83. Nach drei Monaten werden die Tiere geopfert und der Gelenkoberflächendefekt analysiert und durch Histologie im Hinblick auf Ausmaß und Qualität der Knorpelreparatur und die Integration der Ränder eingeteilt. Eine in-situ-Hybridisierung für menschliche Alu-Repeats wird durchgeführt, um den Beitrag injizierter Chondrozyten zu der Knorpelreparatur zu untersuchen.
  • In einem anderen Ansatz haben wir ein ex-vivo-Modell einer JSD-Reparatur durch ACT entwickelt. Die gesamte Patella wurde von weißen männlichen jungen Neuseeland-Kaninchen exzisiert, ein Knorpeldefekt wurde erzeugt und vorher isolierte Chondrozyten wurden unterhalb eines Periostlappens vernäht, um die Läsionen abzudecken injiziert. Die Patella wurde dann in Kultur in DMEM, supplementiert mit 10 % FBS und einer antibiotischen-antimykotischen Lösung bei 37°C in einer 5%igen CO2-Atmosphäre platziert. Nach 2 Wochen wurde die Patella in 4 % Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und im Hinblick auf Histologie und andere Verfahren analysiert.
  • Dieser Versuchsaufbau erlaubte längere und kontrolliertere experimentelle Bedingungen und ebenfalls eine genauere und flexiblere Überwachung des Heilprozesses durch z.B.
  • Zellmarkierung, Zeitpunkt-Biopsie des heilenden Gewebes für histologische und molekulare Analysen usw.
  • Beispiel 7 – Rettung seriell durch Passagen geführter artikulärer Chondrozyten
  • Eine kurze Behandlung mit einem Wachstumsfaktor der TGF-β-Superfamilie direkt vor der Implantation kann seriell durch Passagen geführte artikuläre Chondrozyten teilweise retten, die gerade ihre phänotypische Stabilität verloren haben oder das Zellexpansionsverfahren dramatisch reduzieren, das auftritt, bevor Zeller für Gelenkoberflächen-Defektreparaturen injiziert werden können, und eliminiert idealerweise die Notwendigkeit desselben. Die Behandlung wird für Zellen in Suspension für eine kurze Zeitspanne verabreicht und darauf folgen exzessive Waschungen in PBS, direkt vor der Injektion. Ähnlich behandelte Zellen werden im Hinblick auf die Expression molekularer Marker getestet, verbunden mit einer phänotypischen Stabilität der artikulären Chondrozyten.
  • In einem Satz von Experimenten wurden frisch isolierte artikuläre Chondrozyten in Einzelzellsuspensionen 30 Minuten gegenüber 100 ng/ml CDMP-1 in Nährmischung Ham's F-12 (Life Technologies) bei 37°C exponiert, zweimal in PBS gewaschen und in den in-vivo-Assay von Beispiel 2 injiziert. Kontrollinjektionen wurden mit Chondrozyten durchgeführt, die gegenüber HAM-F12 allein exponiert waren. Nach drei Wochen wurden die Knorpelimplantate gewogen, in 0,2%iger roher Collagenase bei 37°C verdaut und die isolierten Zellen wurden gezählt. Das von den CDMP1 behandelten Zellen erhaltene Implantat hatte ein Feuchtgewicht, das dreimal höher war als im Vergleich mit Proben, behandelt mit HAM-F12 allein und die Zellzahl war zweimal so hoch. Wie in 8 dargestellt, war ebenfalls die Produktion hoch sulfatierter Proteoglykane erhöht, wie bewiesen durch eine stärkere metachromatische Färbung mit Safranin 0 in dem Implantat, das von den CDMP-1 behandelten Chondrozyten erhalten wurde (8B) im Vergleich mit der Kontrolle (8A). Dies zeigt, dass eine kurze Aussetzung gegenüber CDMP-1 in Suspension, direkt vor der Injektion, den chondrozytischen Phänotyp erhöhen kann, gemessen durch den in-vivo-Assay von Beispiel 2. Weiterhin macht die Effektivität eines solchen kurzen Fortschritts (pulse) verlängerte, teure und potenziell gefährliche Expansionen unnötig.
  • Beiepiel 8 – Isolation stabiler Chondrozyten aus einer Mischzell-Population durch die Verwendung der Fluss-Zytometrie
  • Während der Zell-Expansion, wie in Beispiel 4 demonstriert, wurden einige Chondrozyten phänotypisch instabil und konnten in vivo kein Knorpelgewebe organisieren. In der Konsequenz hängt das chondrogene Potenzial einer expandierten Chondrozyten-Population nicht nur von der Zahl der Zellen, sondern auch von der Zahl der phänotypisch stabilen Chondrozyten ab, die sie enthält. Die Identifizierung Membran-assoziierter molekularer Marker für sowohl stabile als auch instabile Chondrozyten – z.B. FGFR-3 bzw. ALK-1 oder jeder damit co-detektierbare Marker – ergibt die Möglichkeit, optimale Zellen für die ACT zu selektieren. Die gesamte expandierte Zellpopulation wird mit Antikörpern inkubiert, die gegen ALK-1 und/oder FGFR-3 gerichtet sind oder gegen irgendwelche damit co-detektierbare Membranmarker, markiert mit unterschiedlichen Fluorochromen. Eine FACS-Analyse an doppelt markierten oder vielfach markierten Zellen zeigt die Verteilung von stabilen und instabilen Chondrozyten in dem gesamten Pool. Falls benötigt, wird die Zellsortierung verwendet, um die stabilen von den instabilen Chondrozyten (z.B. unter Verwendung positiver Marker) zu trennen oder die instabilen von den stabilen zu trennen (z.B. unter Verwendung negativer Marker). Ein kleines Aliquot der sortierten stabilen Chondrozyten-Population wird für eine Qualitätskontrolle verwendet, z.B. unter Verwendung anderer unabhängiger positiver und negativer Marker der Chondrozyten-Stabilität (z.B. Typ-II-Collagen und BMP-2 als positive Marker und Collagen-Typ-X als negativer Marker). Die verbleibenden stabilen Chondrozyten werden in einem Kulturmedium wiedergewonnen, enthaltend autologes Serum und hergestellt für ACT. Dies ermöglicht den Erhalt einer Zellsuspension, bestehend aus einer konsistenten Zahl stabiler Chondrozyten, die für eine Implantation oder für eine Verwendung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet sind, wobei alle oder ein Hauptteil der Zellen zu der Knorpelreparatur beitragen und es sich nicht um eine Mischung heterogener Zellen, unabhängig von ihrem Phänotyp, handelt. Es ermöglicht auch die Eliminierung instabiler Chondrozyten aus dem Pool, die nicht in der Lage sind, in vivo Knorpel zu bilden, die jedoch die geeignete Reparatur potenziell negativ beeinflussen können.
  • Beispiel 9
  • 9 zeigt, dass die meisten aus menschlichen adulten artikulären Knorpel isolierten Zellen Typ-2-Collagen und FGFR3 simultan co-exprimieren. Die Zellen wurden aus Knorpelgewebe durch enzymatischen Verdau über Nacht in 0,2 % Collagenase freigesetzt, unter Verwendung von Fix & Perm-Reagenz (Sigma) permeabel gemacht und entweder unmarkiert gelassen (A) oder mit Kaninchen-anti menschlichem FGFR3-Antikörper markiert (B) oder mit Maus-anti menschlichem Collagen-Typ-2-Antikörper markiert (C) oder mit beiden von diesen markiert (D). Fluorescein- oder Phycoerytrinkonjugierte Antikörper gegen Kaninchen- bzw. Maus-IgG wurden als sekundäre Antikörper verwendet. Eine flusszytometrische Analyse zeigte, dass 80 % der Zellen für FGFR3 (in B) positiv war und 85 % der Zellen für Collagen-Typ-2 (in C). Panel D zeigt, dass individuelle Zellen sowohl FGFR3 als auch Collagen-Typ-2 co-exprimieren, was anzeigt, dass FGFR3 in vollständig differenzierten Zellen vorliegt und nicht ein Marker für Skelett-Vorläuferzellen ist.
  • Beispiel 10
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Zellen und Zellkulturen, die positive und negative Marker, wie oben beschrieben, in spezifischen Verhältnissen exprimieren. Aufgrund von kommerziellen, praktischen und Zeitbegrenzungen ist es nicht immer möglich, die Zellsortierungsverfahren, wie oben beschrieben, so durchzuführen, dass jede Zelle positive Marker exprimiert und keine negativen Marker exprimiert.
  • Um das Verhältnis von Zellen mit positiven Markern (Cell+) zu denjenigen mit negativen Markern (Cell–) zu bestimmen, wurden der in-vivo-Assay und die diagnostischen Verfahren, wie oben beschrieben, für menschliche Zellpopulationen verwendet, um zu bestimmen, wann ein zufriedenstellendes Implantat erwartet werden kann, d.h. wann das Implantat gesunde stabile Knorpel erzeugen wird. Diese Experimente zeigen, dass bei einem Verhältnis von Cell+/Cell– von 1 oder darüber geeignete Implantate aus einer solchen Zellpopulation hergestellt werden können. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis 2 oder mehr. Ein Verhältnis von 5 oder mehr wird als eine signifikante Sicherheit, ein erfolgreiches Implantat bereitstellend, angesehen. Das Verhältnis kann in vorteilhafter Weise aus einer Überprüfung von den oben beschriebenen DNA-Chips erhalten werden.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00520001

Claims (13)

  1. Verfahren zum Identifizieren von molekularen Markern, die mit der phänotypischen Stabilität einer Knorpelzell-Population verbunden sind, und das folgendes umfaßt: a) intramuskuläres oder subkutanes Injizieren einer Suspension isolierter oder expandierter Zellen in einer iso-osmotischen Flüssigkeit in ein nicht-menschliches Säugetier, wobei die Suspension ein Äquivalent von zumindest 1 × 106 Gelenkknorpelzellen wie an immundefiziente Mäuse verabreicht, umfaßt, b) histologisches Auswerten des in vivo gebildeten Knorpels, ob es sich um stabilen Knorpel handelt, der frei von irgendwelchen Anzeichen einer Vaskularisierung ist, und c) Identifizieren eines oder mehrerer positiver und/oder negativer molekularer Marker dieser isolierten oder expandierten Zellen, von denen sich in Schritt b) herausgestellt hat, daß sie in vivo stabilen Knorpel bilden, der frei von irgendwelchen Anzeichen einer Vaskularisierung ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Identifizierens positiver oder negativer molekularer Marker unter Verwendung einer Technik durchgeführt wird, ausgewählt aus der Gruppe einer semiquantitativen RT-PCR, Northern Hybridisierung, Differentialdisplay, substraktiver Hybridisierung, subtrahierten Bibliotheken, cDNA-Chips und cDNA-Arrays.
  3. Verwendung des positiven Markers BMP-2 und/oder FGFR-3 und/oder eines Markers, der mit BMP-2 und/oder FGFR-3 co-detektierbar ist, identifizierbar durch das Verfahren nach Anspruch 1, oder eines oder mehrerer Reporterkonstrukte, die einen Promotor des positiven Markers umfassen, als Marker zum in vitro Identifizieren einer isolierten oder expandierten Knorpelzell-Population als Zellpopulation, die dazu in der Lage ist, in vivo stabilen nicht-vaskularisierten Knorpel zu erzeugen.
  4. Verwendung des negativen Markers exprimierte Aktivinartige Kinase (ALK-1), und/oder eines Markers, der mit ALK-1 co-detektierbar ist, identifizierbar durch das Verfahren nach Anspruch 1, oder eines Reporterkonstruktes, das einen Promotor der negativen Markers als Marker zum in vitro Identifizieren einer isolierten oder expandierten Knorpelzell-Population als Zellpopulation umfaßt, die dazu in der Lage ist, stabilen nicht-vaskularisierten Knorpel in vivo zu erzeugen.
  5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4 als Werkzeug zur Überwachung einer Passage durch Passagen-Zellexpansion und/oder zur Vorhersage, wenn eine Zellexpansion gestoppt werden muß und/oder um ein Mittel zur Qualitätskontrolle von Zellen, die zur autologen Zelltransplantation verwendet werden sollen, bereitzustellen.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 3–5, wobei die Identifizierung mit Reihen von DNA-Sonden durchgeführt wird, die an mRNA positiver oder negativer Marker für die phänotypische Knorpelzell-Stabilität hybridisieren, wobei die Sonden auf DNA-Arrays oder DNA-Chips angeordnet sind.
  7. Verfahren zum Identifizieren und/oder Sortieren einer Zellpopulation in vitro mit oder ohne phänotypischer Knorpelzell-Stabilität innerhalb einer isolierten oder expandierten Knorpelzell-Population unter Verwendung von exprimiertem BMP-2 als Marker.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, das weiterhin die Verwendung von FGFR-3 als positiven Marker für die phänotypische Knorpelzell-Stabilität umfaßt.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, das weiterhin die Verwendung von ALK-1 als negativen Marker für die phänotypische Knorpelzell-Stabilität umfaßt.
  10. Verfahren nach Anspruch 7, das die Feststellung umfaßt, dass die Zellpopulation ein Verhältnis von positivem Marker für die phänotypische Knorpelzell-Stabilität gegenüber negativem Marker für die phänotypische Knorpelzell-Stabilität exprimiert, das größer als 1, vorzugsweise größer als 2 ist, wobei der positive Marker für die positive phänotypische Knorpelzell-Stabilität exprimiertes BMP-2 oder ein Marker ist, der mit BMP-2 coexprimiert wird; und wobei der negative Marker für die phänotypische Knorpelzell-Stabilität exprimierte Aktivinartige Kinase (ALK-1) oder ein Marker ist, der mit ALK-1 co-exprimiert wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Identifizierung mit Reihen von DNA-Sonden durchgeführt wird, die an mRNA positiver oder negativer Marker für die phänotypische Knorpelzell-Stabilität hybridisieren, wobei die Sonden auf DNA-Arrays oder DNA-Chips angeordnet sind.
  12. Diagnostisches Werkzeug zur Identifizierung von Zellen, die dazu in der Lage sind, nicht-vaskularisierten Knorpel in vivo stabil zu erzeugen, umfassend DNA-Sonden, die an die mRNA von zumindest zwei der Marker hybridisieren, ausgewählt aus BMP-2, FGFR-3 und ALK-1 oder Markern, die mit BMP-2, FGFR-3 und ALK-1 co-detektierbar sind, identifizierbar durch das Verfahren nach Anspruch 1.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 3–6, wobei die Zellpopulation passagiert wird.
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