CN1752214A - 一种预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一种预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法。根据鸡H－FABP基因序列设计一对引物；利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出H－FABP基因内含子II中的14bp插入/缺失的变异位点；分别对鸡H－FABP基因内含子II缺失14bp、含有14bp插入及该位点杂合时进行命名。实验结果表明具有BB基因型个体的腹脂重和腹脂率比AA基因型个体的腹脂重低4.83－17.2克和0.2％－1％。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明的分子标记方法对鸡腹脂性状进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹脂性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。

Description

一种预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法

(一)、所属领域

本发明属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用分子标记检测鸡体脂性状的方法。

(二)、背景技术

快大型肉鸡体脂(尤其是腹脂)蓄积过多已成为一个突出的问题。肉仔鸡体内沉积过多的脂肪有诸多不利：(1)明显降低饲料转化效率，因为沉积单位重量的脂肪组织比沉积单位重量的瘦肉多消耗三倍的能量；(2)降低了胴体瘦肉对脂肪组织的比例，因而降低了分割肉产量；(3)加工者和消费者将肉仔鸡体内沉积的这些脂肪的很大一部分(腹脂垫、肌胃周围脂肪、嗉囔脂肪及肠系膜脂肪等)丢弃，这不仅增加了加工者和消费者的负担，而且增加了废物及处理水中的脂肪含量，从而污染环境。由此看来，肉仔鸡体内沉积过多的脂肪将会给生产者、加工者和消费者造成显而易见的经济损失。肉种鸡过肥将会严重影响产蛋率、受精率和孵化率，并且会诱导脂肪肝综合症的发生，从而加大了产蛋期的死淘率。因此，控制脂肪在鸡体内的过多蓄积，进一步提高肉鸡的饲料转化效率和胴体质量是我国急需研究解决的重大问题。

脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein，FABP)属于脂类结合蛋白超家族的成员，存在于动物体的细胞内，是一类分子量为14-15KD的蛋白。FABP对长链脂肪酸具有很强的结合能力，其主要功能是运输细胞内的脂肪酸、调节细胞的生长及分化、细胞的信号传导、基因转录和保护游离脂肪酸的酶解。在哺乳动物中至少有9种FABP已经被分离出来，它们分别是肝脏(L-)FABP、小肠(I-)FABP、心脏(H-)FABP、脂肪(A-)FABP、表皮(E-)FABP、回肠(IL-)FABP、脑(B-)FABP、髓磷脂(M-)FABP和睾丸(T-)FABP。这些蛋白由126-134个氨基酸组成，并且由第一个被分离的组织而命名。编码这些蛋白的基因具有相同的结构，都是由4个外显子和3个内含子构成，并且外显子的长度基本相同或相近，但内含子的长度变异很大。

在哺乳动物中，对各种不同类型的FABP的功能已经有了较为深入地研究。其中H-FABP基因敲除的小鼠表现出对外围长链脂肪酸利用的严重缺陷，心脏不能有效地摄取在正常情况下作为主要燃料的血浆中长链脂肪酸，并开始对葡萄糖进行利用(Binas等，1999)。H-FABP的缺失不能被完全补偿，并且导致对剧烈运动的耐受性降低，会导致老龄者局部的心肌肥大。进一步研究表明，H-FABP基因敲除的小鼠心肌细胞在舒张和收缩时，对棕榈酸的摄取和氧化都显著减少(Schaap等，1999)。H-FABP基因敲除的小鼠心肌细胞在舒张时，对葡萄糖氧化作用增加了80％。综合考虑，这些结果表明H-FABP在长链脂肪酸的摄取与氧化、燃料的选择和能量代谢的动态平衡中起着重要的作用。Gerbens等(1999，2000)在研究中发现猪H-FABP基因的5′调控区和第二个内含子中存在HaeIII、HinfI和MspI三个限制片断长度多态，这些位点的多态性与猪IMF(Intramuscular Fat)含量、BFT(backfat thickness)及体重显著相关。

FABP在禽类的肝脏、肌肉、小肠、视网膜和脂肪组织中也已被分离出来(Sewell等，1989a，1989b；Sams等，1990，1991；Gotz等，1996；Sellner等，1993)。Gotz等(1996)在鸡的肌胃平滑肌中分离出一种FABP，推测它的可能功能是通过运输多聚不饱和脂肪酸来调节平滑肌的收缩。另外在长距离迁徙的鸟的飞行肌中分离出一种FABP(M-FABP)，它的部分氨基酸序列与人的H-FABP有80％的同源性，该蛋白分别占胸大肌和心肌细胞质中可溶性蛋白的14％和21％，推测M-FABP在鸟的长距离飞行中对脂肪酸的供应具有重要作用，脂肪酸被认为是飞行动力的主要燃料。禽类FABP基因多态性的研究刚刚起步。王启贵等(2001)研究表明EX-FABP基因的多态性与腹脂含量相关极显著(p＜0.01)。

王启贵等(2004)克隆了鸡H-FABP基因，研究表明该基因由4个外显子和3个内含子构成，并且在该基因的内含子II中发现一个14bp插入/缺失的变异位点(Genbank Accession No.AY648562)。

(三)、发明内容

本发明的主要目的是提供一种分子生物学技术，即采用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测鸡腹脂含量，从而预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法。

本发明的目的是这样实现的：

1、根据鸡H-FABP基因序列设计一对引物

HFF7：5’-AGTGGGTTGCAGGGACCCACA-3’

HFR7：5’-GGGCTCTGCATGACTTAAGA-3’；

2、利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；

3、使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出H-FABP基因内含子II中的14bp插入/缺失的变异位点；

4、当鸡H-FABP基因内含子II缺失14bp时，PCR扩增片段长度为181bp，将其命名为AA基因型；当鸡H-FABP基因内含子II含有14bp插入时，PCR扩增片段长度为195bp，将其命名为BB基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带181bp和195bp，将其命名为AB基因型。

本发明还可以包括：

1、其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入/缺失而分类的基因型。

2、其中用于分析基因多态性的部位是内含子。

3、其中用于分析基因多态性的部位是由HFF7和HFR7表不的引物扩增的内含子区。

4、其中用于分析多态性的位点选自鸡H-FABP基因如下序列中第134位至第147位的14个碱基的插入/缺失。

1   AGTGGGTTGC AGGGACCCAC ATCATGGTGA GACCCAAGCCATGGGAACAT CCAACCGTGG

61  GGTGACTCAA GCAATGGGGA GACCTGAGGA CATGCAGGTAATGGGGAGTC CTAAGCTATG

121 GGGACATCCA ACCATTGGGA GATTCAAACT GTGAGAAGACCCAAACAATG GAGAATCTTA

181 AGTCATGCAG AGCCC

5、其中鸡体脂性状是鸡的腹脂重和腹脂率。

6、其中聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为14％。

实验证明具有BB基因型个体的腹脂重和腹脂率显著低于具有AA基因型鸡的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)。在我们所研究的3个群体中，具有BB基因型个体的腹脂重比AA基因型个体的腹脂重低4.83-17.2克；具有BB基因型个体的腹脂率比AA基因型个体的腹脂率低0.2％-1％。

本发明巧妙地采用PCR扩增和凝胶分离的方法检测鸡H-FABP基因内含子II中的14bp插入/缺失的变异位点。由于AA基因型和BB基因型的H-FABP基因片段长度仅差14个碱基，使用琼脂糖凝胶电泳很难将两种基因型分离，因此本发明采用14％的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离两种基因型。

本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的标记基因型对鸡的腹脂性状进行选择时，将使腹脂重和腹脂率分别取得7.7％和15.6％的遗传进展，可以带来很大的经济效益。利用本发明的分子标记方法对鸡腹脂性状进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为鸡的腹脂性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。

(四)、附图说明

附图是H-FABP基因14bp插入/缺失多态位点分析。

(五)、具体实施方案

下面举例对本发明做更详细地描述：

一、实验材料

1.实验动物和性状测定

中国农业大学建立的以明星肉鸡和丝毛乌骨鸡为亲本杂交产生的F₂资源群体，其中肉鸡做父本为正交，乌骨鸡做父本为反交。本研究选取正反交各4个家系，共计564只鸡。东北农业大学育种基地建立的肉鸡高低脂双向选择品系第六世代230只鸡、第七世代397只鸡。

F₂代群体于12周龄时翅静脉采血，草酸盐抗凝，称量活重之后屠宰，然后称量屠体重(g)和腹脂重(g)，并除以屠体重计算出腹脂率。肉鸡高低脂双向选择品系第六世代于7周龄时翅静脉采血，EDTA-Na₂抗凝，称量活重之后屠宰，然后测量腹脂重(g)，并除以7周龄活重计算出腹脂率。肉鸡高低脂双向选择品系第七世代于7周龄时翅静脉采血，EDTA-Na₂抗凝，称量活重之后屠宰，然后测量腹脂重(g)，除以7周龄活重计算出腹脂率。

2.药品和酶

三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL2000、dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶，大连宝生物公司；琼脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，原平皓公司。

3.主要仪器

PTC-200PCR仪(PERKIN ELMER)、Biometra梯度PCR仪、UVP多功能成像系统、Ultrospec 1000紫外分光光度计、BECKMAN冷冻离心机、Milli-Q超纯水仪、DYY-III2稳压电泳仪及配套电泳槽。

二、实验方法

1.缓冲液与常用试剂的配制

1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

TE缓冲液：10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高压灭菌。

20×SET缓冲液：3M NaCl，1M Tris·Cl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，高压灭菌。

5×TBE缓冲液：54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。

50×TAE缓冲液：242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。

1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

0.5M EDTA：186.1g EDTA溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。

3M NaAc(pH5.2)：408.1g NaAc·3H₂O溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至7.0，定容至1000ml。

200ml银染液：NH₃·H₂O 2ml；3.6％NaOH 4.2ml；20％AgNO₃ 3.6ml，加去离子水至200ml。

200ml显色液：1％柠檬酸钠1ml；甲醛100ul；加去离子水至200ml。

禽血裂解液：10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。

2.引物的设计与合成

以下引物由上海博亚生物公司合成：

HFF7：5’-AGT GGG TTG CAG GGA CTC ACA-3’

HFR7：5’-GGG CTC TGC ATG ACT TAA GA-3’

3.鸡基因组DNA的小量提取

方法一：

(1)取20μl抗凝血液，加入500μl禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。

(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。

(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。

(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。

(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。

(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μl TE中。

方法二：

(1)将20μl全血加入装有700μl 1×SET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。

(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μl和10％的SDS至终浓度0.5％，55℃消化12h。

(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀

(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。

(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23∶1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。

(7)向水相中加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。

(8)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。

(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。

(10)加入200μl的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。

4.PCR反应

(1)以鸡DNA为模板进行PCR扩增，25ul反应体系中包含以下溶液或试剂：

10×PCR reaction buffer    2.5μl

dNTP Mixture(各2.5mM)      2.0μl

引物1(10μM)               0.5μl

引物2(10μM)               0.5μl

EX-Taq(5U/μl)             0.25μl

去离子水                   18.25μl

基因组DNA(50ng/μl)        1.0μl

(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。

94℃变性5min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 60sec，30个循环；72℃延伸10min。

(3)反应结束后，取PCR反应液(5～10μl)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。

5.非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳

以浓度为14％、体积为25ml，厚度为0.1cm的胶为例。

(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用0.8％琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。

(2)在100ml烧杯内加入30％丙烯酰胺11.7ml，50％甘油2.5ml，5×TBE 5ml，10％过硫酸铵0.175ml，TEMED 8μl，去离子水5.617ml，混匀后迅速灌胶。

(3)当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚和半小时，多余的丙烯酰胺4℃保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。

(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入1×TBE，用注射器冲洗加样孔。

(5)预电泳10min，同时准备点样。

(6)取2μl PCR产物置于PCR管中，加2μl上样Buffer混匀，用微量注射器点样。

(7)120伏，电泳8-10h。

6.硝酸银染色方法

(1)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70％乙醇中，水浴震荡器缓慢摇匀固定10-15min。(乙醇用完可以回收)。

(2)双蒸水洗胶2遍，每次2min，去除残留乙醇。

(3)用200ml染色液染色30min。

(4)双蒸水洗胶3遍，每次2min。

(5)用200ml显色液显色，约10-30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液。

(6)去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。

7.统计模型建立

(1)根据F₂资源群体的特点，构建线性模型如下：

Y＝μ+G+F+S+H+R+e①

Y＝μ+a+G+F+S+H+R+e②

Y为性状观察值，μ为群体均值，a为剩余多基因效应，G为基因型固定效应，F为家系固定效应，S为性别固定效应，R为正反交(组合)固定效应，H为孵化批次固定效应，e为剩余值。对于模型①使用统计软件JMP4(SAS Institute Inc.，Cary，NC)检验基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。对于模型②使用统计软件MTDFREML估计基因型对性状的遗传或表型贡献率。

(2)根据肉鸡高低脂双向选择品系的特点，构建线性模型如下：

Y＝μ+G+L+H+e

Y为性状观察值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，H为品系固定效应，H为孵化批次固定效应，e为剩余值。使用统计软件JMP4检验基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。

实施例1、鸡H-FABP基因的多态性与F₂资源群体腹脂性状的相关

利用本发明的引物(HFF7和HFR7)对F₂资源群体564个个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在F₂资源群体中共检测到3种基因型，对于PCR扩增片段长度为181bp的个体，将其命名为AA基因型；对于PCR扩增片段长度为195bp的个体，将其命名为BB基因型；对于PCR扩增产物为两条带(181bp和195bp)的个体，将其命名为AB基因型(附图)。

对H-FABP基因14bp插入/缺失的变异位点的3种基因型与F₂资源群体564个个体的腹脂重和腹脂率进行最小二乘分析，结果表明基因型对F₂资源群体的腹脂重和腹脂率有显著影响(P＜0.05)(表1)。

表1.F2资源群体腹脂性状的最小二乘分析结果(P值)

              腹脂重                     腹脂率

基因型        0.039                      0.017

性别          0.0001                     0.0001

孵化批次      0.0001                     0.0001

家系          0.0026                     0.0001

正反交组合    0.091                      0.0126

对3种基因型间F₂资源群体腹脂性状的最小二乘均值进行多重比较，结果表明AB和BB基因型个体的腹脂重和腹脂率显著低于AA型个体的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有BB基因型个体的腹脂重和腹脂率比AA基因型个体的腹脂重和腹脂率分别低17.2克和1.0％(表2)。

表2.H-FABP基因不同基因型对F₂资源群体鸡只腹脂性状的影响

基因型	个体数	腹脂重最小二乘均值(克)	腹脂率最小二乘均值
				AAABBBadD	4351227	48.97±5.05a42.83±5.52b31.78±10.64b-8.602.455-0.285	0.0327±0.0029a0.0287±0.0031b0.0226±0.0060b-0.00510.00105-0.206

均值比较时同一列无相同字母者差异显著(^a-bp＜0.05)

D：显性度D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(AA+BB)/2

表3列出基因型对F2资源群体鸡只腹脂性状的遗传贡献率和表型贡献率。H-FABP基因的变异位点对F₂群体的腹脂重和腹脂率的遗传贡献率都较大，尤其是对腹脂率的遗传贡献率达到15.6％。因此推测用该基因对腹脂性状进行标记辅助选择，会获得较大的遗传进展。

表3.H-FABP基因对F₂群体鸡腹脂性状的遗传和表型贡献率

性状     A¹       E          G       遗传贡献率(％)   表型贡献率(％)

腹脂重   155.66    463.36     12.91        7.7             2.0

腹脂率   0.00002   0.00011    0.0000037    15.6            2.8

¹A为剩余多基因效应方差；E为残差的方差；G为检测的基因效应方差

实施例2、鸡H-FABP基因的多态性与肉鸡高低脂双向选择品系第六世代腹脂性状的相关

利用本发明的引物(HFF7和HFR7)对肉鸡高低脂双向选择品系第六世代的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在第六世代中共检测到3种基因型，对于PCR扩增片段长度为181bp的个体，将其命名为AA基因型；对于PCR扩增片段长度为195bp的个体，将其命名为BB基因型；对于PCR扩增产物为两条带(181bp和195bp)的个体，将其命名为AB基因型。

对H-FABP基因14bp插入/缺失的变异位点的3种基因型与第六世代230个个体的腹脂重和腹脂率进行最小二乘分析，结果表明基因型对第六世代个体的腹脂率有显著影响(P＜0.05)；对腹脂重有一定影响(P＝0.066)(表4)。

表4.第六世代腹脂性状的最小二乘分析结果(P值)

              腹脂重                   腹脂率

基因型        0.066                    0.036

品系          0.0001                   0.0001

对3种基因型间第六世代鸡只腹脂性状的最小二乘均值进行多重比较，结果表明BB基因型个体的腹脂重和腹脂率显著低于AA和AB型个体的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有BB基因型个体的腹脂重和腹脂率比AA基因型个体的腹脂重和腹脂率分别低14.8克和0.54％(表5)。

表5.H-FABP基因不同基因型对第六世代鸡只腹脂性状的影响

基因型	个体数	腹脂重最小二乘均值(克)	腹脂率最小二乘均值
				AAABBBadD	171545	53.43±1.19a55.08±2.07a38.64±6.72b-7.409.04-1.22	0.0207±0.0004a0.0215±0.0007a0.0154±0.0023b-0.00270.0215±0.0007a-1.278

均值比较时同一列无相同字母者差异显著(^a-bp＜0.05)

D：显性度D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(AA+BB)/2

实施例3、鸡H-FABP基因的多态性与肉鸡高低脂双向选择品系第七世代腹脂性状的相关

利用本发明的引物(HFF7和HFR7)对肉鸡高低脂双向选择品系第七世代的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。在第七世代中共检测到3种基因型，对于PCR扩增片段长度为181bp的个体，将其命名为AA基因型；对于PCR扩增片段长度为195bp的个体，将其命名为BB基因型；对于PCR扩增产物为两条带(181bp和195bp)的个体，将其命名为AB基因型。

对H-FABP基因14bp插入/缺失的变异位点的3种基因型与第七世代397个个体的腹脂重和腹脂率进行最小二乘分析，结果表明基因型对第七世代个体的腹脂重和腹脂率有显著影响(P＜0.05)(表6)。

表6第七世代腹脂性状的最小二乘分析结果(P值)

              腹脂重                       腹脂率

基因型        0.025                        0.031

品系          0.0001                       0.0001

孵化批次      0.0188                       0.1845

对3种基因型间的第七世代鸡只各性状的最小二乘均值进行多重比较，结果表明AB和BB基因型个体的腹脂重和腹脂率显著的低于AA型个体的腹脂重和腹脂率(P＜0.05)；具有BB基因型个体的腹脂重和腹脂率比AA基因型个体的腹脂重和腹脂率分别低4.83克和0.16％(表7)。

表7.H-FABP基因不同基因型对第七世代鸡只腹脂性状的影响

基因型	个体数	腹脂重最小二乘均值(克)	腹脂率最小二乘均值
				AAABBBadD	26610724	49.84±0.78a46.04±1.21b45.01±2.51b-2.415-1.3850.573	0.0206±0.00030a0.0191±0.00047b0.0190±0.00098b-0.0008-0.00070.875

均值比较时同一列无相同字母者差异显著(^a-bp＜0.05)

D：显性度D＝d/a；a＝(BB-AA)/2；d＝AB-(AA+BB)/2

Claims (8)

1、一种预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：

(1)、根据鸡H-FABP基因序列设计一对引物

HFF7：5’-AGTGGGTTGC AGGGACCCAC A-3’

HFR7：5’-GGGCTCTGCA TGACTTAAGA-3’；

(2)、利用该引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增；

(3)、使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出H-FABP基因内含子II中的14bp插入/缺失的变异位点；

(4)、当鸡H-FABP基因内含子II缺失14bp时，PCR扩增片段长度为181bp，将其命名为AA基因型；当鸡H-FABP基因内含子II含有14bp插入时，PCR扩增片段长度为195bp，将其命名为BB基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带181bp和195bp，将其命名为AB基因型。

2、根据权利要求1所述的预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入/缺失而分类的基因型。

3、根据权利要求2所述的预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：其中用于分析基因多态性的部位是内含子。

4、根据权利要求3所述的预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：其中用于分析基因多态性的部位是由HFF7和HFR7表示的引物扩增的内含子区。

5、根据权利要求4所述的预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：其中用于分析多态性的位点选自鸡H-FABP基因如下序列中第134位至第147位的14个碱基的插入/缺失。

1    AGTGGGTTGC AGGGACCCAC ATCATGGTGA GACCCAAGCCATGGGAACAT CCAACCGTGG

61   GGTGACTCAA GCAATGGGGA GACCTGAGGA CATGCAGGTAATGGGGAGTC CTAAGCTATG

121  GGGACATCCA ACCATTGGGA GATTCAAACT GTGAGAAGACCCAAACAATG GAGAATCTTA

181  AGTCATGCAG AGCCC

6、根据权利要求1-5任何一项所述的预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：其中鸡体脂性状是鸡的腹脂重和腹脂率。

7、根据权利要求1-5任何一项所述的预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为14％。

8、根据权利要求6所述的预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法，其特征是：其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为14％。

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