CN2858654Y - 疱疹类病毒基因芯片 - Google Patents
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Abstract
本实用新型提供疱疹类病毒基因芯片,以玻片为载体,有固定在玻片表面矩阵分布的经5`端氨基修饰及杂交的寡核苷酸探针,是在疱疹类病毒的高度同源序列选择通用引物,建立能检测CMV、HSV、EBV、VZV、HHV等所有疱疹类病毒的PCR方法,在疱疹类病毒的可变区选择特异DNA探针,并选择HSV I型与II型、HHV6A与HHV6B等亚型探针,建立基因芯片,用以区分不同疱疹病毒及其亚型。本实用新型提供的疱疹类病毒基因芯片在检测疱疹类病毒中的应用。本实用新型方法设计合理,能早期、快速、准确检测疱疹类病毒,能够区分不同疱疹类病毒,并区分不同亚型及发现疱疹类病毒的混合感染,提高检测疱疹类病毒的敏感性、特异性及准确性。
Description
技术领域
本实用新型属生物技术,涉及基因芯片,尤其涉及疱疹类病毒基因芯片,区分不同疱疹病毒及其亚型,达到早期、快速、准确检测所有疱疹类病毒,以及它们的混合感染。
背景技术
目前,对疱疹类病毒感染仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法。传统的诊断“金标准”为病毒分离,培养一般需要5-21天,费时费力,且敏感性和特异性均欠佳。大多数情况下,脑炎的特异性病毒检测率仅30%,约2/3的感染者无法用病毒分离获得明确诊断。病毒特异性抗体IgM,在体液中要达到有效浓度需10天左右,同时可与其他病毒感染产生交叉反应,从而使其诊断的敏感性和特异性大大降低,而IgG抗体则有95%的患者将维持终生,故IgG抗体的存在只能说明有既往感染,不能说明是现时感染,如要用IgG抗体作为现时感染的诊断依据,必需动态观察其滴度的变化,因而不能满足临床早期诊断的需要。聚合酶联反应(PCR)是近十几年来发展起来的分子生物学技术,它可在一定条件下,短时间内(数小时)使病原体基因片段发生上百万倍的扩增,然后用凝胶电泳、核酸杂交、限制性酶切分析、序列检测。近几年来,PCR诊断技术已广泛地应用于临床诊断疱疹类病毒感染,Pozo应用多对引物的多重PCR来诊断疱疹类病毒感染,虽然能区分不同的病毒,但因其引物间可互相干扰,使其敏感性较低。也有人用各种病毒基因的保守区设计不同引物进行PCR扩增,但只能检测一种病毒,易造成漏诊,无法达到一次性检测所有疱疹类病毒,以及它们的混合感染。
检索国内外近15年有关疱疹类病毒的文献,发现国内外传统的诊断“金标准”病毒分离因时间需1-3周,敏感性及特异性欠佳,达不到早期准确诊断的目的。免疫、分子生物学诊断技术一直是希望提高诊断准确性的方向。特异性IgM、IgG的酶联免疫技术因其出现的时间及维持时间的限制,加之滴度的变化需重复检测,限制了该技术的发展。近10年来,国内外研究的重点主要集中在PCR技术的诊断。病毒特异性引物建立高度敏感的PCR技术已经在临床应用,如我们于90年代末(1,2)成功地建立了套式PCR加限制酶分析检测巨细胞病毒,经实验证明具有高度的特异性与敏感性。然而,疱疹类病毒感染其临床表现相似,有时几种疱疹类病毒同时感染需用多对引物进行多次PCR来检测不同的疱疹类病毒,使得特异性PCR在临床实际诊断中受到限制。
随着人类基因组计划的成功及寡核苷酸探针合成技术的成熟,基因芯片已成为近年来发展最为迅速及活跃的一种。一个芯片即可替代数百次常规测试,即简化了操作程序,又节约了宝贵的样品。目前,尽管高集成度的基因芯片具有独特的优势,但中、低密度的基因芯片在临床诊断、药物筛选中具有重要的现实意义。它不仅降低了制作芯片的成本及难度,也为信号转换与检测提供了方便。
发明内容
本实用新型的目的是提供疱疹类病毒基因芯片,以玻片为载体,由玻片、醛基化修饰表面、点样区、定位点、固定在玻片表面矩阵分布的经5`端氨基修饰及杂交的寡核苷酸探针、标签区组成,寡核苷酸探针具有SEQ ID NO 3-11的序列。在芯片的点样区分别点上人疱疹类芯片的特异性寡核苷酸探针,从上到下为9排,每排矩阵有六个小点,点的大小为120±20μm,点间距为400μm;醛基化修饰表面是在普通的氨基修饰的玻璃片通过0.2%1,4-苯二异硫氰酸酯醛基化修饰,有利于寡核苷酸探针的结合;玻片设有标签区,易于不同品种的区别。
本实用新型提供疱疹类病毒基因芯片是在疱疹类病毒的高度同源序列选择通用引物,建立能检测人巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、爱泼斯坦-马尔病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒(HHV)等所有疱疹类病毒的PCR方法,在疱疹类病毒的可变区选择特异DNA探针,并选择HSV I型与II型、HHV6A与HHV6B等亚型探针,建立基因芯片,用以区分不同疱疹病毒及其亚型。具体通过以下步骤实现:
(1)寡核苷酸5`末端氨基NH2的修饰,使探针能和芯片的表面基团化学结合;
(2)寡核苷酸探针液体浓度稀释,稀释成20umol/L的终浓度;
(3)氨基玻片的醛基化修饰,取被氨基修饰过的玻片用吡啶/DMF1∶9的0.2%1,4-苯二异硫氰酸酯处理2小时;
(4)基因芯片点样制作:启动GMS417点样仪将5`端氨基修饰的寡核苷酸探针通过机械针固定在修饰过的玻片上,水合30分钟,干燥30分钟,用0.2%SDS洗脱两次,晾干4℃保存;
(5)芯片杂交过程:取5×SSPE、1%SDS的杂交液9uL加等量的荧光标记PCR产物置于芯片上50℃杂交30分钟,洗片扫描。
其中步骤(1)所用寡核苷酸探针,是根据临床常见疱疹病毒包括CMV、HSV、EBV、VZV、HHV6、HHV7、HHV8设计的寡核苷酸特异探针。
本实用新型的有益效果是:
(1)本实用新型方法设计合理,能够提高检测疱疹类病毒的敏感性、特异性及准确性;
(2)早期、快速、准确检测疱疹类病毒;
(3)一次检测即能检出所有疱疹类病毒;
(4)能够区分不同疱疹类病毒,并区分不同亚型;
(5)能够发现疱疹类病毒的混合感染。
附图说明
图1为本实用新型疱疹类病毒基因芯片的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合实施例和附图作进一步的说明。
实施例一 本实用新型基因芯片的制备
参见图1,本实用新型提供疱疹类病毒基因芯片,由玻片(1)、醛基化修饰表面(2)、点样区(3)、固定在玻片(1)表面矩阵分布的经5`端氨基修饰及杂交的寡核苷酸探针(4)、标签区(5)组成,寡核苷酸探针(4)具有SEQID NO 3-11的序列。在芯片的点样区(3)分别点上人疱疹类芯片的特异性寡核苷酸探针(4),从上到下为9排,每排矩阵有六个小点,点的大小为120±20μm,点间距为400μm;醛基化修饰表面(2)是在普通的氨基修饰的玻璃片通过0.2%1,4-苯二异硫氰酸酯醛基化修饰,有利于寡核苷酸探针的结合;玻片(1)设有标签区(5),易于不同品种的区别。
本实用新型基因芯片具体通过以下步骤实现:
(1)以临床常见疱疹病毒感染的诊断为目标,经计算机查索核酸序列库,选取保守DNA区域设计引物,引物序列为:5`-TCATCTATGGGGATACGGA-3`和5`-GCACCAGATCCACGCCCTT-3`,建立能扩增所有6-8种疱疹类病毒的PCR方法,对标准毒株HSVI(F株)、HSVII(G株)、CMV(169株)、EBV(B95-8株)、VZV(EF株),以及HHV6(GS株)进行PCR扩增,并选择其他病毒如HBV、细菌(大肠杆菌、金葡菌等)、真菌(新型隐球菌)作为对照,以摸索出进行通用引物PCR所需的最小检出量,及其各自反应体系的适宜条件。
(2)在疱疹类病毒的可变区域设计各自特异性引物,建立扩增对各自特异病毒DNA的PCR方法,包括CMV、HSV、EBV、VZV、HHV6、HHV7、HHV8等的PCR方法,并比较各自特异PCR方法与通用引物PCR检测标准毒株其敏感性、准确性等方面的差异。
(3)经核酸序列GenBank比较,设计各自特异的寡核苷酸特异探针,并进一步分子克隆、序列分析,明确HSV、HHV6的亚型基因,设计HSVI/II、HHV6A/6B等的特异性亚型探针,寡核苷酸序列分别为:
CMV:5`-CACGAAAGCGGACAAACA-3`;
HSVI:5`-GCACAGCACAAAGATGGA-3`;
HSVII:5`-GCACAAAACGAAAATGGA-3`;
EBV:5`-CGGCACTCGATAAACAGC-3`;
VZV:5`-GAATCGGATAAACACAGA-3`;
HHV6A:5`-AGAGACTGATTAACCATAT-3`;
HHV6B:5`-AGAGACTCATTAGCCATAT-3`;
HHV7:5`-TGAAAGTAACAAAAAGAC-3;
HHV8:5`-GCAGCATATGAAAAGAGA-3`。
(4)对设计的DNA探针末端修饰,微阵列,制作基因芯片,(按照常规方法)内容包括固相载体的选择、玻片表面修饰、探针末端修饰、微阵列制备技术、核酸探针的固定及杂交。
(5)基因芯片杂交系统参数的确定及检测,包括DNA固液相杂交、荧光标记与检测方法,灵敏度及特异性测定等。
实施例二 本实用新型制备的基因芯片的用途
1:引物的灵敏度和探针的特异性
用上述的通用引物对8种疱疹类病毒、乙型肝炎病毒、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、新型隐球菌和人类基因组等进行扩增,结果显示对CMV、HSVI、HSVII、EBV、VZV、HHV6、HHV7、HHV8均有扩增条带,且芯片杂交信号单一,在各自的探针矩阵中显示各自病毒株的信号值,没有交叉信号,探针特异性良好。同时用该引物扩增乙肝病毒、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、新型隐球菌和人类基因组等,均没有相应的条带,且杂交均没有信号。取标准毒株DNA作为模板,用双蒸水1∶10定量稀释,浓度波动范围为100pg~0.1fg/μL,在PCR体系中扩增,检测EBV、CMV、HSVI/II的灵敏度为o.1fg,VZV和HHV6为1fg。HHV7和HHV8由于很难拿到标准毒株,灵敏度很难检测,但是根据理论推断,其二者的灵敏度也应不低于1fg。
2:临床标本的检测
98份拟诊为病毒性脑炎患者的脑脊液(CSF)标本用PCR扩增后13例阳性(阳性率为13.3%),用基因芯片进行杂交,发现4例为EBV,3例为HSVI,CMV和VZV各为2例,HSVII为1例,另1例为HSVI和EBV混合感染。5份血和脑脊液配对的标本中有1例两者均为HSVII阳性。ELISA法检测中枢神经系统病毒特异性抗体产生指数CSQre1>1.5有5例(阳性率为5.09%),两者具有显著差异(x2=4.003,P<0.05)。9份非病毒感染的脑脊液标本均为PCR扩增阴性。检测快速,整个过程在4个小时之内完成,通过基因芯片,且可以检测到混合感染的毒株,提高准确率。
无需进一步详细阐述,相信采用前面所公开的内容,本领域技术人员可最大限度地应用本实用新型。因此,前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明,而非以任何方式限制本实用新型的范围。
序列表
<110>浙江大学
<120>疱疹类病毒基因芯片
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<400>1
AGAGACTGATTAACCATAT 19
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<211>19
<212>DNA
<213>疱疹类病毒(Human Herpesviruses)
<220>
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<212>DNA
<213>疱疹类病毒(Human Herpesviruses)
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TGAAAGTAACAAAAAGAC 18
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<213>疱疹类病毒(Human Herpesviruses)
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GCAGCATATGAAAAGAGA 18
Claims (3)
1.疱疹类病毒基因芯片,其特征是:由玻片(1)、醛基化修饰表面(2)、点样区(3)、固定在玻片(1)表面矩阵分布的经5`端氨基修饰及杂交的寡核苷酸探针(4)、标签区(5)组成。
2.根据权利要求1所述的疱疹类病毒基因芯片,其特征是:点样区(3)矩阵分布的人疱疹类芯片的特异性寡核苷酸探针从上到下为9排,每排矩阵有六个小点,点的大小为120±20μm,点间距为400μm。
3.根据权利要求1所述的疱疹类病毒基因芯片,其特征是:醛基化修饰表面(2)是在普通的氨基修饰的玻璃片通过0.2%1,4-苯二异硫氰酸酯醛基化修饰。
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Cited By (2)
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2005
- 2005-12-09 CN CN 200520117107 patent/CN2858654Y/zh not_active Expired - Fee Related
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CN101871013A (zh) * | 2009-04-22 | 2010-10-27 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒 |
CN101871013B (zh) * | 2009-04-22 | 2013-04-03 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒 |
CN103131793A (zh) * | 2011-11-22 | 2013-06-05 | 广州呼研所医药科技有限公司 | 疱疹病毒荧光pcr检测试剂盒 |
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