CN1274851C - 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1274851C CN1274851C CN 200410088716 CN200410088716A CN1274851C CN 1274851 C CN1274851 C CN 1274851C CN 200410088716 CN200410088716 CN 200410088716 CN 200410088716 A CN200410088716 A CN 200410088716A CN 1274851 C CN1274851 C CN 1274851C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- avian influenza
- influenza virus
- subtype avian
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。本发明提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒，包括A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL，H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物H5F和H5L以及N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L；所述NPF具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述NPL具有序列表中序列2的核苷酸序列，所述H5F具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述H5L具有序列表中序列4的核苷酸序列，所述N1F具有序列表中序列5的核苷酸序列，所述N1L具有序列表中序列6的核苷酸序列。本发明的方法及试剂盒不但可用于实验室的诊断与科研，还可用于大规模的流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测领域中一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒。
背景技术
高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒所引起的禽类烈性传染病，发病急，传播快，致死率高，对养殖业可造成致命性的打击。高致病性禽流感病毒的亚型通常为H5和H7亚型；2004年，发生于中国和亚洲其他国家和地区的流感病毒亚型主要为H5N1亚型，由于该亚型不仅对亚洲的养殖业造成了严重的经济损失，而且在泰国、越南还造成了人的感染与死亡，因而又具有重要的公共卫生学意义。在流禽感的控制环节中，最重要的是要进行快速的诊断，及时划定疫点、疫区，并采取封锁等控制措施，防止疫情的扩散。因此，建立一种灵敏、特异、快速的诊断方法具有重要的现实意义。
传统的流感病毒检测方法为采用鸡胚进行病毒的分离培养，然后采用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验进行亚型的鉴定，试验费时、费力，不能做出快速而及时的诊断。因此，临床上，迫切需要一种能快速诊断H5N1亚型禽流感病毒的检测方法，不但能够确定病毒是否为A型流感病毒，而且能确定是否为H5血凝素亚型和N1神经氨酸酶亚型。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒。
本发明所提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒，包括A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL，H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物H5F和H5L以及N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L；所述NPF具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述NPL具有序列表中序列2的核苷酸序列，所述H5F具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述H5L具有序列表中序列4的核苷酸序列，所述N1F具有序列表中序列5的核苷酸序列，所述N1L具有序列表中序列6的核苷酸序列。
序列表中的序列1由20个碱基组成，序列表中的序列2由20个碱基组成，序列表中的序列3由19个碱基组成，序列表中的序列4由19个碱基组成，序列表中的序列5由20个碱基组成，序列表中的序列6由21个碱基组成；其中，m＝a或c，y＝t或c，r＝a或g，k＝g或t，w＝a或t。
所述A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL的PCR扩增产物长度为467bp；所述H5血凝素特异性引物H5F和H5L的PCR扩增产物长度为545bp；所述N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L的PCR扩增产物长度为368bp。
所述引物NPF，NPL，H5F，H5L，N1F和N1L包含于多重RT-PCR反应液中，每43.8μl所述多重RT-PCR反应液含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)。
为了便于现场检测，所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶，AMV反转录酶，提取样品总RNA所需试剂(如裂解液，氯仿，异丙醇，乙醇，RNase free水)以及电泳检测试剂(如溴化乙锭，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液，标准PCR产物)。
所述标准PCR产物为从已鉴定的H5N1亚型流感病毒提取RNA，反转录后以cDNA为模板，以H5F和H5L为引物扩增并回收的545bp PCR扩增产物；以NPF和NPL为引物扩增并回收的467bp PCR扩增产物以及以N1F和N1L为引物扩增并回收的368bp PCR扩增产物的混合产物。
所述RNA酶抑制剂规格为30U/μl。
为了在实验中避免由于人为操作所造成的假阴性或假阳性，该试剂盒还包括阳性对照液(H5N1亚型灭活病毒液)和阴性对照液(RNase free水)。
本发明的第二个目的是提供一种快速检测H5N1亚型禽流感病毒的方法。
本发明所提供的检测H5N1亚型禽流感病毒的方法，是以被检样品的总RNA为模板，利用上述检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒进行多重RT-PCR反应，被检样品若同时出现467bp、545bp和368bp的扩增带，被检样品为H5N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和545bp的扩增带，被检样品为H5亚型禽流感病毒阳性；被检样品若同时出现467bp和368bp的扩增带，被检样品为N1亚型禽流感病毒阳性；被检样品若只出现467bp的扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阳性；被检样品若不出现扩增带，被检样品为A型禽流感病毒阴性。
所述多重RT-PCR反应的50μl反应体系包括43.8μl多重RT-PCR反应液(含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mMMgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)；0.8μl RNA酶抑制剂(规格为30U/μl，Genview公司生产)，0.8μl Taq DNA聚合酶，0.6μl AMV反转录酶，4.0μl待检样品总RNA。
所述多重RT-PCR反应的循环程序为42℃45min；95℃3min；95℃30s，55℃40s，65℃2min进行35个循环；65℃延伸10min。
本发明巧妙地利用了多重RT-PCR方法，制备了一步法快速检测H5N1亚型禽流感病毒的试剂盒。该试剂盒能特异、灵敏地检测出H5N1亚型禽流感病毒的感染。而且其制备容易，操作简单，敏感性高，反应快速(可在5小时内完成对H5N1亚型禽流感病毒的检测与鉴定)。不但可用于实验室的诊断与科研，还可用于大规模的流行病学调查，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例1、样品的采集和处理
1、样品的采集
组织样品：病死或扑灭病禽，取肝、脑、肺等组织；棉拭子：鼻腔拭子、泄殖腔拭子。2-8℃保存，送实验室检测。要求送检病料新鲜。
2、样品处理：每份样品分别处理
(1)组织样品处理：称取待检病料100mg置研磨器中，加入0.8ml裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)研磨，把研磨好的病料移至1.5ml离心管中，4℃8000rpm离心5min，取上清250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl上述裂解液，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
(2)全血样品处理：待血凝后，取血清于1.5ml灭菌离心管中，4℃8000rpm离心5min，取上清250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
(3)棉拭子处理：将浸液中的棉拭子充分捻动，拧干后弃去拭子，4℃8000rpm离心5min，取上清液250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
3、阳性对照处理：取阳性对照液(H5N1亚型灭活病毒液)250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
4、阴性对照(RNase free水)：取灭菌双蒸水250μl，置于1.5ml灭菌离心管中，加入750μl裂解液(硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀)，剧烈振荡混匀，室温放置5min。
实施例2、检测H5N1亚型禽流感病毒
1、检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒
10头份试剂盒由表1所示的试剂组成。
表1.试剂盒(10头份)的组成
| 名称 | 数量(10头份) |
| 阳性对照液 | 3.0ml |
| 裂解液 | 30.0ml |
| 氯仿 | 8.0ml |
| 异丙醇 | 18.0ml |
| 75％乙醇 | 35.0ml |
| RNase free水 | 6.0μl |
| RNA酶抑制剂 | 60.0μl |
| 多重RT-PCR反应液 | 1.5ml |
| TaqDNA聚合酶 | 26.0μl |
| AMV反转录酶 | 20.0μl |
| 溴化乙锭溶液 | 30.0μl |
| 50×TAE电泳缓冲液(50倍稀释用) | 20.0ml |
| 上样缓冲液 | 200μl |
| 标准PCR产物 | 35.0μl |
其中，部分试剂的组成、配制方法如下：
裂解液：硫氰酸胍，0.8M；硫氰酸铵，0.4M；醋酸钠缓冲液，0.1M；甘油5％和苯酚38％，混匀；RNase free水：1mlDEPC加到1L蒸馏水中，摇匀，高压灭菌。
每43.8μl多重RT-PCR反应液含有RNase free水，17.3μl；10×PCR Buffer，7μl；2.5mM each dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；引物共7μl(NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，N1F和N1L各1.5μl，引物浓度均为20μM)。
10mg/ml溴化乙锭(EB)贮存液：100mg EB溶于10ml双蒸水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下闭光保存。
50×TAE电泳缓冲液(50倍稀释用)：Tris碱，121g；冰醋酸，28.55ml；0.5M EDTA(pH8.0)，50ml。加双蒸水，混合，定容至500ml，工作液浓度为1×TAE。
0.5M EDTA(pH8.0)：186.1g EDTA溶于800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10M NaOH调节PH值至8.0，定容至1L。
75％乙醇：75ml乙醇加25ml水，-20℃保存。
6×凝胶加样缓冲液：溴酚蓝，0.025g；二甲苯青FF，0.025g；甘油，3ml。加入一定量去离子水溶解，定容到10ml。
RNA酶抑制剂：规格为30U/μl，Genview公司生产。
标准PCR产物为从已鉴定的H5N1亚型流感病毒提取RNA，反转录后以cDNA为模板，以H5F和H5L为引物扩增并回收的545bp PCR扩增产物，以NPF和NPL为引物扩增并回收的467bp PCR扩增产物以及以N1F和N1L为引物扩增并回收的368bp PCR扩增产物的混合产物。
2、检测方法
(1)病毒RNA的提取
1)取疑为禽流感病禽肌肉或脏器100mg，按照实施例1的方法进行样品处理，每管加入200μl氯仿，剧烈摇匀，冰浴10min，4℃12000rpm离心15min。
2)取上清500μl于新的1.5ml灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，置液氮中3min，4℃12000rpm离心15min。
3)弃上清，沿管壁缓缓加入1ml 75％乙醇，4℃8000rpm离心3min，倒掉乙醇，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空干燥10min。
4)用50μl RNase free水和1μl RNA酶抑制剂(规格为30U/μl，Genview公司生产)溶解沉淀，即用或-80℃保存备用。
(2)多重RT-PCR反应
每管反应体系为50μl，反应体系如下：
多重RT-PCR反应液 43.8μl
RNA酶抑制剂(购自Genview公司) 0.8μl
Taq DNA聚合酶 0.8μl
AMV反转录酶 0.6μl
样品总RNA 4.0μl
混匀，并作好标记，在自动PCR仪上进行42℃45min；95℃3min；95℃30s，55℃40s，65℃2min，进行35个循环；65℃延伸10min。4℃保存。
(3)电泳
配制1％琼脂糖凝胶，加入EB，工作浓度为0.5μg/ml；10μl PCR产物、3μl标准PCR产物各混合3μl 6×凝胶加样缓冲液，分别上样，于1×TAE电泳缓冲液中电泳，用紫外检测仪观察结果。结果判定时，阳性对照应同时出现545bp、467bp和368bp扩增带，阴性对照无条带出现(引物带除外)。被检样品中同时出现545bp、467bp和368bp的扩增带，表明样品中含有H5N1亚型禽流感病毒。
序列表
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(6)
<223>m＝a或c
<400>1
gcacamagag caat gatgga 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ataacaatag agagaatggt 20
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(8)
<223>y＝t或c
<220>
<221>misc-feature
<222>(11)
<223>r＝a或g
<400>3
cacatgcyca rgacatact 19
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(2)
<223>y＝t或c
<220>
<221>misc-feature
<222>(5)
<223>r＝a或g
<400>4
tytgrttyag tgttgatgt 19
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(5)
<223>k＝g或t
<220>
<221>misc-feature
<222>(11)
<223>r＝a或g
<400>5
ctgtkgctgt rttgaaatac 20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc-feature
<222>(4)
<223>w＝a或t
<220>
<221>misc-feature
<222>(13)
<223>y＝t或c
<400>6
gtcwccgaaa acyccactgc a 21
Claims (7)
1、一种检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒，包括A型禽流感病毒通用引物NPF和NPL，H5亚型禽流感病毒血凝素的特异性引物H5F和H5L以及N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶特异性引物N1F和N1L；所述NPF具有序列表中序列1的核苷酸序列，所述NPL具有序列表中序列2的核苷酸序列，所述H5F具有序列表中序列3的核苷酸序列，所述H5L具有序列表中序列4的核苷酸序列，所述N1F具有序列表中序列5的核苷酸序列，所述N1L具有序列表中序列6的核苷酸序列。
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述引物NPF，NPL，H5F，H5L，N1F和N1L包含于多重RT-PCR反应液中，每43.8μl所述多重RT-PCR反应液含有无RNA酶水，17.3μl；10×PCR缓冲液，7μl；2.5mM dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；浓度均为20μM的NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，浓度均为20μM的N1F和N1L各1.5μl。
3、根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA酶抑制剂，TaqDNA聚合酶，AMV反转录酶，提取样品总RNA所需试剂以及电泳检测试剂。
4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。
5、一种检测H5N1亚型禽流感病毒的方法，是以被检样品的总RNA为模板，利用权利要求1至4中任一项所述的检测H5N1亚型禽流感病毒的专用试剂盒进行多重RT-PCR反应，被检样品若同时出现545bp、467bp和368bp的扩增带，被检样品为H5N1亚型禽流感病毒阳性。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述多重RT-PCR反应的50μl反应体系包括43.8μl多重RT-PCR反应液，0.8μl RNA酶抑制剂，0.8μl Taq DNA聚合酶，0.6μl AMV反转录酶，4.0μl待检样品总RNA；所述多重RT-PCR反应液含有无RNA酶水，17.3μl；10×PCR缓冲液，7μl；2.5mM dNTPs，7.5μl；25mM MgCl2，5μl；浓度均为20μM的NPF、NPL、H5F和H5L各1μl，浓度均为20μM的N1F和N1L各1.5μl。
7、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述多重RT-PCR反应的循环程序为42℃ 45min；95℃ 3min；95℃ 30s，55℃ 40s，65℃ 2min进行35个循环；65℃延伸10min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410088716 CN1274851C (zh) | 2004-11-01 | 2004-11-01 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410088716 CN1274851C (zh) | 2004-11-01 | 2004-11-01 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1635163A CN1635163A (zh) | 2005-07-06 |
| CN1274851C true CN1274851C (zh) | 2006-09-13 |
Family
ID=34847515
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200410088716 Expired - Fee Related CN1274851C (zh) | 2004-11-01 | 2004-11-01 | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1274851C (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1313605C (zh) * | 2005-07-08 | 2007-05-02 | 扬州大学 | 一种禽流感病毒基因重配株d3/f－r2/6及其构建方法 |
| FR2902430B1 (fr) | 2005-11-25 | 2012-11-02 | Biomerieux Sa | Oligonucleotides, utilisation, methode de detection et kit permettant de diagnostiquer la presence des genes h5 et n1 du virus d'influenza a |
| US8007999B2 (en) * | 2006-05-10 | 2011-08-30 | Theranos, Inc. | Real-time detection of influenza virus |
| CN1904068B (zh) * | 2006-05-10 | 2010-12-15 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 |
| CN101070347B (zh) * | 2006-05-12 | 2010-06-30 | 青岛宝麦德生物医药科技有限公司 | 禽流感h5n1新型粘膜免疫疫苗及其应用 |
| CN101323882B (zh) * | 2007-06-14 | 2011-03-23 | 上海市农业科学院 | 一种检测猪流感病毒及血清亚型的引物集及其试剂盒 |
| CN102140453B (zh) * | 2011-01-25 | 2013-03-20 | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 用于扩增h5n1流感病毒np基因核苷酸片段的引物及检测方法 |
| CN104131009B (zh) * | 2014-07-28 | 2016-09-14 | 中国农业大学 | 一种检测不同流感病毒的引物组合物及其应用 |
| CN106676103A (zh) * | 2017-03-01 | 2017-05-17 | 中国农业大学 | 一种检测北美h3n1亚型猪流感病毒的引物组及其应用 |
-
2004
- 2004-11-01 CN CN 200410088716 patent/CN1274851C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1635163A (zh) | 2005-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1476485A (zh) | 一种用于检测非致病性或致病性a型流感病毒h5亚型病毒的试剂盒 | |
| CN1274851C (zh) | 一种检测h5n1亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒 | |
| CN1814805A (zh) | H5、h7、h9亚型禽流感病毒的实时荧光定量pcr检测方法 | |
| CN1687447A (zh) | 一种同步检测三种鱼病病毒的试剂盒及其检测方法 | |
| CN1164767C (zh) | 一种快速定量检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量pcr试剂盒及应用 | |
| CN102191339B (zh) | 一种基因芯片制备方法及检测方法 | |
| CN108085413B (zh) | 一种用于同时检测三种禽病毒病的高通量试剂盒及其检测方法和应用 | |
| CN1289692C (zh) | Sars冠状病毒rna磁性捕获方法及应用该方法的pcr检测 | |
| CN1282750C (zh) | Wssv的fq－pcr诊断试剂盒及检测方法 | |
| CN1900314A (zh) | 一种荧光标记abo基因分型的方法及其试剂盒 | |
| CN1693479A (zh) | 细胞角蛋白19(CK19)mRNA荧光定量RT－PCR检测试剂盒 | |
| CN1690220A (zh) | 禽流感病毒反转录聚合酶链式反应检测方法及试剂盒 | |
| CN1904068A (zh) | 一种h5n1型禽流感病毒荧光扩增检测试剂盒及检测方法 | |
| CN104805217A (zh) | 一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒及其应用 | |
| CN101045939A (zh) | 一种hbv dna基因分型的检测方法及其试剂盒 | |
| CN100340673C (zh) | 人类免疫缺陷病毒hiv－1核酸扩增－荧光定量检测试剂盒 | |
| CN102071263A (zh) | 禽流感病毒h5亚型套式荧光rt-pcr检测方法及检测试剂盒 | |
| Lin et al. | Development of a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification assay to detect avian influenza viruses in clinical specimens | |
| CN1605868A (zh) | 一种鉴定动物皮张的方法 | |
| CN1831139A (zh) | 水产品中致病性副溶血弧菌的分子生物学定量检测方法 | |
| CN1814806A (zh) | 安氏隐孢子虫pcr检测试剂盒 | |
| CN106435030B (zh) | 一种联合检测禽流感h7n9和h9n2的四通道荧光定量pcr检测方法及试剂盒 | |
| CN1858255A (zh) | 马铃薯病毒病两步法多重rt－pcr固相化检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN112941212A (zh) | 用于现场检测布鲁氏杆菌的通用型引物组、试剂盒及方法 | |
| CN1752214A (zh) | 一种预示和鉴定鸡体脂性状的分子标记方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20060913 Termination date: 20091201 |