CN101235419B - 一种猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记rnase6的克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与免疫性状相关的分子标记及应用。所述的分子标记由RNASE6基因克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQID NO：3所述。在序列表SEQID NO：3的第296bp处有一个C296-T296的碱基突变，导致MspI-RFLP多态性。本发明还公开了扩增RNASE6基因第2外显子所用的引物以及用于多态性检测方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

一种猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记RNASE6的克隆及应用 

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体地说涉及一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记的克隆及应用。 

背景技术

作为农业大国，畜禽的养殖特别是猪的养殖在我国畜牧业中占有举足轻重的地位。随着人们对猪肉消费的增加以及对猪肉品质要求不断的提高，促使人们对猪的遗传育种改良主要集中于生产性状。随着生产集约化程度的不断提高以及饲养条件的改变，近几年不断爆发的大范围疾病流行，表明疾病已成为制约我国的畜牧业发展的重要因素。疾病尤其是病毒性传染病严重的影响着猪的健康和生产，导致猪的死亡、生产效率降低、医药费用增加等一系列问题，最终造成养猪业的巨大经济损失；它甚至会严重影响和降低猪的遗传育种进程。 

随着遗传学的不断发展，人们已将分子标记技术应用于畜禽抗病育种方面，旨在解决、提高动物机体对病原的抗性，并且确定了一些与猪疾病抗性有关的候选基因及主效基因。 

跨越7号染色体着丝粒的猪淋巴细胞抗原(SLA)复合体(Smith T P等.Directed integration of thephysical and genetic linkage maps of the swine chromosome 7 reveals that SLA spans the centromere.Genome Research，1995，5：259-271)即猪主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility complex，MHC)是一组与免疫应答和抗病性密切相关的基因家族，在宿主的免疫反应中，对细菌、病毒、寄生虫的遗传控制有重要作用。一些学者对SLA单倍型或等位基因与免疫应答、抗病性的关系进行了研究：Rothschild M F等(Rothschild M F等.The setrogen receptor locus is associated with a major geneinfluencing litter size in pigs[J].Proc Natl A cad Sci，1996，93：201-205)发现微型猪单倍型SLAa/a对感染支气管败血性波氏杆菌高反应存在关联；Hruban V等(Hruban V等.Presence of specific MHChaplotype in melanoblstomabearing minipigs.Animal Genetics，1994，25(supp1.2，C1))则观察到SLA I等位基因与恶性黑色素瘤的出现存在关联。 

位于猪15号染色体q2.3-2.6的NRAMP1基因(Sun H S等.  Mapping of the naturalresistance-associated macrophage protein 1(NRAMP1)gene to pig chromosome 15.Animal Genetics，1998，29：138-140)属于天然抗性相关的巨噬蛋白基因家族，Guolong Zhang等(Guolong Zhang等.Cloningof Porcine NRAMP1 and Its Induction by Lipopolysaccharide，Tumor Necrosis Factor Alpha andInterleukin-1β：Role of CD14 and Mitogen-Activated Protein Kinases[J].infection and immunity，2003，3：1086-1093)通过对猪NRAMP1基因的mRNA表达研究发现其在细胞核特异性组织中都可表达，但在巨噬细胞中表达量最高，推测其可能通过消耗含有胞内病原生物的吞噬体中二价金属离子如镁、亚铁、锌等离子使病原微生物缺乏增殖必需的离子而达到抵抗胞内微生物的作用。Kramer J等(Kramer J等. Association of twelve candidate gene polymorphisms and response to challenge with Salmonellaenteritidis in poultry.Anim Genet，2003，34：339-348)发现NRAMP1等位基因与鸡沙门氏菌感染反应存在关联。 

干扰素(interferon，IFN)作为机体最重要的细胞因子之一，因其具有广谱抗病毒、免疫调节与增强功能及其它生物活性而被人们广泛研究。体外重组β-干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒的感染(曹瑞兵等.猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究[J].中国病毒学，2004，19(4)：364-368)；体内注射猪瘟疫苗和干扰素可增强对猪瘟病毒的防御能力(Suradhat S等.Thecorrelation of virus-specific interferon-gamma production and protection against classical swinefever virus infection.Vet Immunol Immunopathol，2001，83(3-4)：177-189)。 

RNASE6(Ribonuclease 6)属于核糖核酸酶A超家族，它们具有相似的初级结构和酶活性。人RNASED6在多数体细胞组织中表达，且是单拷贝的基因(Rosenberg H F等.Eosinophil cationic protein andeosinophil-derived neurotoxin：Evolution of novel function in a primate ribonuclease gene family.J Biol Chem，1995，270(50)：30234)。Helene F等(Helene F等.Molecular cloning and characterizationof a novel human ribonuclease(RNASEk6)：increasing diversity in the enlarging ribonuclease genefamily.Nucleic Acids Res，1996，24(18)：3507-3513)对人RNAE6进行了分子鉴定，并揭示了其重组蛋白的免疫活性和核糖核酸酶活性。人RNAE6在人单核细胞和中性粒细胞有表达，但在嗜酸性粒细胞未检测到其mRNA的表达，推测其与宿主防御有关。Kimberly D D等(kimberly D D等.Isolation，Characterization，and Evolutionary Divergence of Mouse RNASE 6：Evidence for Unusual Evolutionin Rodents.J Mol Evol，2004，59：657-665)将鼠RNASE6定位于鼠14号染色体；并对啮齿类RNAE6基因的进化进行了分析，发现其在啮齿类动物中序列较为保守，也有可能有利于宿主防御。 

发明内容

本发明的目的在于从RNASE6基因中克隆一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记及其在猪标记辅助选择关联分析上的应用。 

本发明通过以下技术实现： 

申请人从报道基因RNASE6中克隆得到与猪免疫性状相关基因的DNA片段，它的cDNA序列如序列表SEQID NO：1和附图2所述(该序列包括全部CDS和部分5’-UTR、3’-UTR)。它的部分DNA序列如序列表SEQID NO：3和附图3所述。序列表SEQ ID NO：3的第296 bp处有一个C296-T296的碱基突变，导致MspI-RFLP多态性。这个碱基突变位于RNASE6基因第2外显子中，但不改变其翻译的氨基酸序列。 

申请人设计了一对克隆猪免疫性状相关基因RNASE6的引物，该引物的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。与此同时申请人克隆了扩增RNASE6基因第2外显子所用的引物，该引物的DNA序列如SEQ ID NO：3所示。 

本发明所述的分子标记的制备方法是： 

用人RNASE6基因mRNA(GenBank收录号：NM_005615.2)为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性70％以上的表达序列标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；与人同源比对，根据表达序列标签-重叠群 设计引物；以成年通城猪胃组织提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增、PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列(包括全部CDS和部分5’-UTR、3’-UTR)；提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。 

应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：3所示的第296位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪部分免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。 

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪免疫性状相关基因RNASE6的部分cDNA序列； 

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的猪免疫性状相关基因RNASE6编码的蛋白质序列； 

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的猪免疫性状相关基因RNASE6的部分DNA序列； 

图1：是本发明技术流程图； 

图2：是本发明中猪RNASE6基因cDNA序列(包括全部CDS和部分5’-UTR、3’-UTR)，图中起始密码子和终止密码子用标有下划线的斜体显述，引物序列用斜体加粗及阴影显述； 

图3：是本发明中猪RNASE6基因DNA序列，图中突变位点用标有下划线的4号加粗斜体显述，引物序列用斜体加粗及阴影显述； 

图4：是本发明中猪RNASE6基因基因组扩增电泳结果，图中M：DL2000； 

图5：是本发明中猪RNASE6基因第2外显子的MspI-RFLP的三种基因型(TT TC CC)电泳结果，图中M：DL2000； 

图6：是本发明中猪RNASE6基因反向测序发现的C-T突变。 

具体实施方式

实施例1： 

(一)猪RNASE6基因的CDS克隆及部分DNA序列扩增 

(1)引物设计： 

以报道的人RNAE6基因mRNA(GenBank收录号：NM_005615.2)为信息探针，利用NCBI网站中的BLAST工具扫描GenBank猪表达序列标签数据库，将同源性大于70％、片段长度大于100bp的猪的表达序列标签全部下载到电脑上，然后用生物学软件DNAStar中的SeqMan程序将猪RNAE6基因的表达序列标签拼接成表达序列标签-重叠群。根据与人RNAE6基因mRNA的同源比对初步确定起始及终止密码子位置，利用生物学引物设计软件Primer Premier 5.0，以拼接的表达序列标签-重叠群作为引物设计的模板序列设计引物，引物序列如下： 

RNASE6 CDS：正向5’CCAGGACTAACTGCTGCTTC 3’， 

反向5’CTCCAGTCCAACCTCCTCAT 3’。 

该引物的DNA序列扩增片段长度为665bp。 

(2)反转录PCR扩增反应： 

利用TRIzoL试剂盒(购自美国GIBCO公司)从成年“通城猪”(一种具有中国地方猪血缘的地方猪种)胃组织中提取总RNA，具体操作方法参照TRIzoL试剂盒说明书进行。 

cDNA第一链的的合成：反应总体积为50μl，首先将总RNA 2μg与oligod(T)₁₁4μl，随机引物1μl，DEPC水9μl混合于一离心管中，70℃变性5min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级结构的重新生成，经短暂离心后加入M-MLV 1.5μl，5×buffer 10μl，dNTP 2.5μl，RNASE抑制剂1μl和DEPC水20μl，于42℃温育1h后将温度升至95℃灭活反转录酶，置于-20℃保存备用。 

PCR反应：反应总体积为10μl，其中猪cDNA模板0.5μl，双蒸水6.9μl，buffer 1μl，Mg²⁺0.6μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.2μl(1U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸25s，最后72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。 

(3)PCR产物的纯化、克隆和测序 

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(新长江)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是按照100mg胶块加入400μl GS Buffer的比例加入GS Buffer，置50℃温育10min，使琼脂糖胶块完全溶化，每两分钟颠倒混匀一次；将溶化的胶液转入到离心吸附柱，并将离心吸附柱置于废液收集管中，10000rpm离心30s，弃去废液；将离心吸附柱置回废液收集管中，加入500μl Wash Buffer于离心吸附柱中，10000rpm离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μl Wash Buffer溶液洗涤一次；将离心吸附柱置会废液收集管中，最高速度离心1min；小心取出离心吸附柱，将其套入一个无菌的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30μl双蒸水，室温静置2-10min后，最高速度离心1min；取出离心吸附柱，将1.5ml离心管(DNA溶液)置于-20℃保存备用。 

连接反应：将纯化PCR产物与pMD18-T载体(购自takara公司)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括Solution I 2.5μl，pMD18-T 0.5μl，纯化PCR产物2μl，4℃过夜。 

感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5 α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD₆₀₀达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出，冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4000rpm离心10min，弃去培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/l的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4000rpm离心10min，用4ml冰预冷的0.1mol/l的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。 

转化：无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml离心管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动离心管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。 

序列测定策略是采用克隆测序方法。克隆测序是挑取单个阳性克隆子用于测序，序列测定由北京奥科公司完成，每个基因片段至少测两个克隆子。 

(4)DNA序列同源性检索鉴定： 

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information.http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。 

(二)PCR-RFLP诊断方法建立 

(1)引物序列 

RNASE6 SNP：正向：5’TATTGCTGCTGGGACTGT 3’， 

反向：5’GGGAACAAACGGATAAGG 3’。 

该引物扩增片段长度404bp。 

(2)PCR扩增条件 

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.12μl，10×buffer 1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.08μl(5U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环4次94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s；循环4次94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s；循环28次94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。 

(3)RFLP检测 

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物3μl，双蒸水5.85μl，1×buffer Tango 1μl，限制性内切酶MspI为0.15μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。 

用引物扩增猪基因组DNA得到了404bp特异性扩增片段，测序结果发现该片段在第296位发现一个C-T转换，位于外显子2中(如图6所示)，造成一个MspI酶切位点(C

CGG)，其中第295bp处为多态性酶切位点。酶切产生三种基因型，TT基因型只有404bp一条带，CC基因型有295bp和109bp两条带，杂合子TC基因型有404bp，295bp和109bp的三条带，如图5所述。 

实施例2： 

利用PCR-MspI-RFLP检测了7个不同中外猪品种：其中具有国外猪血缘的猪种分别是长白猪、大白猪和杜洛克猪，具有中国地方猪血缘的猪种分别是清平猪、二花脸猪、大花白猪和玉山黑猪。该突变位点在不同猪种中的基因型和基因频率如表1所示，结果显示RNASE6基因各基因型在长白猪、大白猪和二花脸猪都有分布，杜洛克猪和清平猪中没有检测到TT基因型，大花白猪和玉山黑猪没有检测到CC基因型。χ² 检验7个不同中外猪品种间基因型频率差异如表2所示，结果显示7个不同品种间基因频率分布存在着一定的差异。 

表1  不同猪品种中RNASE6基因MspI多态性的基因型和基因频率 

表2不同猪品种中RNASE6基因MspI多态性基因频率的χ²检验结果 

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。χ² _0.05(12)＝21.02607，χ² _0.01(12)＝26.21697。 

实施例3： 

利用PCR-MspI-RFLP检测了广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的“长白猪”群(一种具有国外猪血缘的猪种)，猪群的基因型频率、基因频率、香农指数和χ²检验P值如表3所示，结果显示RNASE6基因各基因型在长白猪种均有分布，CC基因型数最少，TT基因型数最多，长白猪是T等位基因占优势；RNASE6基因的香农指数较高，该广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群的多样性较大；对该基因进行Hardy-Weinberg平衡定律适合性检验，结果表明：在长白猪群中RNASE6基因的基因型和基因频率的分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。 

表3本发明的PCR-MspI-RFLP多态性在长白猪中的分布 

实施例4： 

本实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司水台原种猪场的长白猪群，父母代及子一代全部进行了基因型检测，子代在0、17、32日龄采集抗凝血和非抗凝血，用于血常规和抗体水平检测。

所分析的性状主要是免疫性状，包括：子一代猪分别在0、17、32三个日龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项指标。根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析RNASE6基因SNP位点的基因型效应及其与免疫指标的关系： 

Y＝Xβ+Zγ+e 

其中Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括性别效应、胎次效应、线别效应、候选基因的基因型效应；Z为混合模型中的随机效应的关联矩阵；γ为所有随机效应参数向量，包括公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应；采用SAS(Version 8.0)软件中MIXED MODELS程序进行数据处理与统计分析。 

对猪RNASE6基因第2外显子MspI-RFLP多态性位点与部分免疫性状进行关联分析，由表7可知：在295个个体中TT基因型有174个，TC基因型有98个，CC基因型有23个。所分析的免疫性状主要是子一代猪分别在0、17、32三个日龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体水平、猪瘟病毒抗体水平、伪狂犬抗体水平及血常规18项指标，不同基因型之间性状差异显著性的结果如表4-6所示，所得到相关的性状是0日龄平均红细胞体积、0日龄平均血红蛋白量和0日龄中性粒细胞如表4所示。 

表4 RNASE6基因第2外显子多态性位点基因型与0日龄部分免疫性状的关联分析检测 

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。 

表5 RNASE6基因第2外显子多态性位点基因型与17日龄部分免疫性状的关联分析检测 

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。 

表6 RNASE6基因第2外显子多态性位点基因型与32日龄部分免疫性状的关联分析检测 

注：^**表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。 

由表4-6可知，RNASE6基因第2外显子的SNP位点对0日龄平均红细胞体积和0日龄平均血红蛋白量有极显著影响(P＜0.01)，对0日龄中性粒细胞有显著影响(P＜0.05)，此位点对其它免疫性状没有显著影响。 

对0日龄平均红细胞体积和0日龄平均血红蛋白量有极显著影响(P＜0.01)，对0日龄中性粒细胞有显著影响(P＜0.05)的RNASE6基因第2外显子的SNP位点基因型的最小二乘均数如表7所示。 

表7 SNP位点(RNASE6)基因型0日龄平均红细胞体积、0日龄平均血红蛋白量和0日龄中性粒细胞的最小二乘均数 

注：^**7表示P＜0.01，^*表示P＜0.05。 

由表7可知，TC基因型个体的0日龄平均红细胞体积显著高于TT基因型(P＜0.05)；CC基因型个体的0日龄平均红细胞体积、0日龄平均血红蛋白量和0日龄中性粒细胞极显著高于TT基因型(P＜0.01)；CC基因型个体的0日龄平均红细胞体积极显著高于TC基因型(P＜0.01)，而CC基因型个体的0日龄平均血红蛋白量和0日龄中性粒细胞显著高于TC基因型(P＜0.05)。因此，C等位基因是0日龄平均红细胞体积、0日龄平均血红蛋白量和0日龄中性粒细胞的有利等位基因。 

血常规的检测不仅有利于动物正常生长和生存，而且有助于改进饲养与管理和预防疾病的发生。平均血红蛋白量即平均单个红细胞血红蛋白量，与每升血液中血红蛋白量呈正比。平均血红蛋白量越高，那么血红蛋白量也越高，机体的循环和免疫系统的功能越强，对疾病的抵抗能力越大(程泽信等.家猪与家野杂交猪血液中八项指标的比较分析.湖北农业科学，2007，46(3)：419-421)。有关报道中平均血红蛋白量与平均红细胞体积呈极显著正相关，而平均红细胞体积与白细胞数呈显著正相关(刘榜等.通城猪及其杂种猪若干免疫性状的研究.华中农业大学学报，2003，22(5)：469-473)。中性粒细胞亦属于白细胞。在血液、淋巴组织、脾等组织中均存在有白细胞，其通过吞噬作用对机体损伤治愈、抗御病原入侵和疾病免疫方面起着重要的作用。当血常规中的平均红细胞体积、平均血红蛋白量和中性粒细胞越高，那么白细胞数也越高表明机体对于疾病的抵抗力越强。 

序列表 

<110>华中农业大学 

<120>一种猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分子标记RNASE6的克隆及应用 

<130> 

<141>2008-01-14 

<160>3 

<170>PatentIn version 3.1 

<210>1 

<211>665 

<212>DNA 

<213>猪(Sus scrofa) 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(665) 

<223> 

<220> 

<221>3’UTR 

<222>(522)..(665) 

<223> 

<220> 

<221>5’UTR 

<222>(1)..(59) 

<223> 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(646)..(665) 

<223> 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(20) 

<223> 

<220> 

<221>CDS 

<222>(60).. (521) 

<223> 

<400>1 

ccaggactaa ctgctgcttc tcttctcagc gggaacccca gcgtggagac ctgagaaaa     59 

atg ggg cca gat ctg aga tgc ttt cct ctc ctc cta ttg ctg ctg gga      107 

Met Gly Pro Asp Leu Arg Cys Phe Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly 

1               5                   10                  15 

ctg tgg tgg tca gtg cgt cca ctt tgt gcc ata ccc aag aat ctc acc      155 

Leu Trp Trp Ser Val Arg Pro Leu Cys Ala Ile Pro Lys Asn Leu Thr 

            20                  25                  30 

agg gct caa tgg ttt aca att cag cat att cag cca agc cct ctc caa      203 

Arg Ala Gln Trp Phe Thr Ile Gln His Ile Gln Pro Ser Pro Leu Gln 

        35                  40                  45 

tgc aac aag gca atg aac agt gtc aac aat tat act tgg cac tgt aag      251 

Cys Asn Lys Ala Met Asn Ser Val Asn Asn Tyr Thr Trp His Cys Lys 

    50                  55                  60 

cct caa aac acc ttt ctg cac gac tcc ttc cag gat gtg gcc act gcc      299 

Pro Gln Asn Thr Phe Leu His Asp Ser Phe Gln Asp Val Ala Thr Ala 

65                  70                  75                  80 

tgt aat tta ccc aac atc acc tgt aag aac ggc cag aac aac tgc cac      347 

Cys Asn Leu Pro Asn Ile Thr Cys Lys Asn Gly Gln Asn Asn Cys His 

                85                  90                  95 

cag agt gca aag cct gtt agc ctg act cag tgc agt ttc act ggg ggg      395 

Gln Ser Ala Lys Pro Val Ser Leu Thr Gln Cys Ser Phe Thr Gly Gly 

            100                 105                 110 

aac tat ccg aac tgc cgc tac aaa gat gcc gcc caa tac aag ttc ttt      443 

Asn Tyr Pro Asn Cys Arg Tyr Lys Asp Ala Ala Gln Tyr Lys Phe Phe 

        115                 120                 125 

att gtt gcc tgt gat ccc ccg cag aag ggc gac cct cct tat ccg ttt      491 

Ile Val Ala Cys Asp Pro Pro Gln Lys Gly Asp Pro Pro Tyr Pro Phe 

    130                 135                 140 

gtt ccc gta cac tta gat aag atc att taa agtttccatc actttccctc        541 

Val Pro Val His Leu Asp Lys Ile Ile 

145                 150 

tcactcagct cgcgttctct tatgatctct tctgattttt cttttgttga ttttcctggt    601 

tcccatggaa gaaaaaaaag gagggtgttg gaaaaatcag agcgatgagg aggttggact    661 

ggag                                                                 665 

<210>2 

<211>153 

<212>PRT 

<213>猪(Sus scrofa) 

<400>2 

Met Gly Pro Asp Leu Arg Cys Phe Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly 

1               5                   10                  15 

Leu Trp Trp Ser Val Arg Pro Leu Cys Ala Ile Pro Lys Asn Leu Thr 

            20                  25                  30 

Arg Ala Gln Trp Phe Thr Ile Gln His Ile Gln Pro Ser Pro Leu Gln 

        35                  40                  45 

Cys Asn Lys Ala Met Asn Ser Val Asn Asn Tyr Thr Trp His Cys Lys 

    50                  55                  60 

Pro Gln Asn Thr Phe Leu His Asp Ser Phe Gln Asp Val Ala Thr Ala 

65                  70                  75                  80 

Cys Asn Leu Pro Asn Ile Thr Cys Lys Asn Gly Gln Asn Asn Cys His 

                85                  90                  95 

Gln Ser Ala Lys Pro Val Ser Leu Thr Gln Cys Ser Phe Thr Gly Gly 

            100                 105                 110 

Asn Tyr Pro Asn Cys Arg Tyr Lys Asp Ala Ala Gln Tyr Lys Phe Phe 

        115                 120                 125 

Ile Val Ala Cys Asp Pro Pro Gln Lys Gly Asp Pro Pro Tyr Pro Phe 

    130                 135                 140 

Val Pro Val His Leu Asp Lys Ile Ile 

145                 150 

<210>3 

<211>404 

<212>DNA 

<213>猪(Sus scrofa) 

<220> 

<221>gene 

<222>(1)..(404) 

<223> 

<220> 

<221>exon 

<222>(1)..(404) 

<223> 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(387)..(404) 

<223> 

<220> 

<221>primer_bind 

<222>(1)..(18) 

<223> 

<220> 

<221>mutation 

<222>(296)..(296) 

<223> 

<400>3 

tat tgc tgc tgg gac tgt ggt ggt cag tgc gtc cac ttt gtg cca tac       48 

Tyr Cys Cys Trp Asp Cys Gly Gly Gln Cys Val His Phe Val Pro Tyr 

1               5                   10                  15 

cca aga atc tca cca ggg ctc aat ggt tta caa ttc agc ata ttc agc       96 

Pro Arg Ile Ser Pro Gly Leu Asn Gly Leu Gln Phe Ser Ile Phe Ser 

            20                  25                  30 

caa gcc ctc tcc aat gca aca agg caa tga acg gtg tca aca att ata       144 

Gln Ala Leu Ser Asn Ala Thr Arg Gln     Thr Val Ser Thr Ile Ile 

        35                  40                      45 

ctt ggc act gta agc ctc aaa aca cct ttc tgc acg act cct tcc agg      192 

Leu Gly Thr Val Ser Leu Lys Thr Pro Phe Cys Thr Thr Pro Ser Arg 

        50                  55                  60 

atg tgg cca ctg cct gta att tac cca aca tca cct gta aga acg gcc      240 

Met Trp Pro Leu Pro Val Ile Tyr Pro Thr Ser Pro Val Arg Thr Ala 

    65                  70                  75 

aga aca act gcc acc aga gtg caa agc ctg tta gcc tga ctc agt gca      288 

Arg Thr Thr Ala Thr Arg Val Gln Ser Leu Leu Ala     Leu Ser Ala 

80                  85                  90 

gtt tca cyg ggg gga act atc cga act gcc gct aca aag atg ccg ccc      336 

Val Ser Xaa Gly Gly Thr Ile Arg Thr Ala Ala Thr Lys Met Pro Pro 

95                  100                 105                 110 

aat aca agt tct tta ttg ttg cct gtg atc ccc cgc aga agg gcg acc      384 

Asn Thr Ser Ser Leu Leu Leu Pro Val Ile Pro Arg Arg Arg Ala Thr 

                115                 120             125 

ctc ctt atc cgt ttg ttc cc                                           404 

Leu Leu Ile Arg Leu Phe 

            130 

Claims (5)

1.一种作为猪标记辅助选择应用的与猪免疫性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所述。

2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于：序列表SEQ ID NO：3的第296bp处有一个C296-T296的碱基突变，导致MspI-RFLP多态性，所述的碱基突变位于RNASE6基因的第2外显子中。

3.根据权利要求2所述的分子标记，其中扩增RNASE6基因第2外显子所用的引物序列如下所示：

正向：5’TATTGCTGCTGGGACTGT 3’，

反向：5’GGGAACAAACGGATAAGG 3’。

4.权利要求1或2所述的分子标记在猪辅助选择育种中的应用。

5.一种权利要求1或2所述的分子标记的制备方法，其特征在于按照以下步骤：

用人RNASE6基因mRNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性70％以上的表达序列标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；根据表达序列标签-重叠群设计引物，所述的引物序列如下所示：正向：5’CCAGGACTAACTGCTGCTTC 3’，反向：5’CTCCAGTCCAACCTCCTCAT3’；从成年通城猪胃组织提取总RNA，再通过RT-PCR扩增得到目的片段，获得如序列表SEQID NO：1所述的cDNA序列；以该cDNA序列为模板设计引物，所述的引物序列如下：正向：5’TATTGCTGCTGGGACTGT 3’，反向：5’GGGAACAAACGGATAAGG 3’，从猪耳组织中提取的基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：3所述的核苷酸序列。

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