CN100425703C - 与鸡产蛋量相关的mhc b-lb基因pcr-rflp标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，涉及一种利用分子生物学技术检测鸡的产蛋量的方法。更具体地说，本发明建立了一种利用鸡MHC B-LB基因的PCR-RFLP多态性对鸡的产蛋性能进行检测技术及其应用。本发明还涉及到一种用于检测与鸡产蛋量的试剂盒。其主要步骤包括：从鸡血液或组织中提取基因组DNA、设计引物、获得MHC B-LB基因部分序列，然后进行PCR产物克隆测序、BsuR I-RFLP多态性检测、RFLP多态性与产蛋量的关联分析，这些结果证实了BPR等位基因的存在与鸡产蛋量之间有显著关联。本发明还公开了用于扩增MHC B-LB基因片段特定序列的一对引物，以及该基因片段的所有的碱基突变位点和BsuR I-RFLP多态性在检测鸡产蛋量上的应用，本发明为鸡的标记辅助选择提供了有用的分子标记。

Description

与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体地说，涉及利用鸡MHC B-LB基因的PCR-RFLP多态性与鸡的产蛋量相关联性能进行检测的方法，本发明还涉及到与鸡的产蛋性相关联的DNA序列以及应用该关联基因制备的检测诊断试剂盒。

背景技术

近年来，国内外学者对鸡遗传标记与生产性能的关系进行了大量的研究。合适的遗传标记对于开展标记辅助选择，实行早期选种，提高选种准确性和选育效率以及加速遗传进展具有特别重要的意义。

产蛋量既是鸡的最重要生产性状之一，又是衡量其繁殖力的重要指标。国内外的许多新培育品种或品系，通过常规育种方法(如个体选择和家系选择等)，在产蛋量性状上均得到了大幅度选育提高。但由于鸡的产蛋量遗传力很低，只有0.09～0.27(Besbes，B等，用简化的多性状动物模型最大似然法对蛋鸡产蛋性能遗传参数的估计.In：Proceedings 42^nd Annual Meeting European Association of Animal Production，Session IV，Berlin，Germany.Page 1-9.，1991)，表型选择的遗传改进效果缓慢，常常会造成大量人力，物力和财力消耗。此成为制约家禽育种工作开展的主要影响因素之一，并一直受到动物遗传育种工作者和研究者们的关注。随着分子生物技术的应用研究和发展，分子标记辅助选择(Marker assisted selection，MAS)在动物遗传育中的应用为显著地改良如鸡的产蛋量这类遗传力较低的生产性状提供了新途径。但要有效地利用分子标记辅助选择，必须对与鸡的产蛋性状相关的等位基因等进行研究。近几十年来，人们对此主要从如下两方面进行了大量研究。

一、关于血液蛋白多态性(等位酶)，即生化标记：

碱性磷酸酶(AKP)的多态性发现得较早。1965年Law和Munro发现AKP的变异型(Law，G.R.J.et al.1965.Science，149：1518)。AKP是一个位点上具有显隐性关系的一对等位基因(Ap²、Ap⁴)控制。Wilcox(1966)完成了分型工作，并将AKP分为移动快的(F)和慢的(S)两种带型(Wilcox，F.H.1966.genetics，53：799-805)。Shukla(1982)报道了白来航鸡AKP快慢两型间产蛋率无差异，AKP活力与产蛋率相关为-0.34(Shukla，R.K.1982，白来航鸡血清碱性磷酸酶水平及其与某些经济性状相关的研究.2^nd worldcongression on genetics applied to livestock production，813-818)。孙宪如等(1989)认为，快型(F)鸡产蛋力强于慢型鸡(孙宪如等，鸡血清碱性磷酸酶变化规律的研究，兽医大学学报，1989，9(3)：237-241)。吴伟(1991)指出，快型(F)和慢型(S)表型个体在生产能力方面具显著差异(吴伟，碱性磷酸酶同功酶与产蛋性能的关系，中国畜牧杂志，1991，27(1)：15-17)。

周勤等曾报道武定鸡农大I系血液蛋白多态性与生产性能之间存在着一定的相关效应，鸡血液Akp-1^s、酯酶Es-1^cc、淀粉酶Amy-1^AB对产蛋性能可能有促进作用(周勤等，武定鸡农大I系血液蛋白多态性与生产性能关系的研究，云南农业大学学报，2002，17(1)：33-38)。

尽管大量研究报道已表明，鸡血液蛋白多态性(等位酶)与其产蛋性能有着密切的相关，但由于缺乏大样本重复印证等原因，迄今，血液蛋白多态性(等位酶)作为一种重要的生化遗传标记能具体应用于家禽育种选育实践者实属少见。

二、关于DNA分子标记：

分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。与上述生化标记相比较，DNA分子标记具有许多明显的优越性，表现为：(1)直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受性别和时空限制，不存在表达与否等问题；(2)数量丰富，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；(3)多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；(4)表现为共显性标记特点，可以区别纯合子和杂合子；(5)表现为中性，不影响目标性状的表达；(6)可以解释家系内某些个体的遗传变异。

分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、DNA指纹技术(DNA Fingerprinting)、原位杂交(in situ hybridization)等；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性DNA标记(Randomamplification polymorphism DNA，RAPD)、简单序列重复标记(Simple sequence repeat，SSR)或简单序列长度多态性(Simple sequence length polymorphism，SSLP)，也称微卫星(Microsatellite)，扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、序列示踪位点(Sequencetagged sites，STS)、序列特征化扩增区域(Sequence charactered amplified region，SCAR)等；第三类是一些新型的分子标记，如：单核苷酸多态性(Single nuleotide polymorphism，SNP)、表达序列标签(Expressed sequences tags，EST)等，有些分子标记已被广泛用于畜禽标记辅助选择等方面。本发明是以鸡MHC为其产蛋性状的侯选基因进行研究的。

鸡主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)，又称B复合体，位于鸡的第16号染色体上，是由紧密连锁的高度多态的基因位点所组成的染色体上的一个遗传区域，它包括I类(B-F)，II类(B-LB)和IV类(B-G)基因，与核仁组织区(NOR)相连锁，具有高度的多态性和保守性(Pink，J.等，鸡主要组织相容性复合体的三位点模式.Immungenetics.5：203-216，1977.；Briles，W等，抗恶性肿瘤基因在主要组织相容性复合体(B)亚区的定位.Science.219：977-979，1983.；Guillemot，F.等，鸡主要组织相容性复合体II类β基因家族与I类基因和核仁组织区紧密连锁的分子图谱.EMBO Journal.7：2775-2785。1988)。早期对鸡MHC的研究，是从鸡的B血型系统开始的，通过血型标记把鸡的B血型系统分为39类血型因子，如B²、B¹³、B¹⁵、B¹⁹和B²¹等，广泛探讨了不同血型因子与免疫特性和生产性能间的关系。Nordskog等(1973)认为B²、B²¹型产蛋率和成活率最高，B¹型的较差(Nordskg，A等，白来航鸡B血型系统对成年鸡死亡率和产蛋量的影响.Genetics，75：181-189，1973)。后来，英国利用MHC B血型系统进行定向选育，培育出了具有B⁷血型因子繁殖力强的D系，具有B²、B¹⁴因子产蛋率高的M系。

对鸡MHC的大量研究表明，MHC不仅与鸡的抗病性和免疫应答有关，与鸡的生产性能也密切关联(Briles，W.等，鸡主要组织相容性复合体B在抗病性和易感性等位基因上的效应.Science.195：193-195，1977.；Lamont，S.等与鸡饲料转化率和产蛋性能相关的主要组织相容性复合体不同基因频率.Poul.Sci.66：819-8241，987.；Abplanal，H.等，主要组织相容性复合体不同单倍型纯系白来航鸡的繁殖性能.Poul.Sci.71：9-17，1992.)。Lamont(1996)、Lakshmana(1997)和Lgesias(2003)等以白来航鸡和肉鸡为实验材料，用单核苷酸链构象多态性标记(single-strand conformation polymorphism，SSCP)和限制性片段长度多态性标记(RFLP)方法对MHC(B-F、B-L和B-G)进行了遗传分型研究，并认为某些特定的基因型与鸡的产蛋性能相关(Lamont，S.等，与家禽数量性状相连锁的遗传标记.Anim.Genet.27：1-8，1996.；Lakshmana，L.等，鸡马立克氏病高抗性和高产蛋品系主要组织相容性复合体II类基因的多态性研究.Poul.Sci.76：1517-1523，1997.；Lglesias，G.等，考姆波罗斯(Comperos)肉鸡主要组织相容性复合体(B和Rfp-Y的遗传变异.Animal Genetics.34：88-95，2003)。

国内也有类似报道，以PCR-RFLP方法，用四种内切酶(HhaI、EcoRV、HaeIII、XbaI)对已知报道(Rima Zoorob等，鸡主要组织相容性复合体II类B基因(相连锁的等位基因和基因座)序列变异分析.Eur.J.Immunal，1993，23：1139-1145)的白来航鸡B12单倍型的主要组织相容性复合体B-LIIB序列进行分析来实现对丝羽乌骨鸡MHC的分型，结果表明，鸡MHC与其产蛋性能相关(欧阳建华等，中国泰和乌骨鸡MHC与其繁殖性能相关和研究，江西农业大学学报，2000，22(1)：98-101)。

但目前国内外对与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记的研究和应用上还是空白。

发明内容

本发明的目的在于寻找一种与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记方法，即，在体外检测MHC B-LB基因中限制性内切酶BsuR I PCR-RFLP(BPR)等位基因的存在。扩增、克隆鸡MHC B-LB基因第2外显子和内含子的特定片段(如序列表SEQ ID NO：3所示)，并对该基因片段进行限制性酶切，寻找其PCR-RFLP多态性及其与鸡产蛋量的相关。应用PCR-RFLP的方法检测鸡MHC B-LB基因的多态性，并根据其基因型，初步判断鸡的产蛋量。为鸡产蛋性状的分子标记辅助选择提供了一个新的遗传标记。同时本发明的目的还在于在体外检测诊断与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记方法，该方法在鸡产蛋量性状的检测方面，以及应用上述标记基因制备一种用于检测鸡产蛋量性状的试剂盒。

本发明通过以下技术方案实现：

这是一种与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记方法，其特征在于首先从鸡中提取的DNA，例如从鸡的全血或组织中提取DNA，通过测序和/或RFLP和凝胶电泳进行BPR等位基因的检测，优选的是通过RFLP和凝胶电泳，在体外检测MHC B-LB基因中限制性内切酶BsuR I PCR-RFLP(BPR)等位因的存在。

以上所述的检测方法主要还包括基因组DNA在检测前进行预扩增，经扩增的DNA片段含有MHCB-LB基因第二外显子、内含子和第三外显子的全部或部分序列，其长度为359bp。在扩增获得的MHC B-LB基因序列中存在27个碱基突变位点，其中第111位碱基处有一个碱基突变C111T，导致BsuR I PCR-RFLP多态性；其中第265位碱基处有一个G265碱基插入，导致了第265位碱基处内切酶BsuR I识别位点的消失，但没有导致该酶切位点的多态性(详细情况见序列表SEQ ID NO：3所示)。

这种与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记，关键含有如序列表SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的引物对。

申请人经过大量的生物学实验，已经证实应用上述方法可以应用于与鸡产蛋量性状相关联的遗传检测，其中，由BPR等位基因所产生的基因型AA型与高产蛋量有显著关联，AB和BB型与低产蛋量显著关联。

利用上述制备方法，申请人已经制成了用于检测与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP诊断试剂盒，该试剂盒至少包括了如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对，该试剂盒的组成如下：序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对的每种引物浓度为10μmol/L；1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas公司生产或者从商业上获得)；10m mol/LdNTP(从商业上获得)；10×buffer(MBIFermentas公司生产或者从商业上获得)；25m mol/L MgCl₂((从商业上获得))。

以上所述的一对引物对的DNA序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

本发明的具体技术方案是：

1、鸡MHC B-LB基因第2外显子和内含子的特定片段的扩增和克隆

(1)鸡基因组DNA的提取：

分别从8个中国地方品种鸡：藏鸡(263只)、狼山鸡(57只)、泰和乌骨鸡(46只)、固始鸡(24只)、仙居鸡(44只)、白耳鸡(33只)、满鸡(20只)和斗鸡(34只)翅静脉无菌采血，每只鸡采血约1ml，用10ml 10mmol/LEDTA(pH8.0)裂解液(含有10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和2％SDS)混合血样，按Briles等(1993)报道的基因组DNA提取方法进行(Briles，W.E.，R.W.Goto，C.Auffray and M.M.Miller.1993.与鸡主要组织相容性复合体相关而在遗传上独立的多态系统.Immunogenetics.37：408-414)。

(2)引物设计：

用GenBank收录的鸡的MHC B-LB DNA序列(GenBank收录号：M_26306)为信息，利用Primerpremier5.0(Microsoft Corp.)引物设计程序，根据该DNA序列特点设定待设计引物参数，最终设计并筛选特异引物序列(即所述的引物对)如下：

5’-GCAGAGTGCCACTACCTG-3’((正向引物)，

5’-GCCGAGACCCTCACCTTG-3’(反向引物)

(3)PCR反应条件：

PCR仪为PTC-100^TM(MJ Research，Inc)，反应总体积为20μl，其中鸡基因组DNA约50-60ng，1×buffer(MBI Fermentas)，1.5m mol/L MgCl₂，0.2m mol/L dNTP，每种引物浓度为0.1μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)。PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后95℃40s，59℃30s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸4min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)PCR扩增产物的纯化、克隆和测序：

PCR扩增产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mlEpendorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)，按试剂盒说明书对PCR产物进行纯化。具体步骤：在每300μl融化的凝胶中加入1ml清洗液(Resin液)，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过亲和层析柱(Minicolumn柱)挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml离心管(Ependorff管)中，加入30～50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，将DNA洗脱于Ependorff管中。

PCR产物的克隆、测序：

连接反应：将纯化过的PCR产物与pGEM-T载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl2×buffer，0.5μl T载体，0.5μl纯化PCR产物，0.5μl T₄连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD₆₀₀达到0.3～0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃去培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

质粒的小量制备：挑取平板上的单菌落，接种于2～3ml LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I[50m mol/L葡萄糖，25mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II[0.2mol/L NaOH，1％十二烷基磺酸钠贮存液(SDS)]200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III[5mol/L乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H₂O 28.5ml]150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE20μl。

重组质粒的酶切鉴定：取3μl质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为15μl，加入2～3U限制性内酶EcoR I及2μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1～2小时，取2～3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。

(4)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知基因进行序列同源性比较，以鉴定所获得的DNA序列。

2、PCR-RFLP方法的建立

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 2μl，PCR产物3μl，限制性内切酶BsuR I为0.5μl(5U)，双蒸水4.5μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，用凝胶成像系统(Syngene)拍照。

3、PCR试剂盒的制备(试剂盒组成、使用剂量及测定方法)

试剂盒的组成：(1)本发明的每种引物浓度为10μmol/L，(2)1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)，(3)10m mol/L dNTP，(4)10×buffer(MBI Fermentas)，(5)25m mol/L MgCl₂。

使用剂量和测定方法：每20μl反应体积需本发明的上、下游引物(10μmol/L)各0.2μl，(2)1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)，(3)10m mol/L dNTP 0.2μl，(4)10×buffer(MBI Fementas)2μl，(5)25m mol/LMgCl₂1.2μl。加双蒸水至19μl，再加1μl鸡基因组DNA混合均匀后，即可据前述的PCR反应条件进行PCR扩增。

4、标记性状关联分析

供试鸡来自中国西藏自治区一种地方鸡种-藏鸡的一个自然群(规模为207只藏鸡)，每只鸡采取一份DNA样品，共获得207个DNA样品用于基因型检测。

本发明的效果

1、鸡MHC B-LB基因片段的扩增、克隆

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物(如图1所示)。将PCR产物回收纯化后克隆测序，测序结果显示PCR产物长度为359bp。

将该片段DNA序列在GenBank中进行同源性检索，结果表明(如图2所示)，该片段每个引物序列与目的基因MHC DNA(GenBank收录号：M26306)完全一致，该PCR产物序列对应于目的基因的第2外显子(pos.317-563th)、第2内含子(pos.564-646th)和第3外显子的5′端的25个核苷酸序列(pos.647-671th)。且该片段359个核苷酸序列中在分别对应于目的基因限制性内切酶BsuRI两个识别位点(GG^CC)424-427th和577-580th上，有一个碱基发生转换，即¹¹¹C→T，因此产生一个内切酶BsuRI多态识别位点；在另一位点上有一个碱基插入，即G265插入，此引起该处内切酶BsuRI识别位点的消失。

2、PCR-RFLP诊断方法建立

用引物扩增鸡基因组DNA得到了359bp特异性扩增片段。序列分析结果表明在109bp处存在1个BsuRI酶切位点(GG^CC)，该基因座由两个等位基因控制，A等位基因只有359bp一个片段，B等位基因有250bp+109bp两个片段。这两个等位基因可组成三种基因型AA，AB，BB。

2、藏鸡的基因频率和基因型频率分析

表1：藏鸡的基因频率和基因型频率分布

从表1可见，在该西藏藏鸡群体中，尽管等位基因A和B的基因频率为中等，但在基因型频率分布上，AB基因型占优势，为主导等位基因，AA基因型和BB基因型频率较低。

4、标记性状关联分析对鸡MHCB-LB基因BsuRI-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在207个个体中AA基因型有19个，AB基因型有178个个体，BB基因型有10个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状是产蛋量(32周龄至54周龄累计161天的产蛋数)、蛋重和50周龄时的体重。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表1。关联分析结果表明(见表2)，AA基因型鸡的产蛋量极显著(P＜0.01)高于其它基因型，在蛋重和体重两性状上不同基因型间均无显著差异(P＞0.05)。

表2：鸡MHCB-LB基因BsuRI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

注：表中上标a表示相应基因型的性状值显著高于其它基因型的性状值(P＜0.01)，在其它性状的基因型间无显著差异(P＞0.05)，N为样本含量，M为平均观察值，S为标准差。

序列表、附图说明：

序列表SEQ ID NO：1是本发明用于进行PCR-RFLP检测鸡产蛋量MHC B-LB基因多态性的引物对中的正向引物序列；

序列表SEQ ID NO：2是本发明用于进行PCR-RFLP检测鸡产蛋量MHCB-LB基因多态性的引物对中的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明利用PCR-RFLP进行鸡产蛋量检测的MHCB-LB基因部分DNA序列。

图1：是本发明的技术流程图

图2：是用于进行PCR-RFLP检测鸡产蛋量MHC B-LB基因多态性的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图3：是该发明中PCR产物序列以及该序列中的27个新碱基突变(在这27个突变碱基中，24个出现在外显子，其中一个为C或T插入突变；另3个突变出现在内含子中，且均为插入突变)。图中下画线的片段为引物序列，*表示与基因库(GenBank accession number：M26306)序列一致的MHC B-LB基因的核苷酸，突变碱基用字母表示出，BsuR I内切酶识别位点中的突变碱基用方框表示。

具体实施方式

实施例1

鸡MHCB-LB基因PCR-RFLP-BsuRI多态性在3个中国地方鸡品种中的分布检测分析

(1)引物序列：5’-GCAGAGTGCCACTACCTG-3’(正向)，

             5’-GCCGAGACCCTCACCTTG-3’(反向)

(2)PCR扩增条件：PCR反应总体积为20μl，其中鸡基因组DNA约50-60ng，含1×buffer(MBI Fermentas)，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，每种引物浓度为0.1μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(MBI Fermentas)。PCR扩增程序：95℃预变性5min，然后95℃40s，59℃30s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸4min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测条件：PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 2μl，PCR产物3μl，限制性内切酶BsuRI为0.5μl(5U)，双蒸水4.5μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，用凝胶成像系统(Syngene)拍照。检测结果如表3所示：

表3PCR-RFLP-BsuRI多态性在3个鸡品种中的分布

根据表2的基因型和基因频率的结果显示，在所检测的3个鸡品种中，都是B等位基因占优势。

实施例2：

申请人用建立起的PCR-RFLP诊断方法，对一个藏鸡群(207只规模)的207份DNA样品进行MHC-B-L-RFLP-BsuRI的基因型检测。检测方法采用了如实施例1所述的操作步骤。

检测结果表明，在207个个体中AA基因型有19个，AB基因型有178个，BB基因型有10个个体。在与产蛋量的关联分析中，基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表4。关联分析结果表明，AA与AB基因型、AA与BB基因型鸡的产蛋量呈极显著差异(P＜0.01)，AB与BB基因型鸡的产蛋量间无显著差异(P＞0.05)。如表4所示：

表4：鸡MHC B-L基因BsuR I-RFLP基因型与产蛋量的关联分析

注：表中AA基因型鸡的产蛋量显著高于AB和BB基因型的产蛋量(P＜0.01)，在AB和BB基因型间的产蛋量无显著差异(P＞0.05)。

实施例3：

PCR-RFLP-BsuR I多态性在仙居鸡、固始鸡和泰和乌鸡的分布的检测分析。操作步骤应用了如实施例1所述的步骤，其结果如表5所示：

表5PCR-RFLP-BsuR I多态性在3个鸡品种中的分布

从表5可见，在仙居鸡、固始鸡和泰和乌鸡3个中国地方鸡种中，B等位基因占优势，为主导等位基因。

实施例4：

PCR-RFLP检测鸡MHC B-L基因的多态性及PCR-RFLP-BsuR I多态性在中国地方鸡种的分布检测分析。操作步骤应用了如实施例1所述的步骤，其结果如表6所示：

表6MHCB-L基因PCR-RFLP-BsuR I多态性及在5个鸡品种中的分布

在上述6个地方鸡种的自然群体中，A等位基因在斗鸡品种占优势，B等位基因在泰和乌鸡、狼山鸡和仙居鸡三个鸡品种中占优势，而在该西藏藏鸡群体中，等位基因A和B的基因频率为中等。

鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因序列表

<110>华中农业大学

<120>与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记

<130>

<141>2004-04-14

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>鸡(Gallus gallus)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(18)

<223>

<400>1

gca gag tgc cac tac ctg                               18

Ala Glu Cys His Tyr Leu

1               5

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>鸡(Gallus gallus)

<220>

<221>exon

<222>(1)..(18)

<223>

<400>2

gcc gag acc ctc acc ttg                          18

Ala Glu Thr Leu Thr Leu

1               5

<210>3

<211>359

<212>DNA

<213>鸡(Gallus gallus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(359)

<223>

<220>

<221>variation

<222>(308)..(308)

<223>

<220>

<221>variation

<222>(265)..(265)

<223>

<220>

<221>variation

<222>(258)..(258)

<223>

<220>

<221>variation

<222>(226)..(226)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(221)..(221)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(197)..(197)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(194)..(194)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(192)..(192)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(185)..(185)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(176)..(176)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(175)..(175)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(173)..(173)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(172)..(172)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(132)..(132)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(131)..(131)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(111)..(111)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(103)..(103)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(77)..(77)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(76)..(76)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(74)..(74)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(70)..(70)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(55)..(55)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(54)..(54)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(52)..(52)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(48)..(48)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(47)..(47)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(41)..(41)

<223>

<400>3

gcagagtgcc actacctgaa cggcaccgag cgggcgaggt atctggwcag gyawrtctac    60

aaccggcags agtwcgcgca cttcgacagc gacgtgggga aayacgtggc tgatacaccg    120

ctgggtgagc cgcaggctga aatctggaac agcaacgccg agattctgga gacccgaatg    180

aatgaagtgg acasgtwctg ccggcacaac tacggggttg tggagytcct tcacggtgca    240

gaggagcggt gagtgccgcg gggcgcagcg cgcacgcacg ggcaggcgcc gcgctctggc    300

ggtcggtccg cagcgctccc cccgtgcccc gcagtggagc ccaaggtgag ggtctcggc     359

Claims (10)

1、一种与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记方法，其特征在于在体外检测MHC B-LB基因中限制性内切酶BsuR I PCR-RFLP(BPR)等位基因的存在。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过测序和/或RFLP和凝胶电泳进行BPR等位基因的检测。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于通过RFLP和凝胶电泳进行BPR等位基因的检测。

4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于从鸡的全血或组织中提取基因组DNA进行检测。

5、根据权利要求2或4的所述的方法，其特征在于基因组DNA在检测前预扩增。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于经扩增的DNA片段含有MHC B-LB基因第二外显子、内含子和第三外显子的全部或部分序列，其长度为359bp。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增获得的MHC B-LB基因序列中存在27个碱基突变位点，其中第111位碱基处有一个碱基突变C111T，导致BsuR I-RFLP多态性。

8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中第265位碱基处有一个G265碱基插入，导致了第265位碱基处内切酶BsuR I识别位点的消失，但没有导致该酶切位点的多态性。

9、一种与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记，含有如序列表SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的引物对。

10、权利要求9所述与鸡产蛋量相关的MHC B-LB基因PCR-RFLP标记在鸡产蛋量相关联的遗传检测中的应用。

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