CN102167737B - 与猪免疫性状相关的蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪免疫性状相关的蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明公开了猪免疫性状相关的蛋白OLFML3及其编码基因(全长cDNA和基因组DNA)，并公开了基因组DNA中的一个位点的突变(G585→T585)，应用该点突变，用本发明的提供的特异引物对(由序列表的序列5所示DNA和序列6所示DNA组成)和限制性内切酶Hae II，可通过RFLP辅助鉴别具有不同免疫性状的猪，从而实现早期选育。本发明为猪的分子设计育种和标记辅助选择提供了新的技术手段，将在猪的育种中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种与猪免疫性状相关的蛋白及其编码基因和应用，还涉及基于所述编码基因的单核苷酸多态及应用其鉴别具有不同免疫性状的猪的方法。
背景技术
猪是最早的家养动物，已经有7000多年的历史，是最重要的农业动物之一。猪肉不仅是人类动物蛋白的主要来源，占世界红肉消费量的43％(Rothschild andRuvinsky，1998)，也是我国最主要的动物性食品，随着人类生活水平的提高，动物性食品安全问题日益受到重视。现代畜牧生产的重点包括两个方面：一、提高猪的抗病性，即抗病育种，从而降低单位产品的生产成本，减少药物残留，提高畜产品质量；二、运用现代育种技术，结合分子标记技术，提高猪生产性能。
在过去一段时间里，人们过于注重猪的生长速度的提高，忽视了对其抗病性能的选育，因而猪的快速生长也伴随着抗病性的降低；近期研究表明某一特定基因型的猪其生长速度和胴体组成在一定程度上决定其健康水平。抗病性好，健康的猪采食量、生长速度和饲料转换效率都比较高；此外，还可改变猪的胴体组成，使猪沉积更多的肌肉或体蛋白，尽量减少脂肪组织的沉积。然而，猪免疫能力与生产性能间的相互关系仍然不十分清楚，因此从分子水平上揭示出生产性能和免疫力控制基因间的相互关系是关键，也为家畜的分子辅助育种提供了新的思路。
个体免疫力是衡量动物健康状况的一个重要指标，它属于数量性状，所涉及的相关基因较多，分子机制也较复杂。当个体受到病原体侵染时，机体会调动三方面的防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制加以抵抗。猪的健康状况取决于侵染和防御机能相互作用的结果，若防御技能强便表现出自然抵抗力。
抗病性主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility complex，MHC)是与抗病性和免疫应答密切相关的一组基因群，猪的MHC(命名为SLA)位于猪的7号染色体上(Warner，Mapping of C2，Bf，and C4 genes to the swine majorhistocompatibility complex.Immunology.1987，139：3388-3395)，包括I型和II型基因，其中I型基因具有较强的多态性，Rothschild实验室长期从事猪SLA基因单倍型与猪初生重、生长速度、背膘厚等性状的研究，他们认为SLA基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(Rothschild MF，Identification of quantitative trait lociand interesting candidate genes in the pig：progress and prispects.Proc 6thWCGALP 1998，26：403-409)。Mallard等(1998)在经8代选择形成的猪高免疫应答(H系)和低免疫应答(L系)品系中发现H系比L系早10d达到上市体重，上述研究表明猪的SLA与多种生产性状均有连锁，且猪的SLA与生长、背膘和繁殖性状间的联系多呈正相关关系。同时对生产性状和免疫性状进行选择是可行的，因而，能同时影响猪生长性状和免疫性状的基因就显得尤为重要，这类基因也就成为分子辅助育种研究的重点对象。
Olfactomedin家族是一类结构上独特的细胞外蛋白。1991年，Snyder等首次从蛙嗅觉组织中克隆得到Olfactomedin，之后，Danielson和Karavanich等分别在大鼠和小鼠中分离获得，到目前为止，已有100多个OLF家族成员被相继发现。在脊椎动物中OLF家族包含68个成员，分为I、II、III、IV、V、VI、VII七个亚系(Zeng etal.2005)。目前已证实，OLF蛋白在嗅腺中特异表达，并与嗅觉感受器神经元密切相关。一些OLF成员在各种生理学过程中发挥着重要作用，例如：TIGR/Myocilin与人类疾病相关，Myocilin OLF区域的回归突变与慢性青光眼密切相关，Noelin在神经发育过程中发挥着重要作用。
等位基因与性状间的关联可以找出许多与该性状具有关联的分子标记，从而为标记辅助选择(MAS)乃至分子育种提供理论依据。因此当前各国动物育种学家包括人类疾病研究者都渴望通过这种简短而有效的方法找到“放之世界而皆准”的分子遗传标记。分子遗传标记可较早地对种猪进行选择，因此合适的遗传标记对于开展标记辅助选择，加快遗传进展，并最终实现分子育种是极其重要的。另外，研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个强有力的手段。在群体中通过性状关联分析寻找与猪免疫性状相关的基因，进行分子育种始终是育种工作者的一项重要而艰巨的任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种与猪免疫性状相关的蛋白及其编码基因和应用。
本发明所提供的猪免疫相关蛋白，名称为OLFML3，来源于猪，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与猪免疫性状相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的OLFML3便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的OLFML3可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OLFML3的编码基因可通过将序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
序列表的序列1所示蛋白由407个氨基酸残基组成。
编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所述的DNA分子：
(1)序列表中序列2自5’末端第47至1270位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表中序列2所示的DNA分子；
(3)序列表中序列3所示的DNA分子；
(4)在高严谨条件下与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列杂交且编码猪免疫性状相关蛋白的DNA分子；
(5)与(1)或(2)或(3)限定的DNA序列至少具有90％以上同源性且编码猪免疫性状相关蛋白的DNA分子。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表的序列2所示基因由1770个核苷酸组成，自5’末端第1-46位核苷酸序列为5’非翻译区(UTR)、第47-1270位核苷酸为开放阅读框，第1271-1770位核苷酸序列为3’UTR，第1732-1738bp位核苷酸序列为ATTAAAA加尾信号，第1753-1770位核苷酸为PolyA尾巴。
序列表的序列3所示基因由2798个核苷酸组成，包含3个外显子和2个内含子，自5’末端第47-158位核苷酸为第1外显子，第159-862bp位核苷酸为第1内含子，第863-1153位核苷酸为第2外显子，第1154-1477bp位核苷酸为第2内含子，第1478-2298bp位核苷酸为第3外显子。
含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种辅助鉴别具有不同免疫性状猪的试剂，为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对；所述免疫性状为白细胞数、血红蛋白浓度和血细胞平均血红蛋白含量中的至少一种。所述猪具体可为五指山猪、巴马香猪、通城猪、长白猪、大白猪、大长通[LW×(LD×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪]和长大通[(LD×(LW×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪)中的至少一种。
含有所述试剂的试剂盒也属于本发明的保护范围，所述试剂盒还可含有限制性内切酶Hae II。
所述试剂可用于制备辅助鉴别具有不同免疫性状猪的试剂盒；所述免疫性状为白细胞数、血红蛋白浓度和血细胞平均血红蛋白含量中的至少一种。所述猪具体可为五指山猪、巴马香猪、通城猪、长白猪、大白猪、大长通[LW×(LD×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪]和长大通[(LD×(LW×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪)中的至少一种。
所述试剂可用于辅助鉴别具有不同免疫性状的猪；所述免疫性状为白细胞数、血红蛋白浓度和血细胞平均血红蛋白含量中的至少一种。所述猪具体可为五指山猪、巴马香猪、通城猪、长白猪、大白猪、大长通[LW×(LD×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪]和长大通[(LD×(LW×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪)中的至少一种。
本发明还保护一种辅助鉴别具有不同免疫性状猪的方法，包括如下步骤：检测待测猪的序列表的序列2所示的OLFML3基因自5’末端第585位核苷酸是G还是T，确定待测猪的基因型是GG还是GT，GT基因型猪的白细胞数、血红蛋白浓度和血细胞平均血红蛋白含量中的至少一种高于GG基因型的猪。
所述方法具体可包括如下步骤：(1)提取待测猪的基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，用序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(3)用限制性内切酶Hae II酶切所述PCR扩增产物；如果PCR扩增产物只有一种，且不能被限制性内切酶Hae II酶切，待测猪为TT基因型；如果PCR扩增产物只有一种，且能被限制性内切酶Hae II酶切，待测猪为GG基因型；如果PCR扩增产物有两种，其中一种能被限制性内切酶Hae II酶切，另一种不能被限制性内切酶Hae II酶切，待测猪为GT基因型。
所述PCR扩增产物为383bp。所述PCR扩增产物如果可以被限制性内切酶Hae II酶切，应得到71bp和312bp的酶切产物。
所述待测猪具体可为五指山猪、巴马香猪、通城猪、长白猪、大白猪、大长通[LW×(LD×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪]和长大通[(LD×(LW×T)，T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪)中的至少一种。
所述方法可用于猪的育种。具体可选择GT基因型的猪进行育种。
本发明公开了猪免疫性状相关的蛋白OLFML3及其编码基因(全长cDNA和基因组DNA)，并公开了基因组DNA中的一个位点的突变(G585→T585)，应用该点突变，用本发明的提供的特异引物对和限制性内切酶Hae II，可通过RFLP辅助鉴别具有不同免疫性状的猪，从而实现早期选育。本发明为猪的分子设计育种和标记辅助选择提供了新的技术手段，将在猪的育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为本发明中OLFML3蛋白及其编码基因、及其相关SNP的发现和应用的流程。
图2为猪三种基因型(GG，GT，TT)样本的酶切产物的电泳图；M：DNA分子量标准(100-1500bp ladder)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、猪OLFML3蛋白及其编码基因的获得和序列分析
一、猪OLFML3蛋白及其cDNA序列和基因组DNA序列的获得
(一)cDNA序列的获得
1、以人的同源基因的cDNA(GenBank收录号：NM_020190.2)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为85％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用软件DNAStar中的Seqman程序构建猪的EST重叠群，从而获得拼接的猪cDNA序列。
2、根据拼接的猪cDNA序列设计四对引物(见表2)。
表2用于猪OLFML3基因分离的引物信息
3、反转录PCR扩增反应
提取长白猪的总RNA。
cDNA第一链的的合成：反应体系(见表3)为50μL，首先将2μg总RNA与oligod(T)11混合于Ependorff管中，70℃温育5min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级结构的重新生成，经短暂离心后按照表3加入其余组分，于37℃温育1h后将温度升至95℃灭活反转录酶，置于-20℃保存备用。
表3反转录反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| 总RNA | 10μL | 2μg |
| oligo d(T)11 | 5μL | 1μmol/L |
| DEPC H2O | 20μL | - |
| 5×PCR buffer | 10μL | |
| dNTP | 2.5μL | 500μmol/L |
| RNAsin | 1μL | 40U |
| M-MLV | 1.5μL | 300U |
| 总体积 | 50μL |
PCR反应体系总体积为20μL，各组分的加样体积及终浓度见表4。PCR扩增程序：94℃3min；94℃30s，退火(退火温度见表2)45s，72℃1min，循环35次；最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
表4PCR反应体系
| 组分 | 体积 | 终浓度 |
| dd H2O | 13.2μL | - |
| 10×PCR buffer | 2μL | |
| MgCl2 | 1.2μL | 1.5mmol/L |
| 引物 | 1μL | 10μmol/L |
| dNTP | 0.4μL | 10mmol/L |
| Taq DNA聚合酶 | 0.2μL | 1U |
| cDNA | 1μL | ＞100ng |
| 总体积 | 20μL |
4、PCR产物的纯化、克隆和测序
(1)凝胶纯化
在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化PCR产物。
(2)连接反应
将纯化PCR产物与pGEM-T(Promega)载体连接，连接反应总体积是5μL，其中包括2.5μL 2×buffer，0.5μL T载体，1.5μL纯化PCR产物，0.5μL T4连接酶，最后置4℃水浴过夜。
(3)感受态细胞的制备
从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mL LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待0D600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
(4)转化
无菌状态下取100-120μL感受态细胞于1.5mL Ependorff管中，将5μL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μL涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
(5)质粒的小量制备
挑取平板上的单菌落，接种于2-3mL LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5mLEP管12000r/min离心数秒收集菌体。然后使用天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒进行质粒DNA的提取。
(6)重组质粒的酶切鉴定
取3μL质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为15μL，加入2-3U限制性内切酶及2μL相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μL反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由英俊生物技术有限公司完成。
(7)DNA序列同源性检索鉴定
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
(二)基因组DNA序列的获得
1、引物设计
与猪OLFML3基因同源的人OLFML3基因组DNA(GenBank收录号：NM_020190.2)长约2846bp，有3个外显子，2个内含子，其中第一内含子701bp，第二内含子331bp。将猪OLFML3基因的cDNA全长序列与其进行比对，发现猪的也具有3个外显子，根据序列表中序列2所示的的cDNA序列设计4对引物(见表5)，扩增猪的全基因组序列。
表5OLFML3基因组DNA分离用引物
2、PCR扩增
以猪的基因组DNA为模板，并根据人的该同源基因的第一内含子长度(701bp)设计反应程序，进行PCR扩增。PCR反应体系：2.0μL 10×Buffer，1.6μL MgCl2(2.5mmol/L)，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，0.4μL dNTPs(10mmol/L)，0.2μL Taqase，1μL DNA模板，ddH20定容至20μL。PCR扩增程序：95℃3min，30个循环(94℃30s，对应引物的温度退火30s，72℃延伸40s)，最后在72℃延伸3min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
以猪的基因组DNA为模板，并根据人的该同源基因的第二内含子长度(331bp)设计反应程序，进行PCR扩增：反应体系：2.0μL 10×Buffer，1.6μL MgCl2(2.5mmol/L)，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，0.4μLdNTPs(10mmol/L)，0.2μL Taqase，1μL DNA模板，ddH2O定容至20μL。PCR扩增程序：95℃3min，30个循环(94℃30s，对应引物的温度退火30s，72℃延伸30s)，最后在72℃延伸3min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3、获取序列
所得序列进行拼接，最后得到一个长约2798bp的DNA片段(见序列表的序列3)，其中第一内含子长704bp，第二内含子长361bp。
将序列表的序列1所示蛋白质命名为猪0LFML3蛋白。将猪0LFML3蛋白的编码基因命名为猪OLFML3基因，其cDNA如序列表的序列2所示，其基因组DNA如序列表的序列3所示。
序列表的序列2所示基因由1770个核苷酸组成，自5’末端第1-46位核苷酸序列为5’非翻译区(UTR)、第47-1270位核苷酸为开放阅读框，第1271-1770位核苷酸序列为3’UTR，第1732-1738bp位核苷酸序列为ATTAAAA加尾信号，第1753-1770位核苷酸为PolyA尾巴。
序列表的序列3所示基因由2798个核苷酸组成，包含3个外显子和2个内含子，自5’末端第47-158位核苷酸为第1外显子，第159-862bp位核苷酸为第1内含子，第863-1153位核苷酸为第2外显子，第1154-1477bp位核苷酸为第2内含子，第1478-2298bp位核苷酸为第3外显子。
二、猪OLFML3基因物理定位
1、用于猪OLFML3基因物理定位的引物序列如下：
FMF：5′-AGAGAGAAAGCCCGCAGCA-3′；
FMR：5′-GCCGCAGTACAAACCGAGTC-3′。
靶序列长度为256bp，是序列表的序列2自5′末端第1469-1724位核苷酸。
2、用于物理定位的实验材料
用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位(包括27个体细胞杂种细胞系，1-19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20-27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系)，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，IMpRH)进行染色体精确定位(包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照)，两套体细胞杂种板的制备方法见参考文献(Yerle et al.，A somatic cell hybrid panelfor pig regional gene mapping characterized by molecular cytogenetics.Cytogenet Cell Genet.1996，73：194-202；Yerle et al.，Construction of awhole-genome radiation hybrid panel for high-resolution gene mapping in pigs.Cytogenet Cell Genet.1998，82：182-188)。
IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29.3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。
3、PCR分型条件
在IMpRH中进行扩增的PCR反应总体积为10μL，其中模板DNA为25ng，含1×buffer(Promega)，dNTP终浓度为75μmol/L，引物终浓度为0.3μmol/L，0.3U TaqDNA聚合酶(Takara)。PCR扩增程序是：94℃5min，循环35次：94℃30sec，60℃退火30s；然后72℃25sec，最后72℃延伸5min。PCR反应产物均用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
4、猪OLFML3基因的定位效果
分型结果：
00001100010100010？1100000000000000001001010010000000100010000100001000000000101010000000000100000000101000010000000010(其中0和1分别表述扩增结果为阴性和阳性)。
将以上分型数据输入IMpRH数据统计分析服务器(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/RH/IMpRH.htmL/)，用HMAP 3.0软件进行数据统计分析。统计分析结果，两点分析结果显示，OLFML3基因与猪染色体SSC14号上的已有的标记IGLV紧密连锁，LOD值为5.26，RH图距是0.68Ray。
实施例2、猪OLFML3的单核苷酸多态性和RFLP多态性检测
一、SNP(585G/T)的发现和特异引物对的设计
在猪OLFML3基因的基因组DNA(序列表的序列3所示)中，发现一个SNP(585G/T)，根据该SNP设计一对引物(特异引物对)如下：
上游引物：5′-AGTCTGTAGCAGCCTATTCC-3′(序列表的序列5)；
下游引物：5′-GACTACTCTGGTCTTGGCACT-3′(序列表的序列6)。
靶序列如序列表的序列4所示(383bp)，序列4即序列表的序列3自5’末端第516至898位核苷酸(位于基因组DNA第二外显子和第二内含子中)。序列表的序列4自5’末端第70位核苷酸(序列表的序列3自5’末端第585位核苷酸)存在G→T的突变，当该核苷酸为G时，存在1个Hae II酶切位点(RGCGC^Y)。
二、应用特异引物对对各个群体进行分型
分别对7个群体的猪(见表6)进行分型。
表6SNPs检测的群体和样品数
T代表通城猪，LD代表长白猪，LW代表大白猪。
1、提取待测猪的基因组DNA。
2、以基因组DNA为模板，用步骤一设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系(20μL)：基因组DNA 50ng，1×buffer，dNTP 75μmol/L，上、下游引物各0.3μmol/L，Mg2+1.5mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U。
PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5min。
3、将PCR扩增产物用限制性内切酶Hae II酶切，得到酶切产物。
酶切反应体系(10μL)：其中10×buffer 1μL，PCR扩增产物3-5μL，限制性内切酶Hae II 0.5μL(5.0U)，用ddH2O补足10μL。
酶切反应体系混匀后离心，37℃温育4h。
4、将酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照像，记录基因型并统计基因频率。
所有酶切产物显示三种带型，基于酶切产物的电泳图分型如下：
带型I：显示71bp和312bp的两条带(因71bp条带较小，比较微弱，电泳图上没有清晰显示)；
带型II：显示383bp的一条带；
带型III：显示383bp、312bp和71bp的三条带。
5、将步骤2的各个PCR扩增产物分别进行测序，测序结果与带型显示的结果一致，基于测序结果分型如下：
GG型：PCR扩增产物(383bp)如序列表的序列4所示，该PCR扩增产物能被限制性内切酶Hae II酶切，产生71bp和312bp的两个酶切产物；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型I(因71bp条带较小，比较微弱，电泳图上没有清晰显示)。
TT型：PCR扩增产物(383bp)为将序列表的序列4自5’末端第70位核苷酸突变为T得到的DNA片段，该PCR扩增产物不能被限制性内切酶Hae II酶切；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型II。
GT型：PCR扩增产物为GG型的PCR产物和TT型的PCR产物的混合物；该PCR扩增产物的酶切产物电泳显示带型III(即GG型的酶切产物和TT型的酶切产物的叠加)。
部分基因型的样本的酶切产物的2％的琼脂糖凝胶电泳图见图2。
7个群体的基因型及等位基因频率统计结果如表7所示。
表7OLFML3 SNP(585G/T)多态性在7个猪群中的分布
如表7所示，可以明显看出该SNP位点在两种小型猪(巴马小型猪、五指山小型猪)中G和T基因型的分布较为均匀。而在其它几个猪品种中以偏G型存在。
三、性状关联分析
根据SNP的分型统计结果，对大白猪，长白猪，通城猪，大长通猪和长大通猪5个猪群组成的整个群体(共计134头；其中大白猪、长白猪、大长通猪和长大通猪均为表7中的样本，通城猪为表7中GG基因型和GT基因型的样本)进行性状关联分析。
1、分别检测134只猪的白细胞数(WBC)、血红蛋白浓度(HGB)和血细胞平均血红蛋白含量(MCHC)。
2、数据处理
应用SAS8.0软件中的广义线性模型(General Linear Model)程序进行性状关联分析。
首先建立分析模型甲以消除性别、组合及批次对表型值的影响：
Yijk＝μ+BATCHi+SEXj+COMBINATIONk+(BS)ij+(BC)ik+(SC)jk+εijkl，
其中，Yijk是性状观察值，μ为总体均数，BATCHi为批次效应，SEXj为性别效应，COMBINATIONk为组合的效应，(BS)ij为批次和性别的互作效应，(BC)ik为批次和组合的互作效应，(SC)jk为性别和组合的互作效应，εijk为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
应用分析模型甲对于每个原始性状都获得了一个新的性状值，即标准化的残差值，然后将所获得残差值作为新的性状值，再建立如下的分析模型乙：
Yij＝μ+GENOTYPEi+εij
Yij是新的性状值，μ新的性状值的总体均值，GENOTYPEi为基因型效应，εij为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
应用分析模型乙根据最小二乘分析法分析基因型的效应，同时进行基因型间的两两比较。
结果发现，585G/T突变位点与猪的免疫性状显著相关，115个个体为GG基因型，19个个体为GT基因型，GG基因型与GT基因型的猪免疫性状差异显著。基因型间性状的平均数和标准差分析结果总结于表8。
表8不同基因型(585G/T)群体的免疫性状比较
| 基因型 | 样本个数 | WBC | HGB | MCHC |
| GG | 115 | 24.5822±1.9500A | 52.3324±4.3175A | 143.9843±11.4970A |
| GT | 19 | 37.8163±4.5654B | 80.3858±10.1083B | 215.9394±26.6979B |
| P value | 134 | 0.0058 | 0.0082 | 0.0101 |
不同的肩标表示统计学上差异显著。
应选择WBC、HGB和MCHC值较高的GT型猪进行育种。
Claims (10)
1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1）或(2）或(3）所述的DNA分子：
（1）序列表中序列2自5’末端第47至1270位核苷酸所示的DNA分子；
（2）序列表中序列2所示的DNA分子；
（3）序列表中序列3所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。
6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。
8.扩增权利要求2或3所述基因的全长的引物对；
所述引物对为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对。
9.辅助鉴别具有不同免疫性状猪的试剂，为序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对；所述免疫性状为白细胞数、血红蛋白浓度和血细胞平均血红蛋白含量中的至少一种。
10.权利要求9所述试剂在制备辅助鉴别具有不同免疫性状猪的试剂盒中的应用；所述免疫性状为白细胞数、血红蛋白浓度和血细胞平均血红蛋白含量中的至少一种。
Priority Applications (1)
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| Genbank.CAC39696.1.《NCBI》.2001, |
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