CN101215565B - 一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记由BCL10基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。序列表SEQ ID NO：2所示序列的第144位碱基处有一个C144-T144的碱基突变，导致RFLP-HinP1I多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记的克隆及应用

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记的克隆及应用。

背景技术

近年来，现代育种技术在改良猪生产性状方面做出了很大贡献，但对健康和抵抗疾病的能力的遗传改良确没有得到足够重视。一些预防性措施的应用，如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物和疫苗等，在现代养猪业中发挥了重要作用，但随着全球对减少药物和疫苗使用的呼声越来越高，采用分子遗传学方法从本质上提高畜禽机体自身抗病能力越来越受到关注，成为研究的重点。

抗病力是一般受先天性免疫和后天性免疫所协调。先天免疫快速，一般发生在接触病原96h之内，无病原特异性，主要与单核细胞(如巨噬细胞)、粒细胞(如嗜中性粒细胞)、自然杀伤细胞等白细胞，红细胞及血液中天然存在的抗微生物分子，补体系统、细胞因子和急性期蛋白因子有关。白细胞根据常规方法离心后可大致分为三大类，即淋巴细胞、中间白细胞(主要为巨噬细胞等单核细胞)以及中性粒细胞。其在免疫中的作用主要为细胞吞噬及产生特异抗体。红细胞有许多与免疫有关的物质(如CR1、CR3、CD58、CD59、DAF、SOD等)，数目众多，自成系统。红细胞事血循环中最重要的固有免疫细胞，具有识别、黏附、浓缩、杀伤抗原、清除循环免疫复合物(CIC)的能力，参与机体免疫调控，并有完整的自我调控系统，许多疾病免疫发病机制中，红细胞天然免疫缺陷占有很重要的地位。后天免疫包括细胞免疫和体液免疫两个方面，是通过特定的遗传机理产生特殊的抗原翻译，即特异性免疫应答。按遗传基础的不同，抗病力可分为特殊抗病力和一般抗病力，特殊抗病力是指猪对某一特定疾病或病原体的抗性，这一抗性主要受一个主基因位点控制，表现为宿主体内存在或缺失某种分子或其受体。一般抗病力不限于对某一种病原体的抗性，病原体抗原性差异对一般抗病力基本没有影响，它体现了机体对疾病的整体防御功能。在疾病发生时，大多数抗病力都受到遗传因素及环境因素的影响，即使是由特定病原体所致的传染病或寄生虫，在不同种群和个体中的抗性也不同。

个体免疫力是衡量动物健康的重要指标(Knap等，Relationships between genetic changes and infectiousdisease in domestic livestock[A].Brit Soc Anim Sci，2000，27：65-80.)，它属于数量性状，其中涉及相关基因较多，分子机制很复杂。免疫力与生产性能通常表现为表型负相关关系，这为育种工作者提出了一个大的难题，即如何在保持和提高生产性能的基础上同时提高个体免疫能力是育种工作者研究的新课题。不过，最近国外少量研究表明猪免疫能力与生产性能的关系是双向的，某种情况下即正常状态免疫能力的增强能提高猪的生长速度，饲料效率等主要生产性能，而单纯针对生产性能的选择却导致猪免疫能力下降即相关等位基因的丢失或频率的降低。但是，目前二者的相互关系仍然不是很明了，从基因组水平揭示出生产性能和免疫力的控制基因体系间的具体关系，是解决上述难题的有效途径。在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。

对于猪抗病性状的候选基因，目前已有多例报道，其中研究得较清楚的是猪大肠杆菌K88和F18受体基因。研究表明动物体内如果缺乏大肠杆菌K88受体或F18受体，就会对相应的血清型大肠杆菌引起的腹泻产生抗性，目前编码大肠杆菌K88受体(K88abR和K88acR)的基因已经定位在猪13号染色体上靠近转铁蛋白基因的位置(Edfors-Lilja等，Mapping Quantitative Trait Loci for Immune Capacity in the Pig.1998，161：829-835)，α-(1，2)-海藻糖转移酶1(α(1，2)fucosyltransferase，FUT1)基因是F18受体(ECF18R)的候选基因，位于猪6号染色体上(Vogeli P等，Association between the H blood group system and GP1 red cellenzyme system and the locus specifying receptors of an Escheri chia coli strain expressing fimbriae F107.AnimalGenetics，1992，23：93)。此外，Ecoli F4受体基因也与猪的腹泻有关。氟烷基因(Hal)是另一个影响较大的抗性相关基因，它的氟烷敏感等位基因(Halⁿ)可导致猪的体质和抵抗力下降，产生剧烈的应激反应。猪的干扰素被证明对繁殖障碍与呼吸道综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、胃肠炎冠状病毒等多种重大传染病病毒均具有广谱防御和抑制作用，因而干扰素基因、干扰素受体基因是选择猪的非特异性抗病力的重要候选基因。另外，MHC已经被证明与抗体对多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关(Peelman等，A detailed physical map ofthe porcine major histocompatibility complex(MHC)class III region：comparison with human and mouse MHC class III regions，Mammalian Genome，1996，5：373-367)，其它有研究的与抗病力有关的基因是MX1(Myxovirus(influenza)resistance 1，粘液病毒(流感)抗性因子1)、NRAMP1(Natural resistance-associated macrophage protein 1，与巨噬细胞有关的天然抗性蛋白1)，IL1(Interleukins 1，白细胞介素1)、PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因。

前人研究表明，BCL10基因编码的是一种含有胱冬肽酶募集结构域(caspase recruitment domain CARD)的蛋白，同时属于黏膜相关淋巴组织(mucosaassociated lymphoid tissue MALT)B淋巴瘤中鉴定的断裂位点的基因，在淋巴细胞中抗原受体介导的NF-kB激活过程中是必需的。Bcl-10属于CARD蛋白家族成员，调节细胞凋亡和NF-kB信号转导通路。

培养细胞中Bcl-10的过表达可以促进细胞凋亡，然而Bcl-10对于细胞凋亡的调节机制目前还不十分清楚。Yui et al对于Bcl-10在细胞凋亡中的信号转导机制进行了研究。在细胞凋亡的调节中Bcl-10的磷酸化修饰以及与细胞内其他蛋白之间的相互结合相互作用是非常重要的。Bcl-10与其他潜在的细胞凋亡调节蛋白之间存在相互作用，例如TNF受体相关因子2(TRAF2)，细胞凋亡蛋白抑制因子(inhibitor ofapoptosis proteins cIAP)等。研究表明Bcl-10蛋白与这些蛋白之间的相互作用是具磷酸化修饰依赖性的。Bcl-10的磷酸化造成Bcl-10与cIAP之间的结合，同时与TRAF2分离。然而Bcl-10蛋白的过度磷酸化却可以促进细胞凋亡，表明Bcl-10与其结合蛋白的结合状态与Bcl-10的促进细胞凋亡的功能有关。Bcl-10分子中与cIAP结合位点的确是不能诱导细胞凋亡。这些发现表明Bcl-10是一种介导细胞凋亡信号转导的因子主要的分子机制就是通过Bcl-10不同的磷酸化修饰与cIAP结合替代与TRAF2结合。

迄今为止，尚未见全面研究猪BCL10基因功能的报道，而研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因的部分的外显子进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它在免疫方面的功能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，克隆猪免疫相关基因BCL10的片段，寻找BCL10基因片段的突变位点，筛选一种与猪免疫性状相关的分子标记，利用该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人克隆得到与猪免疫性状相关基因BCL10的DNA片段，它的cDNA序列(包括全长CDS及部分3’-UTR)如序列表SEQ ID NO：1所述；它的部分DNA序列如序列表SEQ ID NO：2所述。

PCR扩增的BCL10基因cDNA长为1113bp，包括CDS全长702bp及部分3’-UTR，即如序列表SEQ IDNO：1所述和附图2所示的核苷酸序列。

PCR扩增的BCL10基因组序列全长为635bp，即如序列表SEQ ID NO：2所述和附图3所示的核苷酸序列。

在序列表SEQ ID NO：2的第144bp处有一个碱基突变(C144-T144)，该突变导致HinP1I-RFLP多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism)。

扩增BCL10基因cDNA序列的引物如下所示：

正向：5′GAGGCCGAAGCCCCCAGCCT 3′，

反向：5′AGAAACACTCTTCCCAGCCACGAC 3′。

扩增BCL10基因测序并检测C144-T144处碱基突变所用的引物序列如下所示：

正向：5’-GAATAGTCGTGGCTGGGAAGAG-3’，

反向：5′-AGACAGATGGCAGGAAATAGGC-3′。

本发明所述的分子标记的制备方法是：

用人BCL10基因mRNA(GenBank收录号：NM 003921)为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；与人同源比对并设计引物，提取RNA进行RT-PCR及PCR扩增，并克隆得到如序列表SEQ ID NO：1所示的cDNA序列(包括CDS全长及部分3’-UTR)；根据与猪BCL10基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物，提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：2所示的第144位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪免疫性状相关基因BCL10部分cDNA序列(包含CDS全长及部分3’-UTR)。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的与猪免疫性状相关基因BCL10部分DNA序列。

图1：本发明的技术流程图。

图2：本发明中猪BCL10基因部分cDNA序列(包含CDS全长及部分3’-UTR)。

图3：本发明中猪BCL10基因外显子III部分序列，其中第144位碱基处的括号内为等位基因的突变位点。

图4：本发明中猪BCL10基因外显子III部分序列的扩增序列的电泳图谱，片段大小为635bp(琼脂糖胶浓度为1.5％)。图中：M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。

图5：本发明中猪BCL10基因测序发现的C144-T144的等位基因突变。

图6：本发明中猪BCL10基因外显子III的HinP1I-RFLP的三种基因型(AA AB BB)电泳图谱。M泳道为DNA分子量标准(DL2000)

具体实施方式

实施例1：

(一)BCL10基因CDS克隆及部分DNA序列扩增

(1)引物设计

用人BCL10基因mRNA(GenBank收录号：NM 003921)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用序列分析软件DNAStar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群。根据与人BCL10基因mRNA的同源比对初步确定起始与终止密码子位置，设计引物克隆得到如序列表SEQ ID NO：1所示的cDNA序列(包括CDS全长及部分3’-UTR)；根据与猪BCL10基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，推测猪BCL10基因含有3个外显子，设计扩增引物，进行PCR扩增、产物纯化及测序，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。其中，通过对外显子III部分序列(635bp)的扩增测序比对，于144bp处发现了1个碱基突变(C144-T144)，对此突变进行酶切分析，发现该突变恰好影响着内切酶HinP1I的识别。

克隆BCL10基因cDNA序列的引物如下所示：

正向：5′GAGGCCGAAGCCCCCAGCCT 3′，

反向：5′AGAAACACTCTTCCCAGCCACGAC 3′。

扩增BCL10基因测序并检测C144-T144处碱基突变所用的引物序列如下所示

正向：5’-GAATAGTCGTGGCTGGGAAGAG-3’，

反向：5′-AGACAGATGGCAGGAAATAGGC-3′。

(2)PCR产物的纯化、克隆和测序

PCR扩增条件：10μL的反应体系中加入DNA模板0.5μL，双蒸水7.5μL，10×PCR buffer 1μL，dNTP0.3μL，10mM引物前后各0.3μL，Taq酶1U。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸35s，33个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，于65℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μL融化的凝胶中加入1mL Resin试剂，混匀20s，将Resin/DNA混合物转移至带有吸附柱的离心管，离心除去液体。再向吸附柱中加入80％的异丙醇2mL，离心除去液体，取下吸附柱装入1.5mL Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将吸附柱装入另一个干净的1.5mL Ependorff管中，加入30～50μL灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

连接反应：将纯化PCR产物与pGEM-Teasy载体(购自promega公司)连接，连接反应总体积是5μL，其中包括2.5μL2×Buffer，0.5μL的T载体，1.5μL的纯化PCR产物，0.5μL的T4连接酶，置16℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mLLB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100-120μL感受态细胞于1.5mL Ependorff管中，将5μL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μL涂布于已提前4h涂布了IPTG(英文名称：Isopropylthio-β-D-galactoside，中文名称：异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，购自上海美季生物技术有限公司和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

质粒的小量制备：挑取平板上的单菌落，接种于2-3mL LB中，37℃300r/min培养6-8h。用1.5mL EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μL用冰预冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II[0.2M NaOH，1％十二烷基磺酸钠(SDS)]200μL，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III[5M乙酸钾，冰乙酸11.5mL，双蒸水28.5ml]150μL，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇(按体积比为苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)500μL，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE(Tris乙酸盐-EDTA缓冲液，pH7.4)20μL。

重组质粒的酶切鉴定：取3μL质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为10μL，加入5U限制性内切酶EcoRI及1μL相应的10×限制性内切酶反应缓冲液(购自MBI公司)，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μL反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博道生物技术有限公司完成。

在本实施例中，PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR得到的cDNA序列长度为1113bp，包括CDS全长及部分3’-UTR(如图2和序列表SEQ IDNO：1所示)；PCR得到的DNA序列全长为635bp，均为3’-UTR(如图3和序列表SEQ ID NO：2所示)，测序结果表明在该DNA序列的144bp处存在C144-T144突变，测序结果见图5所示。

(3)DNA序列同源性检索鉴定

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

(二)PCR-RFLP诊断方法建立

RFLP检测：将PCR产物3μL，10×Buffer 1μL，限制性内切酶HinP1I为0.2μL(2U)，加双蒸水补至10μL，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

用引物扩增猪基因组DNA得到了635bp特异性扩增片段(详见图4)，序列分析结果表明在144bp处存在C144-T144突变，并导致HinP1I多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中T是没有形成酶切位点的等位基因，C是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型其中AA型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有635bp一条DNA带)，BB型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现492bp和143bp两条DNA带)，AB为杂合型(电泳检测时出现635bp、492bp和143bp三条DNA带)。(三)PCR-HinP1I-RFLP多态性在各猪品种中的分布情况的检测的应用

利用PCR-HinP1I-RFLP检测了六个猪种：其中属于中国地方血缘的猪种分别是二花脸猪，通城猪，大花白猪，属于外来的例如欧美血缘的猪种分别是长白猪，大白猪和杜洛克猪。该突变位点在不同猪种中的基因型和基因频率如表1所示，结果显示在地方猪种中等位基因A占优势，在国外猪种中等位基因G占优势。

表1：几个猪品种中BCL10基因144位点多态性的基因型和基因频率

品种

个体数

基因型

等位基因频率

TT(AA)

TC(AB)

CC(BB)

T(A)

C(B)

二花脸猪通城猪大花白猪长白猪大白猪杜洛克猪

223541173132

004250

1316111911

2132214721

0.0230.0430.2930.4410.4680.172

0.9770.9570.7070.5590.5320.828

x²检验六个猪种间基因型频率差异性发现，几个猪种间基因频率差异不显著

实施例2

实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪(为国外猪种血缘)，父母代为17头长白猪公猪和36头长白猪母猪，子一代长白猪共302头仔猪，父母代及子代全部进行了基因型检测，子代在0、17、32日龄采集抗凝血和非抗凝血，采用常规方法对血常规和抗体水平进行检测。

所分析的性状主要是免疫性状，包括猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析BCL10基因SNPs位点的基因型效应及其与免疫指标的关系：

Y＝Xβ+Zγ+e

其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括性别效应、胎次效应、线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；γ为所有随机效应参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS(Version 8.1)软件中MIXEDMODELS程序进行数据处理与统计分析。

对猪BCL10基因外显子III多态性位点基因型检测结果表明在355个个体中AA(TT)基因型有50个，AB(TC)基因型有131个，BB(CC)基因型有174个。所分析的免疫性状有：猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬病毒抗体水平及血常规18项，分别对302头仔猪在0、17、32三个日龄进行检测。所得到的相关性状是0日龄的平均RBC体积、中间白细胞(％)及中间白细胞绝对值，17日龄的红细胞总数，32日龄的红细胞数和血红蛋白含量。结果见表2-7。

表2：BCL10基因外显子III多态性位点基因型与0日龄部分免疫性状的关联分析检测

免疫性状(0日龄)	BCL10exon3	免疫性状(0日龄)	BCL10exon3	免疫性状(0日龄)	BCL10exon3
						猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)抗体猪瘟抗体伪狂犬抗体白细胞总数红细胞总数血红蛋白含量红细胞压积	0.24640.27330.52520.36200.43940.80680.6918	平均RBC体积平均HGB量平均HGB浓度血小板淋巴细胞(％)中间白细胞(％)中性粒细胞(％)	0.0442*0.14230.69170.29070.53670.0201*0.8286	淋巴细胞绝对值中间白细胞绝对值中性粒细胞绝对值RBC分布宽度PLT分布宽度血小板体积大血小板比率	0.56070.0132*0.23380.33700.29470.12110.2406

^*表示差异显著，P＜0.05；^**表示差异极显著P＜0.01(以下表格中同)

由表2可知：BCL10基因外显子III的SNP位点对0日龄的平均RBC体积、中间白细胞(％)及中间白细胞绝对值有显著影响(p＜0.05)，此位点对其它免疫性状没有显著影响。

对平均RBC体积、中间白细胞(％)及中间白细胞绝对值有显著影响的BCL10基因外显子III中SNP位点基因型的最小二乘均数见表3：

表3SNPs位点(BCL10)基因型0日龄平均RBC体积、中间白细胞(％)及中间白细胞绝对值的最小二乘均数

基因型	平均RBC体积	中间白细胞(％)	中间白细胞绝对值
				AAABBBP值	79.9635±1.188579.9071±1.014978.4780±1.01070.0442*	13.6417±1.275510.8932±0.63360.0201*	1.2500±0.21960.7379±0.10910.0132*

AA-ABAA-BBAB-BB

0.94150.08520.0155*

0.0201*

0.0132*

由表3可知，BB基因型的平均RBC体积显著低于AB基因型(p＜0.05)和AA基因型(p略大于0.05)，AA基因型的平均RBC体积最高。BB基因型的中间白细胞百分比及中间白细胞绝对值均显著低于AB基因型(p＜0.05)。因此B等位基因(C等位基因)是猪0日龄的平均RBC体积、中间白细胞(％)及中间白细胞绝对值的有利标记。

表4：BCL10基因外显子III多态性位点基因型与17日龄部分免疫性状的关联分析检测

免疫性状(17日龄)

BCL10exon3

免疫性状(17日龄)

BCL10exon3

免疫性状(17日龄)

BCL10exon3

猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)抗体猪瘟抗体伪狂犬抗体白细胞总数红细胞总数血红蛋白含量红细胞压积

0.08010.22840.21810.95190.0481*0.17940.0821

平均RBC体积平均HGB量平均HGB浓度血小板淋巴细胞(％)中间白细胞(％)中性粒细胞(％)

0.49840.25710.43520.72190.1816

淋巴细胞绝对值中间白细胞绝对值中性粒细胞绝对值RBC分布宽度PLT分布宽度血小板体积大血小板比率

0.30080.65570.73230.96750.9379

由表4可知：BCL10基因外显子III的SNP位点对17日龄的红细胞总数有显著影响(p＜0.05)，此位点与其他免疫性状没有达到显著水平。

对红细胞总数有显著影响的BCL10基因外显子III中SNP位点基因型的最小二乘均数见表5：

表5：SNP位点(BCL10)17日龄红细胞总数的最小二乘均数

基因型	红细胞总数(RBC)
		AAABBBpr＞|t|AA-ABAA-BBAB-BB	4.7620±0.14474.8890±0.10685.0578±0.10130.0481*0.29870.0253*0.0561

由表5可知，BB基因型的红细胞数显著高于AA基因型(p＜0.05)和AB基因型(p约等于0.05)。因此B等位基因是17日龄的红细胞总数的有利标记。

表6：BCL10基因外显子III多态性位点基因型与32日龄部分免疫性状的关联分析检测

免疫性状(32日龄)

BCL10exon3

免疫性状(32日龄)

BCL10exon3

免疫性状(32日龄)

BCL10exon3

猪繁殖与呼吸综合征(蓝耳病)抗体猪瘟抗体伪狂犬抗体白细胞总数红细胞总数血红蛋白含量红细胞压积

0.88790.16210.47230.62870.0019**0.0035**0.4963

平均RBC体积平均HGB量平均HGB浓度血小板淋巴细胞(％)中间白细胞(％)中性粒细胞(％)

0.14250.52080.30750.08790.3936

淋巴细胞绝对值中间白细胞绝对值中性粒细胞绝对值RBC分布宽度PLT分布宽度血小板体积大血小板比率

0.50740.33310.66800.70570.7937

由表6可知：BCL10基因外显子III的SNP位点对32日龄的红细胞数和血红蛋白含量有极显著影响(p＜0.01)，此位点与其他免疫性状没有达到显著水平。

对红细胞数和血红蛋白含量显著影响的BCL10基因外显子III中SNP位点基因型的最小二乘均数见表7：

表7SNPs位点(BCL10)基因型32日龄红细胞总数和血红蛋白含量的最小二乘均数

基因型	红细胞(RBC)数	血红蛋白含量
			AAABBBpr＞|t|AA-ABAA-BBAB-BB	6.0912±0.15516.3772±0.11146.5803±0.10420.0019**0.02780.0006**0.0285*	116.52±3.9308117.93±2.7885125.40±2.55560.0035**0.67920.0143*0.0019**

由表7可知，BB基因型的红细胞数极显著高于AA基因型(p＜0.01)和显著高于AB基因型(p＜0.05)，而血红蛋白含量绝对值显著高于AA基因型(p＜0.05)和极显著高于AB基因型(p＜0.01)。因此B等位基因是猪32日龄的红细胞数和血红蛋白含量的有利标记。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记的克隆及应用

<130>

<141>2008-01-09

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1113

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>mRNA

<222>(1)..(1113)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1090)..(1113)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(79)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(782)..(1113)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(80)..(781)

<223>

<400>1

gaggccgaag cccccagcct gggcggggcg gcgcaccccg agcgcggacc cggaaggagc  60

gccgtccccc gcctccgcc atg gag ccc gcc gcg ccg tcc ctg acc gag gag   112

Met Glu Pro Ala Ala Pro Ser Leu Thr Glu Glu

1           5                       10

gac ctg acc gaa gtg aag aag gac gct tta gaa aat ttg cgt gtg tac    160

Asp Leu Thr Glu Val Lys Lys Asp Ala Leu Glu Asn Leu Arg Val Tyr

15                  20                   25

ctg tgt gaa aaa atc ata gct gag aga cat ttt gat cat tta cgt gca    208

Leu Cys Glu Lys Ile Ile Ala Glu Arg His Phe Asp His Leu Arg Ala

30              35                      40

aaa aaa ata ctc agt aga gaa gac acc gaa gaa att tcc tgc cga aca    256

Lys Lys Ile Leu Ser Arg Glu Asp Thr Glu Glu Ile Ser Cys Arg Thr

45                  50                  55

tca agt aga aaa agg gct gga aaa ttg tta gac tac tta caa gaa aac    304

Ser Ser Arg Lys Arg Ala Gly Lys Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Asn

60                  65                  70                  75

ccc aaa gga ctg gat acc ctg gtc gaa tct att cgg cga gaa aaa aca    352

Pro Lys Gly Leu Asp Thr Leu Val Glu Ser Ile Arg Arg Glu Lys Thr

80                  85                  90

cag aac ttt ctg ata cag aag att aca gat gaa gta ctg aaa ctt aga    400

Gln Asn Phe Leu Ile Gln Lys Ile Thr Asp Glu Val Leu Lys Leu Arg

95                  100                 105

aat ata aaa cta gaa cac ctg aaa gga ctg aaa tgc agc agc tgt gag    448

Asn Ile Lys Leu Glu His Leu Lys Gly Leu Lys Cys Ser Ser Cys Glu

110                 115                 120

cct ttc cca gat ggc gcc acc agc aac ctc ccc agg tca aat tca gag    496

Pro Phe Pro Asp Gly Ala Thr Ser Asn Leu Pro Arg Ser Asn Ser Glu

125                 130                 135

gag agt aat ttc tct gac aaa ctg aga gca tcc act gtc atc tac cat    544

Glu Ser Asn Phe Ser Asp Lys Leu Arg Ala Ser Thr Val Ile Tyr His

140                 145                 150                 155

ccg gaa gga gaa tcc agc acg gcc ccc ttt ttt tcg act gat tcc tct    592

Pro Glu Gly Glu Ser Ser Thr Ala Pro Phe Phe Ser Thr Asp Ser Ser

160                 165                 170

ctg aat ttg ccc gtt ctg gaa gtg ggc agg act gaa cac ccc acc ttc    640

Leu Asn Leu Pro Val Leu Glu Val Gly Arg Thr Glu His Pro Thr Phe

175                 180                 185

tct tca acg acg ctg ccc aga cct gga gac ccg ggg gcg cct cct ttg    688

Ser Ser Thr Thr Leu Pro Arg Pro Gly Asp Pro Gly Ala Pro Pro Leu

190                 195                 200

cca ccg gag ctg cgc tta gaa gaa gaa gga acc tgt gga aac tcc agc    736

Pro Pro Glu Leu Arg Leu Glu Glu Glu Gly Thr Cys Gly Asn Ser Ser

205                 210                  215

gag atg ttt ctc ccc ctg aga tca cgt gct ctt ttg cgg caa tga        781

Glu Met Phe Leu Pro Leu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Arg Gln

220                 225                     230

cagctgacta cctttttctt tatttttgat gatgaccaga aaatgtgatt gataaaatat  841

agcatcatgt aaagttgctg gagtgactta ctaacttttg atacacgtcc ctttagcacg  901

ccatgtaagc atactttgta aatagactct tttagaataa aagaagcatc cttttagata  961

gctaacgtca gtcatgttga tcatgggctt ttcagtattt tgtattctca gttttaaggt  1021

aatttagtat gttcactttt tttttagtga tttaagacta acagagaaca tttctccact  1081

tgagaatagt cgtggctggg aagagtgttt ct                                1113

<210>2

<211>233

<212>PRT

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

Met Glu Pro Ala Ala Pro Ser Leu Thr Glu Glu Asp Leu Thr Glu Val

1               5                   10                  15

Lys Lys Asp Ala Leu Glu Asn Leu Arg Val Tyr Leu Cys Glu Lys Ile

20                  25                  30

Ile Ala Glu Arg His Phe Asp His Leu Arg Ala Lys Lys Ile Leu Ser

35                  40                  45

Arg Glu Asp Thr Glu Glu Ile Ser Cys Arg Thr Ser Ser Arg Lys Arg

50              55                      60

Ala Gly Lys Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Asn Pro Lys Gly Leu Asp

65                  70                  75                  80

Thr Leu Val Glu Ser Ile Arg Arg Glu Lys Thr Gln Asn Phe Leu Ile

85                  90                  95

Gln Lys Ile Thr Asp Glu Val Leu Lys Leu Arg Asn Ile Lys Leu Glu

100                 105                 110

His Leu Lys Gly Leu Lys Cys Ser Ser Cys Glu Pro Phe Pro Asp Gly

115                 120                 125

Ala Thr Ser Asn Leu Pro Arg Ser Asn Ser Glu Glu Ser Asn Phe Ser

130                 135                 140

Asp Lys Leu Arg Ala Ser Thr Val Ile Tyr His Pro Glu Gly Glu Ser

145                 150                 155                 160

Ser Thr Ala Pro Phe Phe Ser Thr Asp Ser Ser Leu Asn Leu Pro Val

165                 170                 175

Leu Glu Val Gly Arg Thr Glu His Pro Thr Phe Ser Ser Thr Thr Leu

180                 185                 190

Pro Arg Pro Gly Asp Pro Gly Ala Pro Pro Leu Pro Pro Glu Leu Arg

195                 200                 205

Leu Glu Glu Glu Gly Thr Cys Gly Asn Ser Ser Glu Met Phe Leu Pro

210                 215                 220

Leu Arg Ser Arg Ala Leu Leu Arg Gln

225                 230

<210>3

<211>635

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(635)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(614)..(635)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(22)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(144)..(144)

<223>

<400>3

gaatagtcgt ggctgggaag agtgtttctt tgtgcattgt gctaataagt ttcacagtct    60

aatagtccct tctgacgtcc agcggtcccc ccggggatga agctgttcgt attcagtggt    120

aaagccaatc tctttgggaa cagygccagt gagctgaatc ctttccccac tcagcgggac    180

ccacgggcac atgcagggcc accttgtagt tcagaggagc aagtagtgga gtttgaccaa    240

aagataacaa tttgccaaaa tacatttcct attaaatctt acaaatttat tctactttaa    300

gatgttcata ttttttgctt tattattttc attcctaaag aaaaatcttg aaataacctt    360

aagttattac atataatttg aggggacttt taaacatact ttttctgtac ttttctttat    420

cccttttaat gactactgta cagttgaaat aattagaaca aaattgtgtg ggtatgagac    480

agttctgctt ctaatactgt ttggaacaaa tgggccattg aagtagattt gtctttttgt    540

tctataacaa agtttgacta atttttacac atttataaac ctgctttcat tgttttcatt    600

aaattataat tctgcctatt tcctgccatc tgtct                               635

Claims (5)

1.一种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，序列表SEQ ID NO：3所示序列的第144位碱基处有一个C144-T144的碱基突变，导致RFLP-HinP1I多态性。

3.检测权利要求2所述碱基突变的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：5’-GAATAGTCGTGGCTGGGAAGAG-3’，

反向引物：5′-AGACAGATGGCAGGAAATAGGC-3′。

4.一种如权利要求1或2所述的分子标记的制备方法，其特征按照以下步骤：

用人BCL10基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；根据与猪BCL10基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物，提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

5.权利要求1或2所述的分子标记在猪分子标记辅助选择中的应用。

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