CN1796409A - 猪免疫，生长性状相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪免疫，生长性状相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白为具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：6；2)将序列表中SEQ ID №：6的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪免疫，生长性状相关的蛋白质。检测猪免疫，生长性状的方法，是用由序列表中SEQ ID№：2和SEQ ID №：3的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基为A还是C；或用Csp6I酶切所述PCR扩增产物，检测得到的酶切片段的大小及数量。本发明的猪免疫，生长性状相关蛋白及其编码基因将在猪的育种中发挥重要作用。

Description

猪免疫，生长性状相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质及其编码基因与应用，特别是涉及一种猪免疫，生长性状相关蛋白及其编码基因与利用该蛋白编码基因的单核苷酸多态性和限制片段长度多态性检测猪免疫，生长性状的方法。

背景技术

猪肉是我国最主要的动物性食品，动物性食品安全问题日益受到重视。现代畜牧生产的重点囊括两方面：一方面是提高猪的抗病性，即抗病育种，从而降低单位产品的生长成本，并且减少药物残留，提高畜产品的质量；另一方面是运用现代育种技术，并结合分子标记技术，进一步提高猪的生产性能。

在过去一段时间里，人们过于注重猪的生长速度的提高，忽视了对其抗病性能的选育，因而猪的快速生长也伴随着抗病性的降低；近期研究表明某一特定基因型的猪其生长速度和胴体组成在一定程度上决定其健康水平。抗病性好，健康的猪采食量、生长速度和饲料转换效率都比较高；此外，还可改变猪的胴体组成，使猪沉积更多的肌肉或体蛋白，尽量减少脂肪组织的沉积。然而，猪免疫能力与生产性能间的相互关系仍然不十分清楚，因此从分子水平上揭示出生产性能和免疫力控制基因间的相互关系是关键，也为家畜的分子辅助育种提供了新的思路。

个体免疫力是衡量动物健康状况的一个重要指标，它属于数量性状，所涉及的相关基因较多，分子机制也较复杂。当个体受到病原体侵染时，机体会调动三方面的防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制加以抵抗。猪的健康状况取决于侵染和防御机能相互作用的结果，若防御机能强便表现出自然抗病力。

抗病性主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility complex，MHC)是与抗病性和免疫应答密切相关的一组基因群，猪的MHC(命名为SLA)位于猪的7号染色体上(Warner，Mapping of C2，Bf，and C4 genes to the swine majorhistocompatibility complex.J.Immunology.1987，139：3388-3395)，包括I型和II型基因，其中I型基因具有极强的多态性。Rothschild实验室长期从事猪SLA基因单倍型与猪初生重、生长速度、背膘厚等性状的研究，他们认为SLA基因单倍型与上述生产性能存在相关关系(Rothschild MF，Identification of quantitative traitloci and interesting candidate genes in the pig：progress and prospects.Proc6th WCGALP 1998，26：403-409)。Mallard等(1998)在经8代选择形成的猪高免疫应答(H系)和低免疫应答(L系)品系中发现H系比L系早10d达到上市体重。上述研究表明猪的SLA与多种生产性状均有连锁，且猪的SLA与生长、背膘和繁殖性状间的联系多呈正相关关系。表明，同时对生产性状和免疫性状进行选择是可行的，因而，能同时影响猪生长性状和免疫性状的基因就显得尤为重要，这类基因也就成为分子辅助育种研究的重点对象。

RPLPO基因编码的蛋白是核糖体蛋白大亚基蛋白中的一种。核糖体蛋白(ribosmalprotein，rp)有数十种，大多是分子量不大的多肽类，分布在核蛋白体大亚基的蛋白称为RPL，分布在小亚基的蛋白称为RPS。原核生物和真核生物的核蛋白体均由易于解聚的大、小亚基组成。对大肠杆菌核蛋白体的研究发现其质量的三分之二是rNRA，三分之一是蛋白质。rRNA分为5S、16S、23S三种；小亚基由16SrRNA和21种RPS构成，大亚基由5S、23SrRNA和31种RPL构成。真核生物核蛋白体小亚基含18SrRNA和30多种RPS，大亚基含28S、5.8S、5S三种rRNA，近50种RPL，各种生物核蛋白体小亚基中的rRNA具有相似的二级结构。

研究表明，在同一界中某些核糖体蛋白排列顺序的差异能反映出物种间的亲缘关系，亲缘关系越近，基因排列顺序越接近。这样就可以通过比较基因的排列顺序来研究物种间的系统发育关系。

研究表明，rRNA必须与核糖体蛋白结合才能执行其功能-合成蛋白质，因此，科学家开始展开对核糖体蛋白功能的研究。童克忠研究员一直从事核糖体蛋白质突变体分离的研究，并研究这些突变体对其它基因表达的影响，已分离并鉴定了枯草杆菌和大肠杆菌核糖体蛋白质突变体等总共51种核糖体蛋白质突变体，居世界首位。经研究上述核糖体蛋白的突变对细菌基因和噬菌体基因表达的影响发现：1)某些突变的核糖体蛋白质同原来的核糖体蛋白质的翻译特异性不同；2)同一核糖体蛋白质突变体对不同基因或基因组表达的影响不同；3)不同的核糖体蛋白质突变体对同一基因或基因组表达的影响不同。这些基因表达高低的差异正是由核糖体蛋白质对不同的mRNA有所取舍造成，这一结论与美国加州大学(伯克利)生物化学系报导的大肠杆菌核糖体蛋白质S₁对mRNA具有选择性吻合。美国西维基尼亚大学和加利福尼亚大学医学院的学者们检查了白内障患者的晶体的mRNA，经和对照晶体的mRNA作比较，发现患者和对照之间的基因表达方面存在着较大差异，患者体内L21，L15，L13a和L7a这四种蛋白的表达量相对较少。由此推测，核糖体蛋白调控的蛋白合成与其它功能，如和衰老有关的白内障发病机制有关。另一研究发现核糖体蛋白L6有着与T细胞白血病病毒(HTLV)-I长片段重复序列结合的活性，这为人类白血病的治疗提供了新的信息(Wang J等，Cloning of mouse genomic ribosomal protein L6 gene and analysisof its promoter.Biochim Biophys Acta.2002，1576(1-2)：219-224)。

此外，RPLPO还可作为持家基因，用于基因的表达研究。人的RPLPO基因，被定位于人HAS12q24.2(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/)。RPLPO基因由7个外显子，6个内含子组成。但目前为止，有关RPLPO基因功能的研究还不是很透彻，研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个强有力的手段。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。这种变异可能是转换(C→T，在其互补链上则为G→A)，也可能是颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。无论采用哪一种方法，都首先必须对靶序列进行扩增，然后才能进行其它检测。

PCR-RFLP全称为多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性(restrictionfragment length Polymorphism，RFLP)分析。主要包括三个环节：(1)靶基因PCR扩增；(2)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性)，该术应用PCR将目的基因片段扩增百万倍以上，即使被测样品核酸量小于pg水平，也能被扩增出来，这不仅大大提高了基因分析的灵敏度，而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR-RFLP主要用于核酸变异性分析与比较，当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重排，使某种酶切位点增加，减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过核酸电泳，可

将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小).PCR-RFLP用于基因分析具有分辩率高，重复性好，简便快速直观等优点，主要用于微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断，HLA分型及载脂蛋白基因的分析等。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪免疫，生长性状相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的猪免疫，生长性状相关蛋白，名称为RPLPO，来源于猪，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：5；

2)将序列表中SEQ ID №：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪免疫，生长性状相关的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID №：5由318个氨基酸残基组成。

上述猪免疫，生长性状相关蛋白的编码基因(RPLPO)也属于本发明的保护范围。

上述猪免疫，生长性状相关蛋白的编码基因包括猪免疫，生长性状相关蛋白的cDNA序列和猪免疫，生长性状相关蛋白的基因组片段。其cDNA基因可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：4的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：5蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：4由1293个碱基组成，该cDNA序列的编码序列为序列表中SEQ ID №：5的自5′端第177-1133位碱基。

其基因组基因，具有下述核苷酸片段之一：

1)序列表中SEQ ID №：1核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：5蛋白质序列的DNA；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的序列1由595个碱基组成，自5′端的第1-56位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第194-340位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第447-595位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第57-193位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第341-446位碱基为该基因组基因的第五个内含子。

含有本发明的猪免疫，生长性状相关蛋白编码基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种检测猪免疫，生长性状的方法。

本发明所提供的检测猪免疫，生长性状的方法，是用由序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：3的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行下述至少一种检测：

1)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基为C还是A；

2)用Csp6I酶切所述PCR扩增产物，检测得到的酶切片段中是否含有一条595bp条带和/或一条353bp条带和一条242bp条带。

如果PCR扩增产物的单核苷酸多态性检测结果是自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基，即自序列表中序列4的5′端第545位碱基为C时，其纯合体的基因型为CC；自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基，即自序列表中序列4的5′端第545位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AC。

Csp6I酶切所述PCR扩增产物，若得到的酶切片段为一条595bp的条带，则确定待测猪的基因型为CC；若得到的酶切片段为一条353bp和一条242bp的两条带，则确定待测猪的基因型为AA；若得到的酶切片段为一条595bp的条带，一条353bp和一条242bp的三条带，则确定待测猪的基因型为AC。

其中，CC基因型个体的估算眼肌面积(cm²)值显著高于AA基因型的对应值，AC基因型的对应值居中；而AA基因型肌内脂肪含量的对应值脂肪含量最高，AC基因型肌内脂肪含量的对应值其次，CC基因型肌内脂肪含量的对应值最小，AA基因型肌内脂肪含量的对应值显著高于CC基因型的对应值；AA基因型的IgG2含量最高，并且显著高于AC基因型；CC基因型对应值次之，杂合AC基因型个体的对应值最低，表明AA基因型个体的免疫性状较好；初步显示与其它免疫性状没有关联。

所述单核苷酸多态性检测可采用DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等进行检测。

本发明的猪免疫，生长性状相关蛋白及其编码基因可用于检测猪IgG2含量免疫性状，为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，将在猪的育种中发挥重要作用。

附图说明

图1为检测猪RPLPO部分DNA序列多态性的流程图

图2为猪RPLPO基因的基因组部分DNA序列的扩增结果

图3为PCR-RFLP法检测猪RPLPO基因的基因组部分DNA序列多态性的琼脂糖凝胶电泳检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、猪RPLPO的获得

1、猪RPLPO基因的cDNA序列的获得

从猪胚胎骨骼肌文库(由上海联合基因公司构建)中挑选克隆子测序，然后将测序结果在NCBI中搜索同源序列，与人RPLPO基因序列相似程度最高(NM_001002，93％)，确认为猪RPLPO基因的cDNA。

2、猪RPLPO基因的定位

以猪×啮齿类体细胞杂种克隆板RH克隆板(INRA-Minnesota porcineradiationhybrid panel，ImpRH，118个杂种细胞系)中的DNA(购自法国农业科学院，Laboratoirede Génétique Cellulaire，INRA)为模板，在正向引物：5’-AGCAGATCCGCATGTCTCTC-3’和反向引物：5’-GCAGGTACAGTGACTTCGCA-3’的引导下进行PCR扩增。扩增条件为：94℃变性4min，94℃变性20s，59℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环。最后在72℃延伸5min。其中的反应体系组成为：PCR反应总体积为10μl，其中RH克隆板DNA约25ng，含1×缓冲液(Promega)，2mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度均为0.2μmol/L，1U TaqDNA聚合酶(Promega)。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增片段分型，其中在第6，8，10，12，13，21，22，27，29，49，51，59，61，62，73，74，75，82，86，94，100，101，103，105，107，109，114，117，118号杂种细胞系中的DNA中获得阳性扩增结果。将PCR分型数据提交给HybWeb(http://imprh.toulouse.inra.fr/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果表明猪RPLPO基因定位于猪14号染色体上，与微卫星标记SW1321紧密连锁，LOD值为14.54。

实施例2、猪RPLPO基因基因组的部分DNA序列的单核苷酸多态性和RFLP多态性检测

猪RPLPO基因基因组的部分DNA序列的单核苷酸多态性和RFLP多态性检测的流程如图1所示，具体步骤如下：

一、猪RPLPO的基因基因组的部分DNA序列的单核苷酸多态性的检测

具体过程包括如下步骤：

1、引物设计

用人RPLPO的cDNA序列(GenBank收录号：NM_001002)为信息探针，利用NCBI的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列检索，获得一系列同源性达90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI的ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.htmL)中查询相应序列，然后用软件GeneTool中的ASSEMBLY程序构建猪的EST重叠群并结合文库克隆子测序结果，最后根据拼接的序列设计扩增引物，引物序列如下：

引物1(正向)：5’-TTGTGTTCACCAAGGAGGAC-3’(SEQ ID №：2)

引物2(反向)：5’-GTGATGTCAAGCACTTCAGG-3’(SEQ ID №：3)

2、PCR扩增及其扩增产物的纯化、克隆和测序

分别以大长通组合(大白×长白×通城猪)23头，长大通组合(长白×大白×通城猪)26，大白猪15头，长白猪15头，杜洛克15头和通城猪70头的血液基因组的总DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，PCR扩增猪RPLPO部分DNA序列。PCR反应总体积为20μl，其中，猪基因组DNA约100ng，2μl 10×PCR缓冲液(Promega)，MgCl₂终浓度为1mmol/L，dNTP终浓度为150μmol/L，引物1和引物2终浓度各为0.2μmol/L，2U TaqDNA聚合酶。PCR反应程序为：先94℃ 4min；然后94℃ 20s，59℃ 20s，72℃ 20s，30个循环；最后72℃延伸5min。将PCR反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，表明获得的PCR产物大小约为595bp。图2中，2泳道为PCR扩增产物，M泳道为DNA分子量标记(100-1000bp ladder)。然后按照如下方法进行PCR产物的纯化、克隆和测序：

(1)PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温浴至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml树脂(Resin)，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过微柱(Minicolumn)挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl无菌水，静置1min，10,000g离心20s，弃上清，洗脱DNA存于Ependorff管中。

(2)连接反应：将步骤(1)纯化的PCR产物与pGEM-T载体(Promega)用T₄DNA连接酶连接，得到重组载体。连接体系为：2.5μL 2×缓冲液，0.5μL pGEM-T载体，0.5μL纯化的PCR产物，0.5μL T₄DNA连接酶，1μL灭菌水，16℃水浴12-24h。

(3)感受态细胞的制备：将大肠杆菌DH5α(TaKaRa)在LB固体培养基上37℃培养16-20h后，挑取单菌落接种于2mL LB液体培养基中，37℃振荡培养3h，然后取1mL菌液转接于含有30mL LB液体培养基的摇瓶中，在37℃继续振荡培养约4h，待菌液OD₆₀₀的值达到0.3-0.4时将摇瓶从摇床取出，冰浴10-15min使之冷却，然后将菌液转入离心管中于4℃、4,000g离心10min收集菌体细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬沉淀，即菌体细胞，冰浴30min后，4℃ 4,000g离心10min，再用4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液重悬沉淀，置4℃保存备用。

(4)转化：无菌状态下取100-120μl步骤(3)制备的感受态细胞于1.5mLEpendorff管中，再加入5μL步骤(2)获得的连接产物，混匀，冰浴30min，42℃热激90s(上述转化过程中不要摇动Ependorff管)，取出后冰浴3-4min，再加入400μl不含抗生素的LB液体培养基，在37℃振荡培养45min，最后取100μL菌液涂布于含4μL的200mg/mL IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和40μL的20mg/mL X-gal的LB平板上，先37℃预培养1h后在相同条件下倒置培养12-24h；

(5)质粒的小量制备：挑取琼脂平板上长出的单菌落接种于2-3mL LB液体培养基中，37℃ 300r/min培养12-24h，再用1.5mL EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0))，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III(5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H₂O 28.5ml)150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。

(6)重组质粒的酶切鉴定：取3μl质粒DNA与双蒸水混匀，使其总体积为15μl，加入2-3U限制性内酶EcoRI及2μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，得到酶切结果与预计完全相同的目的重组质粒。

(7)测序：重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果表明该PCR产物的长度为595bp，具有序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列，其中，自5′端的第1-56位碱基为RPLPO基因组基因的第四个外显子的部分序列(自序列表中序列4的5′端第439-494位碱基)；自5′端的第57-193位碱基为该基因组基因的第四个内含子完整序列；自5′端的第194-340位碱基为RPLPO基因组基因的第五个外显子的完整序列(自序列表中序列4的5′端第495-641位碱基)；自5′端的第341-446位碱基为RPLPO基因组基因的第五个内含子的完整序列；自5′端的第447-595位碱基为RPLPO基因组基因的第六个外显子的部分序列(自序列表中序列4的5′端第642-790位碱基)。自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基(自序列表中序列5的5′端第545位碱基)处存在C、A两个等位基因，即为多态性位点。如自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基(自序列表中序列4的5′端第545位碱基)为C时，其纯合体的基因型为CC；自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基(自序列表中序列4的5′端第545位碱基)为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AC。

3、DNA序列同源性检索鉴定

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列(SEQ ID NO：1)与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息，结果表明猪和人的序列相似性为83％，该序列编码猪的核糖体蛋白RPLPO。

二、猪RPLPO基因基因组的部分DNA序列的RFLP多态性的检测

1、猪RPLPO基因基因组的部分DNA序列Csp6I-RFLP多态性检测：分别以大长通组合(大白×长白×通城猪)23头，长大通组合(长白×大白×通城猪)26，大白猪15头，长白猪15头，杜洛克15头和通城猪70头的血液基因组的总DNA为模板，引物1：5’-TTGTGTTCACCAAGGAGGAC-3’和引物2：5’-GTGATGTCAAGCACTTCAGG-3’的引导下进行PCR扩增。PCR反应总体积为20μl，其中，猪基因组DNA约100ng，2μl10×PCR缓冲液(Promega)，MgCl₂终浓度为1mmol/L，dNTP终浓度为150μmol/L，引物1和引物2终浓度各为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件为：先94℃ 4min；然后94℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 20s，30个循环；最后72℃延伸5min。然后将PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了595bp大小的电泳条带。将PCR产物用Csp6I限制性内切酶酶切，酶切反应体系(10μl)：1×酶切缓冲液1μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶0.5μl(5U)，用H₂O补足10μl。酶切条件为：37℃水浴4h。用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果并记录基因型，结果如图3所示(图3中，泳道M为Marker，泳道AA为基因型为AA的纯合体，泳道CC为基因型为CC的纯合体，泳道AC为基因型为AC的杂合体)，表明CC基因型个体中，只得到一条595bp的条带；AC基因型个体中，得到三条带：一条595bp，一条353bp和一条242bp条带；AA基因型个体中，得到两条带：一条353bp和一条242bp条带。当等位基因为A时，自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第242-245位碱基出现限制性内切酶Csp6I的识别位点(G↓TAC)，若用Csp6I酶切该片段，则C等位基因只出现595bp一个片段，A等位基因则会出现353bp和242bp两个片段，由于该基因座由上述两个等位基因控制，因而可组成CC，AC，AA三种基因型。

实施例3、检测猪免疫，生长性状

分别以大白猪15头，长白猪15头，杜洛克15头和通城猪36头的血液基因组的总DNA为模板，共81个个体为实验对象，按照实施例2的方法检测81个个体的单核苷酸多态性和RFLP多态性，确定它们的基因型，其结果如表1所示，表明在所检测的4个猪品种的个体中，CC基因型的个体数为14，AC基因型的个体数为52，AA基因型的个体数为15。中国通城猪中A，C两个基因的频率相差不显著，A基因频率稍高；在3个外国猪品种中，大白猪和长白猪的C基因频率明显高于A基因的相应值，杜洛克的C基因频率明显低于A基因的相应值。

            表1  各个基因型在4个猪品种中的分布

品种	个体数	基因型			等位基因频率
							CC	AC	AA	C	A
		大白猪	15	10	5	0						0.8333	0.1667
长白猪	15						3	12	0	0.6000	0.4000
		杜洛克猪	15	0	7	8						0.2333	0.7667
通城猪	36						1	28	7	0.4167	0.5833

2、标记性状关联分析

按照实施例2的方法检测以下83个个体：大长通组合(大白×(长白×通城))23头猪，长大通组合(长白×(大白×通城))26头猪，通城纯繁组34头猪的单核苷酸多态性和RFLP多态性，确定它们的基因型，并进行基因型与生产、免疫性状关联分析。

用如下最小二乘模型分析免疫性状(血红蛋白含量，红细胞压积，红细胞平均容积，血液抗体IgG含量，平均血红蛋白浓度，平均血红蛋白含量，白细胞总数和红细胞总数)和生产性状(初生达结束体重(90KG)日龄，屠宰率，估算眼肌面积(cm²)，腿臀比率，板油率，肌内脂肪，剪切率，PH值，平均日增重，背膘厚，肉色，大理石纹，失水率和滴水损失)：

y_ijk＝μ+GENOTYPE_i+SEX_j+COMBINATION_k+ε_ijk，

其中，y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPE_i为基因型效应，SEX_j为性别效应，COMBINATION_k为不同组合的效应，ε_ijk为随机误差，假定服从N(0，σ²)分布。

不同基因型之间性状的性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)如表2所示，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。

表2  不同基因型与部分生长性状，免疫性状的关联分析

基因型	估算眼肌面积(cm2)	肌内脂肪含量(％)	IgG2(mg/ml)
				AAACCC	23.053±2.45927.894±1.06831.834±2.940	4.160±0.4563.341±0.1982.728±0.545	66.791±3.60257.996±1.64458.594±4.650
AA/ACAA/CCAC/CC	0.0750.025*0.212	0.1040.047*0.294	0.030*0.1680.904

注：^**表示差异极显著，^*表示差异显著。

表2表明，CC基因型个体的估算眼肌面积(cm²)值显著高于AA基因型的对应值，AC基因型的对应值居中；而AA基因型肌内脂肪含量的对应值最高，AC基因型肌内脂肪含量的对应值其次，CC基因型肌内脂肪含量的对应值最小，AA基因型肌内脂肪含量的对应值显著高于CC基因型的对应值；因此，可以说明CC基因型个体瘦肉产率比较高，而AA基因型个体的肌内脂肪含量比较高，肉质风味好。AA基因型的IgG2含量最高，并且显著高于AC基因型；CC基因型对应值次之，杂合AC基因型个体的对应值最低，表明AA基因型个体的免疫性状较好。

                                  序列表

<160>5

<210>1

<211>595

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(244)

<223>n＝a或c

<400>1

ttgtgttcac caaggaggac ctcactgaga tcagggacat gctgctggcc aataaggtga     60

ggggagaatc agcttggctg aagaggcctt atcattaatt ttggctcctt aaaagcaaga    120

aaaaaagaag acaatctttt tcaggttgta gctgtggaaa gaagttttct cattgtttgt    180

cctttttgtt caggtgccag ctgccgcccg tgctggtgcc atagccccat gcgaagtcac    240

tgtncctgcc cagaacactg gtctggggcc tgagaagacc tccttcttcc aggctttagg    300

catcaccact aaaatctcca ggggcaccat tgaaatcctg gtgagtgggc ctggcttggc    360

ctgtgccagc caggcaggtg gcgggggctt ggttgctgtg gacctgctgg atgtctgggt    420

taactgtcac ctaccttgtt tttcagagtg atgtgcagct gattaagact ggagacaaag    480

tgggagccag tgaagccacg ttgctgaaca tgttgaacat ctcccccttc tcctttgggc    540

tgatcatcca gcaggtgttt gacaatggca gcatctacaa ccctgaagtg cttga         595

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ttgtgttcac caaggaggac                                                 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gtgatgtcaagcacttcagg                                                  20

<210>4

<211>1293

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(545)

<223>n＝a或c

<400>4

gtacgactca ctatagggcg aattgggtac cgggcccccc ctcgaggtcg acggtatcga     60

taagcttgat atcgaattcg tatcggccat tacggcctac tggctctcgc caggcgtcct    120

cgtgtgagtg acatcgtctt taaaccctgc gtggcaatcc ctgacgcacc gccgtgatgc    180

ccagggaaga cagggcgacc tggaagtcca actacttcct taagataatc caacttctgg    240

atgattatcc gaaatgcttc attgtgggag cagacaatgt gggctccaag cagatgcagc    300

agatccgcat gtctctccgc gggaaagccg tggtgctgat gggcaagaac accatgatgc     360

gcaaggccat ccgagggcac ctggaaaaca acccagccct ggagaaactg ttgcctcaca     420

tccgggggaa cgtgggcttt gtgttcacca aggaggacct cactgagatc agggacatgc     480

tgctggccaa taaggtgcca gctgccgccc gtgctggtgc catagcccca tgcgaagtca     540

ctgtncctgc ccagaacact ggtctggggc ctgagaagac ctccttcttc caggctttag     600

gcatcaccac taaaatctcc aggggcacca ttgaaatcct gagtgatgtg cagctgatta     660

agactggaga caaagtggga gccagtgaag ccacgttgct gaacatgttg aacatctccc     720

ccttctcctt tgggctgatc atccagcagg tgtttgacaa tggcagcatc tacaaccctg     780

aagtgcttga catcaccgag gaaactctgc attctcgctt cctggagggt gtccgcaatg     840

ttgccagcgt atgtctgcag attggttacc caactgttgc atctgtaccc cattctatca     900

tcaatgggta caagcgggtc ctggctttgt ctgtggaaac tgattacacc ttcccacttg     960

ctgaaaaggt caaggccttc ttggctgatc catctgcctt tgtggctgct gcccctgtgg     1020

ctgcagccac cactgctgct cctgctgctg ctgctgcagc cccagccaag gttgaagcaa    1080

aggaggagtc ggaggagtcg gacgaggata tgggatttgg tctctttgac taaattacca    1140

aaaagcaacc aagtcagcca gctttatttg tgaaacaaag aaataagggc ttactcctaa    1200

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacat gtcggccgcc tcggcctatg tgcggccgcc    1260

accgcggtgg agctccagct tttgttccct tta                                 1293

<210>5

<211>318

<212>PRT

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>5

Met Pro Arg Glu Asp Arg Ala Thr Trp Lys Ser Asn Tyr Phe Leu Lys

1               5                   10                  15

Ile Ile Gln Leu Leu Asp Asp Tyr Pro Lys Cys Phe Ile Val Gly Ala

            20                  25                  30

Asp Asn Val Gly Ser Lys Gln Met Gln Gln Ile Arg Met Ser Leu Arg

        35                  40                  45

Gly Lys Ala Val Val Leu Met Gly Lys Asn Thr Met Met Arg Lys Ala

    50                  55                  60

Ile Arg Gly His Leu Glu Asn Asn Pro Ala Leu Glu Lys Leu Leu Pr0

65                  70                  75                  80

His Ile Arg Gly Asn Val Gly Phe Val Phe Thr Lys Glu Asp Leu Thr

                85                  90                   95

Glu Ile Arg Asp Met Leu Leu Ala Asn Lys Val Pro Ala Ala Ala Arg

            100                 105                 110

Ala Gly Ala Ile Ala Pro Cys Glu Val Thr Val Pro Ala Gln Asn Thr

        115                 120                 125

Gly Leu Gly Pro Glu Lys Thr Ser Phe Phe Gln Ala Leu Gly Ile Thr

    130                 135                 140

Thr Lys Ile Ser Arg Gly Thr Ile Glu Ile Leu Ser Asp Val Gln Leu

145                 150                 155                 160

Ile Lys Thr Gly Asp Lys Val Gly Ala Ser Glu Ala Thr Leu Leu Asn

                165                 170                 175

Met Leu Asn Ile Ser Pro Phe Ser Phe Gly Leu Ile Ile Gln Gln Val

            180                 185                 190

Phe Asp Asn Gly Ser Ile Tyr Asn Pro Glu Val Leu Asp Ile Thr Glu

        195                 200                 205

Glu Thr Leu His Ser Arg Phe Leu Glu Gly Val Arg Asn Val Ala Ser

    210                 215                 220

Val Cys Leu Gln Ile Gly Tyr Pro Thr Val Ala Ser Val Pro His Ser

225                 230                 235                 240

Ile Ile Asn Gly Tyr Lys Arg Val Leu Ala Leu Ser Val Glu Thr Asp

                245                 250                 255

Tyr Thr Phe Pro Leu Ala Glu Lys Val Lys Ala Phe Leu Ala Asp Pro

            260                 265                 270

Ser Ala Phe Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala

        275                 280                 285

Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Val Glu Ala Lys Glu Glu

    290                 295                 300

Ser Glu Glu Ser Asp Glu Asp Met Gly Phe Gly Leu Phe Asp

305                 310                 315

Claims (8)

1、一种猪免疫，生长性状相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：5；

2)将序列表中SEQ ID №：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪免疫，生长性状相关的蛋白质。

2、权利要求1所述的猪免疫，生长性状相关蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：4的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：5蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4、根据权利要求2所述的的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸片段之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：5蛋白质序列的DNA；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、含有权利要求2或3或4所述编码基因的载体。

6、含有权利要求2或3或4所述编码基因的细胞系。

7、含有权利要求2或3或4所述编码基因的宿主菌。

8、一种检测猪免疫，生长性状的方法，是用由序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID№：3的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行下述至少一种检测：

1)对所述PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO：1的5′端第244位碱基为C还是A；

2)用Csp6I酶切所述PCR扩增产物，检测得到的酶切片段中是否含有一条595bp条带和/或一条353bp条带和一条242bp条带。

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