CN1715419A - 猪免疫性状相关基因psmc5的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与猪免疫性状相关基因PSMC5突变位点的检测方法及其在猪遗传育种技术领域作为辅助选择的应用。克隆了猪免疫性状相关基因PSMC5的部分基因序列，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该序列全长为966bp，其中包含如附图2所述的部分外显子5，完整的外显子6，7和部分的外显子8的序列。在第120位碱基处有一个碱基突变(120T－120C)，导致MunI－RFLP多态性；在第309位碱基处有一个碱基突变(309T－309G)，导致SacI－RFLP多态性。应用本发明分别对原产于中国地方猪种和欧洲的血统的猪种进行了相关检测，肯定了本发明用于猪遗传辅助选择的效果。本发明还提出了制备上述基因和用于检测应用的方法。

Description

猪免疫性状相关基因PSMC5的克隆及其应用

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体地说涉及猪的与免疫性状相关基因PSMC5的突变位点检测方法，建立适用于猪免疫性状的分子标记的方法。

背景技术

近10年以来，现代育种技术使猪的生产性能(生长，胴体与肉质性状)得到了显著的改良，而对猪健康及抵抗疾病能力的遗传改良却重视不够。随着人民生活水平的提高，畜牧生产中在重视生产性状的同时对畜禽的健康，抗病力的提高也越来越重视，因为健康并充满活力的猪将大大降低生产成本、减少用药量及产品的药物残留，提高市场竞争力。

个体免疫力是衡量动物健康的重要指标(Knapp等，Relationships between genetics changes andinfections disease in domestic livestock，(eds.Hill W G，Bishop S C，McGuirk B.，)brit.Soc AnimSci.，Edinburgh Occasional publication no.27，65-80.2000)，它属于数量性状，其中涉及相关基因较多，分子机制很复杂。免疫力与生产性能通常表现为表型负相关关系，这为育种工作者提出了一个大的难题，即如何在保持和提高生产性能的基础上同时提高个体免疫能力是育种工作者研究的新课题。不过，最近国外少量研究表明猪免疫能力与生产性能的关系是双向的，某种情况下即正常状态免疫能力的增强能提高猪的生长速度，饲料效率等主要生产性能，而单纯针对生产性能的选择却导致猪免疫能力下降即相关等位基因的丢失或频率的降低。但是，目前二者的相互关系仍然不是很明了，从基因组水平揭示出生产性能和免疫力的控制基因体系间的具体关系，是解决上述难题的有效途径。在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。

肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔猪泻痢的主要病原体之一(施启顺，猪肠毒素大肠杆菌抗性基因及抗病育种。第11次全国动物遗传育种学术会议论文集，中国农业出版社，2001，229-333)，研究表明动物体内如果缺乏大肠杆菌K88受体或F18受体，就会对相应的血清型大肠杆菌引起的腹泻产生抗性，目前编码大肠杆菌K88受体(K88abR和K88acR)的基因已经定位在猪13号染色体上靠近转铁蛋白基因的位置(Edfors-Lilja等，The porcine intestinal receptor forEscherichia coli K88ab，K88ac：regional localization on chromosome 13and influenve of IgGresponse to the K88 antigen.Anim Genet，1997，26：237-242)，α-(1，2)-海藻糖转移酶1(α(1，2)fucosyltransferase，FUT1)基因是F18受体(ECF18R)的候选基因，位于猪6号染色体上(Meijerink等，Two α(1，2)fucosyltransferase genes on porcine chromosome 6q11 are closely linked to theblood group inhibitor(s)and Escherichia coli F18 receptor(ECF18R)loci.MammGenome，1997，8：736-741)。

此外，MHC已经被证明与抗体对多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关(Peelman等，A detail physical map of the porcine major histocompatibilitycomplex(MHC)class III region：comparison with human and mouse MHC class III regions.Mamm Genome，1996，7：363-367)，其它有研究的与抗病力有关的基因是MX1(Myxovirus(influenza)resistance 1，粘液病毒(流感)抗性因子1)、NRAMP1(Natural resistance-associated macrophage protein 1，与巨噬细胞有关的天然抗性蛋白1)，IL1(Interleukins 1，白细胞介素1)、PPARG(Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因。

Rothschild实验室长期从事猪第7号染色体着丝粒附近的主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibility complex，MC)基因单倍型与猪初生重、断奶重、生长速度、背膘厚等性状有关等性状的研究，他们认为MHC基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(Rothschild MF，Identification ofquantitative trait loci and interesting candidate genes in the pig：progress and prospects.Proc6th WCGALP 1998，26：403-409)。

PSMC5基因编码PA700蛋白酶体激活因子PSMC5亚基。PSMC5亚基属于26S蛋白酶体亚基家族，在泛素-蛋白酶体的蛋白水解途径中，也在MHCI类分子介导的抗原提呈中起着非常重要的作用。

人的PSMC5基因，也就是甲状腺激素受体互作蛋白基因(TRIP1，thryoid hormonereceptor-interacting protein)，它的组织结构和表达已有研究报道(Lee等，Two classes of proteinsdependent on either the presence or absence of thyroid hormone for interaction with the thyroidhormone receptor.Molec Endocr.1995；9：243-254.)。人和小鼠PSMC5基因的cDNA全长已被克隆和测序。在PSMC5基因有11个外显子，12个内含子组成。用荧光原位杂交的方法将人的PSMC5基因定位在HAS17q24-25(Hoyle J等，Localization of genes encoding two human one-domain members of the AAAfamily：PSMC5(the thyroid receptor-interacting protein，TRIP1)and PSMC3(the tat-bindingprotein，TBP1).Hum Genet 1997；99：285-8.)，而Tanahashi等却将人的PSMC5基因定位HAS17q23.1-23.3(Tanahashi等，Chromosomal localization and immunological analysis of a family of human 26Sproteasomal ATPase.Biochem.And Biophys.Research communications 1998：243：229-32)。

用RH克隆板扩增猪的PSMC5的基因组DNA片段，猪的PSMC5基因被定位在猪12q14(Wang等，Mappingof genes encoding four ATPase and three non-ATPase components of the pig 26S proteasome.AnimGenet.2003：34：393-395)。

PSMC5基因除了参与泛素-蛋白酶体途径的蛋白水解，还参与其他的代谢途径。但是PSMC5基因的功能研究还不是很透彻，研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以我们对这个基因的最大的外显子进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它的功能。

发明内容：

本发明的目的在于克隆猪PSMC5基因的部分基因组DNA序列，寻找PSMC5基因的突变位点以及基因多态性的检测方法，建立适用于猪免疫性状的分子标记的方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种猪免疫性状相关基因PSMC5，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述：。

PCR扩增的PSMC5基因序列全长为966bp，其中包含如附图2所示的部分外显子5，完整的外显子6，7和部分的外显子8的序列。

在序列表SEQ ID NO：1的第120位碱基处有一个碱基突变(120T-120C)，导致MunI-RFLP多态性；

在序列表SEQ ID NO：1的第309位碱基处有一个碱基突变(309T-309G)，导致SacI-RFLP多态性。

检测120T-120C和309T-309G碱基处碱基突变的正、反向引物的DNA序列如下所示：

5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，

5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)

一种筛选猪免疫性状的分子标记的方法，按照以下步骤制备：

用人PSMC5基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；根据与人PSMC5基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物；从猪血液基因组提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

应用PCR-RFLP的方法检测猪PSMC5基因120T-120C和309T-309G的多态性，并初步进行其基因型与猪的部分免疫性状之间的关联分析。本发明为猪的分子育种提供了两个新的分子标记。

依照本发明，所述的猪免疫性状相关基因PSMC5可以应用在猪标记辅助选择中。

以下对本发明详细细节作进一步的描述：

1.PSMC5基因部分DNA序列的克隆

(1)引物设计：

用人PSMC5基因cDNA(GenBank收录号：NM_002805)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计扩增引物。序列如下：

5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，

5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)

(2)PCR产物的纯化、克隆和测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml Resin，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30~50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

连接反应：将纯化RACE产物与pGEM-T载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl2×buffer，0.5μl的T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16~20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3~0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10~15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4，000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100~120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3~4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

质粒的小量制备：挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mMTris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II[0.2M NaOH，1％SDS]200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III[5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H2O28.5ml]150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚：氯仿：异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。

重组质粒的酶切鉴定：取3μl质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为15μl，加入2-3U限制性内酶EcoR I及2μl相应的10X限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。

(3)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

2.PCR-RFLP诊断方法建立

(1)引物序列：5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，

             5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)

该引物扩增片段长度966bp。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物3~5μl，限制性内切酶MunI或SacI为0.3μl(3U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

3、标记性状关联分析

在利用申请人组建的湖北省通城猪群做性状关联分析，96个DNA样品用于基因型检测。

所分析的性状有部分免疫性状，部分生产性能，部分肉质性状。申请人建立了如下最小二乘模型：

y_ijk＝μ+GENOTYPE_i+SEX_j+COMBINATION_k+ε_ijk，

其中，y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPE_i为基因型效应，SEX_j为性别效应，COMBINATION_k为组合的效应，ε_ijk为随机误差，假定服从N(0，σ²)分布。

本发明的效果

1、猪PSMC5基因部分DNA序列的克隆

PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR产物的长度为966bp。其中包括部分外显子5，完整的外显子6，7和部分的外显子8的序列。所涉及的完整的内含子5，6，7序列均符合GT-AG规则。

2、PCR-RFLP诊断方法建立

用引物扩增猪基因组DNA得到了966bp特异性扩增片段，该序列包括部分外显子5和部分外显子8序列以及完整的内含子5，6，7的DNA序列(详见图2)。

序列分析结果表明在120bp处存在1个MunI酶切位点(C↓AATTG)，该基因座由两个等位基因控制，C等位基因只有966bp一个片段，T等位基因有117bp+849bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型CC，CT，TT(见图3)。

序列分析结果表明在309bp处存在1个SacI酶切位点(GAGCT↓C)，该基因座由两个等位基因控制，G等位基因只有966bp一个片段，C等位基因有308bp+658bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型CC，CG，GG(见图4)。

3、标记性状关联分析

3.1猪PSMC5基因MunI-RFLP多态性与免疫性状及部分生产性状之间的关联分析

对猪PSMC5基因MunI-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在91个个体中TT基因型有6个，TC基因

表1：不同PSMC5基因第六外显子MunI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	T细胞比例	血红蛋白浓度	背膘厚(mm)	6-7肋间背膘厚(mm)	肉色
						TTTCCCTT-TCTT-CCTC-CC	80.633±3.77083.094±1.99977.966±1.0360.5340.5110.035*	111.311±7.88194.330±4.20598.216±2.2980.041*0.1270.446	3.471±0.2623.410±0.1513.629±0.0810.8250.2110.022*	3.500±0.3083.405±0.1774.218±0.0950.7700.034*0.000**	2.663±0.2753.066±0.1583.197±0.0850.034*0.007**0.285

型有22个个体，CC基因型有63个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有免疫性状，部分生产性状和肉质性状。不同基因型之间性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)总结于表1。其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。

由表1可知，TC基因型的T细胞百分比显著高于CC基因型(p＜0.05)，而前者的平均背膘厚却显著地低于后者(P＜0.05)。与此相同的是，杂合基因型的猪的6-7肋骨处背膘厚度也是极显著的低于CC型(P＜0.001)。可见，在这三个性状上，有明显的杂合效应。对HGB来说，TT基因型组合要显著的高于TC组合。TT型猪的肉色极显著地低于CC基因型的猪(P＜0.01)，显著地低于杂合型的猪(P＜0.05)。

3.2 猪PSMC5基因SacI-RFLP多态性与免疫性状及部分生产性状之间的关联分析

对猪PSMC5基因SacII-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在92个个体中GG基因型有13个，GC基因型有55个个体，CC基因型有24个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有免疫性状，部分生产性状和肉质性状。不同基因型之间性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)

表2：不同PSMC5基因第六外显子SacI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析总结于表1。其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。

基因型	T细胞比例	初生重(kg)	背膘厚(mm)	6-7肋间背膘厚(mm)	肉色
						GGGCCCGG-GCGG-CCGC-CC	79.932±2.27877.364±1.09682.853±0.17360.3150.3320.011*	0.934±0.0571.128±0.0281.105±0.0420.04*0.024*0.648	3.758±0.1813.800±0.0883.406±0.1330.8330.1390.016*	4.177±0.2264.075±0.1103.604±0.1670.6890.0540.022*	3.187±0.1263.211±0.0612.922±0.0930.8640.1100.012*

由表2可知，GC基因型的T细胞百分比显著高于CC基因型(P＜0.05)，而前者的平均背膘厚却显著地低于后者(P＜0.05)。与此相同的是，杂合基因型的猪的6-7肋骨处背膘厚度也是极显著的低于CC型(P＜0.05)。而且，对初生重来说，GC基因型要显著的高于GG组合(P＜0.05)。 GC型猪的肉色极显著地高于CC基因型的猪(P＜0.05)。可见，在这几个性状上，都具有明显的杂合效应。

序列表、附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪免疫性状相关基因PSMC5的DNA序列；

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是猪PSMC5基因部分DNA序列。大写字母分别为外显子5，6，7，8。小写字母分别为内含子5，6，7。5’-和3’拼接位点的两个保守核苷酸(GT/AG)用黑体标出，引物的位置用方框显示(在提供的序列表1中已经明确指出了内含子和引物的确切位置)。

图3：MunI-RFLP的示意图。

图4：SacI-RFLP的示意图。

具体实施方式

实施例1

PCR-RFLP-MunI多态性在6个猪品种中的分布情况

(1)引物序列：5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，

             5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)

(2)PCR扩增条件：PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。扩增程序：94℃ 4min，然后循环35次94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测条件：酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 10μl，PCR产物3～5μl，限制性内切酶MunI为0.3μl(3U)，用H₂O补足10μl，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

表3  PCR-RFLP-MunI多态性在3个猪品种中的分布

品种	个体数	基因型			等位基因频率
							CC	CT	TT	C	T
		梅山藏猪二花脸	52746	3213	1749	3234						0.77880.42850.1630	0.22120.57150.8370

根据表3的基因型和基因频率的结果显示，在所检测的3个猪品种中，”梅山猪”是A等位基因占优势，”藏猪”和”二花脸”都是B等位基因占优势。

实施例2：

对猪PSMC5基因MunI-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在91个个体中TT基因型有6个，TC基因型有22个个体，CC基因型有63个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有免疫性状，部分生产性状和肉质性状。不同基因型之间性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)总结于表1。其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。

表4  不同PSMC5基因第六外显子MunI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	T细胞比例	血红蛋白浓度	背膘厚(mm)	6-7肋间背膘厚(mm)	肉色
						TTTCCCTT-TCTT-CCTC-CC	80.633±3.77083.094±1.99977.966±1.0360.5340.5110.035*	111.311±7.88194.330±4.20598.216±2.2980.041*0.1270.446	3.471±0.2623.410±0.1513.629±0.0810.8250.2110.022*	3.500±0.3083.405±0.1774.218±0.0950.7700.034*0.000**	2.663±0.2753.066±0.1583.197±0.0850.034*0.007**0.285

由表4可知，TC基因型的T细胞百分比显著高于CC基因型(P＜0.05)，而前者的平均背膘厚却显著地低于后者(P＜0.05)。与此相同的是，杂合基因型的猪的6-7肋骨处背膘厚度也是极显著的低于CC型(P＜0.001)。可见，在这三个性状上，有明显的杂合效应。对HGB来说，TT基因型组合要显著的高于TC组合。TT型猪的肉色极显著地低于CC基因型的猪(P＜0.01)，显著地低于杂合型的猪(P＜0.05)。

实施例3：PCR-RFLP-MunI多态性在清平猪，杜洛克和大白猪的分布

表5  PCR-RFLP-MunI多态性在清平猪，杜洛克和大白猪的分布

品种	个体数	基因型			等位基因频率
							CC	CT	TT	C	T
		清平猪杜洛克大白	181419	000	3210	16129						0.08300.07140.2632	0.91700.92860.7368

根据表5的基因型和基因频率的结果显示，在所检测的3个猪品种中都是B等位基因占优势。

实施例4

PSMC5基因MunI酶切多态与部分性状的关联分析

在下半年的通城杂交群体中，对PSMC5基因的MunI酶切产生的三种基因型与猪部分生产性能、部分肉质性状和部分生理指标进行最小二乘方差分析，发现6-7肋间背膘厚在三种基因型之间有极显著的差异(P＜0.01)，三点平均背膘厚和平均血细胞容积在三种基因型之间有显著的差异(P＜0.05)，屠宰率在三种基因型之间有差异的趋势(P＜0.1)，如表6所示。CC基因型个体的6-7肋间背膘厚和三点平均背膘厚极显著地高于CT基因型的个体(P＜0.01)，但其平均血细胞容积却极显著地低于CT基因型的个体(P＜0.01)。TT基因型个体的屠宰率显著地高于CT基因型的个体(P＜0.05)。

        表6.PSMC5基因MunI酶切多态性对部分性状的影响

基因型genotype	个体数(No.)a	6、7肋间背膘厚(mm)	平均背膘厚(mm)	平均血细胞容积	屠宰率(％)
						MunI-CCCTTTP值CC-CTCC-TTCT-TT	110,12318,185,4	3.4257±0.0582.461±0.1832.647±0.3＜0.0001**0.0123*0.5262	3.29±0.052.794±0.162.93±0.2610.0039**0.18070.5928	57.269±0.29559.940±0.97257.024±1.7620.0098**0.89140.0987	75.887±0.17474.981±0.55476.975±0.9060.12430.24240.026*

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01

^a个体数均为2列，前列为计算生产性状的个体数，后列为计算免疫性状的个体数。

实施例5：

PCR-RFLP-SacI多态性在中国血统猪种”小梅山”，”二花脸”，”清平猪”，欧洲血统猪种”杜洛克”和”大白猪”中的分布情况

           表7  PCR-RFLP-SacI多态性在5个猪品种中的分布

	个体数	基因型			等位基因频率
							GG	GC	CC	G	C
		小梅山二花脸清平猪杜洛克大白猪	4955202431	10154	0151416	485414511						0.02040.00910.17500.50.3871	0.97960.99090.82500.50.6129

这5个猪种中，除了杜洛克是G等位基因和C等位基因各占50％以外，其它都是C等位基因占优势。

实施例6：

不同PSMC5基因第六外显子SaeI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

    表8  不同PSMC5基因第六外显子SacI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	T细胞比例	初生重(kg)	背膘厚(mm)	6-7肋间背膘厚(mm)	肉色
						GGGCCCGG-GCGG-CCGC-CC	79.932±2.27877.364±1.09682.853±0.17360.3150.3320.011*	0.934±0.0571.128±0.0281.105±0.0420.04*0.024*0.648	3.758±0.1813.800±0.0883.406±0.1330.8330.1390.016*	4.177±0.2264.075±0.1103.604±0.1670.6890.0540.022*	3.187±0.1263.211±0.0612.922±0.0930.8640.1100.012*

由表8可知，GC基因型的T细胞百分比显著高于CC基因型(P＜0.05)，而前者的平均背膘厚却显著地低于后者(P＜0.05)。与此相同的是，杂合基因型的猪的6-7肋骨处背膘厚度也是极显著的低于CC型(P＜0.05)。而且，对初生重来说，GC基因型要显著的高于GG组合(P＜0.05)。GC型猪的肉色极显著地高于CC基因型的猪(P＜0.05)。可见，在这几个性状上，都具有明显的杂合效应。

实施例7

PSMC5基因SacI酶切多态与部分性状的关联分析

在另一组通城猪杂交群体实验中，对PSMC5基因的SacI酶切产生的三种基因型与猪部分生产性能、部分肉质性状和部分生理指标进行最小二乘方差分析，发现达上市体重的日龄、6-7肋间背膘厚在三种基因型之间的差异接近显著水平(P＜0.1)，三点平均背膘厚在三种基因型之间有极显著的差异(P＜0.01)，板油率在三种基因型之间有显著差异(P＜0.05)，如表所示。CC基因型个体的达上市日龄显著地高于GC基因型的个体(P＜0.05)，然而，其6、7肋间背膘厚却显著地低于GC基因型的个体(P＜0.05)，特别是其三点平均背膘厚，极显著地低于GC基因型的个体(P＜0.01)。而且CC基因型个体的板油率也显著地低于GC基因型的个体(P＜0.05)。

        表9.PSMC5基因SacI酶切多态性对部分生产性状的影响

基因型genotype	个体数(No.)	达90kg(75kg)日龄数(天)	6、7肋间背膘厚(mm)	平均背膘厚(mm)	板油率(％)
						PSMC5-SacI CCGCGGP值CC-GCCC-GGGC-GG	346138	196.358±3.645187.496±2.586191.073±3.1430.0270*0.30380.4172	3.093±0.1263.42±0.093.34±0.1090.0186*0.17440.5771	2.997±0.1013.374±0.0723.205±0.0870.0009**0.14650.1708	2.883±0.1583.315±0.1123.015±0.1360.0129*0.34040.2482

^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01；^*Indicate P＜0.05；^**Indicate P＜0.01

猪免疫性状相关基因PSMC5序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>华中农业大学

<120>猪免疫性状相关基因PSMC5的克隆及其应用

<130>

<141>2004-06-07

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>966

<212>DNA

<213>猪(Sus serofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(966)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(309)..(309)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(120)..(120)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(947)..(966)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(636)..(829)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(340)..(608)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(29)..(108)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(830)..(966)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(609)..(635)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(109)..(339)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(1)..(28)

<223>

<400>1

cgt gga caa gaa cat cga cat caa tga t gtgagtgcag caggtgaggt           48

Arg Gly Gln Glu His Arg His Gln

1               5

tgggagtggg ggggtcagct ctcaccatgc cccatcctaa aactctcttc tctcgcccag    108

gt  gac acc caa ttg ccg ggt ggc tct cag aaa tga tag cta cac ttt      155

Cys Asp Thr Gln Leu Pro Gly Gly Ser Gln Lys         Leu His Phe

    10                  15                          20

gca caa gat cct gcc caa caa ggt aga ccc act ggt gtc act gat gat      203

Ala Gln Asp Pro Ala Gln Gln Gly Arg Pro Thr Gly Val Thr Asp Asp

        25                  30                  35

ggt gga gaa agt gcc aga ttc aac tta cga gat gat tgg tgg act gga      251

Gly Gly Glu Ser Ala Arg Phe Asn Leu Arg Asp Asp Trp Trp Thr Gly

    40                  45                  50

caa gca gat caa gga gat caa aga agt gat cga gct gcc cgt gaa gca      299

Gln Ala Asp Gln Gly Asp Gln Arg Ser Asp Arg Ala Ala Arg Glu Ala

55                  60                  65                  70

tcc tga gct ctt tga agc gct ggg cat tgc aca gcc caa g gtgagccggg     349

Ser     Ala Leu     Ser Ala Gly His Cys Thr Ala Gln

                        75                  80

cgtctctggg agggccgagc aggtgttggg gtagactggc gcctgccgaa gctggccctc    409

cttgtgcaca ggggctgtgg cagagatgct gccagggcag cgactggttt ggatgtaagg    469

cccagagggg accttgacat tcattttttg tatgtctggc gtctagcaca ggatctagga    529

cggtacagac actcagtaaa tattcactga atgacatggg ggacggcttt ttgccctgag    589

tcctgccatt gctctctag gg  agt gct gct ata cgg acc ccc agg c           635

                     Gly Ser Ala Ala Ile Arg Thr Pro Arg

                                 85                  90

actgggaaga cactgctggc ccgagctgtg gcccatcata cagactgcac ctttattcgc    695

gtctctggct ctgagctggt acagaaattc attggggaag gtaagtggcc agaagcgaaa    755

agactaagcc caagggggtc gggggagagg gagagggagc ttatcagctc aatgccagct    815

tggcctctgc acag gg  gca agg atg gtg agg gag ctg ttt gtc atg gcc      864

                Arg Ala Arg Met Val Arg Glu Leu Phe Val Met Ala

                                95                  100

cga gaa cac gct cca tct atc atc ttc atg gac gaa atc gac tcc att      912

Arg Glu His Ala Pro Ser Ile Ile Phe Met Asp Glu Ile Asp Ser Ile

        105                 110                 115

ggc tcc tcg cgg ctg gaa ggg ggc tct gga ggg gac agt gaa gtc cag      960

Gly Ser Ser Arg Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Glu Val Gln

    120                 125                 130

cgc acg                                                              966

Arg Thr

135

Claims (7)

1、一种猪免疫性状相关基因PSMC5，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述：。

2.、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：PCR扩增的序列全长为966bp，其中包含如附图2所示的部分外显子5，完整的外显子6，7和部分的外显子8的序列。

3、根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于：序列表SEQ ID NO：1的第120位碱基处有一个碱基突变(120T-120C)，导致MunI-RFLP多态性；

4、根据权利要求1所述的DNA序列，其特征在于：序列表SEQ ID NO：1的第309位碱基处有一个碱基突变(309T-309G)，导致SacI-RFLP多态性。

5.权利要求1所述的基因，检测120T-120C和309T-309G碱基处碱基突变的正、反向引物的DNA序列如下所示：

5’-CGTGGACAAGAACATCGACA-3’(正向)，

5’-CGTGCGCTGGACTTCACTGT-3’(反向)

6、一种筛选猪免疫性状的分子标记的方法，按照以下步骤：

用人PSMC5基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后对EST进行拼接；根据与人PSMC5基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物；从猪血液基因组提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

7、权利要求1-6任一项所述的猪免疫性状相关基因PSMC5在猪标记辅助选择中的应用。

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