发明内容 针对上述不足,本发明所要解决的技术问题就是建立一种更快捷、更高特异性和灵敏性的诊断WSSV的反应体系,并提供利用这一反应体系的试剂盒以及以这一试剂盒进行WSSV诊断的检测方法,即提出一种WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒及检测方法。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,有试剂容器,其中有包装下列试剂的试剂容器:
TaqMan Buffer液;
特异性引物-1;
特异性引物-2;
特异性TaqMan探针;
其中,
特异性引物-1的序列为:5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’;
特异性引物-2的序列为:5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’;
特异性TaqMan探针的序列为:5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCTCC-TAMARA-3’。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,还有包装已知病毒拷贝浓度的标准参照品的试剂容器,已知病毒拷贝浓度的标准参照品用于对待测样本中的WSSV DNA浓度进行定量计算。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,还有包装DNA提取剂或DNA提取剂和样本稀释用的生理盐水的试剂容器,DNA提取剂和样本稀释用的生理盐水用于制备待检测样本中的WSSV DNA模板,其中所说的DNA提取剂为含有0.9%NaCl和0.1%二巯基乙醇的溶液。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,还有包装无RNA酶水和/或Taq酶的试剂容器,无RNA酶水和Taq酶用于参加反应。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,以上所说的各种试剂分别装在一个试剂容器内。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,有一PCR反应液试剂容器,内装:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l
的混合液,在混合液中各试剂的体积组分比为:
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针=125∶5∶5∶3。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,所述反应液试剂容器中所装的混合液还包括无RNA酶水;
混合液中各试剂的体积组分比为:
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水=125∶5∶5∶3∶42。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,所称的标准参照品的包装容器有4-6件,其中所包装的标准参照品的病毒拷贝数浓度各不相同,且各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml中的一个。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊检测方法,首先是制备待测样本中的WSSV DNA模板,然后将模板和各标准参照品同时置于各自的反应体系中并同时置入PCR仪进行DNA扩增,扩增完毕后由PCR仪自动得出检测结果,其中
进入PCR仪的待测样本中的WSSV DNA模板反应体系的试剂及材料有:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释,12.5μl;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l,0.5μl;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l,0.5μl;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l,0.3μl;
无RNA酶水,4.2μl;
Taq酶,0.4μl;
待测样本中的WSSV DNA模板,2μl。
进入PCR仪的标准参照品反应体系的材料及试剂有:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释,12.5μl;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l,0.5μl;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l,0.5μl;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l,0.3μl;
无RNA酶水,4.2μl;
Taq酶,0.4μl;
标准参照品,2μl。
一起置入PCR仪中的标准参照品反应体系为4-6个,其中标准参照品的病毒拷贝数浓度各不相同,且各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml中的一个。
在所述方法中,所用的
特异性引物-1的序列为:5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’;
特异性引物-2的序列为:5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’;
特异性TaqMan探针的序列为:5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCTCC-TAMARA-3’。
在PCR仪中的操作过程是:
先作预变性:93℃ 2分钟;
再作变性:93℃ 5秒钟和退火延伸:60℃ 30秒钟的循环40次;
每个循环中退火延伸结束时60℃下作一次单点荧光检测。
对结果的定性判断标准:Ct值≥40为阴性,Ct值<40为阳性;
对结果的定量判断依据:设立横坐标为病毒拷贝数浓度,纵坐标为Ct值的直角坐标系,先将各标准参照品的已知起始病毒拷贝数浓度及其所测得的Ct值在坐标系上作一点,再将以4-6个标准参照品所得的4-6个点作成平滑的曲线为标准曲线,最后根据获得的待测样品的Ct值,从标准曲线上查得该待测样本的起始病毒拷贝数浓度。上述结果由荧光定量仪器自动计算。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,所说的反应体系按以下步骤准备
将TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释,12.5μl;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l,0.5μl;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l,0.5μl;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l,0.3μl;
无RNA酶水,4.2μl等为单元的同一倍数的各试剂混合,或直接吸取含有相同混合比例的混合液,
所准备的反应体系总量=(待测样本的个数+所采用的标准参照品的个数)×上述单元试剂量的和,为保证有足够的量,弥补器壁挂附损失,准备时可适当将各试剂的吸取量扩大同一个比例:K。
即所准备的反应体系总量=K(待测样本的个数+所采用的标准参照品的个数)×上述单元试剂量的和。
混匀后再加入Taq酶,所加入的量为以0.4μl为单元的与上述混合液的同一倍数的量,即Taq酶的加入量=K(待测样本的个数+所采用的标准参照品的个数)×0.4μl。再混匀。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断检测方法,制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法是:先取0.1-50mg待测样本,然后加入DNA提取液50μl混匀,接着在100℃下水浴或干浴10分钟,最后在13,000转/分钟下离心10分钟,所得上清即为待测样本中的WSSV DNA模板。待测样本包括虾体、虾饵料、虾塘底泥、虾塘中生活的其他生物,如蟹等。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,在制备待测样本中的WSSV DNA模板时,为降低待测样本中的蛋白浓度可先在待测样本中加入待测样本重量4倍以下的生理盐水制成待测样本匀浆,并在1,000-1,500转/分钟下离心1分钟,然后取上清50μl加DNA提取液50μl混匀,接着在100℃下水浴或干浴10分钟,最后在13,000转/分钟下离心10分钟,所得上清即为待测样本中的WSSV DNA模板。
本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,配备了所有无法从市场上购得的本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断检测方法所用的各种试剂。本发明提供的WSSV的FQ-PCR
表1
M(病毒拷贝数/ml) |
S |
CV(%) |
109 |
0.23 |
1.60 |
107 |
0.20 |
0.87 |
104 |
0.47 |
1.39 |
实验及计算方法:取某一浓度[如第一行的109(病毒拷贝数/ml)]的被测样本,再分为四份,并按本发明提供的WSSV的FQ-PCR诊断检测方法,平行测得四个浓度为:M1、M2、M3、M4求得Ma=(M1+M2+M3+M4)/4(病毒拷贝数/ml);S=[(M1-Ma)2+(M2-Ma)2+(M3-Ma)2+(M4-Ma)2]1/2/4;CV=(S/Ma)×100% |
特异现象;4、检测所需样本数量:0.1-50mg范围内对检测结果无显著差异;5、检测所需时间:模板制作25分钟,PCR检测25分钟。
具体实施方式 1、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,有4支贴有标明浓度的安瓿瓶,其中分别装有:
序列为5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’的特异性引物-1、
序列为5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’的特异性引物-2;
序列为5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCT CC-TAMARA-3’的特异性TaqMan探针。使用时由操作人员按要求配制成所需浓度。
2、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,除实施例1所有内容外还有1支贴有标明浓度的安瓿瓶,内装标准参照品。使用时由操作人员按要求配制出4-6份浓度各异的标准参照品。
3、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,除实施例2内容外还有1支安瓿瓶,内装DNA提取剂,即含有0.9%NaCl和0.1%二巯基乙醇的溶液,用于制备待检测样本中的WSSV DNA模板。
4、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,除实施例2内容外还有2支安瓿瓶,分别装有DNA提取剂,即含有0.9%NaCl和0.1%二巯基乙醇的溶液,和生理盐水,用于制备待检测样本中的WSSV DNA模板。
5、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,除实施例2内容外还有2支安瓿瓶,分别装有无RNA酶水和Taq酶,用于参加反应。
6、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,有一有盖玻璃管,内装:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l
的混合液0.3ml,在混合液中各试剂的体积组分比是:
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针=125∶5∶5∶3。
7、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,有一有盖塑料管,内装:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l;
无RNA酶水
的混合液0.4ml,混合液中各试剂的体积组分比为:
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水=125∶5∶5∶3∶42。
8、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,其式样如图1所示,盒体为纸盒1,盒内有一以纸折成的衬板2,在该衬板上有8个孔,其中:一个孔内是一有盖塑料管3,内装:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l;
无RNA酶水
的混合液0.4ml,混合液中各试剂的体积组分比为:
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水=125∶5∶5∶3∶42。
一个孔内是1支有盖塑料管4,内装Taq酶8.5μl。
一个孔内是1支有盖塑料管5,内装DNA提取剂,即含有0.9%NaCl和0.1%二巯基乙醇的溶液0.5ml。
一个孔内是1有盖塑料管6,内装生理盐水2.5ml。
另4个孔内各有1支有盖塑料管7,内装病毒拷贝数浓度各为104/ml、105/ml、106/ml、107/ml的标准参照品各5μl。
可用于对待测样本6只一批做两批检测用。
9、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR诊断试剂盒,盒内有一泡沫塑料衬板,在该衬板上有10个槽,一个槽内是有盖玻璃瓶,内装:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/l;
无RNA酶水
的混合液0.6ml,混合液中各试剂的体积组分比为:
TaqMan Buffer液∶特异性引物-1∶特异性引物-2∶特异性TaqMan探针∶无RNA酶水=125∶5∶5∶3∶42。
一个槽内是1支有盖玻璃瓶,内装Taq酶13.5μl。
一个槽内是1支有盖玻璃瓶,内装DNA提取剂,即含有0.9%NaCl和0.1%二巯基乙醇的溶液1.2ml。
一个槽内是1支有盖玻璃瓶,内装生理盐水5ml。
另6个槽内各有1支有盖玻璃瓶,内各装病毒拷贝数浓度各为104/ml、105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml的标准参照品5μl。
可用于对待测样本10只一批做两批检测用。
10、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,一次检测6份待测虾样。
首先是分别制备该6份待测样本中的WSSV DNA模板,准备好4份病毒拷贝数浓度各为103/ml、104/ml、105/ml、106/ml的标准参照品,
然后将:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释,125μl;
序列为5’-CCA GAG ATG GGA GTA ACA CGT-3’的特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l,5μl;
序列为5’-CTC CTC TGT TGC GAA TAC TTC TAA AT-3’的特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l,5μl;
序列为5’-FAM-CGG ACC TTG TGC AAC TCT CCA CCT CC-TAMARA-3’的特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/L,3μl;
无RNA酶水,42μl,注到一个容器内混匀,
又取Taq酶4μl注到该容器内混匀,
再后从该容器内分别吸取混合液18.4μl注入到10只PCR反应管中,为保证足够使用,在配制混合液时可按同比例适当增加各试剂的量,
最后将6份模板和4份标准参照品各取2μl同时分别注入每只PCR反应管中,在每分钟2,000转离心1分钟后同时置入PCR仪进行DNA扩增,其中离心的作用是使模板或标准参照品与PCR反应管中的试剂混匀。扩增操作过程是:
先作:93℃下预变性2分钟;
再作:93℃下变性5秒钟、60℃下退火延伸30秒钟、60℃下单点荧光检测一次的循环40次。
11、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,一次检测10份待测蟹样,
首先是分别制备该10份待测样本中的WSSV DNA模板,准备好6份病毒拷贝数浓度各为105/ml、106/ml、107/ml、108/ml、109/ml、1010/ml的标准参照品,
然后从如实施例9所提供的混合液中提取306μl注入一容器中,其中包含:
TaqMan Buffer液,浓度为2倍稀释,212.5μl;
特异性引物-1,浓度为0.5μmol/l,8.5μl;
特异性引物-2,浓度为0.5μmol/l,8.5μl;
特异性TaqMan探针,浓度为0.3-0.5μmol/L,5.1μl;
无RNA酶水,71.4μl;
又向该容器中注入Taq酶6.8μl混均,
再后从该容器内分别吸取混合液18.4μl注入到16只PCR反应管中,
最后将10份模板和6份标准参照品各取2μl同时分别注入到每只PCR反应管中,在每分钟2,000转离心1分钟后同时置入PCR仪进行DNA扩增,其中离心的作用是使模板或标准参照品与PCR反应管中的试剂混匀。扩增操作过程是:
先作:93℃下预变性2分钟;
再作:93℃下变性5秒钟、60℃下退火延伸30秒钟、60℃下单点荧光检测一次的循环40次。
12、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法:先取0.1mg虾样,加入DNA提取液25μl混匀,接着在100℃下干浴10分钟,最后在13,000转/分钟下离心10分钟,所得上清即为待测虾样本中的WSSV DNA模板。
13、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法:先取1mg虾塘底泥样,加入DNA提取液50μl混匀,接着在100℃下水浴10分钟,最后在13,000转/分钟下离心10分钟,所得上清即为待测虾塘底泥样本中的WSSVDNA模板。
14、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法:先取10mg虾塘内所获之蟹样,再加入20μl生理盐水制成蟹匀浆,并在1,500转/分钟下离心1分钟,然后取上清50μl加入DNA提取液50μ1混匀,接着在100℃下干浴10分钟,最后在13,000转/分钟下离心10分钟,所得上清即为待测蟹样本中的WSSV DNA模板。
15、本实施例提供的WSSV的FQ-PCR检测方法,介绍制备待测样本中的WSSV DNA模板的方法:先取50mg虾样,再加入200μl生理盐水制成虾匀浆,并在1,500转/分钟下离心1分钟,然后取上清50μl加DNA提取液50μl混匀,接着在100℃下水浴10分钟,最后在13,000转/分钟下离心10分钟,所得上清即为待测虾样本中的WSSV DNA模板。