CN1270638A - 用于电泳的dna夹住的基因座匹配的标准物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分析系统、试剂盒和方法,它们可以用于在粘性介质中电泳时利用夹靠式与基因座匹配的或特异性校准DNA参照物检测遗传基因座多态性区域的长度。

Description

用于电泳的DNA夹住的基因座匹配的标准物
发明背景
发明领域
本发明一般涉及用电泳系统测量未知脱氧核糖核酸(DNA)片段的长度，更具体地说涉及制造和使用夹住的成对DNA标准物，该标准物与待测DNA位点在序列上密切相关并且优选为其衍生物。
定义
Caskey等人的美国专利US5364759对生物技术中使用的一些术语，具体地说对属于短串联重复多态性的术语做了简要的定义。US5364759的全部内容在此引入作为参考。以下提供的定义有助于为本发明提供清楚并一致的理解。
等位基因：与一种DNA片段相关的遗传突变体，即位于一个遗传基因座的同一多态性区域上的DNA序列的两种或多种不同形式的其中之一。
等位序列梯(ladder)：由扩增后的来自多态性区域的等位基因组成的标准大小参照物。
生化命名：本发明使用的是标准生化命名，其中核苷酸碱基定名为腺嘌呤，A；胸腺嘧啶，T；鸟嘌呤，G；以及胞嘧啶，C。相应的核苷酸是，例如，脱氧鸟苷酸-5’三磷酸(dGTP)等。
偏差：多态性DNA片段的已知(预期)长度与通过各种DNA标准标记物共电泳校准在凝胶电泳上实际测量得到的长度之间的差别。
差异标记：意味着每种延伸产物都能与全部其他产物中区别开来，因为它带有一种不同的标记物，该标记物连接于其上，和/或它具有不同的大小和/或它结合到一种特异的标记寡核苷酸上。本领域普通技术人员会认识到多种标记物都是可行的。不同因素会影响标记物的选择。这些因素包括：标记物对引物与DNA的杂交和结合率的影响，标记物的敏感性，制备标记引物、探针或延伸产物的容易程度，自动化能力，现有装置，方便程度等
延伸产物：是指从寡核苷酸引物3’末端开始合成的核苷酸序列，它互补于结合寡核酸引物的模板链。
侧翼序列：是指遗传位点多态性区域中被扩增部分的任意一侧的核苷酸序列。“特有侧翼序列”指仅在基因组内一个位置发现的那些侧翼序列。
基因座(或遗传基因座)：染色体上的特定位置。一个基因座上的等位基因位于同源染色体的同一位置上。
基因座匹配标记物：为用于凝胶电泳测定多态性遗传基因座DNA片段长度而制备的一种DNA标准标记物，它是通过对该基因座的真实或无效等位基因的侧翼序列的长度进行修饰而得到的。基因座匹配标记物构成本申请描述的发明的一部分。
基因座特异性STR标记物：为用于凝胶电泳测定多态性遗传基因座DNA片段长度而制备的一种DNA标准标记物，这些DNA片段是通过加减串联重复单元制备而成的比所有已知或通常真实等位基因更长或更短新等位基因。基因座特异性STR标记物构成本申请描述的发明的另一部分。
基因座特异性引物：一种能与所述基因座特有的侧翼序列的一部分或其互补链特异性地杂交的引物，至少针对该基因座的一个等位基因，并且在扩增方法使用的条件下不能与其他DNA序列有效地杂交。
多重聚合酶链反应(mPCR)：是指一种变化的PCR，包括对两种以上不同序列同时进行PCR扩增的方法。mPCR中，形成两个互补单链后，加入多对标记后的配对寡核苷酸引物，其中每对引物都特异性地针对一种不同序列。每个引物对中的一个引物基本上互补于正义链的一部分，而该引物对中的另一个引物则基本上与互补的反义链中同一序列的不同部分互补。多个配对引物与它们互补序列之间发生退火，同时从每个引物对中的每个引物开始延伸。然后，延伸产物作为每对引物中的另一引物的模板。
多态性：是指在被扩增的遗传位点的部分中发现的遗传多样性。
聚合酶链反应(PCR)：这项技术包括由变性、引物退火和DNA聚合酶延伸三个步骤组成的多个循环，经过这些循环扩增使目的DNA序列的拷贝数增加了106倍以上。有关PCR方法的更详细的描述见美国专利US4683195和US4683202，这两个专利在此引入作为参考。
引物：两个单链的寡核苷酸或DNA片段，它们能与一个基因座的反向链杂交，从而使得该引物的3’末段处于最紧密的接近度。
引物对：是指其中包括能与被扩增的DNA序列5’末端杂交的向5’方向延伸的引物以及能与被扩增的DNA序列3’末段杂交的向3’方向延伸引物的一套引物。
引物位点：目标DNA中与引物杂交的区域。
迁移时间：是指DNA片段在电场中迁移通过一定长度的凝胶或其他基质并到达一种指示剂时所需要的时间。
突变等位基因：一个遗传基因座的人工制备的STR等位基因，其中包括其多态性的重复单元或核心重复单元，由于重复单元数目的变化使其长度大于或小于该基因座的所有等位基因或共同等位基因。现有技术描述
电泳测定DNA片段大小的经典方法是将未知的样品DNA片段与序列完全不同但长度已知的DNA片段进行比较来实现的。通常测大小的标准品是用限制性内切酶消化质粒或噬菌体DNA或者通过PCR扩增已知模板制备而成的。但是当大量使用时，这些方法就暴露出了以下弊端：DNA序列的不同可能会产生独特的DNA构象动力学，这样就导致长度相等的片段的迁移率不同。因此，长度相等的标准品DNA片段和样品DNA片段可能在凝胶电泳中表现出不同的大小。
变性后的DNA的电泳迁移率主要决定于片段的长度。但是，包括下列因素在内的几种因素会影响迁移率：电泳介质的类型(溶液相对于凝胶)、减速分子的类型、浓度、聚合和交连、缓冲液、电场强度以及温度。由于在不同电泳条件下DNA迁移率的固有可变性，以及在同一种表观电泳条件下，泳道和泳道之间以及每次电泳之间都存在着差别，所以为了给长度未知样品DNA提供参考校准，在每次电泳时都需要使用已知长度的标准DNA片段一起共电泳。
有些情况下，将电泳后染色了的样品条带与共电泳的标准片段进行简单的肉眼比较就可以足以对未知样品做出鉴定。现在，自动DNA测序仪的出现能够将只有1个核苷酸(1个核苷酸)差异的DNA片段识别开来，这些仪器中可以同时使用外置及内置两种DNA标准物，绘制出标准曲线，自动读出样品片段的长度。
通常，用局部Southern标定公式或相关公式能够将电泳迁移率转化成片段长度(见，Elder和Southern，“单维限制性内切片段凝胶电泳的电脑辅助分析”，bishop，m.J.，rawlings，c.j.(编著)，核酸及蛋白质序列分析，IRL Press，Oxford，1987)。它使用了以夹住未知样品的最临近的标准品标记物限定的标准曲线的局部节段来产生一种比用全部曲线更精确的计算。Elder和Southern还报道了序列相关的DNA提供的校准比异源序列更精确。
Schumm等人的美国专利US5599666从总体上讨论了等位序列梯，并具体讨论了短串联重复(STR)基因座中的等位序列梯，该专利的全部内容在此引入作为参考。如上述专利中解释的那样，等位序列梯方面的早期工作涉及下述内容：将从几个个体(即独立的基因组DNA样品)中扩增出来的等位基因混合，并对它们进行电泳分离。用荧光引物标记分离后的等位基因，该引物可以用荧光检测器来检测。Schumm的专利中，来自一个特定基因座中DNA的STR序列可以通过使用含有与该基因座中的两个或多个已知等位基因等长的核苷酸片段的STR等位序列梯来检测。另外，在Schumm的专利中，用序列分析可以检测出等位序列梯的组成。组成等位序列梯的片段在大小和序列上与从样品材料中鉴定的扩增后的等位基因都是相同的，因此，不论电泳分离使用的凝胶系统如何，都具有与待测片段相等的大小和序列依赖性的电泳迁移率。
T细胞受体(TCR)在免疫系统识别微生物中发挥着重要的作用。它发挥如此作用的分子基础在于它的α(A)链和β(B)链上的多态性CDR3区域形成的环，该环与结合于组织相容性分子形成的槽中的抗原性片段直接接触。TCR基因不仅在微生物免疫中发挥着核心作用，而且在肿瘤免疫、自身免疫、同种免疫以及免疫缺陷中也同样如此。因此，上述这些免疫状态中涉及的TCR基因的识别是至关重要的。
TCR CD3区域在序列和长度上都是高度可变的，位于TCR基因的5’端可变(V)区与3’端恒定(C)区之间，由高变区D和交连区J的核苷酸以及B链中的N核苷酸和A链中的J区和N核苷酸组成。现有50多个A链已知和45个B链已知的TCRV区基因。根据V基因区中的序列同源性，它们分组为32A链家族(见，moss等，欧洲免疫学杂志23：1153-1159(1992))以及25B链家族或亚家族(见，rowen等科学272：1755-1762，1996)。
为了扩增出它们CDR3区域中的TCR基因，当这些来自多克隆T淋巴细胞群体的基因的家族用PCR扩增时，使用的侧翼引物杂交在V和C区上，已发现它们一系列长度为0～60个核苷酸的多态性CDR3系列(见，liu等，免疫学方法杂志，187：139-150(1995))。当变性的条件下用聚丙烯酰胺测序凝胶电泳时，不同的基因片段分辨为因多个3个核苷酸不同的峰值，在CDR3长度对应为1个氨基酸的差异。所以，为了精确地将分离的克隆后的TCRA和B链基因片段与它们的原始群体联系起来，电泳测量的偏差应该小于1.5个核苷酸。由于目前使用的是异源DNA标准品，所以通常这一目标是无法实现的。
电泳精确鉴定DNA片段长度需要测量含有STR序列多态性遗传基因座。STR位点含有长度为2～7个碱基对(bp)的串联重复序列单元，只要富含稳定的、可遗传的、多态性标记，这种多态性的出现是由于重复基序的拷贝数不同引起的。在人基因组中每隔15kb便出现3和4聚体的STRs，形成高达200,000个单个基因座(见beckman和weber，genomics，12：627-631(1992))。现已证明STRs可以用于人类鉴定、亲子测试以及亲缘关系分析，并且由于具有操作容易及可重复的优点，这些应用中优选使用STRs。例如，Sheffield等，人类分子遗传学4：1837-1844，1991，这篇文献中已经描述了在构建基因组范围的人连锁图谱中使用2000多个这样的基因座。带有大重复单元的小卫星基因座以及带有2bp重复单元的STR基因座表现出与其他STR基因座类似的特性，但是由于技术原因使得分析更难。一些STR基因座，尤其是含有四核苷酸重复单元的STR基因座，表现出了大小上仅差1或2个个核苷酸的不完整的等位基因(见，puers等科学272：1755-1762(1993))。由于等位基因设计围绕最近的核苷酸，因此，对于STR等位基因检测需要使偏差小于0.5个核苷酸。
用PCR从基因组DNA中扩增STR多态性使用的是特异性引物序列，其序列可与序列的5’端和3’端侧翼序列杂交，这种方式类似于扩增多态性CDR3区域时使用TCR基因侧翼V和C区特异性引物的方式。用于不同的STR基因座的引物对通常为4～8个，往往与多重PCR结合在一起。
当电泳测定片段长度时，通过扩增区域中包含的重复序列拷贝数目的不同可以将STR基因座的等位形式区分开来，并可以根据重复单元的数目对等位基因的形式进行计数。等位PCR片段的鉴定通常在板状凝胶上电泳来实施，电泳使用异源DNA片段作为校准标准物，标准物可以加入到泳道内或者在泳道内和泳道外都使用(内部标准物为把标准物与样品加入到同一个泳道内进行电泳；外部标准物为将标准物加入到与样品泳道相邻的泳道内进行电泳)。用于毛细管电泳的标准物往往是在同一种凝胶上电泳，但不同时电泳，在未知样品之前或者之后。由非基因座特异性DNA构成的更可靠的标准物是由20～50基序单元组成的串联体，这些串联体互相之间长度上差1个单元，这类标准物已经开发成功(见，vanier等，genomics 41：1-9，1997)。在决定电泳迁移率的序列上，这些均聚物相互之间表现出最小的差异性。
在泳道外标记物中，最可靠的梯度就是由该等位基因本身组合而成的(见，sprecher et al.，bio techniques 20：266-277，1996)，因为它们与待测DNA样品等位基因片段具有相同的序列。但是，等位序列梯难以用作泳道内标准物，因为它们和未知DNA片段迁移到了凝胶上的同一位置，从而无法加以检测。尽管存在这种弊端，moscetti et al.，electrophoresis 16：1875-1880，1995，这篇文献中在重迭等位基因用与未知样品同样的荧光标记时使用了样品峰值信号加强来作为检测的方法。Smith，bio techniques 18：122-128，1995，这篇文献中为了说明在泳道中等位序列梯是优于异源DNA标准物的，在同一STR基因座内使用了三种不同的荧光。能量转化荧光已经被用于等位并且非基因座特异性标准物与未知样品中。它们用共同的激光器来激发，但是产生非重叠的可检测发射信号(见wang et al.，anal.Chem.67：1197-1203，1995；wang et al.，electrophoresis 17：1485-1490)。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种能够生产夹住样品的、与基因座匹配的或特异性的长度和序列已知的DNA标准物，该标准物可以用于多种用途，其中具体包括用于测量TCRA和TCRB基因多态性CDR3区域。
本发明的另一目的是提供一种能够生产从待测基因座衍生出来的DNA标准物，该标准物与多态性DNA样品共电泳，作为夹住样品的、与基因座匹配的或特异性的DNA标准物，既可以泳道内使用也可以泳道外使用。
本发明还有另一个目的是提供制备和使用基因座特异性STR标记物的方法，用于测定DNA片段的长度。
根据本发明，构建用于遗传基因座片段长度多态性分析的与序列匹配的或特异性DNA标记物的目标是做到紧紧夹住但不重迭，电泳分离时该基因座的几个或所有已知等位基因的长度。因为它们与它们目的遗传基因座的等位基因之间在序列和片段长度上紧密相关，夹住等位基因的与基因座匹配的标记物与来自该基因座的样品等位基因共电泳于同一泳道中，这样就为样品片段长度的测定提供了精确的校定标准物。本发明的另一个目的是为使夹住等位基因的基因座特异性标准物其侧翼序列有足够的长度而提供成对的PCR模板片段。这些模板对可以使用用于该基因座的PCR引物与基因组样品DNA一起共扩增。共扩增可以产生PCR反应的阳性对照，以及用于该基因座的夹住等位基因的内置标准物。共扩增还为夹住等位基因的标记物与样品DNA通过TagDNA聚合酶在其3’末端附加额外核苷酸提供了同等的机会。
另外，本发明的另一个目的是，通过添加或减去串联重复单元制备出相应地比所有已知或共有的真正等位基因更长或更短的新等位基因，从而制备出多态性遗传基因座的基因座特异性STR标准物。这些基因座特异性STR参照物可以用于电泳测定该多态性遗传基因座的DNA片段的长度。
附图简述
从下面参照附图对本发明的优选实施例所做的详细描述中，可以更好地理解上述以及其他的目的、方面和优点。这些附图具体如下：
图1是表明实施本发明所用策略的简图；
附2是表明实施本发明所用的另一策略的简图；
图3是表明实施本发明所用的另一策略的简图；
图4是表明实施本发明所用的另一策略的简图；
图5a-b是与实施例1有关的聚丙烯酰胺电泳凝胶泳道的电脑Fragment managerTM扫描图，其中显示出用于TCRAV7基因多态性CDR3区域的与基因座匹配的夹住等位基因的标记物；
图6是与实施例2有关的聚丙烯酰胺电泳凝胶泳道的FragmentmanagerTM扫描图，其中显示出用于TCRBV16基因多态性CDR3区域的与基因座匹配的夹靠式标记物；
图7a-c是与实施例3有关的聚丙烯酰胺电泳凝胶的泳道FragmentmanagerTM扫描图，其中显示的是通过修饰侧翼序列制备的用于STR基因座CSF10PO、FESFPS和F13A01的与基因座匹配的夹靠式标记物；
图8a-c是与实施例6有关的聚丙烯酰胺电泳凝胶的泳道FragmentmanagerTM扫描图，其中显示的是通过减少或增加多态性区域中串联重复单元的数目制备的用于STR基因座F13A01的基因座特异性夹靠式标记物，以及通过Taq DNA聚合酶添加不同数目额外核苷酸对DNA片段峰的影响；
图9是与实施例6有关的聚丙烯酰胺电泳凝胶的泳道FragmentmanagerTM扫描图，其中显示的是在与来自3个不同基因组DNA样品的F13A01基因座共扩增后，每个样品都与较短突变等位基因夹靠式标记物一起共扩增，通过Taq DNA聚合酶添加不同数目额外核苷酸对DNA片段峰的影响。
图10是琼脂糖凝胶电泳的扫描图，其中显示的为泳道1中是DNA校准标准标记物；用反向引物F13A01 rev251-Eam-1和来自5’侧翼序列的正向F13A01 fwd配对从基因组DNA的F13A01基因座中扩增出来的延伸侧翼区域(泳道2)以及用正向F13A01 fwd 248-Eam-2与来自3’侧翼序列的F13A01 rev 628配对扩增的产物(泳道3)；用典型F13A01基因座特异性引物对从其连接产物(泳道2+3)扩增的275bp短的F13A01变异等位基因(泳道4)。
本发明优选实施例详述
本发明的系统提供了一种快速、非同位素方法，该方法可以用于评估微量(例如，lng)的人DNA。该优选方法包括在通过变性介质电泳分离时，使用荧光发射检测荧光标记的、扩增后的、与基因座匹配的长度多态性DNA产物。也可以在使用任一现有凝胶或粘性基质电泳或者其他根据大小分离的手段中，使用放射性标记物和各种颜料或染料标记变性或原初DNA来检测DNA片段。
构建用于遗传基因座片段长度多态性分析的与序列匹配的DNA标记物的目标是在电泳分离时做到紧紧夹住但不与该基因座的几个或所有已知等位基因重迭。因为它们与它们目的遗传基因座的等位基因之间在序列和片段长度上紧密相关，所以将夹住等位基因的与基因座匹配的标记物与来自该基因座的样品等位基因在同一泳道中共电泳，能够为样品片段长度测定提供精确的校准标准物。
紧紧夹住等位基因的与基因座匹配的标记物的制备涉及几个概括性步骤，其中包括获得DNA样品、克隆及测序、扩增、分离及检测。在这些步骤的基础上，可以制备出夹住等位基因的与基因座匹配的标记物。下面将逐个讨论上述概括性步骤。
获得DNA样品-选择几个个体用于DNA分离。用标准方法(puregene，genta systems，minneapolis，MN)直接从血液、组织或组织培养细胞中提取DNA。分光光度法测定出DNA浓度。K562对照DNA购自promega(madison，WI)。
用密度沉降(LSM，organon teknika，durham，NC)从10ml全血或我们实验室培养的人淋巴细胞克隆中获得2-3×106外周血单核细胞(PBMC)，并从中提取RNA(RNAzol B，Tel-Test，friendswood，TX)。可以用与DNA相同的装置测定RNA浓度。用第一链cDNA试剂盒(pharmacia，piscataway，NJ)从1.0μg全RNA中合成第一链cDNA(33μl)。
克隆及测序-利用在微量滴定孔中的原代培养物建立T细胞克隆，培养在有限稀释条件(0.7个细胞-孔)下进行，有PHA、IL-2存在并以105自体同源放射标记(5000拉德)PBMC作为饲养细胞。用PCR-script amp SK(+)克隆试剂盒(stratagene，lajolla，CA)对平端TCR PCR产物进行分子克隆。用fmolDNA循环测序系统(promega)和A.L.F.自动DNA测序仪(pharmacia)对克隆的TCR片段进行循环测序。
扩增-用特异于每个基因座的引物和温控循环条件对DNA样品进行PCR扩增。表1给出的是基因座特异性引物对的序列。
                             表1
                      寡核苷酸的序列和定位
引物名称 Seq.Id No.   引物序列(5′-->3′) 位置 参考文献
  TCRAV 7   1   gcaacatgctggcggagcacccac   159-136   Genevee，C.(1992)
TCRAC 27-Cy51  2  cacggcagggtcagggttctg  27-7  Liu et al.
TCRAC 57-Cy5/F2  3  gtcactggatttagagtct  57-39  Genevee，C.(1992)
TCRAC 87-Cy51  4  atcaaaatcggtgaataggcag  87-66  Liu et al.
TCRAC 129  5  atacacatcagaatccttactttg  129-106  Genevee，C.(1992)
TCRBV 16  6  aaagagtctaaacaggatgagtcc  103-108  Choi，Y.(1989)
TCRBC 24-Cy5/F2  7  tgggaacacgtttttcag  24-7  Liu et al.
TCRBC 54-Cy5/F2  8  ttctgatggctcaaacac  54-37  Choi，Y.(1989)
TCRBC 78-Cy51  9  cttttgggtgtgggagatctc  78-58  Liu et al.
TCRBC 92-Cy5/F2  10  cacaccagtgtggccttttg  92-73  Liu et al.
TCRBC 168  11 4 tcgtcgaccccactgtgcacctccttccc  168-145  Robinson，M.(1991)
aCSF1POfwd 11848-F3  12  aacctgagtctgccaaggactagc  11848-1187  Hammond，H.(1994)
CSF1PO rev12158  13  acacaccactggccatcttc  12158-12139  Liu et al.
CSF1PO rev12162-atct  14 4 atctttccacacaccactggccatcttc  12162-12139  Liu et al.
bF13A01 fwd1  15  aatcccaacactttgggaagc  1-21  Liu et al.
 F13A01 fwd190-Cy5/F2  16  gaggttgcactccagcctttgcaa  190-213  Puers，C.(1994)
 F13A01 fwd268-Eam-2  17   atctcttcaaagaaagagtaaaagaaaaaaatt  268-282  Liu et al.
 F13A01 fwd248-Eam-9  18   atctcttcaaaga aag(aaag)7agt  248-278  Liu et al.
 F13A01 rev251-Eam-1  19   atctcttcactttcatctttctatctttcagatg  251-227  Liu et al.
 F13A01 rev275-Eam-9  20   atctcttcactttct tt(cttt)7cat  275-245  Liu et al.
 F13A01 rev480  21  tgaatcatcccagagccaca  480-461  Liu et al.
 F13A01 rev484  22  ttcctgaatcatcccagagccaca  484-461  Puers，C(1994)
 F13A01 rev484-cttt  23 4 ctttttcctgaatcatcccagagccaca  484-461  Liu et al.
 F13A01 rev488  24  tgcattcctgaatcatcccagagccaca  488-461  Liu et al.
 F13A01 rev628  25  atgcttttgcctggcaggtcagc  628-606  Liu et al.
 cFESFPSfwd 4649-F3  26  gcttgttaattcatgtagggaaggc  4649-4673  Hammond，H.(1994)
 FESFPS rev4884  27  tcccagctacttggctactc  4884-4864  Liu et al.
 FESFPS rev4888-attt  28 4 atttgtagtcccagctacttggctactc  488-4864  Liu et al.
1引物5’端用Cy5标记。
2引物5’端用Cy5或荧光素标记。
3引物5’端用荧光素标记。
4下划线核苷酸与基因组序列不互补。
a序列参考：人CSF-1受体的c-fms原癌基因。
Genebank登录号X14720NID。
b序列参考：人凝集因子XIIIα亚基基因，5’侧翼；
Genbank登录号M21986 J03834 NID g 182293。
c序列参考：人c-fes/fps原癌基因。Genbank登录号X06292M14209M14589 NID。
参考文献：
liu et al.-本发明中出现的资料
Genevee，C.，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immun.)22：1261-1269(1992)
Choi，Y.，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)86：8941-8945(1989)
Robinson，M.，免疫学杂志(J.Immunol.)146(12)：4392-4397(1991)
Hammond，H.，人类遗传学杂志(J.Hum.Genet.，)55：175-189(1994)
Puers，C.，基因组学(Genomics)23：260-264(1994)
下面的实施例提供了与每个基因座相关的特定方法的细节。基因座特异性引物包括大量核苷酸，在杂交所用条件下，其数目足以能与待扩增的该基因座等位基因之间发生杂交且基本上不与其它基因座的等位基因进行杂交。寡核苷酸引物由Operon技术公司(Alameda，CA)提供。Simons的美国专利US5192659更加充分地描述了位点特异性引物，该专利在此引入作为参考。
在本发明的一个实施例中，选择TCR A和B基因CDR3多态性来进行DNA片段长度测定。与5’侧的恒定区(VA)或(VB)片段杂交的引物用作正向引物，与3’侧的恒定区(CA)或(CB)杂交的引物用作反向引物(见，例如，liu et al.，j.Immuno.Meth.187：139-150，1995)。每个PCR反应系统由下列物质组成：1.0μl正向和反向引物(各为3μM)、0.15μl Tag DNA聚合酶、0.15μl 10μM dNTPs，1.0μl cDNA以及补足终体积至10.0μl的水。反应条件为：94℃下变性45s，55℃下退火45s，72℃下延伸45s，共进行30个循环，最后一个循环后72℃下延伸10min。
在另一个实施例中，含有荧光素标记的等位序列梯和来自3个单独基因座的引物的3 STR试剂盒购自Promega(Gene print fluorescentSTR system，promega，madison，WI)：CSF1PO、FESFPS和F13AO1。TaqDNA聚合酶和10×缓冲液购自Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。用perkin-elmer 480 DNA热循环仪，按照Promega公司1996年2月技术手册中的操作方法8进行PCR扩增。用STR基因座特异性引物(Promega)扩增STR样品DNA，该引物与串联重复区域5’和3’侧翼的基因座特异性序列(表1)杂交。内置用的DNA标准物梯度为50～500bp，购自Pharmacia公司。
DNA片段的分离和检测-电泳分离扩增产物，例如通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳采用0.5mm厚的6％变性聚丙烯酰胺预混式凝胶和TBE缓冲液(Gel-Mix 6和Gel-Mix Running Mate，GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)，在自动DNA测序仪A.L.F.和A.L.F.显示屏(pharmacia)上进行。根据厂商提供的方法，对于A.L.F./A.L.F.显示屏的操作条件是电压：1500V/1500V；电流：38mA/60mA；功率：3mW/3mW；温度：42℃/55℃。
为了能使所有待分析DNA片段中都有1条链被加以标记，用合适的荧光团(A.L.F.用荧光素，A.L.F.显示屏用Cy5)对每个PCR引物对中的一个成员进行标记。在下述条件下用Fragment managerTM1.2软件(pharmacia)对数据进行处理：峰宽10、峰高0.5、以及聚集敏感度(clustersensitivity)0。将样品在凝胶上的电泳迁移率与同一泳道(内置参照物)和/或不同泳道(外置参照物)中的已知大小的标记物进行比较，在此基础上该软件自动测定出片段长度。调整每个凝胶泳道中的PCR产物上样量，以使每种片段都能形成有别于相邻峰的单峰。与基因座匹配的夹靠式标记物的制备
与基因座匹配的夹靠式标记物的制备使用具有如下特征的PCR引物：针对用于扩增的遗传基因座多态性区域的特有侧翼序列具有特异性。在优选实施例中，该引物是一种单链寡脱氧核苷酸，在有一种诱导剂存在下其长度足以启动从一段特异性序列到延伸产物的合成反应。用模板DNA的一种给定样品，通过引物长度和序列的独特性可以测定出寡核苷酸引物的敏感度和特异性。本发明中，寡核苷酸引物通常大于15聚体，在优选实施例中为约20～30聚体或更长。
每对引物都被选择来检测不同遗传基因座的部分。本发明中选择的每个引物对中的每个引物都基本上在待扩增的每个特异性遗传序列的侧翼序列上与不同的链互补。因此，每个引物对中有一个引物互补程度足以能与正向链的部分序列杂交，而另一个引物的互补程度足以能与反向链的同一序列的不同部分杂交。尽管引物序列不需要反映模板的确切序列，但是3’末端反映该确切序列越严密，退火阶段就结合的越好。
在一个实施方案中，当与其他经典侧翼序列引物在PCR反应中联用时，引物针对经典位点5’和3’端侧翼序列位点，从而扩增到比经典产物更长或更短的扩增产物。那么，在电泳场中新的扩增产物就会比经典产物迁移的更快或更慢，从而可以用作经典产物定位的夹靠式标记物。
在另一个实施方案中，新设计的引物可以结合到与用于扩增给定多态性区域的经典引物对部分等同的位点上，不同之处仅在于比经典引物更长或更短。短引物在远离目标多态性基因座的一端被截短，以便产生出更短的扩增引物。长引物则是在远离目标基因座的一端被加长，以便产生出更长的扩增引物。如果与来自相对的特有侧翼序列的经典的基因座特异性引物配对使用，那么它们将会分别扩增到更长或更短的DNA片段，那么这些片段在电泳分析片段长度时就可以从两侧把传统扩增产物夹住。
在一个优选实施方案中，这类修饰过的基因座特异性引物用于通过从多态性区域扩增预期长度的选定等位基因，从而制备出标准电泳标记物。用一个截短引物将来自一个遗传基因座的多态性区域的最短等位基因或短的罕见等位基因缩短，从而制备出一种短的夹住标记，该标记的电泳迁移率比任意一种等位基因或该多态性区域的任意一种共同的等位基因都更大。用一个加长引物将来自一个遗传基因座的多态性区域的最长等位基因或长的罕见等位基因加长，从而制备出一种长的夹住标记物，该标记物的电泳迁移率比任意一种等位基因或该多态性区域的任意一种共同的等位基因都更小。
在另一个实施方案中，为了制备出比任一天然生成或任一常见等位基因更长或更短的变异等位基因，设计多套引物对去改变多态性区域本身，而不是改变其特有的侧翼序列。在本申请中，针对常规用于扩增多态性区域的引物具有特异性的同一侧翼序列用于扩增不同等位基因，从而制备出成对的紧密夹住的扩增产物，这些产物分别具有比该多态性基因座的任一等位基因或常见等位基因更小或更大的电泳迁移率。因此，上述夹靠式的不同等位基因可以和被分析的样品等位基因一起用同一个PCR反应扩增。
图1简要地显示了本发明的一个实施方案，其中的脱氧核糖核酸片段来自关注的遗传基因座，通常具有被鉴定为以5’端开始的正义链和被鉴定为以3’端结尾的反义链。其多态性区域“P”使用正向引物1和反向引物2通过PCR扩增，这两引物与它的侧翼序列杂交。引物3和4设计成与反向引物2一样能与同一正义链杂交，其杂交位点分别位于引物2杂交位点的5’侧或3’侧。同样，引物3和4也可以设计成与引物1一样能与同一反义链杂交，其杂交位点分别相应位于引物1杂交位点的5’侧或3’侧。
在该优选实施方案中，反向引物2、3和4每个都用一种标记物标记，例如荧光团、放射性测量标记或其他任意一种可检测和鉴定的适当试剂。替代地，可以标记正向引物1，而不标记引物2、3和4，或者标记所有引物。图1所示的实施方案中，用引物2、3和4制备不同长度的延伸产物。在进行PCR时，制备出以引物1开始并以引物2、3和4结尾的片段。这些片段可以用电泳分离，分别用反向引物3和4制备出的较短或较长延伸产物就会把用反向引物2制备出的延伸产物夹住。这种情况下，由于在与5’端和3’端为引物1和2的经典片段分享的区域内，该夹住的延伸产物与该经典片段具有同样的序列，所以它们在电泳介质(例如凝胶)中具有近似的迁移率。此外，因为用引物3和4从已知模板中扩增出来的夹靠式延伸产物的长度可以从该模板序列中精确地获得，所以用上述夹靠式延伸产物作为长度校准标记物，可以将用引物1和2扩增的未知样品中的等位区域的长度容易地测定出来。而且，引物选择的是引物3和4，不会与被扩增的多态性区域重叠在一起，所以可以容易地识别出它们的夹靠式延伸产物。
图2显示的是图1所示方法制备出的不同产物。具体地说，基因组基因座的多态性区域通过反义链上的正向引物5和正义链上的反向引物6’、6”和6限定。该反向引物优选用荧光素或放射性标记物标记且它选自核苷酸序列6。然而，应该理解的是本发明实施中可以标记引物5。最长引物6’构成核苷酸序列6的全长或大部分。引物6”优选是用于该基因组基因座的经典已知引物，除引物6’中出现的另外附加的已知数目核苷酸外，引物6”和引物6’是相同的。引物6是最短引物。引物6具有引物6”的5’端的全部核苷酸，而不含3’的那几个核苷酸。
在进行PCR时，生产出标记片段，这些片段都在5’末端具有引物5，而在3’末端则为标记的引物6’、6”和6。电泳时，由于这些片段具有同一构象，所以这些片段都具有同样的相对迁移率，以6’和6结尾的片段将夹住以6”结尾的片段。因为夹住片段核苷酸数目已知，所以参照用引物6’和6扩增的已知片段，可以容易地测定出用引物6”扩增的未知片段的长度。
图3显示的是本发明的一个实施方案，该方案可以制备出用于短串联重复(STR)基因座的与基因座匹配的夹住标记物。使用侧翼序列P1和P2，可以从含有STR基因座的基因组DNA的多个样品中制备出包含N个长度不同等位基因的等位序列梯。将PCR扩增得到的等位基因克隆到质粒载体中，然后将重组载体转化到细菌中。分离最短和最长等位基因或常见等位基因。这些等位基因每个都是在5’末端以与引物P1相同的核苷酸侧翼序列结尾，在3’末端以与引物P2相同的核苷酸侧翼序列结尾。
引物P1用荧光素、放射性或其他合适标记物标记。因此，当正义链与反义链分开时，正义链被标记。
引物P2是该STR基因座的反向引物。修饰引物P2，添加一定数目(X)核苷酸得到较长的P2引物，或者去除一定数目(Y)核苷酸得到较短的P2引物。添加或去除核苷酸的数目优选是相等的。此外，最优选添加或去除的数目与该STR基因座重复单元中所含核苷酸数目相等，因此生产出的夹靠式标记物比该STR区域更长或更短，具有固定重复数的核苷酸。
如图3所示，较短的P2引物与最短等位基因杂交，较长的P2引物与最长的等位基因杂交。用较短和较长的等位基因作模板，以较短的P2引物和较长的P2引物分别与标记后的P1正向引物配对使用，扩增出延伸产物。从图3中可以看出，带有较短P2引物的延伸产物不含Y部分，而Y这部分在未经修饰的P2引物中却存在，带有较长P2引物的延伸产物包含X部分，而X这部分在未经修饰的P2引物中却不存在。因此，与用未经修饰的引物P1和P2制备出的延伸产物相比，这些延伸产物具有增加或减少了已知数目的核苷酸，并且这些产物把用未经修饰的引物P1和P2制备出的延伸产物紧紧地夹在中间。
因为(从添加的X和删减的Y)可以知道所述夹住标记物的确切长度，所以在电泳过程中它们具有与用未经修饰的引物P1和P2制备出的PCR等位基因产物近似的迁移率，而且由于它们不会与该遗传基因座的已知或常见等位基因重叠，所以这些夹靠式、与基因座匹配的标记物能确保精确地测定出该STR基因座的长度。
图4显示的是下述设计方案：为了制备出比任一天然生成等位基因或常见等位基因更长或更短的各种等位基因，所以不在独特的侧翼序列上，而在多态性区域自身内部删减或插入重复单元。用一对经典STR引物正向引物5和反向引物6’从基因组DNA扩增出的经典PCR产物，可以从重复区域分为两部分。经典产物的5’部分用经典的正向引物5与反向引物7和7’分别配对从重复区域中扩增出来。反向引物7’含有较短变异等位基因中重复单元的一半。反向引物7”则含有产生较长变异等位基因所必需的重复单元的一半。经典产物的3’部分用经典的反向引物6”与正向引物8’和8”分别配对从重复区域中扩增出来。正向引物8’含有用于制备较短等位基因的重复单元的一半。正向引物8”则含有用于制备较长等位基因的重复单元的另一半。这4个来自所述重复区域的引物在5’末端都是以几个额外核苷酸开始，接下来是重复单元核苷酸，其3’端以侧翼序列核苷酸结尾，其中所述的5’末端核苷酸可以被Eam 1104 I等无伤痕(seamless)限制性内切酶识别。PCR扩增后，得到的4个片段每个都可以用一种无伤痕限制性内切酶(例如Eam 1104I)消化，而且用T4 DNA连接酶连接成为2个片段。用引物对7’和5扩增到的片段与用引物对8’和6”扩增到的片段连接形成较短的等位基因或最短的相同等位基因。用引物对7”和5扩增到的片段与用引物对8”和6”扩增到的片段连接形成较长的等位基因或最长的等位基因。电泳分离时，最短和最长的常见等位基因会将天然生成“共有”等位基因被夹在中间，从而确保可以测定出精确长度。实施例
给出的以下实施例是为了说明本发明的优点，帮助本领域普通技术人员实施和利用本发明。但是，这些实施例不应该被理解用于限制本发明公开的和所附权利要求阐述的范围。实施例1
制备可以用于测量来自TCRA基因座的V7家族基因的多态性CDR3区域长度的与基因座匹配的夹靠式标记物。
在淋巴细胞增殖过程中，每个TCRA基因都是通过体细胞重组从50多个AV节段基因和63个AJ节段基因中各取1个与单个AC节段基因组装而成(见，Davis et al.，nature 334：394-402，1988；以及moss etal.，Eur.J.Immunol.23：1153-1159，1993)。位于AV和AC节段之间的多态性CDR3区域的长度和序列用下述手段制备的：在AJ节段的可变区删减和添加核苷酸。TCRA CDR3区域的长度范围为0-17aa(liu，D.，Dau，p.，美国专利US08/559205，在此引入作为参考)。根据序列同源性，可以将TCRA基因分为32个家族，它们的多态性CDR3区域可以用家族特异性AV节段正向引物和共同的AC节段反向引物来扩增。因此，这些基因节段可以作为用于分析每个特定TCRAV基因家族的CDR3片段长度多态性的侧翼序列。
因为在扩增所有TCRAV家族中的CDR3片段长度多态性中，用共同AC节段引物与下游侧翼序列杂交，所以为了扩增出能在电泳时将经典扩增片段夹在中间的较短和较长DNA片段，将另外2个AC节段引物制备成能与位于经典AC节段引物结合位点5’和3’侧的AC序列杂交。
因为可以将同一种下游侧翼AC节段引物与特异于每个家族的不同AV上游侧翼引物配合用于扩增多态性CDR3区域，所以上述方法的原理适用于所有AV家族。然而，新设计的AC引物必须和与其配对的每个家族特异性AV引物在温度和序列上是匹配的。由于使用的是同源性PCR模板，温度相容性是一种无关紧要的因素，这就保证了除任一对之间的序列不相容性外，下面讨论的同一个新设计的AC节段引物能与所有的28个AV节段引物配对。可以重新设计不相容引物对使之能与不同的AV或AC特异性序列结合，直到为每个AV家族都发现一个相容性引物对为止。
用单独的(separate)PCR反应扩增来自T细胞克隆No.263的cDNA，每个反应使用特异于29个TCRAV家族中的一个的正向引物(genevee et al.，eur.J.Immunol.22：1261-1269，1993)与一个共同AC129反向引物配对，该引物可以扩增出侧翼AC节段5’末端的前129个核苷酸。T细胞克隆从唯一一个反应中生产出一种特异性产物。通过测序凝胶电泳上片段长度测定或通过测序把非特异性产物排除。发现用AV7-AC129引物对扩增的cDNA是单克隆的，具有长为27个核苷酸的CDR3区域，表达AJ26基因节段的核苷酸，片段全长349个核苷酸。此外，分子克隆(No.147)是从AV7-AC129的分子克隆中衍生出的，AV7-AC129是从来自PBMC多克隆cDNA扩增而来的。使用pCR-Script SK(+)克隆试剂盒(stratagene，la jolla，CA)克隆得到的平端PCR产物。测序时，M147含有长为30个核苷酸的CDR3，表达AJ5基因节段，片段长度为352个核苷酸。
由于经典的AC节段反向引物扩增的是AC节段5’端的57个核苷酸，设计出的较短和较长的反向AC节段引物扩增的分别是AC节段5’端的27个核苷酸和87个核苷酸，因而制备出的产物比经典产物短或长30个核苷酸。因此，用克隆No.147 DNA作模板，这些夹住标记物中将包括0～60个核苷酸的CDR3区域，从而将样品TCRA DNA中期望长度的CDR3包括进去。
3个TCRAC节段引物全部用荧光检测的Cy5进行了5’端标记。图5a-b给出的是当用3个AC节段引物与AV7节段引物在分离PCR反应中配合使用时，这些AC引物生产出差距60个核苷酸的PCR产物。图5a显示克隆No.147具有长为250、280和310bp的相应片段。图5b显示克隆No.263具有长为247、277和307bp的相应片段，CDR3区域缩短了3个核苷酸。
来自这些克隆的DNA，外加PCR扩增的AV7家族特异性DNA，用电泳片段分析对它们进行了测量，该AV7家族特异性DNA来自另外15个已经测序并用AV7/AC57引物对扩增的克隆，电泳分析使用基因座无关的100/350bp和200/350bp标记物以及上述CA27和CA87与基因座匹配的标记物作为夹住的标准物。将电泳分析结果与测序测定的长度比较。当在A.L.F.显示屏上使用的是247-307bp夹住的标记物对时，测量的最大偏差为0.3个核苷酸(平均0.10±0.13个核苷酸)，这完全符合数值小于1.5个核苷酸的要求。对于200/350bp夹住的标记物对而言，偏差高出0.6个核苷酸(平均0.25±0.15个核苷酸)，反映出了这两对AV7家族特异性夹住标记物之间CDR3区域的序列异源性。用100/350bp基因座无关标记物得到相对于实际片段长度大得多的偏差值(4.25±0.23个核苷酸)。当使用200/350bp无关标准标记物时，平均偏差值减小到1.08±0.11个核苷酸，这显示了100和200bp标准标记物之间序列异源性的效果以及夹住的标准物相对于样品DNA的紧密性。实施例2
制备可以用于测量来自TCRB基因座的V16家族基因的多态性CDR3区域长度的与基因座匹配的夹住标记物。
在淋巴细胞增殖过程中，每个TCRB基因都是通过体细胞重组从45个TRCBV节段基因、2个BD节段基因、13个BJ节段基因和2个BC节段基因中各取1个组装而成(见，Davis et al.，Nature 334：395-402，(1988)；以及Rowen et al.，Science 272：1755-1762(1996))。长度和序列多态性CDR3区域位于BV和BC节段之间，由BD和BJ节段可变区通过删减核苷酸和添加N核苷酸制备而成。根据序列同源性，可以将TCRB基因分为25个家族或亚家族，它们的多态性CDR3区域可以用不同家族特异性BV节段正向引物和共同的BC节段反向引物来扩增。因此，这些基因节段可以作为用于分析每个特定TCRBV基因家族的CDR3片段长度多态性的侧翼序列。
为了将共同BC节段引物夹在中间，将另外2个BC节段引物制备成能与位于经典BC节段引物结合位点5’和3’侧的BC序列杂交，这两个引物与BV家族特异性引物配合使用扩增出较短和较长的DNA片段。这些扩增到的DNA片段长度能在电泳时将经典扩增片段夹在中间。原理上，这种技术适用于任一BV家族，因为它们相同或高度近似的BC节段使得可以将共同的3’侧翼BC引物与它们的5’侧翼家族特异性BV引物结合用于扩增所有BV基因的多态性CDR3区域。然而，新设计的AC引物必须和与其配对的每个家族特异性BV引物在温度和序列上是相容的。由于使用的是高度纯化的PCR模板，所以温度相容性无关紧要，这就确保了除任一对之间的序列不相容性外，下面讨论的同一个新设计的BC节段家族特异性引物能与所有25个BV节段家族特异性引物配对。可以重新设计不相容引物对，使之能与不同的BV或BC特异性序列杂交，直到为每个BV家族都发现一个相容性引物对为止。
用T细胞克隆No.296的cDNA作为25个分离PCR反应的模板，每个反应使用特异于25个TCRBV家族其中一个的正向引物(参见Liu等，免疫学方法杂志，187：139-150(1995))与一个共同BC54反向引物配对，该引物可以扩增出侧翼BC节段5’末端的前54个核苷酸。只用BV16家族特异性引物，可以从T细胞克隆中生产出一种特异性产物。通过在自动聚丙烯酰胺测序凝胶电泳时测定产物是否落在BV家族正确的长度范围内，或者通过在同一装置上进行DNA循环测序测定其确切序列，从而把非特异性产物排除。
序列测定发现，用BV7-BC168引物扩增的cDNA是单克隆的，长为363 bp。其CDR3区域长为30个核苷酸，而且它使用的是BJ1.2基因节段。因为经典BC节段反向引物扩增的是BC节段5’端的54个核苷酸，短反向引物扩增的是BC节段5’端的24个核苷酸，长反向引物扩增的是BC节段5’端的92个核苷酸。这3个BC节段引物的一套是用荧光素标记生产的，另一个用Cy5标记。
家族特异性BV16引物与经典BC54反向引物配对扩增出一段TCR特异性片段，该片段中包含V节段的3’末端区域、完整的CDR3区域、完整的J区域以及C基因节段5’端到54位核苷酸。该片段序列长为249bp。用BC24或BC92引物取代CB54引物，重复PCR反应扩增出另外的DNA片段。这种情况下，扩增出长为219bp和287bp的TCRBV16特异性片段，除它们的BC节段3’端延伸出的长度外，这些片段具有与249bp片段相同的基因座特异性序列。
图6显示的是把249bp经典产物夹在中间的219bp产物和287bp产物的分离图。当在A.L.F.装置上电泳时，用这些与基因座匹配的标记物测量时，上述249bp片段出现的偏差为-0.3个核苷酸。在同一泳道中共电泳的100/300bp基因座中性标准物不能可靠地鉴定249bp产物，测量偏差为-1.5个核苷酸。对另外12个BV16特异性T细胞克隆进行鉴定，将这些TCR CDR3区域与克隆No.296的TCR CDR3区域一起进行测量。使用219/287bp这对基因座特异性夹住的标准物对时，出现的平均绝对偏差为0.52±0.38个核苷酸。偏差范围为-0.3～+0.8个核苷酸，这反映出CDR3区域与夹住的基因座匹配标记物的J片段之间的序列与单个克隆之间的部分序列不匹配性，以及它们BC节段长度不同。在同一泳道中用100/300bp夹住的无关标准物对共电泳时，测量得到的平均绝对偏差为0.81±0.49个核苷酸。
为了测试出电泳条件的不同，主要是增加温度对这些结果的影响，在A.L.F.显示屏上重复该实验。使用与基因座匹配的夹住标准物时，绝对测量偏差减小到0.17±0.21个核苷酸，但是使用基因座无关标准物在同一泳道中共电泳时，绝对测量偏差增大到3.31±0.74个核苷酸。这些结果表明与无关标准物相比，基因座相容性标准物在电泳条件改变时对偏差变化具有相对抗性。位点无关标准物与位点特异性DNA之间更大的序列及长度不相容性使得不同电泳条件会增加它们的不同迁移率，这反过来会产生更大的测量偏差。A.L.F.和A.L.F.显示装置之间，在凝胶聚合体、电泳采用的缓冲液以及迁移路径长度上都是相同的。
总之，这些结果表明：与使用夹住的基因座无关内置式标准物相比，使用夹住的与基因座匹配的泳道内置标准物进行电泳测量TCR基因片段时，在小于1.5个核苷酸的需要数值范围内偏差值增加更稳定。当电泳测定TCR片段长度时，测量误差之间的差异变得很重要，这是因为通过多个3个核苷酸的变化导致CDR3区域中氨基酸添加或删减从而使它们的长度发生变化。因此，如果误差小于1.5个核苷酸，那么就能可靠地将多态性CDR3片段相互之间区分开来。实施例3
通过修饰侧翼序列，制备可以用于STR基因座CSF1PO、FESFPS和F13A01的基因座相容性夹住的标记物。
在来自每个基因座的长或短等位基因的末端添加或删减核苷酸，制备基因座相容性夹住的标记物。为了制备出电泳迁移率近似于被测STR分子的夹住的标记物，通过下述方法在从Promega等位基因梯度中所能获得的最长等位基因一端添加或在所能获得的最短等位基因一端删减4个核苷酸。
第一步，为了将每个梯度中出现的最短和最长等位基因分离出来，将来自Promega Corp.CSF1PO、FESFPS和F13A01的3个等位序列梯克隆到质粒载体中，并转化到细菌内(PCR-Script amp SK(+)克隆试剂盒，stratagene)。
第二步，设计用于上述3个STR基因座其中之一的2个反向引物。这些反向引物显示于表1，是通过下述方法制备而成的：在初级引物序列的5’端删减4个核苷酸基因组序列或者添加4个核苷酸重复或基因组DNA序列。
第三步，在其5’端用荧光素标记正向引物，在公开的引物序列(见表1)基础上不做任何序列改变。
第四步，用从上述3个基因座其中之一分离到的最短等位基因作为PCR反应的模板，使用它们的截短反向引物与它们的荧光素标记正向引物配对。最长的等位基因则是通过它们自己的加长反向引物与它们的荧光素标记正向引物配对使用扩增出来的。
将制备好的用于每个基因座的夹靠式标准物与它们的基因座特异性等位序列梯加入到聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道内，并用A.L.F.自动DNA测序仪进行电泳。图7a-c显示出，用于STR基因座CSF1PO、FESFPS和F13A01的基因座相容性夹靠式标记物把它们的初始等位基因紧紧地夹靠在中间。实施例4在校准的电泳迁移率中验证与基因座匹配的夹靠式STR标记物
将与基因座匹配的夹靠式STR标记物以内置或外置方式，与内置式标准物共电泳，校定它们的基因座中的等位基因的测量结果，并与使用标准基因座无关夹靠式标记物以及使用来自每个基因座的等位基因梯度中的最短或最长真实等位基因作为标记物进行比较。对于每个数据点来说，在5个聚丙烯酰胺测序凝胶每个上各取至少3个分散泳道对3个STR基因座都做了测定。不同的成套外置式或内置式标记物总是在同一凝胶泳道中共电泳。然后，计算出每次测量数值与期望数值之间的绝对偏差。结果见表2。
                                 表2
                                 校准
  位点   外置   外置   内置   内置   内置 外置+内置   外置+内置
  标准序列梯   等位序列梯   标准夹靠式 与基因座匹配的夹靠式   等位夹靠式 标准序列梯+标准夹靠式 等位序列梯+与基因座匹配的夹靠式
 CSF1P0  2.9±0.15*  1.90±0.13  0.63±0.05  0.32±0.07  0.08±0.04  0.94±0.06   0.01±0.02
 FESFPS  2.37±2.02  2.36±2.59  1.18±0.16  0.16±0.18  0.04±0.06  1.24±0.16   0.04±0.06
 F13A01  2.02±2.38  2.89±3.33  1.85±0.71  0.17±0.21  0.11±0.14  1.87±0.69   0.10±0.12
*平均值±SD(核苷酸)
由基因座无关标准梯度或等位序列梯组成的外置式标准参照物是同样不理想的。由于区分四聚体串联重复等位基因需要测量误差小于2个核苷酸，所以它们无法可靠地区分这3个基因座任一个中的等位基因。
标准基因座无关参照物当作内置夹靠式标准物使用时效果较好，但是同时用于所有3个STR基因座，它们就会产生比与基因座匹配的夹靠式标准物高5.6倍的偏差。由于与人工制备的与基因座匹配的夹靠式标准物相比，较短和较长的真实等位基因的序列与被测等位基因之间的匹配性更大，所以这些较短和较长的真实等位基因产生的偏差比修饰后的等位基因更小。
将标准基因座无关外置式梯度与标准基因座无关内置夹靠式参照物配合使用后，在偏差上与单独使用标准基因座无关内置夹靠式参照物相比并无任何改善。使用等位外置式标准物加上外置式夹靠式基因座匹配标记物，矫正了与内置夹靠式与基因座匹配的标记物相关的偏差，使其低于使用内置式等位基因作为夹靠式参照物时的偏差水平。
然后，用与基因座匹配的夹靠式标准物测量样品DNA等位基因和K562对照样品的长度，该样品DNA等位基因取自2个核心家庭中的7个个体。测量偏差几乎与表2中所示的使用STR等位序列梯时得到的数值相同：CSR1PO 0.28±0.12；FESFPS 0.26±0.15和F13AO1 0.22±0.18。
在测量真实等位基因时，内置式与基因座匹配的夹靠式标准物显示出低标准偏差。这一发现表明，由于它们的电泳迁移率与它们的来源等位基因高度近似，所以在不同泳道之间以及不同的凝胶电泳条件下，它们的迁移率与它们所测量等位基因一起以叠合精确的方式变化，因此保证了测量偏差相对恒定。实施例5用运行时间测量DNA片段长度
用较短(sb)和较长(lb)夹靠式与基因座匹配的或特异性标记物以及被夹靠的未知(u)样品等位基因的运行时间，可以计算出该未知片段的长度。CSF1PO、FESFPS和F13AO1基因座的所有未知(u)样品等位基因的长度，可以利用等式I和II，从A.L.F.装置上显示出的它们的运行时间计算出来。在每个基因座的侧翼反向PCR引物上添加或去除4个核苷酸的基因组DNA序列，在这种条件下制备出用于每个基因座的sb和lb参照物。
EQ1    速率(min/nt)＝RTlb-RT/Llb-Lsb
EQ2    Lu＝RTu-RTsb/速率+Lsb
从对于每个基因座的测量片段长度计算出的平均偏差和SDs很小，显示如下：CSF1PO 0.09±0.07个核苷酸；FESFPS 0.18±0.18个核苷酸和F13AO1 0.17±0.20个核苷酸。
利用来自与基因座匹配的标准物的夹靠式F13AO1测量的A.L.F.和A.L.F.显示系统与利用Fragment ManagerTM软件(0.16和0.14个核苷酸)或RTs(0.16和0.12个核苷酸)测量片段长度之间，在低平均等位基因偏差上几乎没有差异。然而，当使用基因座无关标准标记物时，这两个系统之间的平均偏差就会因这两个装置而变得更大，用A.L.F.是用A.L.F.显示系统的2倍(1.25和0.60个核苷酸，1.25和0.60个核苷酸)。
这一结果又一次表明，与基因座匹配的标准物和样品等位基因的相对迁移率变化的阻力服从于不同操作条件。在进行这些计算中使用RTs使得它们可以被精确设计的计算机软件利用来鉴定样品等位基因。在用固定时间而非使用RTs比较条带迁移距离的其他电泳系统中，也可以类似于使用RTs时的方式利用与基因座匹配的或特异性标记物，通过使用一种精确设计的电脑程序来计算迁移距离。实施例6
通过改变位于被扩增STR多态性区域内的串联重复单元的数目，制备基因座特异性夹靠式标准物，以及它们的验证作为用于电泳校准的夹靠式标准标记物。
可以通过在STR等位基因的多态性(重复)区域中添加或删减串联重复单元，制备可以用作夹靠式参照物的突变等位基因，与通过在等位DNA片段的3’或5’添加或删减核苷酸制备成的与基因座匹配的标记物相比，它们具有更强的基因座特异性。在非单元性的重复序列的情况下，通常采用添加或删减核心重复单元。基因座F13A01含有一个由4-16个重复单元组成的等位区域，因侧翼序列截短每个单元包括3.2个等位基因，下面以基因座F13A01为例来解释如何制备这些参照物。
第一步，从重复区域(表1，F13A01 rev251-Eam-1，F13A01rev275-Eam-9，F13A01 fwd268-Eam-2以及F13A01 fwd248-Eam-9)中设计两个反向引物(短和长)和两个正向引物(短和长)。在每个引物的5’端并入可以被限制性酶Eam1104识别的6个核苷酸，随后是期望数目的重复单元，然后在3’端以一段特异性侧翼序列结尾。
第二步，在分离PCR中，分别将来自重复区域的2个反向引物与经典F13A01正向引物各自配对，扩增实施例3第1步中的克隆后的较长等位基因或者基因座F13A01中的任一符合下述要求的等位基因：含有足够数目用于结合引物的重复单元。
第三步，用Eam1104(stratagene)消化第2步中的每个PCR产物，然后在2％ NuSieve(FMC Bioproducts)mini-凝胶上电泳。从NuSieve凝胶上回收具有预期长度的消化后PCR产物，并用QLAEX(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)纯化。
第四步，用F13A01 rev251-Eam-1反向引物与正向引物F13A01fwd190配对以及用F13A01 fwd268-Eam-2正向引物与反向引物F13A01 rev484-Eam-9配对制备出较短的PCR产物，消化后，按照厂商提供的说明书用T4 DNA连接酶将消化后的产物连接成具有2个重复单元的较短的基因座特异性夹靠式标记物。用F13A01 rev275-Eam-9反向引物与正向引物F13A01 fwd190配对以及用F13A01 fwd248-Eam-2正向引物与反向引物F13A01 rev484配对制备出较长的PCR产物，消化后，按照厂商提供的说明书用T4 DNA连接酶将消化后的产物连接成具有17个重复单元的较短的基因座特异性夹靠式标记物。测序验证这两个连接产物。
第五步，用基因座特异性引物扩增较短和较长的基因座特异性夹靠式标记物，并利用PCR-script amp SK(+)克隆试剂盒(stratagene)将其直接克隆到质粒DNA中用于复制。
另外还有几种其他可以用于制备基因座特异性突变等位基因的已知技术，这些技术是本领域技术人员众所周知的。
优选制备的突变等位基因只是通过出现或缺失1-2个重复单元而有别于它们的相邻等位基因，因此赋予了它们与其相邻等位基因之间如同真实等位基因彼此间一样的关系。在不同的情况下，例如在出现不完整等位基因的情况下，优选突变等位基因的重复数目只是通过部分或多个重复单元而有别于它们的最邻近等位基因。然后，用突变等位基因作为校准标记物对每个真实等位基因的RT进行鉴定，因为它的作为夹靠式多态性区域的长度与它的部分RT间隔成正比，该部分RT间隔是由较短标记物的RT间隔减去从较短突变等位基因到较长突变等位基因的总运行时间间隔得到的。
上述制备的突变等位夹靠式参标记的另一个重要优势是可以利用PCR引物试剂盒扩增它们的模板DNA，该试剂盒被设计为通过结合到同一侧翼区域来扩增多态性基因组基因座。因为突变等位参照物在它们的模板中并入了与真实等位基因相同或更长侧翼序列，所以可以在扩增来自该基因座的未知基因组DNA等位基因的PCR中使用基因座特异性引物，对它们进行共扩增。
电泳时，将共扩增的标记物和样品DNA一起加入到同一泳道中。由于标记物和样品DNA具有同样可区分(same differential)标记物，并且电泳迁移不重叠，所以它们可以容易地检测出来。夹靠式标记物不仅可以精确地测量出未知DNA片段的长度，而且可以在样品分析PCR步骤中作为阳性对照。
图8a-c显示的是F13A01特异性较短和较长夹靠式标记物的电泳扫描图，该标记物与基因组DNA样品STR103(8a)、对照DNAK562以及F13A01等位序列梯分别在同一PCR试管中共扩增。将3个非与基因座匹配的标准标记物(250，300和350个核苷酸)加入到各个泳道中用于比较。根据每个等位基因中重复单元的数目，通过它们的等位数目设计较短和较长突变等位基因以及真实等位基因。在图8c中由于重叠，300个核苷酸标准标记物遮盖了等位基因8。每组PCR产物在3个不同泳道上电泳。用夹靠式标准标记物(250/350，pharmacia)和夹靠式基因座特异性标记物(275/335，较短和较长)测量时的平均变异以及标准偏差，对于来自样品DNA的等位基因3.2和6是1.32±0.39个核苷酸和-0.20±0.05个核苷酸，对于来自对照DNAK562是-1.17±0.40个核苷酸和-0.05±0.07个核苷酸，以及对于该等位序列梯的所有等位基因是-0.47±0.31个核苷酸和-0.02±0.08个核苷酸。
在同一PCR管中共扩增基因座特异性夹靠式参照物和样品DNA的另一个优点是，夹靠式标记物和样品DNA两者的PCR产物都具有与通过Taq DNA聚合酶向它们3’末端添加的额外核苷酸相同的部分。如果校准标准DNA的不同部分在不同的PCR扩增中并入额外核苷酸，或者校准用的标准DNA不是一种PCR产物或是一种非-Taq相关PCR产物，那么通过DNA聚合酶向样品DNA的一部分中添加额外核苷酸就是计算误差产生的来源。而且，在共扩增条件下，Taq DNA聚合酶似乎从基因组中产生较少非特异性产物，包括断断续续的峰。
图9显示在每个泳道中的200和300个核苷酸标准DNA参照物具有无明显额外核苷酸添加的对称峰。用F13A01基因座特异性引物从基因组DNA样品K562中扩增较短突变等位基因和2个真实等位基因，由于这些片段大部分添加了额外核苷酸，这些扩增产物的峰表现为向右移动。从基因组DNA样品108中扩增的较短突变等位基因只在片段小部分添加了额外核苷酸，所以不足以使峰发生移动。从基因组DNA样品109中扩增的较短突变等位基因和两个真实等位基因，由于它们的DNA片段约一半通过Taq DNA聚合酶添加了额外核苷酸，这些扩增产物显示出双相峰。
在无论何种原因需要对经典引物对进行修饰的情况下，可以把夹靠式基因座特异性标记物越过经典引物对结合位点延伸到侧翼区域以产生延伸的PCR模板。例如，来自重复区域的反向引物F13A01rev251-Eam-1不与经典引物对中的一个引物配对，而是与正向引物F13A01 fwd 1(表1)配对，在PCR扩增时可以在经典正向引物的上游产生出额外的189个核苷酸。类似地，来自重复区域的正向引物F13A01fwd248-Eam-2与反向引物F13A01 rev 628(表1)，在经典反向引物的下游产生出额外的146个核苷酸。
图10显示的是fwd 1和Eam-1配对扩增的260bp(泳道2)PCR产物以及Eam-2和rev 628配对扩增的369 bp(泳道3)PCR产物。用Eam1104消化后，将2个DNA片段用T4 DNA连接酶连接起来，用经典引物对进行再扩增。图10中的泳道4显示的是从延伸后的模板中扩增得到的275 bp较短夹靠式标记物。图10中显示的所有样品DNA产物都已通过测序验证。因此，延伸并连接后的DNA片段(F13A01 fwd 1-rev 628)可以用作模板，利用根据未知DNA样品5’和3’侧翼序列设计的引物对与未知DNA样品共扩增。
用于与基因座匹配的夹靠式标记物、基因座特异性STR标记物以及基因座特异性突变等位基因的PCR或mPCR共扩增以及共电泳的试剂盒可以包括下述物质的全部或其中的任一种：1)用于扩增对于每个待测基因座的较短及较长特异性夹靠式标记物的DNA模板，2)与每个基因座的5’和3’侧翼序列结合的PCR引物，3)三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)和适用于PCR的缓冲液，4)适用于PCR的热稳定DNA聚合酶，以及5)用于样品DNA提取和定量的说明书和试剂，定量以确保样品DNA的量与预先配制的模板DNAs相匹配。用于从全血中提取DNA的经典试剂包括NH4Cl、醋酸钾、Rnase A、异丙醇、乙醇、EDTA、SDS和NaOH。可以设计出电脑软件通过用夹靠式与基因座匹配的或特异性标记物校准计算出样品片段长度。与基因座匹配的夹靠式标记物或基因座特异性STR标记物与含有基因座未知等位基因的样品DNA在PCR和mPCR中共扩增和共电泳，可以用于鉴定(基因分型)，而且在对2～20遗传基因座进行操作时效果特好。
虽然用优选实施例对本发明进行描述，但是本领域技术人员应该认识到在所附权利要求的实质和范围内本发明可以改进实施。

Claims (20)

1.能够生产与基因座匹配的标记物的配套引物，其中的标记物用于测定遗传基因座的多态性区域的DNA片段长度，所述配套引物包括：
初级正向和初级反向引物，它们分别与DNA样品遗传基因座的多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交，所述初级正向和初级反向引物中至少有1个包括一种第一可被检测的标记物，所述初级正向引物与所述DNA样品的DNA反义链杂交，所述初级反向引物与所述DNA样品的DNA正义链杂交，所述初级正向和初级反向引物位于所述DNA样品中包括所述多态性区域在内的第一部分的两侧；以及
第一和第二次级反向引物，它们分别在第一和第二部位与所述DNA正义链杂交，这两个部位都位于所述多态性区域的下游，所述第一部位位于所述DNA样品的所述第一部分内，所述第二部位位于所述第一部分的下游。
2.权利要求1所述的配套引物，其中进一步还包括在所述第一和第二次级反向引物上分别带有第二和第三可被检测的标记物。
3.权利要求1所述的配套引物，其中所述的第一和第二次级反向引物分别具有比所述初级反向引物短或长的选定数目的核苷酸。
4.能够生产与基因座匹配的标记物的配套引物，该标记物用于测定遗传基因座的多态性区域的DNA片段长度，所述配套引物包括：
初级正向和初级反向引物，它们分别与DNA样品遗传基因座中多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交，所述初级正向和反向引物中至少有1个包括一种第一可被检测的标记物，所述初级正向引物与所述DNA样品的DNA反义链杂交，所述初级反向引物与所述DNA样品的DNA正义链杂交，所述初级正向和初级反向引物位于所述DNA样品中包括所述多态性区域在内的第一部分的两侧；以及
第一和第二次级正向引物，它们分别在第一和第二部位与所述DNA反义链杂交，这两个部位都位于所述多态性区域的上游，所述第一部位位于所述DNA样品的所述第一部分内，所述第二部位位于所述第一部分的上游。
5.权利要求3的配套引物，其中进一步还包括在所述第一和第二次级正向引物上分别带有第二和第三可被检测的标记物。
6.权利要求4所述的配套引物，其中所述的第一和第二次级反向引物分别具有比所述初级正向引物短或长的选定数目的核苷酸。
7.一种用于测定遗传基因座多态性区域DNA片段长度的方法，其中包括以下步骤：
制备在第一和第二部位上与DNA正义链结合的第一和第二次级反向引物，所述的两个部位都位于遗传基因座多态性区域的下游；
将所述第一和第二次级反向引物与初级正向和初级反向引物配合使用，通过聚合酶链反应扩增与所述多态性区域的等位基因的较短和较长基因座匹配的夹靠式标记物，所述初级正向及初级反向引物分别与所述多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交，所述初级正向引物与DNA的反义链杂交，所述初级反向引物与DNA的正义链杂交，所述初级正向和反向引物位于所述DNA样品中包括所述多态性区域在内的第一部分的两侧，所述第一次级反向引物杂交到位于所述第一部分内的部位上，所述第二次级反向引物杂交到位于所述第一部分下游的部位上；以及
检测与每个等位基因的较短和较长基因座匹配的标记物。
8.权利要求7所述的方法，其中所述检测步骤包括利用电泳分离所述与较短和较长基因座匹配的夹靠式标记物。
9.用于测定多态性遗传基因座中DNA片段长度的与基因座匹配的标记物，该标记物是用下述方法生产的：
扩增分别与DNA样品多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交的初级正向和初级反向引物，所述初级正向和初级反向引物中至少有1个包括一种第一可被检测的标记物，所述初级正向引物与所述DNA样品的DNA反义链杂交，所述初级反向引物与所述DNA样品的DNA正义链杂交，所述初级正向和初级反向引物位于所述DNA样品中包括所述多态性区域在内的第一部分的两侧；
第一和第二次级反向引物分别在第一和第二部位与所述DNA正义链结合，这两个部位都位于所述多态性区域的下游，所述第一部位位于所述DNA样品的所述第一部分内，所述第二部位位于所述第一部分的下游；以及
从上述扩增步骤中获得较短和较长的与基因座匹配的夹靠式标记物，该标记物分别比所述第一部分更短及更长。
10.一种制备用于测定多态性遗传基因座中DNA片段长度的与基因座匹配的标记物的方法，该方法包括以下步骤：
扩增分别与DNA样品多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交的初级正向和初级反向引物，所述初级正向和初级反向引物中至少有1个包括一种第一可被检测的标记物，所述初级正向引物与所述DNA样品的DNA反义链杂交，所述初级反向引物与所述DNA样品的DNA正义链杂交，所述初级正向和初级反向引物位于所述DNA样品中包括所述多态性区域在内的第一部分的两侧；
第一个和第二个次级反向引物分别在第一和第二部位与所述DNA正义链杂交，这两个部位都位于所述多态性区域的下游，所述第一部位位于所述DNA样品的所述第一部分内，所述第二部位位于所述第一部分的下游；以及
从上述扩增步骤中获得较短和较长的与基因座匹配的夹靠式标记物，该标记物分别比所述第一部分更短及更长。
11.用于测定多态性遗传基因座中DNA片段长度的与基因座匹配的标记物，该标记物是用下述方法生产的：
扩增分别与DNA样品多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交的初级正向和初级反向引物，所述初级正向和初级反向引物中至少有1个包括一种第一可被检测的标记物，所述初级正向引物与所述DNA样品的DNA反义链杂交，所述初级反向引物与所述DNA样品的DNA正义链杂交，所述初级正向和初级反向引物位于所述DNA样品中包括所述多态性区域在内的第一部分的两侧；
第一和第二次级正向引物分别在第一和第二部位与所述DNA反义链杂交，这两个部位都位于所述多态性区域的上游，所述第一部位位于所述DNA样品的所述第一部分内，所述第二部位位于所述第一部分的上游；以及
从上述扩增步骤中获得较短和较长的与基因座匹配的夹靠式标记物，该标记物分别比所述第一部分更短及更长。
12.一种用于测定遗传基因座多态性区域DNA片段长度的方法，其中包括以下步骤：
制备在第一和第二部位上与DNA反义链杂交的第一和第二次级正向引物，所述的两个部位都位于遗传基因座多态性区域的上游；
将所述第一和第二次级正向引物与初级正向和初级反向引物配合使用，通过聚合酶链反应扩增较短和较长与基因座匹配的夹靠式标记物，所述初级正向及初级反向引物分别与所述多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交，所述初级正向引物与DNA的反义链杂交，所述初级反向引物与DNA的正义链杂交，所述初级正向和初级反向引物位于所述DNA样品中包括所述多态性区域在内的第一部分的两侧，所述第一次级反向引物杂交到位于所述第一部分内的部位上，所述第二次级反向引物杂交到位于所述第一部分上游的部位上；以及
检测与每个等位基因的较短和较长基因座匹配的标记物。
13.一种制备与基因座匹配的标记物的方法，该标记物针对于包含遗传基因座的短串联重复(STR)，所述方法包括下述步骤：
把从包含遗传基因座的STR中扩增到的等位序列梯或基因组DNA克隆到质粒载体中，所述等位序列梯是用针对于包括所述STR基因座的基因组序列的初级正向和初级反向引物制备而得的；
将质粒载体转化到宿主中；
分离所述等位序列梯或基因组DNA中的较短及较长的等位基因；
标记初级正向引物以产生一种带标记的初级正向引物；
通过从所述初级反向引物中删减掉第一批已知数目的核苷酸，以及通过给所述初级反向引物添加上第二批已知数目的核苷酸，分别制备出针对STR基因座的较短和较长的次级反向引物；
用所述较短等位基因作为PCR反应中的模板，该PCR反应使用所述的带标记的初级正向引物以及所述的较短次级反向引物；以及
用所述较长等位基因作为PCR反应中的模板，该PCR反应使用所述的带标记的初级正向引物以及所述的较长次级反向引物。
14.用于产生基因座特异性短串联重复标记物的配套引物，所述标记物用于测定包含短串联重复(STR)序列的多态性遗传基因座中等位基因的DNA片段长度，所述配套引物包括：
初级正向引物和初级反向引物，它们分别与包含STR核苷酸序列的DNA样品多态性区域的上游和下游侧翼序列杂交；
两个与所述DNA样品的DNA正义链杂交的次级反向引物；
两个与所述DNA样品的DNA反义链杂交的次级正向引物，所述的两个次级反向引物和所述的两个次级正向引物与所述多态性区域内的寡核苷酸序列杂交。
15.一种用于测定多态性遗传基因座中等位基因的DNA片段长度的方法，所述遗传基因座中包含短串联重复(STR)序列，所述方法包括以下步骤：
制备两个与DNA的正义链杂交的次级反向引物以及两个与含STR核苷酸序列的DNA反义链杂交的次级正向引物，所述的两个次级反向引物和所述的两个次级正向引物与含所述STR序列的所述DNA的多态性区域中的核苷酸序列杂交；
将所述的两个次级反向引物与一个同所述多态性区域的上游侧翼序列杂交的初级正向引物配合使用，以及将所述的两个次级正向引物与一个同所述多态性区域下游侧翼序列杂交的初级反向引物配合，通过聚合酶链反应从所述多态性区域中扩增出PCR产物，
所述扩增步骤产生了两个较短和两个较长的PCR产物，所述的两个较短PCR产物中的第一产物在其一端上具有所述的两个次级反向引物中的第一引物而且在其另一端具有所述初级正向引物，所述的两个较短PCR产物中的第二产物在其一端上具有所述的两个次级正向引物中的第一引物而且在其另一端具有所述初级反向引物，所述的两个较长PCR产物中的第一产物在其一端上具有所述的两个次级反向引物中的第二引物而且在其另一端具有所述初级正向引物，所述的两个较长PCR产物中的第二产物在其一端上具有所述的两个次级正向引物中的第二引物而且在其另一端具有所述初级反向引物；
连接上述的两个较短PCR产物以形成一个较短的变异等位基因标记物；
连接上述的两个较长PCR产物以形成一个较长的变异等位基因标记物；
检测所述的较短和较长变异等位基因标记物。
16.用于测定遗传基因座的STR多态性区域中DNA片段长度的基因座特异性短串联重复(STR)标记物，该标记物是用下述方法制备而成的：
用与DNA样品中的STR多态性区域的上游及下游侧翼序列杂交的初级正向和初级反向引物、与所述DNA样品中DNA正义链杂交的两个次级反向引物和与所述DNA样品中DNA反义链杂交的两个次级正向引物，扩增出至少两个较短和两个较长的DNA产物，其中所述的两个次级反向引物和所述的两个次级正向引物与所述多态性区域内的核苷酸杂交；
将上述的两个较短DNA产物连接以形成一个较短的变异等位基因标记物；以及
将上述的两个较长DNA产物连接以形成一个较长的变异等位基因标记物。
17.一种制备基因座特异性短串联重复标记物的方法，该标记物用于测定含短串联重复(STR)序列的多态性遗传基因座中DNA片段的长度，所述方法包括以下步骤：
用与DNA样品中STR多态性区域的上游及下游侧翼序列杂交的初级正向和初级反向引物、与所述DNA样品中DNA正义链杂交的两个次级反向引物和与所述DNA样品中DNA反义链杂交的两个次级正向引物，扩增出至少两个较短和两个较长的DNA产物，其中所述的两个次级反向引物和所述的两个次级正向引物与所述多态性区域内的核苷酸杂交；
将上述的两个较短DNA产物连接以形成一个较短的变异等位基因标记物；以及
将上述的两个较长DNA产物连接以形成一个较长的变异等位基因标记物。
18.用于与基因座匹配的夹靠式标记物、基因座特异性STR标记物以及基因座特异性变异等位基因的PCR或多重PCR共扩增以及共电泳的试剂盒，该试剂盒包括用于至少一个待测基因座的较短和较长基因座特异性夹靠式标记物的DNA模板。
19.权利要求18所述的试剂盒，其中包括用于多个待测基因座的DNA模板。
20.权利要求18所述的试剂盒，其中进一步包括至少一种下列物质：
适用于PCR的dNTP和缓冲液，
适用于PCR的热稳定性DNA聚合酶，以及
用于样品DNA提取和定量的说明和试剂，以确保样品DNA的量与预先制备的模板DNA相匹配。
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