CN1151763A - 检测人细胞色素p4502d6基因多态的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测人细胞色素P450 2D6基因多态的方法，它包括检测人细胞色素P450 2D6(CYP2D6)基因外显子9中，9个碱基TCACCCGTG重复插入的发生率。根据本发明的方法，有可能检出未见报道的新型CYP2D6多态。

Description

检测人细胞色素P450 2D6基因多态的方法

                      技术领域

本发明涉及一种诊断与药物代谢有关酶的基因的方法，更具体而言，是检测细胞色素P450 2D6(下文中缩写为CYP2D6)基因多态的一种新方法。

                      技术背景

人细胞色素P450(P450)是一种酶，在解毒，药物或外源物质的代谢活化，以及类固醇激素和胆酸的生物合成中起重要作用。CYP2D6属于所述的P450分子之一，特别与许多重要的临床治疗药物的代谢有关。迄今为止，已报道多达26种药物如抗高血压药异喹胍和普罗帕酮，β阻断剂普萘洛尔，三环抗抑郁药丙咪嗪等为所述的CYP2D6的特异底物[艾切尔鲍姆M，格罗斯As Clin.Pharmac.Ther.，46，337-394(1990)]。另外，已显示CYP2D6存在多态性。据报道，弱(poor)代谢者(下文中缩写为PMs)按通常剂量服用一种药物，由于药物被保持高血液浓度，可能会产生过度的效应(有害的效应)。CYP2D6多态性有种族差异，在欧洲人和美国人中，PMs的百分率为5～10％[Kimura，S.，Umeno，M.，Skoda，RC Meyer U.A.和Gonzalez，F.J.，美国人类遗传学杂志45，889-904(1989)]。而在日本人中，其百分率低于0～2％[Yokota，T.，Tamura，S.，Furuya，H.，Kimura，S.，Watanabe，M.，Kanazawa，I.，Kondo，I.和Gonzalez，F.J.，药理遗传学，3，256-263(1993)]。因此，如果一种新药在批准之前是CYP2D6的特异底物，很有可能在临床研究阶段，因PMs的低发生率，某些严重的副作用被忽略，可是药品上市后，显露出来。就日本人而言，应对这方面引起特别的注意[Kamataki，Tetsuya，TDM Kenkyu，10，2-7(1993)]。

近年来，对欧洲人和美国人的CYP2D6所作的基因分析表明，CYP2D6基因突变是上述CYP2D6多态性的原因[Gonzalez，F.J.和Meyer，U.A.，Clin.Pharmac.Ther.，50，233-238(1991)；海姆M.和迈耶UA，柳叶刀，336，529-532(1990)；Smith.，C.A.D.，Gough，A.C.，Leigh，P.N.，Summers，B.A.，Harding，A.E.Maranganore，D.M.，Sturman，S.G.，Schapira，A.H.V.，Williams，A.C.，Spurr，N.K.和Wolf，C.R.，柳叶刀，339，1373-1377(1992)]。尽管CYP2D6基因由9个外显子所组成，据报道仅有三类突变，即：A型突变由基因组DNA第2637位，属外显子5区的一个碱基置换所组成；B型突变由第1934位的外显子-内含子交接处，属外显子4区的一个碱基置换所组成；D型突变由完全缺失所组成。已经表明：这些突变和缺失导致代谢能力的明显损害。

上述的CYP2D6突变中，估计A型和B型突变占很高的百分率。据一项报告，在欧洲人和美国人中，95％的PMs是上述的二类突变所引起的。[达利，AK，阿姆斯特朗M，门克曼SC，艾达尔ME和艾达尔JK，药理遗传学，1，33-41(1991)]。另一项报告称，欧洲人和美国人中，75％的PMs为B型突变，5～11％为A型突变[Gonzalez，F.J.，et a1.，op cit.]。

不过，至于日本人，这些突变发生的频率很低，以致相关的研究鲜有进展。

                         发明内容

本发明显示CYP2D6基因的一种新突变，其目的是提供检测CYP2D6基因多态的新方法。尤其是，本发明的目的是开发一种简单、方便的检测方法，用少量DNA样品，能高度敏感准确地，检测出涉及CYP2D6基因多态性的新类型。

为达到以上目的，本发明者对日本人的PMs做了CYP2D6基因分析和家系分析。结果他们发现了可用于上述目的的一种新基因多态，因而成功地发展了一项检测技术，完成了本发明。

因此，本发明是关于检测CYP2D6基因多态之一的方法，它包括检测CYP2D6基因外显子9中，由9个碱基亚序列TCACCCGTG重复所组成的插入序列的发生率。

本发明特别地把氨基酸和碱基序列用IUPAC-IUB推荐的缩写，或者相关技术领域通用或习惯使用的缩写表示，碱基的编号与CYP2D6基因组DNA相一致[用法见Yokota T.et a1.op cit]。

本发明显示的新型突变，其特征是依据插入序列的发生率，该序列由第4213位，即CYP2D6基因外显子9区，9个碱基亚序列TCACCCGTG重复所组成。

本发明的方法并不局限于规定的能检测特别突变的任何特别的技术和方法。这样，任一种不同的便利的方法和技术均可采用。由于本发明能对被检的基因突变予以确认和详细说明，本领域的技术人员将容易地挑选一项适当的技术，作为本发明申请内容相一致的检测。例如，本发明方法可组成，当然也包括以上特定位点的碱基序列分析。选择Southern杂交技术或斑点杂交技术也是合适的[每项技术见：索森EM，分子生物学杂志，98，503-517(1975)]。可采用诸如PCR(多聚酶链反应)-RFLP(限制性片段长度多态性)法，PCR-单链构象多态性法[Orita，M.，Iwahana，H.，Kanazawa，H.，Hayashi，K.和Sekiya，T.，美国国家科学院院报，86，2766-2770(1989)]，PCR-SSO(特异序列寡核苷酸)法，和使用PCR-SSO和斑点杂交的ASO(等位基因特异寡聚体)法[Saiki，R.K.，Bugawan，T.L，Horn，G.T.，Mullis，K.B.和Erlich，H.A.，自然，324，163-166(1986)]，以及其他方法。

特别是上面提到的RFLP技术，是本发明实施中优先采用的方法，尤其是该技术与应用PCR的DNA扩增技术结合时，有可能用少量DNA样品，简单容易，高度敏感准确地检出多态性。此后，将以这项检测方法(PCR-RFLP法)作为实施例，详细地描述本发明。

依据本发明，检测方法可采用的不同步骤，如某些DNA的化学合成，DNA裂解、缺失、添加或延伸的酶处理，DNA分离，纯化，复制，挑选等，每项均可按常规方法进行[例Bunshi Idengaku Jikkenh。(分子遗传学实验)，1983年由Kyoritsu Shuppan出版；PCR技术，1990年由Takara Shuzo出版]。如可用琼脂糖凝胶电泳等方法分离纯化DNA，DNA测序可用双脱氧法[桑格F，尼科兰S和科尔森AR，美国国家科学院院报，74，5463-5467(1977)]，(Maxam-Gilbert)马克塞姆-吉尔伯特法[马克塞姆，AM和吉尔伯特，W.，酶学方法，65，499-560(1980)]等。DNA碱基序列测定也可用商品化的序列测定试剂盒等，很容易地进行。也可按常规方法，用PCR扩增某一DNA的特定区段[如Saiki，R.K.，Scharf，S.，Faloona，F.A.，Mullis，K.B.，Horn，G.T.，Erlich，H.A.和Arnheim，N.，科学，230，1350-1354(1985)]。这些不同的基本步骤，可按文中所引的各种参考文献进行，只要把参考文献和后面所叙的实施例结合在一起就可。

至于用本发明的检测方法，对基因组DNA进行分析，任一种来源于人的DNA样品均可使用，没有任何特别限制。可说的例子有，体液如血，骨髓液，精液和腹腔液，肝和其他组织细胞，体毛如头发，及其他样品。按常规方法，从这些样品中抽提纯化，制备基因组DNA。对基因组DNA中，把含本发明所提及的突变位点的某一DNA区段扩增后，可得到大量的浓缩试样。若用PCR技术，采用适当设计的引物，仅特异地扩增包含有上述外显子9区插入部分的CYP2D6基因，即可实现。能用常规方法设计这种引物。如被扩增区段的碱基长度并不关键，但一般来说，长约100～500bp。所选扩增的DNA区段，含一个任意的限制酶切点，以适用于下一步RFLP操作。规定任选的DNA区段，用酶处理DNA区段得到的裂解片段，有长度差异，以便检测时比较突变基因和正常(野生)基因。这样设计引物的优选例子在文后的实施例中显示。引物是有义引物(9-S)和反义引物(9-AS)，该设计可特异单独地扩增上述所需的CYP2D6区段，明显与CYP2D6碱基序列高度同源的CYP2D7和CYP2D8二个假基因相区别。按这样要求设计的引物，扩增所需的DNA区段长度为334bp(野生)或343bp(突变)，含唯一所需的限制酶切点(Sty I点)，用酶处理后，产生一条77bp(野生)或86bp(突变)的裂解片段和一条257bp的共同片段。

因此，用PCR扩增的所需的DNA区段，采用如Sourthern印迹或凝胶电泳技术，作RFLP检测，就能方便地对其中所含的突变予以检测和鉴定。用上面提到的，适当选择的限制酶处理(消化)所需的DNA区段，对出现的裂解片段，按常规法鉴定其特异带。

按上法所获的带型，就能检测出CYP2D6基因多态(本发明者显示了突变的发生率)。

                      附图简述

图1示参考实施例2(1)中所设计和构建的引物的碱基序列和发生位点。

图2示实施例1(1)中所设计和构建的引物的碱基和发生位点。

图3示按实施例1方法得到的电泳图，结果观察到PM和EM，以及9个碱基插入的碱基。

图4显示碱基序列和所设计的引物存在位点，按实施例2(1)绘制。

图5说明实施例2(3)中按CYP2D6基因外显子9的插入的带长所做的鉴定结果。

图6是依据图5显示的原理所判定的不同类型的图解。

图7显示按实施例2从一例PM和其父母得到的结果。

                   实施发明的最佳方式

以下实施例进一步详细地说明本发明，但绝不是限定发明的范围。

下列缩写用于不同实施例中所用的试剂和其他材料。组合物用每升浓度或量表示。必要时，某些材料高压灭菌(121℃，20分)等。

-TE溶液…10mM Tris-HCl(pH7.5)1mM乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(pH8.0)；

-20×SSC…3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠，5×(Denhardt′s)溶液…10g菲可，10g聚乙烯吡咯烷酮，10g牛血清白蛋白(BSA)；

-2×杂交缓冲液(pH8.0)…0.1M Tris-HCl(pH8.0)，2M氯化钠，20mM EDTA，0.2％十二烷基硫酸钠(SDS)；

-SE溶液…10mM Tris-HCl(pH7.4)， 50mM EDTA，0.5％十二烷基肌氨酸二钠盐。

-甲酰胺染液…100ml甲酰胺，0.1g二甲苯蓝，0.1g溴酚蓝，4ml0.5M EDTA；

-STE…100mM氯化钠，10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA(pH8.0)；

-LB培养基…1g葡萄糖，5g氯化钠，5g酵母提取物，10g细菌培养用胰化蛋白胨；

-LBAmp⁺培养基…1g葡萄糖，5g氯化钠，5g酵母提取物，10g细菌培养用胰化蛋白胨，青霉素(培养基高压灭菌后加，终浓度25μg/ml)；

-LBAmp⁺平板…以上LBAmp⁺培养基补加11g琼脂；

-2×TY培养基…16g细菌培养用胰化蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠；

-2×TY平板…以上2×TY培养基补加11g琼脂；

-10×PCR缓冲液(pH8.3)…100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.3)，50mM氯化钾，0.01％(W/V)明胶，氯化镁(此后每次特定浓度是mM)；

-H琼脂培养基…20g细菌培养用胰化蛋白胨，8g氯化钠，12g琼脂粉；

-H顶层琼脂…20g细菌培养用胰化蛋白胨，8g氯化钠，8g琼脂粉；

-10×T4DNA聚合酶缓冲液(pH8.8)…667mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH8.8)，67mM氯化镁，116mM硫酸铵，100mM2-巯基乙醇，67μM EDTA，0.167％BSA；

-10×变性缓冲液(pH9.5)…20mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH9.5)，1mM亚精胺，0.1mM EDTA；

-10×平末端缓冲液…0.5mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH9.5)，0.1M氯化镁，0.1M2-巯基乙醇；

-标记混合液…7.5μM 5′-脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)，7.5μM 5′-脱氧胞苷三磷酸(dcTP)，7.5μM 5′-脱氧胸苷三磷酸(dTTP)；

-40％丙烯酰胺贮液…38g丙烯酰胺，2g双丙烯酰胺，加纯化水至总体积100ml；

-10×TBE(pH8.3)…108g三羟甲基氨基甲烷，55g硼酸，9.3gEDTA；

-A胶…76.8g尿素，24ml 40％丙烯酰胺贮液，8ml 10×TBE，加纯水至总体积160ml；

-B胶…14.4g尿素，4.5ml 40％丙烯酰胺贮液，7.5ml10×TBE，3.0g蔗糖，溴酚蓝染液(10mg/ml)，加纯水至总体积30ml；

-10×H溶液…500mM三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(pH7.5)，100mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇(DDT)，100mM氯化钠；

-10×M溶液…100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH7.5)，100mM氯化镁，10mM DTT，500mM氯化钠。

参考实施例1

(1)人外周血基因组DNA的制备

按以下方法从人外周血中制备基因组DNA。用抗凝剂肝素收集10ml人外周血，3,000rpm离心10分钟，出现血沉棕黄层。加相同体积的冷PBS到所获的血沉棕黄层中，重复同样的离心操作2或3次。所获的血沉棕黄层层(buffer coat)用5倍体积的0.2％氯化钠-5mM EDTA清洗，5,000rpm离心10分钟，回收沉淀。重复上述清洗操作，直至沉淀中血红蛋白的颜色不见为止。加TE溶液(0.5ml)到沉淀中，成完全悬浮液后，加2μl核糖核酸酶(Rnase A，10mg/ml)和100μl肌动蛋白酶E(20mg/ml)。重悬浮操作后，加1.5ml SE溶液，混合物在37℃下温育2小时，然后用1ml TE溶液稀释。

然后，用苯酚-氯仿溶液重复抽提，直至没有蛋白层出现为止，最后用氯仿抽提。抽提物用1/20体积的5M氯化钠和3倍体积的冷乙醇处理，以引起沉淀。由此所得到的DNA用70％乙醇清洗，所获的基因组DNA溶解于TE溶液中，测定260nM吸光度定量(分光光度计：ShimadzuUV-160)。

(2)用CYP2D6 cDNA进行Sourthern印迹分析

在上(1)中所得到的基因组DNA(8μg)用限制酶EcoR I或Xba I消化，在脉冲电场中，0.8％琼脂糖凝胶上电泳(用Toyo′s Elepos Ps-1510；100V，正向2秒，反向0.6秒)，接着用0.5N氢氧化钠-1M氯化钠溶液和1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH7.4)-1M氯化钠溶液变性，每次中和作用为30分钟。胶浸于20×SSC中30分钟，毛细管法把DNA转移到尼龙膜上8～12小时。用3×SSC洗膜，80℃烤膜2小时，使DNA固定在尼龙膜上。

尼龙膜温育在含100μg/mg热变性的鲑精DNA预杂交缓冲液中(pH8.0)(含1×杂交缓冲液和1×Denhardt′s溶液)，65℃封闭2小时，然后加50ng探针(总长为1.5kb的CYP2D6 cDNA)，该探针用[α-32P]dCTP(Amersham)在含100μg/mg热变性的鲑精DNA的预杂交缓冲液(pH8.0)中标记，然后热变性，65℃进行杂交8～12小时。杂交后，用一份2×SSC－0.1％SDS室温洗尼龙膜15分钟，一份0.5×SSC－0.1％SDS 50℃洗膜15分钟，然后空气干燥，-80℃进行放射自显影12～16小时。

(3)结果分析和讨论

外周血样品从PMs抽提，PMs显示的log10代谢比率为1.50(MR＝未变化的药物/羟基化形式的代谢产物，PM规定为log10MR＞1.1的受实验者)，该比率是用抗高血压药异喹胍和其父母及广谱代谢者(extensive为metabolizer(此后缩写为EMs)，进行人体代谢测试得到。基因组DNA样品的制备，按上述(1)程序进行。

按上述程序(2)的方法，制备的每一种基因组DNA用限制酶EcoR I或Xba I处理，进行Southern印迹分析。

结果是，对来自PMs和他们的父母，EcoR I处理的样品的CYP 2D6分析，证实均有16.0，9.4和8.6Kb带。

同时，已报道CYP2D7和CYP2D8二个假基因的碱基顺序与CYP2D6高度同源，已经了解：EcoR I处理后Southem分析，CYP2D6和这些假基因各自产生9.4，16.0和8.6Kb带[cf.e.g.Kimura，S et al.op cit.]。

同样地，分析Xba I处理后的上述样品，一般产生的带在三条带中，29.0和4.8Kb带，而在PMs和他们的父亲中，观察到一条11.5Kb的额外带。

迄今为止，有关Xba I处理后，进行上述Southern印迹分析的大量研究表明，基因多态性涉及44.0，29.0，11.5和16.0+9.0Kb带。根据这些报告，当三个CYP2D基因，自5′端以CYP2D8，CYP2D7和CYP2D6顺序排列，检测到29.0Kb带；当还有一个CYP2D7加到上面的三个基因之中，自5′端这些基因以CYP2D8，CYP2D7，CYP2D7和CYP2D6)页序排列时，可检测到44.0Kb带。也有报道：11.5Kb带表明CYP2D6完全缺少(D型突变)[Johansson，I.，Yue，Q.Y.，Dahl，M.L，Heim，M.，Bertilsson，L，Meyer，U.A.，Sioquist，F和Ingelman-Sundberg，M.，Eur.J.Clin.Pharmacol.，40，553-556(1991)]，当同时检出16.0和9.0Kb带时，CYP2D7和CYP2D6之间有一基因组DNA突变。

鉴于前述情况，可假定：PMs有D型突变，CYP2D6等位基因之一完全缺乏，并且是从他们的父亲遗传而来。

参考实施例2

PCR分析寻找CYP2D6基因突变

(1)引物设计或选择

为检测CYP2D6基因中A型突变和B型突变，引物应这样设计，仅使CYP2D6基因的这些突变位点特异扩增。进一步说，鉴定A型突变，二个引物(A′-SW和A′-SM)的设计是将突变位点定位在3′端，选择一个碱基的差异。

这些引物的碱基序列和其出现的位点显示在图1中。

(2)引物纯化

按上述11)中设计或选择的引物，按下法制备和纯化。每一合成和用3ml 29％氨水脱三苯甲基化的寡核苷酸，用3ml 29％氨水从树脂上切落，60℃温育4小时。氨水已挥发，所得的沉淀(pellet)溶于20μl甲酰胺染液中，100℃加热染液5分钟，然后进行20％变性丙烯酰胺凝胶电泳。用于电泳的缓冲液是1×TBE。

电泳后，凝胶中含寡核苷酸的部分在紫外线照射下定位，切除，用1-ml注射器挤压破碎。往里加STE(5ml)，在旋转器上缓慢旋转，抽提10～12小时。抽提液100℃加热10分钟，然后3,000rpm离心10分钟。上清过DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱，该柱预先用TE缓冲液平衡，因而能吸附寡核苷酸。依次地用150μl1.5M氯化钠-10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH7.5)，200μl 0.1N氢氧化钠-1mM EDTA和50μl10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH7.5)过柱洗脱。为立刻中和洗脱液，回收寡核苷酸的管中预先放50μl1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH7.5)。中和的溶液进行乙醇沉淀，所得的寡核苷酸溶于适量的纯水中，测定260nM的吸光度定量。

(3)PCR扩增基因组DNA，以检测CYP2D6基因A型突变。

含CYP2D6基因A型突变的基因组DNA(基因组DNA外显子5第2637位的一个碱基缺失)，用DNA热循环仪(Perkin Elmer Cetus)，按下法(参照图1)，进行PCR扩增。

加参考实施例1(1)中制备的1μl基因组DNA溶液(50ng/μl)，17.5μl纯水，1μl 5mM5′-脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)溶液，2.5μl10×PCR溶液(10mM)， 1μl10μM有义引物(A-S)和1μl 10μM反义引物(A-AS)。混合物煮5分钟，然后用冰冷却3分钟，加1μl Taq DNA聚合酶(1U/μl)到混合物中，使总体积为25μl。接着上铺等体积的矿物油层后，按94℃1分，55℃2分和72℃2分循环，进行反应，25个循环以上。

反应完成后，移去矿物油，依次进行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，得到的DNA片段溶于30μl TE中。

依据其带长度(757bp)和限制酶(Ava I和Pvu II)处理结果，确定扩增的DNA片段是CYP2D6基因。Ava I处理，观察到350，204和203bp带；Pvu II处理，观察到464和295bp带。

如果以上过程CYP2D7基因被扩增，Ava I处理观察到的带为400和350bp；若是CYP2D8被扩增，观察到的带为431，146，90，70和27bp，因而这些基因能明显地与上述CYP2D6相区别。

(4)鉴定CYP2D6基因A型突变

用3′端仅差一个碱基的二个有义引物(A′-SW和A′-SM)，结合以上步骤(3)中所用的反义引物(A-AS)，以及以上步骤(3)中制备的样品溶液，按下法作CYP2D6基因A型突变的鉴定。

加(3)中制备的1μl样品溶液，17.5μl纯水，1μl 5mM dNTP溶液，2.5μl10×PCR溶液(7.5mM)，1μl10M鉴定用的有义引物(A′-SW或A′-SM)和1μl10M反义引物(A-AS)。混合物煮5分钟，然后用冰冷却3分钟。加Taq DNA聚合酶(1U/μl；1μl)，使其总体积为25μl，接着上铺等体积的矿物油层。反应通过94℃1分，55℃1分，72℃1分循环实现，25个循环以上。反应完成后，移去矿物油，反应混合物上含0.02％溴化乙锭(EtBr)的1.5％琼脂糖凝胶，进行电泳作鉴定。因有义引物在3′端仅差一个碱基，可预期A′-SW只特异扩增野生型，A′-SM只特异扩增A型突变。这样，当仅在A′-SW边观察到一条451bp带时，该类型可鉴定为野生型；当在A′-SW和A′-SM二边均观察到451bp带时，为杂合基因A型突变；而仅在A′-SM观察到451bp带时，为纯合基因A型突变。

结果是在PM和父母中，仅在A′-SW边观察到451bp带，由此证实：该突变不是A型突变。

(5)PCR扩增基因组DNA，以检测CYP2D6基因B型突变。

含CYP2D6基因B型突变(基因组DNA第1934位的一个碱基置换，该位即是外显子4的外显子-内含子交接处)的基因组DNA，用上述(3)中相同的方法扩增，用(B-S)作有义引物和(B-AS)作反义引物。

确认所扩增的DNA片段为CYP2D6，是依据其带长度(533bp)和限制酶(Ava I)处理后，观察到311，146和76bp带。如果以上过程，CYP2D6或CYP2D8被扩增，用AvaI处理后观察到457和76bp带，因而这些基因和上述CYP2D6能作明显的区别。

(6)鉴定CYP2D6基因B型突变

利用限制酶MvaI识别位点的消失，能鉴定CYP2D6基因B型突变，其结果是外显子4中外显子-内含子连接位点的一个碱基置换。

加上述(5)中制备的10μl样品溶液，2μl10×M溶液，2μl MvaI(10U/μl)和6μl纯水，使总体积达20μl。产生的混合液37℃温育2小时，然后用2％琼脂糖凝胶进行电泳。

当观察到279bp带时，该类型可鉴定为野生型；观察到384和279bp带时，为杂合基因B型突变；而观察到384bp带时，为纯合基因B型突变。

结果从PM和其父母观察到279bp带，这样证实该突变不是B型突变。

实施例1

分析PM的CYP2D6基因碱基序列

(1)引物设计和纯化

引物设计要求，CYP2D6基因所有外显子和外显子-内含子连接位点分为4部分后，能特异地扩增。与参考实施例2相同的方法，各自制备和纯化引物，用这些引物，按下列PCR方法扩增不同的片段。

所用的引物碱基序列和它们在CYP2D6上相应的位点，以及所得到的不同片段的图解见图2。以上采用的反义引物(B-AS)扩增的片段，包含外显子2至4，有义引物(A-S)和反义引物(A-AS)扩增包含外显子5至6的片段，分别与参考实施例2所用的这些引物相同。

(2)CYP2D6基因的外显子和外显子-内含子连结位点的PCR扩增

含CYP2D6基因外显子和外显子-内含子连接位点的基因组DNA，用PCR技术按下法扩增。

加在参考实施例1制备的1μl基因组DNA溶液(50ng/μl)，17.5μl纯水，1μl 5mMdNTP溶液，2.5μl10×PCR溶液(10mM)，1μl10μM有义引物和1μl10μM反义引物。混合液煮沸5分钟，然后用冰冷却3分钟。往里加1μl Taq DNA聚合酶(1U/μl)，使总体积为25μl，接着上铺等体积的矿物油后，以94℃1分，53℃(限于片段F₁)，48℃(F₂)，55℃(F₃)或50℃(F₄)2分和72℃2分循环进行反应，25个循环以上。反应完成后，移去矿物油，依次进行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，各自得到的DNA片段溶于20μl TE中。

依据各自带长度和用一种合适的限制酶或酶(F₁：HhaI；F₂：AvaI；F₃：Ava I，PVUII；F₄：sty I)处理，观察出现的带，可证实扩增的DNA片段分别来自CYP2D6的产物。

(3)亚克隆进Bluescript载体

在上述(2)中得到的CYP2D6各个DNA片段(F₁～F₄)，按下法变成平末端。

相当于500ng量的各个片段溶于20μl TE中，加8μl2mMdNTP，1μl T₄ DNA聚合酶，  4μl10×T₄ DNA聚合酶缓冲液(pH8.8)和7μl纯水，使总体积为40μl。37℃进行反应15分钟，加纯水至总体积200μl，然后进行苯酚抽提(二次)和氯仿抽提(一次)。得到的上清液加15μl3M乙酸钠(pH5.6)和375μl冷乙醇，产生的混合液冷却至80℃，12,000rpm，4℃离心20分钟，沉淀用70％乙醇洗后，干燥。

因为以上PCR产物5′端缺乏磷酸化基因，按下法进行磷酸化。各个平末端DNA片段加入75μl变性缓冲液(pH9.5)，混合液煮沸2分钟，然后在冰上放2分钟。加1μl腺苷三磷酸(ATP，50 picomoles/μl)，10μl10×平末端缓冲液，12μl纯水和2μl T₄多聚核苷酸激酶(11U/μl)，总体积为100μl，37℃进行反应1小时。加纯水至总体积为200μl，然后进行苯酚抽提(二次)和氯仿抽提(一次)，得到的上清液补加15μl3M乙酸钠(pH5.6)和375μl冷乙醇，混合物冷却至-80℃，然后4℃12,000rpm离心20分钟，沉淀用70％乙醇清洗。干燥沉淀，溶于10μl纯水中。用这种方法，制备不同的插入片段。

Bluescript载体(2μg)用Hinc II处理，然后加47μl1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.0)和2μl碱性磷酸酶(0.5U/μl)，总体积达52μl，65℃进行反应30分钟。加纯水至总体积为200μl，然后进行苯酚抽提(三次)和氯仿抽提(一次)。上清液中加15μl3M乙酸钠(pH5.6)和375μl冷乙醇，混合液冷却至-80℃，12,000rpm，4℃离心20分钟，沉淀用70％乙醇清洗，然后干燥，溶于20μl TE中。用这种方法，完成载体去磷酸化。

各个含CYP2D6外显子和外显子-内含子连接位点的片段(100ng)和10ng Bluescript载体混合，进行连接。连接反应完成后，把300μl感受态细胞悬液加到DNA溶液中，混合液放在冰上20分钟。给予42℃热休克超过2分钟，然后加1ml LB溶液，混合液温育1小时，接着4℃，3,000rpm离心20分钟。移去上清液(1ml)，重新悬浮沉淀，接种于LB培养基中，37℃温育过夜以产生转化体。

所用的宿主大肠杆菌菌株是TG₁，上述感受态细胞用下面的方法制备。

LB培养基(200ml)种入2ml过夜大肠杆菌菌株培养液，37℃培养直到650nM吸光度值达约0.6。培养液在冰水中冷却30分钟，然后收集细胞，悬浮在100ml 50mM氯化钙中。缓慢倒转摇动15分钟后，悬浮液立在冰上1小时。然后重新收集细胞，悬浮于20ml 50mM氯化钙-20％甘油中。悬浮液以300-μl一份分装于微量离心管中，立即用液氮冷却，贮存于-80℃。细胞收集后的所有操作步骤，在低温室(4℃)中进行。

(4)小量制备双链DNA

以上方法得到的转化体克隆恢复培养在3ml LBAmp＋培养基中，离心培养液重获细胞，用下面的方法，小量制备质粒DNA。

上述培养液1.5ml转移到一只微量离心管中，5000rpm离心5分钟，重获细胞沉淀，悬于200μl10mM EDTA溶液中，加400μl1％SDS-0.1M氢氧化钠溶液，让混合液放在冰上5分钟。加200μl5M乙酸钾后，产生的混合液在冰上冷却5分钟，13,000rpm离心5分钟。上清液转移到另一只微量离心管中，加700μl异丙醇。混合液于4℃，13,000rpm离心5分钟，得到的沉淀悬浮在100μl20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH7.5)/10mM EDTA溶液中，加1μl核糖核酸酶I(10mg/ml)，混合液65℃温育15分钟。苯酚抽提和氯仿抽提后，加12μl3M乙酸钠(pH5.6)和224μl冷乙醇，混合液冷却到-80℃，然后于4℃，13,000rpm离心10分钟，沉淀用70％乙醇清洗。干燥后，沉淀溶于20μl TE中。依据载体的多克隆位点和插入DNA片段的限制酶图谱，选择限制酶，处理重得的质粒，接着进行琼脂糖凝脉电泳，确认不同DNA片段的插入按预期得到。

(5)亚克隆进M13载体

根据载体的多克隆位点和插入DNA片段的限制酶图谱，选择内切酶处理，可确认插入DNA片段在质粒中的方向。

用二个其识别位点在载位多克隆位点上的限制酶(EcoR I和Bam HI)处理后，重新得到片段；M13载体也用与这些片段相同的方法处理；连接使片段插入M13载体中。300μl感受态细胞悬液加到连接反应完成后得到的30μl各自DNA溶液(100ng)中，让混合液在冰上放置40分钟。42℃予以热休克2分钟后，3ml H顶层琼脂和200μl过夜的大肠杆菌培养液混合，混合液铺展在H琼脂培养基上，37℃温育过夜，以产生转化体。所用的宿主大肠杆菌菌株是JM103，感受态细胞按上述步骤(4)制备。

(6)制备单链噬菌体DNA

单链噬菌体DNA的制备按下法进行。获取一转化体噬菌斑，培养在3ml2×TY培养基中6小时。该培养液1.5-ml一份在15,000rpm下离心5分钟(二次)，得到上清液。在1.3ml上清液中加200μl20％聚乙二醇(PEG)-2.5M氯化钠。混合液室温搁15分钟，然后15,000rpm离心5分钟，使噬菌体DNA沉淀。15,000rpm进一步离心2分钟后，完全移去上清液，沉淀溶于200μl TE中，加100μl苯酚，振荡后，混合液室温搁15分钟。接着加100μl氯仿，进行同样的操作，接着10,000rpm离心5分钟。取上清液150-μl一份，加15μl3M乙酸钠溶液(pH5.6)和375μl冷乙醇，混合液冷却到-80℃乙醇沉淀。4℃，12,000rpm下进行离心20分钟，沉淀用70％乙醇清洗。干燥沉淀，溶于20μl TE中，以得到单链DNA。进行琼脂糖凝胶电泳，用从没有任何片段的M13载体制备的单链DNA作对照。根据检测到低迁移率的一条带，确认片段按预期插入。

(7)CYP2D6基因外显子和外显子-内含子连接位点的碱基序列分析

用上述(6)中得到的单链DNA，按文献描述的方法[Sanger，F.，Miklen，S.and Coulson，A.R.美国国家科学院院报，74，5463-5467(1977)]，进行碱基序列分析，方法如下。按测序酶^TMVER2.0附的操作指南，进行测序反应。

首先，混和7μl模板DNA(700ng)，1μl引物(1 picomole/μl)和2μl5×退火缓冲液(pH7.5)，混合液65℃加热2分钟，然后逐渐冷却，使引物和模板DNA一起退火。然后，加1μl 0.1M DTT，2.0μl标记混合液，0.5μl[α-³³P]5′-脱氧腺苷三磷酸(dATP)和2μl 8-倍稀释的测序酶，混合液室温温育2～5分钟。在那段时间内，含四种双脱氧NTPs的反应终止液，以2.5μl份分装于微量离心管中，37℃预温育。反应完成后，反应混合液分别以3.5μl份加到终止液中，接着进一步37℃温育5分钟。加甲酰胺染液(4μl)，各个混合液煮2分钟，然后加到凝胶中。凝胶是蔗糖密度梯度凝胶，胶厚0.4mm，用60cm玻璃板制做。在40ml A胶溶液和15ml B胶溶液中，分别加32μl20％N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)和9μl过硫酸铵(APS)。依次把A胶溶液和B胶溶液，吸进-50-ml一次性的注射器中，吸2或3个气泡轻轻摇动，混合液灌进玻璃板中。用上层胶注满剩余的空间。用1×TBE，电泳在恒压2,500～3,000V下进行2～7小时。然后，凝胶浸在10％乙酸-10％甲醇中15分钟，使DNA固定，然后在干胶器的吸力下干燥。X光片-80℃曝光过夜。

(8)结果分析和讨论

分析对各个来源于PM的外显子和外显子-内含子连接位点的碱基序列，结果是证实外显子9(4213bp)的9个碱基序列TCACCCGT(4213-4222bp)重复插入。

可推断这种插入导致插入三个氨基酸(缬氨酸，脯氨酸，苏氨酸)。该位点位于紧靠血色素(hem)结合区(HR-2区)之后，该区是铁结合位点，在药物氧化反应中很重要，在血色素蛋白(hem protein)P450中起重要作用。推测碱基插入引起的三个氨基酸插入，对PMs的代谢能力产生一定的影响，显著地降低代谢能力。

CYP2D6基因上述突变是迄今为止未见报道的新型突变，这种突变可认为是PMs的一个因素。

实施例2

CYP2D6基因新型突变检测(PCR-RFLP)

(1)引物设计和纯化

有义引物设计要求是：含插入位点，这是外显子9中的新型突变位点；和只允许CYP2D6特异扩增。所用的反义引物与实施例1构建的相同(9-AS)，所选的引物和其位置在图4显示。

与参考实施例2相同的方法，纯化各个引物。用这些引物，按下列的PCR方法，扩增外显子9的基因组DNA。

(2)CYP2D6基因外显子9的PCR扩增

在参考实施例1中制备的1μl基因组DNA溶液(50ng/ml)中，加17.5μl纯水，1μl5mMdNTP溶液，2.5μl10×PCR溶液[仅是本实施例，其组成液是：200mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH8.4)，250mM氯化钾，0.5％吐温20，1mg/ml明胶，10mM氯化镁]，1μl 10μM有义引物(9-S)和1μl10μM反义引物(9-AS)。混合液煮沸5分钟，然后冰上冷却3分钟。加进1μl Taq DNA聚合酶(1U/μl)，使总体积为25μl，接着上铺等体积的矿物油层后，以94℃1分，55℃1分，72℃2分循环进行反应，25个循环以上。

反应后，移去矿物油，依次进行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，得到的DNA片段溶于20μl TE中。

证实扩增的DNA片段来自CYP2D6，是依据其带长度(334bp)和观察限制酶(Sty I，Asp718)处理的结果，Sty I处理为一条257bp带和一条77bp带，Asp718处理为一条189bp带和一条145bp带。如果在那种情况下，CYP2D7被扩增，StyI处理后将观察到一331bp带，若是CYP2D8被扩增，Asp718处理后，将观察-320bp带；因而，有可能与这些基因明显区别。

(3)由PCR产物的限制酶处理，鉴定CYP2D6基因外显子9中的插入

用限制酶Sty I处理以上(2)中扩增的DNA片段，接着测定带长度做出鉴定(图5)。

在(2)中制备的10μl样品液中，加2μl10×H溶液，2μl Sty I(10U/μl)和6μl纯水，使总体积为20μl。产生的混合液37℃温育2小时。反应后，依次进行苯酚抽提，氯仿抽提和乙醇沉淀，DNA片段溶于5μlTE中，用10％丙烯酰胺凝胶进行电泳。当观察到一条77bp带时，该DNA可鉴定为野生型，当观察到77bp带和一条86bp带时，为杂合基因突变；而观察到一条886bp带时，为纯合基因突变(图6)。

(4)结果和讨论

检查一PM和PM的父母，作CYP2D6基因上述新型突变检测的结果表示在图7中。在PM和其母亲(在图中，MP)观察到86bp带，因而用本发明证实了涉及的突变(插入)。从而证明该突变从母亲中遗传。图中，FP表示PM的父亲，对一EM所做的结果也表示在图中。

从以上结果显而易见的是，根据本发明检测CYP2D6基因的新型突变，作PM的基因诊断是有用的。

                      工业应用性

依据本发明，显示3CYP2D6基因的一种新型突变，提供了检测含这种突变的新CYP2D6基因多态的一种方法。

靠检测CYP2D6基因多态，有可能对PMs作基因诊断，尤其是在PMs中引起的因素不是已知的CYP2D6基因多态。因此，如在诊断，预测或研究不同的药物物质副作用的原因中，所述的检测方法是十分有用的。

Claims (1)

1.一种检测人细胞色素P450 2D6基因多态的方法，它包括检测人细胞色素P450 2D6基因外显子9中，9个碱基TCACCCGTG重复插入的发生率。

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