CN1346411A

CN1346411A - 核酸扩增方法

Info

Publication number: CN1346411A
Application number: CN00805887A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·迪莱特
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-05-01
Publication date: 2002-04-24
Also published as: JP2002542837A; WO2000066768A1; AUPQ008799A0; EP1181389A4; KR20020008153A; EP1181389A1; US6737253B1

Abstract

本发明涉及基因分析,尤其是涉及基因组分析,具体地说,本发明涉及一种核酸(即靶核苷酸序列)的扩增方法,该方法通常被用于测序,尤其是基因组的测序中。

Description

核酸扩增方法

技术领域

本发明涉及基因分析，尤其是涉及基因组分析，具体地说，本发明涉及一种核酸(或目的核苷酸序列)的扩增方法，该方法通常被用于测序，尤其是基因组的测序中。

背景技术

DNA自动序列分析方法的发展及生物信息学的发展，给生物学和医学带来了革新，并将其引入到基因组学新领域——基因和基因组的研究。这些技术被用于破译许多细菌(5，7，9，10，20)，古细菌(3)及真核生物的全基因组(6，11)。

较大基因(包括人类基因组)的传统测序方法是采用一种三阶段各个击破“divide-and-conquer”战略(29)。

第一阶段是构建被研究若干生物体的DNA克隆库，先随机将DNA切割成为片断，再按片断的大小不同将它们分类，然后将片断插入到合适的载体中，这些载体具有在酵母或细菌宿主中增殖的能力。

第二阶段包括：(a)在重叠的酵母或细菌人工染色体(YAC或BAC)克隆上，通过识别共有的染色体界标，构建一个低分辨率的物理图谱。举例说，这些界标可能是能被多聚酶链反应(PCR)扩增的唯一位点(序列标志位点即STSs)，或限制性内切酶酶切消化位点；(b)通过随机将YAC或BAC亚克隆到粘粒载体，并识别它们的界标、重叠序列，构建(已知序列的)高分辨率图谱。

第三阶段即最后阶段：选择一套重叠度最小的粘粒克隆，随机切割成小片段，将其亚克隆到M13噬菌体或质粒载体中。在每一个粘粒中，可测得约800个M13噬菌体克隆，并将其组装构成40kbp的粘粒插入片段。这种随机方法(即鸟枪法)的测序结果冗余度极高，约为实际核苷酸量的八倍。

由于“divide-and-conquer”方法的复杂且价格昂贵，人们开始研究发展一些新方法。基因组研究所(TIGR)首先创用大碱基(Mbp)基因组的直接鸟枪测序法。在这种方法中，染色体DNA的小片段被直接克隆到M13载体中。克隆被随机排列并直接组装成染色体序列。这个全基因随机测序技术被用于许多细菌和古细菌的基因测序，包括流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(9)的1.9Mbp基因组。生殖支原体(Mycoplasmagenitalium)(10)的0.58Mbp基因组，和詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)(3)的1.66Mbp基因组。这一方法不需要任何现有的物理图谱，能显著减少完成测序所需的每一碱基对成本。然而，同所有的随机测序方法一样，其根本问题是需要有一个较高的序列冗余度。换句话说，在毗连序列群(sequence contigs)即序列对比群(clusters of alignedsequence)构建之前，用计算机排序方法测得每个核苷酸的量是核苷酸本身的许多倍。例如，H.influenzac基因组用原始的鸟枪法组装，除需要生成11.6Mbp随机序列外(大于基因组总量的6倍)，还包含140个需要大量人工填补的重叠群缺口(9)。

对随机鸟枪测序法的固有的低效性的一种替代方法是引物步进法(primer walking)(25)。在这个过程中，利用根据已知序列设计的一个引物，将序列信息延伸到未知的旁侧序列区域。这个新序列信息可用来设计下一个引物。这个过程不断继续，直到确定了目的区域的全部序列。尽管引物步进法对于大规模测序项目似乎很具有吸引力，但费时较长，且每隔400—500碱基要合成单个引物，其代价是昂贵的，因此这个方法实际上行不通。利用一个合成前的短引物库，可不需要合成每一个新引物。可惜，库中相关短引物的数量极大，例如，一个完整八聚体库包含有65,536个引物，一个完整十聚体库含有上百万个单引物。

有两个基本解决方法可使引物步进法可行，并不需要合成较大引物库。第一个方法是，选用有用的八聚体、九聚体或十聚体的最优化小组，来缩小引物库(4、12、24、26)。第二个方法是采用连接6单体的序贯引物延伸方法(SPEL-6)，将至少三个邻近的互补六聚体(即从全套的4096个六聚体或1024个单一变性六聚体中提取出来)退火到单链DNA模板上，组装成大引物(18bp或更长)。退火六聚体通过连接反应连接，进行一个标准测序反应(15—19、27)，以上述这个方法为基础，发展了一系列相关技术，包括利用六聚体但不需要连接反应(21、22)，或以自我互补的六聚体链(8)的连接反应为基础，

上述两种方法都因存在许多技术难点而难以推广应用。大规模测序的模拟试验表明，引物组数量组减少超过80％—90％就会影响引物的柔韧性及通用性(1、26)。以一个八聚体引物库为例说明，这将导致引物库组包含有6000至12,000个引物，而一个九聚体引物库则需要多达超过其四倍的引物。即使在技术上这样规模的引物库是可以得到的，但其构建成本昂贵，且难以广泛应用。许多研究者设计了较小的只包含1000到3000个引物的八聚引物组和九聚引物组，然而这些引物组因为几乎没有G+C可变区，而在用于蛋白编码序列时受到限制(12、14、24)。在一些更原始的生物中，许多短寡核苷酸的存在是导致引物测序反应失败的原因，例如在一篇报道说，只有约一半的121个九聚体序列引物起作用(2)。这个共性问题似乎与阻碍引物有效结合到正确位点(18)的模板二级结构的形成有关。

SPEL-6六聚体连接方式的复杂性限制其在大规模测序项目中的广泛应用。另外，对于一个完整六聚引物库(包含4096个引物)，这一技术还需要：(1)对六聚引物进行酶促磷酸化作用；(2)一个单链DNA模板，或经化学变性的双链DNA；(3)具有单链结合蛋白的DNA连接反应；(4)在测序之前有一个去蛋白步骤；和(5)采用测序酶。此外，测序失败也经常发生，因为六聚引物退火所需要的低退火温度，有利于形成能有效阻止引物退火的模板二级发夹结构。最后，由于缩小引物库的方法和SPEL-6方法都不能使用荧光标记引物，因此，在测序仪器及化学制品的使用中受到限制。

本发明的目的是克服或改善至少一点现有技术中的不足，即提供一个有用的方法。

发明的概述

本发明涉及了一种用交错的巢式引物(interlaced nesting primers)来扩增核苷酸序列的方法。此方法可用于测序，尤其是基因组的测序。当此方法用于测序时，就成为交错巢式的扩增方法和测序方法(ASIN)。

本发明的第一方面，是提供一种目的核苷酸序列的扩增方法，所述目的核苷酸序列至少包含一个已知序列区，所述已知序列区包含有从5′端到3′端的：第一已知区和第二已知区，所述第一已知区和第二已知区彼此直接相连，所述方法包含：

1)第一步扩增至少包含

(a)以至少含有目的核苷酸序列的序列作为模板；和

(b)一个第一引物，具有5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个与第一已

知区相应的变性序列；一个目的核苷酸第二已知区的互补序列；

所述扩增步骤产生第一个扩增产物；

2)第二步扩增至少包含

(a)以第一个扩增产物作为模板；和

(b)一个第二引物，具有5′端到3′端：一个所述第一引物5′标志序列的互

补链的杂交序列；和一个目的核苷酸序列第一已知区的互补序列；

所述扩增步骤产生第二个扩增产物。

本发明的第二方面，是提供一种目的核苷酸序列的扩增方法和测序方法，此方法包括本发明第一方面所述的目的核苷酸扩增方法和第二个扩增产物的测序方法。

合适的是，所述扩增步骤是聚合酶链式反应(PCR)。

合适的是，分别在第一引物和第二引物中，所述5′标志序列与第一引物5′标志序列互补链的杂交序列是相同的。

合适的是，所述5′标志序列是一个载体特异性序列。所述5′标志序列最好是从M13噬菌体，pUC18，pBR322，pGEM.BLUESCRIPT或pBELOBACII提取的。但本领域的技术人员理解，可以用任一合适的5′标志序列。

合适的是，所述5′标志序列的长度是10—25个碱基，其更合适长度是15—18个碱基，其最合适长度是15个碱基。

合适的是，在第一引物中，第二已知区的互补序列的长度是4—8个碱基。其更合适长度是6个碱基。

合适的是，在第一引物中，与目的核苷酸第二已知区的互补序列相随的变性序列的合适长度为6—12个碱基。其最合适长度为9个碱基。

合适的是，在第二引物中，目的核苷酸序列第一已知区的互补序列的长度为1—5个碱基。其更合适长度为3个碱基。

合适的是，所述5′标志序列，或所述5′标志序列互补链的杂交序列能作为一个测序引物。或者，也可将第二引物用作一个测序引物。

在一个具体实施例中，所述第一步扩增和第二步扩增分别包含两个第一引物和两个第二引物，在第一步扩增中所述第一引物之一作为一个反向引物，在第二步扩增中第二引物之一作为一个反向引物。对本领域的技术人员来说，十分清楚在任一第一引物上的所述5′标志序列可能相同或不同。

对本领域的技术人员来说，十分清楚第一步扩增和第二步扩增可依次序或同时进行。

本发明的第三方面，是提供一种按本发明第一方面或第二方面所述方法得到的产物。

本发明的第四方面，是提供一种引物，它具有从5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个变性序列；一个预先确定的序列，且这些序列彼此直接相连。合适的是，所述预先确定序列的长度是4—8个碱基，其较合适长度为6个碱基。合适的是，与预先确定的序列相伴的变性序列的合适长度为6—12个碱基，其较合适长度为9个碱基。

本发明的第五方面，是提供一个引物，具有从5′端到3′端的：一个如本发明第四方面所述引物的5′标志序列的互补链的杂交序列，和一个预先确定的序列。更合适的是，所述预先确定序列的长度为1—5个碱基，其较合适长度为3个碱基。

本发明第四方面和第五方面所述引物的5′标志序列可能是一个载体特异性序列，是从M13噬菌体，pUC18，pBR322，pGEM.BLUESCRIPT或pBELOBACII提取的载体特异性序列。本发明第四方面和第五方面的引物的合适长度是10—25个碱基，更合适长度为15—18个碱基，最合适长度为15个碱基。

本发明的第六方面，是提供一组引物，至少包含两个引物，其中这些引物选自本发明第四方面和第五方面所述的引物中。所述一组引物中，至少有一个引物是按本发明第四方面所述的引物，至少有一个引物是按本发明第五方面所述的引物。

本发明的第七方面，是提供一个包含本发明第四方面所述引物的引物库。

本发明的第八方面，是提供一个包含本发明第五方面所述引物的引物库。

本发明的第九方面，是提供一个包含本发明第四方面或第五方面所述引物的引物库。

本发明的第十方面，是提供一个包含本发明第六方面所述引物组的引物库。

本领域的技术人员可以通过任何技术方法产生所述引物库。更合适的是，用亚磷酰胺方法通过化学合成产生所述引物库。

本发明的第十一方面，是提供一个包含本发明第四方面或第五方面所述引物的试剂盒。

本发明的第十二方面，是提供一个包含本发明第六方面所述引物组的试剂盒。

本发明的第十三方面，是提供一个包含本发明第七到十方面中的任一方面所述引物库的试剂盒。

更合适的是，所述试剂盒最好能用于本发明第一方面或第二方面所述方法中。所述试剂盒也可以更多包含可供选择的缓冲剂、稀释剂、酶及一个或多个合适的反向引物的模板。

本发明的第十四方面，是提供一个目的核苷酸序列的扩增和测序方法，所述核苷酸序列至少包含一个已知序列区，所述已知区序列包含5′端到3′端的：一个三碱基的第一已知区和一个六碱基的第二已知区，所述第一已知区和第二已知区互相直接相连，所述方法包含：

1)第一步扩增反应至少包含

(a)以至少包含目的核苷酸序列的序列作为一个模板；和

知区相对应的变性序列，一个目的核苷酸第二已知区的互补序列；

所述扩增步骤产生第一个扩增产物；

2)第二步扩增反应至少包含

(a)以第一个扩增产物为模板；和

(b)一个第二引物，具有5′端到3′端的：一个与第一引物相同的5′标志序

列；一个目的核苷酸序列第一已知区的互补序列；

所述扩增步骤产生第二个扩增产物；

3)以所述5′标志序列作为测序引物，对第二个扩增产物进行测序。

本发明的第十五方面，是提供了一种目的核苷酸序列的扩增和测序方法，所述目的核苷酸的序列至少包含有一个已知序列区，所述方法包含

1)一个聚合酶链式反应(PCR)，至少包含

(a)以一个至少包含目的核苷酸序列的序列作为模板；和

(b)一个引物，具有5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个目的核苷酸序

列已知区的互补序列；

所述PCR反应产生一个PCR产物；

2)对所述PCR产物进行测序。

本发明的第十六方面，是提供一个目的核苷酸序列的扩增和测序方法，所述核苷酸序列至少包含一个已知序列区，所述已知区序列包含5′端到3′端的：第一已知区和第二已知区，所述第一已知区和第二已知区互相直接相连，所述方法包含：

1)一个扩增步骤，至少包含

(a)以一个至少包含目的核苷酸序列的序列作为模板；和

(b)一个引物，具有5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个与第一已知区

相应的变性序列，一个目的核苷酸第二已知区的互补序列；

所述扩增步骤产生一个扩增产物；

2)一个测序步骤，用一个测序引物对所述扩增产物进行测序。

更好的是，本发明第十六方面所述的测序步骤至少包含

(a)以所述扩增产物作为模板；和

(b)所述测序引物，具有5′端到3′端的：一个用于扩增步骤的引物的5′

标志序列互补链的杂交序列；和一个目的核苷酸第一已知区的互补序列。

更好的是，本发明第十六方面所述的扩增步骤是一个聚合酶链式反应。在分别用于扩增步骤和测序引物的引物中，所述5′标志序列和用于扩增步骤的引物5′标志序列互补链的杂交序列，可能是相同或不同的。所述5′标志序列可能是一个载体特异性序列，如M13噬菌体，pUC18，pBR322，pGEM.BLUESCRIPT或pBELOBACII。合适的是，所述5′标志序列的长度是10—25个碱基，更合适长度为15—18个碱基，最合适长度为15个碱基。在本发明的第十六方面所述的方法中，在所述扩增步骤的引物中，第二已知区的互补序列的长度可能是4—8个碱基，其更合适长度为6个碱基。扩增步骤所用的引物中，与目的核苷酸第二已知区的互补序列相伴的变性序列的长度为6—12个碱基，其更合适的长度为9个碱基。在测序引物中，目的核苷酸第一已知区的互补序列的长度可能是1—5个碱基，其更合适长度为3个碱基。

本领域的熟练技术人员都理解，本发明的所述引物既可作为正向引物，也可以作为反向引物，所以，以上所述方法可以用于扩增(和测序)任一希望的目的核苷酸序列。此外，由于已知某些生物基因组序列的大部分和其他生物的全基因序列，本发明也可用来建立一个生物体的开放阅读框的序列库或序列排列。

本发明的第十七方面，是提供一个按第十四至十七方面中的任一方面所述的方法制备的产物。

本发明的第十八方面，是提供一种包含本发明第三方面或第十八方面所述产物的试剂盒。

本发明的第十九方面，是提供一种用于引物步进法，如本发明的第一方面或第二方面，或第十四方面至第十七方面中的任一方面所述的方法。

本发明的第二十方面，是提供一种用于引物步进法的，如本发明第三方面所述的产物。

本发明的第二十一方面，是提供一种用于引物步进法的，如本发明的第四方面或第五方面所述的引物。

本发明的第二十二方面，是提供一个用于引物步进法的，如本发明的第六方面所述的引物组。

本发明的第二十三方面，是提供一个用于引物步进法的，如本发明的第七方面至第十方面中任一方面所述的引物库。

本发明的第二十四方面，是提供一个用于引物步进法的，如本发明的第十一方面至第十三方面中的任一方面所述的试剂盒。

常用的实验室操作程序在本说明书中不作详细描述，但在常用的分子生物学书籍中有描述，例如，萨姆布鲁克等编著的《分子克隆的实验指南》(1989，纽约，冷泉港，冷泉港实验室)。

在本说明书中，术语“聚合酶链式反应”和其缩写“PCR”，按本领域的技术人员所理解的常规方法操作。在本技术领域通用的普通分子生物学书籍及参考手册中能查到PCR方法的实例，例如，PCR技术：《DNA扩增的原理及应用》(Ed.H.A.埃力克，1989年，纽约斯多克顿出版社)。

为使PCR扩增反应更为广泛地应用，所述引物是可以按不同的浓度和比例用的。本领域的技术人员可以选用并得到合适的浓度、比例及其他变量。

在本说明书中，术语“扩增”和“扩增产物”(amplify和amplification)在意义上可解释为“制造至少一份复制品”和“至少一份复制的产物”。

在本说明书中，术语“测序引物”在意义上可解释为能启动一个测序反应的任一引物。

在本说明书中，术语“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“模板”可按本领域的技术人员所理解的通常含义解释。

在本说明书中，术语“引物步进法”按本领域的技术人员所理解的通常含义解释，在意义上即为：利用已知核苷酸序列从未知的旁侧区域中得到核苷酸序列，及利用已得到的核苷酸序列，从更旁侧序列中再得到核苷酸序列。所述步骤能重复任意次。

在本说明书和权利要求书中，除非上下文中有明确的要求，“包含”(comprise)“包括”(comprising)及其相近词语可解释为包括在内的意思，而不是严格限制或排外的意思，也就是说是“包括，但不局限于”的意思。

附图的简要说明

图1，本发明的ASIN程序的图示说明，斑点区域代表5′标志序列，条纹区域表示第一已知区，灰色区域表示第二已知区。

图2，本发明的ASIN巢式反应程序抑制非目的PCR产物生成的图示说明，图中标明了目的核苷酸的第一已知区和第二已知区。

图3，以引物EK10R和EK10FS进行PCR扩增得到1727个碱基对的大肠杆菌(E.coli)fruR区。EK10R和EK10FS的退火位点用下划线标明。第一轮ASIN引物TTCCTG的3个长度为8核苷酸的退火位点以框线标出。用ASIN第二轮引物CTAG-GC和CTAG-TA进行PCR扩增，分别产生1108个碱基对和595个碱基对的PCR扩增产物。

图4，用第一轮引物TTCCTG和第二轮引物CTAG-GC和CTAG-TA进行ASIN PCR反应。条带1：150ng的f174DNA标记(1353bp、1078bp、872bp和603bp)。条带2：用第二轮引物CTAG-TA和EK10R的6μlASIN PCR扩增产物。条带3：1μl的fruR PCR产物。条带4：用第二轮引物CTAG-GC的6μl ASIN PCR产物。

图5，3172bp的大肠杆菌E.coli fusA区域。第一轮ASIN引物4G1，4G3和4G6的3个长度为9个核苷酸的退火位点用框线标出。利用ASIN第二轮引物4G9和4G12或4G7和4G12分别产生509bp和1440bp的PCR扩增产物。

图6，fusA ASIN PCR反应和对照反应。条带1：150ng的SppI/EcoRI DNA标记(8857，7427，6106，4899，3639，2799，1953，1882，1515，1412，1164，992，710，492，359，81bp)。条带2：用引物4G3和4G6的7μl对照ASIN PCR#1扩增产物。条带3：用引物4G9和4G12的3μl ASIN PCR#2产物。条带4：用引物4G1和4G6的7μl对照ASIN PCR#1扩增产物。条带5：用引物4G7和4G12的1μl ASIN PCR#2产物。

发明的公开

本发明涉及一种已知其中一个区域的目的核苷酸序列的扩增方法。所述方法可用于测序，尤其是基因组的测序中，可能比当前的测序技术更具优势。

本发明可用于引物步进法，即用从相对较小的合成前引物库中选择引物，在可扩增的模板上进行引物步进法。本方法可与许多不同的测序用化学物品一起使用，并适用于自动化程序。

为更清楚地理解本发明，以下的实施例及其附图将详细说明。

尽管这一研究似乎没有价值，但其结果表明，只有当引物退火到模板的最后8-11bp上(23)，PCR反应才能顺利进行。换句话说，只有当一个寡核苷酸在其3′末端的8个或更多个碱基与模板相匹配时，它才可作为PCR引物。

一个完整的可用于扩增任一模板(至少8个碱基是已知的)的八聚引物库，包含65,536个引物。而一个完整的九聚引物库则包含262,144个引物。这样的引物库即使缩减到90％，也是较难操作的。本发明经精心的引物设计可使完整引物库，也就是，可扩增任一模板(至少有一些序列是已知的)的引物库的引物数量极大地减少。

如本发明所述，采用两步扩增程序，例如从如下所述的小得多的变性九聚引物库中可得到非变性九聚引物特异性，图1为一个两步程序实例的示意图，描述一个9个碱基已知的(被分成第一已知区和第二已知区)模板目的核苷酸序列的扩增。

本发明要求在所述九聚引物上附加5′标志序列。如实施例所述，九聚引物库的每个引物经过部分变性(引入全部四个碱基，如从3′端起的在7、8和9位点)，所需引物库能减小64倍。因此，仅从4096个引物就能构建一个九聚引物库，每个引物包括从3′端起始的7至9个碱基的三个变性位点。尽管这会减少所需引物的数量，但能有效地将九聚引物库转化为4096个成员的六聚引物库，从而极大地降低扩增的特异性。与一个真正的九聚引物每隔262kb的退火位点比较，从这个库中提取的引物易被错误地引作模板上平均每隔4kb存在的退火位点。

从所述引物库中挑选出一个5′标志的变性九聚引物，退火到模板的已知的9个碱基3′端的6个碱基(第二已知区)上。变性九聚引物实际上是64个相关引物的混合物，用这变性引物来扩增会产生一个不同产物的混合物，而所需要的产物只是其中很小的一部分。

然后，利用一个第二引物可以从这个混合物中能选择性扩增需要的产物。该第二引物从包含64个成员的第二引物库中筛选得到(如图2所示)，其中，每个引物包含与第一引物库的引物相同的5′标志序列(或第一引物库中引物的5′标志序列互补链的一个杂交序列)，和它的3′端三核苷酸的64种可能组合之一。将3′端的三核苷酸组合互补到5′端的三碱基，再互补到用于选择第一引物(第一已知区)模板的六碱基上，以此为基础从这个由64个成员的引物中来选择第二引物(如图2所示)。由于不需要的产物在三核苷酸处3′端引物一模板不相配(如图2所示)，因此，所需要的产物能从产物混合物中通过选择扩增得到。

当然，反向引物也是必需的。然而，如果被测序的模板是从一个克隆库中得到的，例如，就可以用一个通用的载体特异性反向引物。产生的PCR产物包含5′端到3′端的：5′标志序列：已知的9bp序列：和旁侧未知的序列。

如上所述，例如通过结合小得多的变性第一引物库(六聚引物库)和具有64个成员的第二引物库，就可得到一个真正的九聚引物库的特异性。

当然，两次PCR产物可通过任一已知序列化学物测序。利用5′标记的八聚引物库或九聚引物库选择合适的引物(也就是说，此引物有与在目的位点的与模板相匹配的

3′端)进行引物步进法和PCR反应。用任一(a)单独的5′标志，或(b)第二引物作为引物，可得到如上所述的与已知序列的旁侧区的序列。利用序列信息从5′标志引物库中选择得到新引物，这一方法可以重复，直至确定了目的核苷酸序列的全序列。

如上所述方法的许多修改/修饰是可以预期的。例如，首先，上述反应可作为两个分开的扩增反应中任一个来进行，或作为包含在一个反应中全部三个引物的一步扩增反应进行，但第一引物(变性引物)的浓度降低10至100倍。在这种情况下，第一个5′标志引物的早期消耗后，确保在后阶段的因第二个5′标志引物的扩增反应占主导地位，从而保持了扩增特异性。

更进一步的是，用两组第一引物和第二引物，而不用传统的反向引物，也可以来扩增。也可以，以这种方法为手段完成常规的扩增反应，而不需要为每个模板特别地合成引物(当然，在目的产物的每个末端上，提供所需碱基的最小数量是已知的)。

例如，第一(变性)引物库用5′标志的九聚引物库，但不一定必须是九聚体，可以是八聚体或十聚体或任一其他可用长度的引物来代替。所需要的引物的长度能由本领域技术人员通过简单的实验建立起来。同样，第二引物库不一定必须是如上所述的三聚体，可以用两聚体或四聚体或任一其他可用长度的引物来代替。所需要的引物的长度能由本领域技术人员通过简单实验来确定。更进一步的是，第一(变性)引物库的大小是可以缩减的。如，一个变性九聚引物库可以通过删除该4096个引物的90％，将4096个引物缩减到约400个引物。

本发明中可用任一可扩增的模板，包括基因组DNA，质粒克隆，cDNA等。

利用只包含一个共同的5′标志序列(如M13反向引物)的引物库和例如，3′端的所有8-9bp，可对任一所需目的核苷酸序列(其中，例如至少8或9个碱基是已知的)分别进行目的核苷酸扩增和测序，尽管有较多麻烦，但还是可行的。在这种方法中，不需要如上所述的第二引物。当目的核苷酸序列被包括在一个载体中时，可以以目的核苷酸序列的3′端的载体序列为基础设计一个反向引物。

以此扩增反应为基础的引物步进法与其他引物库或六聚体配体连接方法相比较，可能有许多优势。其一，这一方法可避免一些与模板二级结构构象相关的问题，因为在第一次循环结束后，步进扩增法可以在较高退火温度下进行，即一旦5′标志序列第一次退火结合到模板上后，在随后的循环中，变性位点成了5′标志序列和起始的8或9bp位点两者。换句话说，5′标志引物只能与其结合使扩增反应进行。如果起始5′标志引物受二级结构约束，而退火性能较差，引物的5′标志序列能接着进行有效的扩增。其二，可用标准测序条件，因为对于每一扩增产物均可引入同样的5′标志序列。其三，标记的测序引物可以使所述测序方法与全部测序化学物(如：Licor)相匹配。其四，可以避免其他测序技术所需复杂的酶催化步骤，如SPEL-6六碱基连接方法。

本领域技术人员认为，通过进行外巢式扩增反应(extra nested amplification)可得到较大序列特异性，例如，通过设计三引物库和两次巢式扩增反应得到12单体特异性。实施例1

E.Coli fruR基因的PCR扩增方法

PCR扩增得到一个含有fruR基因的E.Coli基因组的1727bp片段(SEQ IDNO.1)(如图3所示)。PCR反应包含：5μl 2mM含有全部四种脱氧核苷三磷酸的脱氧核苷三磷酸混合物(dNTP)；5μl 10×PCR缓冲液[500M KCl，100mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)，1％TritonX-100]；4μl 25mM MgCl₂；1μl EK10FS引物(5′-tttaacccataccagtacaat-3′；SEQ ID No.2)(10pmol per μl)；1μl EK10R引物(5′-taacgggtaggcactgataag-3′；SEQ ID No.3)(10pmol per μl)；1μl E.Coli DNA(10ng per μl)；28μl MilliQ水。PCR反应和含有1单位Taq DNA聚合酶和0.1单位Pfu DNA聚合酶的5μl MilliQ水在PE 2400 PCR仪中预热至80℃。反应经过10次循环：95℃10s；65℃20s，且每过一循环降低1℃；72℃90s。PCR反应立即转入随后的20次循环：95℃10s；54℃20s；72℃90s。ASIN PCR#1

以ASIN方法进行1727bp的E.Coli fruR区的巢式PCR扩增反应。第一轮ASIN PCR扩增反应包含：1μl 2mM dNTPs；1μl 10×PCR缓冲液；1μl 25mM MgCl₂；1μl的首轮引物TTCCTG(5′-cgattcgataacnnttcctg-3′；SEQ ID No.4)(1pmol per μl)；0.2ul fruRPCR产物作为模板DNA；1单位的Taq DNA聚合酶；5.6μl MilliQ水。PCR反应预热至95℃30s后，再进行二次PCR循环：95℃10s；40℃60s；72℃60s。ASIN PCR#2

第二轮ASIN PCR混合物含有：4μl 2mM dNTPs；4μl 10×PCR缓冲液；4μl 25mMMgCl₂；1μl所需要的第二轮ASIN引物(10pmol per μl)；1μl EK10R引物(10pmol perμl)；和26μl MilliQ水。该方法第二轮ASIN引物采用：CTAG-TAC(5′-gggcacgattcgataacta-3′；SEQ ID No.5)(图4：条带1)和CTAG-GC(5′-gggcacgattcgataacgc-3′；SEQ ID No.6)(图4：条带3)。将第二轮PCR混合物加入到第一轮ASIN反应中，经25次循环： 95℃10s；50℃20s；72℃60s。

各取ASIN PCR扩增产物6μl走电泳，电泳条件：2％琼脂糖凝胶；1×TAE缓冲液(40mMTris-乙酸盐，1mM EDTA)，40V，1小时。凝胶在溴化乙锭染色后，在紫外透射仪下摄影。实施例2ASIN PCR#1

用ASIN方法将E.Coli fusA的基因(SEQ ID No.7)的PCR扩增区段克隆到pUC19质粒(质粒pUC4G，《细菌学杂志》J.Bacteriol.176：123-29)。第一轮ASIN PCR扩增反应包含：2.5μl 2mM dNTPs；2.5μl 10×PCR缓冲液[500M KCl，100mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)，1％TritonX-100]；2.5μl 25mM MgCl₂；1μl的第一轮ASIN两个正向引物之一，4G1(5′-gat tcgataacnnnctgcaa-3′；SEQ ID No.8)或4G3(5′-gattcgataacnnntgagcg-3′；SEQ ID No.9)(10pmol perμl)；1μl第一轮ASIN逆向引物4G6(5′-gattcgataacnnntgacca-3′；SEQ ID No.10)(10pmol per μl)；1μl pUC4G模板DNA(5ngper μl)(图5)。

PCR反应液和含1单位Taq DNA聚合酶的5ul MilliQ水在PE 2400 PCR仪中预热至80℃。循环条件：95℃10s；39℃1min；72℃2min；共5次循环。PCR反应立即转入随后的循环，循环条件：95℃10s；54℃30s；72℃2min；共10次循环。

ASIN PCR#1的对照反应也用上述方法，除了将上述的PCR循环反应条件修改，即最后的95℃10s；54℃30s；72℃2min；共10次循环，改为95℃10s；54℃30s；72℃2min；共25次循环(图6：条带2和4)。ASIN PCR#2

第二轮ASIN PCR混合物含有：2.5μl2mM dNTPs；2.5ul10×PCR缓冲液；2.5μl 25mMMgCl₂；1μl所需要的第二轮ASIN引物(10pmol per μl)；10.5μl MilliQ水。下述的第二轮ASIN引物采用：4G12(5′-gggcacgattcgataactac-3′；SEQ ID No.11)和4G9(5′-ggcacgattcgataacacg-3′；SEQ D No.12)与4G3/4G6用于ASIN PCR#1反应(图6：条带3)；4G12(5′-gggcacgattcgataactac-3′；)和4G7(5′-ggcacgattcgataacgcg-3′；SEQ IDNo.13)与4G1/4G6用于ASIN PCR#1反应(图6：条带5)，将合适的ASIN PCR#1产物1μl作为模板DNA加入到第二轮ASIN反应中。

ASIN PCR反应液和含1单位Taq DNA聚合酶的5μl MilliQ水在PE 2400 PCR仪中预热至80C。反应的循环条件：95℃10；47℃30s；72℃2min；共28次循环。各取ASIN PCR反应产物5μl走电泳，电泳条件：2％琼脂糖凝胶；1×TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA)，70V，40min。凝胶在溴化乙锭染色后，在紫外透射仪下摄影。实施例3

以入DNA作为模板扩增目的DNA。扩增目的DNA的ASIN第一寡聚体和第二寡聚体的核苷酸序列如表1所示。表1目的序号 ASIN第一寡聚体 ASIN第二寡聚体1CACACAGGAAACAGCTATGACNNNCGCTAC CACACAGGAAACAGCTATGACCTT(SEQ ID NO.14) (SEQ ID NO.17)2CACACAGGAAACAGCTATGACNNNCGATTT CACACAGGAAACAGCTATGACGGT(SEQ ID NO.15) (SEQ ID NO.18)3CACACAGGAAACAGCTATGACNNNAACGCA CACACAGGAAACAGCTATGACGGT(SEQ ID NO.16) (SEQ ID NO.19)

首次反应在10μl反应混合液中进行，反应混合液包含：Taq缓冲液(寶酒造株式会社)，0.2mM dNTP，2.5ngλDNA(寶酒造株式会社)，1pmol ASIN第一寡聚体，1单位Taq DNA聚合酶(寶酒造株式会社)，进行第一次的一个循环，循环条件：95℃30s。随后进行两次循环，循环条件：95℃10s；35℃1min；72℃3min。接着将40ulPCR混合液加入反应溶液中，PCR混合液中含Taq缓冲液，0.2mM dNTP，10pmol ASIN第二寡聚体和10pmol反向引物(GTCGATAAATGGGCAATACGAAC：SEQ ID No.20)，进行PCR反应，反应条件为95℃10s；55℃1min；72℃3min，共30次循环。扩增产物用Microcon YM-100(寶酒造株式会社)来进一步纯化，除去过多的引物。用M13RV引物(CAGGAAACAGCTATGAC：SEQ ID No.21)直接循环测序确定纯化产物的核苷酸序列。用目的1，目的2，目的3，分别得到0.6kb，0.4kb，1.7kb的扩增产物，并确定扩增产物的约0.4kb的核苷酸序列，与目的DNAs是相同的。关于这一点，Sanger等在分子生物学杂志(Jounal of Molecular Biology)162，729-773(1982)中作过描述。实施例4ASIN PCR#1

用ASIN方法将E.Coli fusA的基因的PCR扩增区段克隆到pUC19质粒(质粒pUC4G，《细菌学杂志》J.Bacteriol.176：123-29)。第一轮ASIN PCR扩增反应包含：2.5μl2mM dNTPs；2.5μl 10×PCR缓冲液[500M KCl，100mM Tris-HCl(pH9.0，25℃)，1％TritonX-100]；2.5μl 25mM MgCl₂；1μl第一轮ASIN两个正向引物之一，4G1(5′-gattcgataacnnnctgcaa-3′)或4G3(5′-gattcgataacnnntgagcg-3′)(10pmol perμl)；1μl第一轮ASIN反向引物4G6(5′-gattcgataacnnntgacca-3′)(10pmol per μl)；1μlpUC4G模板DNA(5ng per μl)。

PCR反应液和含1单位Taq DNA聚合酶的5ul MilliQ水在PE 2400 PCR仪中预热至80℃。循环条件：95℃10s；39℃1min；72℃2min；共5次循环。PCR反应快速转入随后的循环，循环条件：95℃10s；54℃30s；72℃2min；共25次循环。测量mDNA测序

将4G1/4G6(T1)和4G3/4G6(T2)扩增反应的混合模板产物进行DNA测序反应。通过乙醇沉淀将过量的引物从T1和T2中除去。将2μl 3M乙酸钠(pH5.2)和22μl 85％乙醇加入20μl每一PCR产物中。样品在室温下孵育5min，然后离心，离心条件：12000g，5min.从DNA沉淀粒中除去上清液，空气干燥30min，再溶于8μl水中。

DNA测序反应进行条件：4μl BigDye Terminator RR混合物(ABI，Foster，City，CA)；0.5μl 4G7(5′-ggcacgattcgataacgcg-3′)与模板T1或4G9(5′-ggcacgattcgataacacg-3′)与模板T2中任一个；3μl T1或T2 DNA模板中任一个；2.5μl MilliQ水。测序反应适用条件：95℃10s；45℃20s；60℃4min；共25次循环。测序反应先用n-正丁醇纯化(生物技术Biotechniques 26：606-610)；再用ABI 377 DNA测序仪进行分析，得到的DNA序列数据与以前从质粒pUC4G上得到的相匹配。实施例5

微生物基因组的测序

对完整微生物基因组进行ASIN引物步进法的测序方法如下：从一微生物培养物中提取全部DNA，构建三个含有平均大小为1.3kbp，5kbp，和50-100kbp插入片段的细菌人工染色体库(BAC)。使用低复制量的BAC载体比标准粘粒载体和M13载体都具有更多优点，包括：(1)克隆插入片段的稳定维持，从而避免因基因重排或缺失引起的分析问题；和(2)当毒性或其他未能克隆序列相关的问题减少时，基因库则更具代表性。另外，使用标准克隆和宿主培养程序使一种载体系统的使用成为可能。

用直接克隆PCR方法(13)可以从1.3kbp和5kbp BAC库中得到克隆的插入片段。特别是，克隆可直接从琼脂平板上挑选出，并转入96-微孔PCR微量滴定平板的单个微孔中。克隆的插入片断可用两个BAC载体特异性引物进行PCR扩增。这种克隆PCR扩增的方法有三个主要优点：(1)可避免质粒小量制备所需的化费和努力；(2)用小的插入BAC库，则不需要生长大量体积的宿主细胞培养；和(3)提供不需进一步纯化就可直接测序的模板(28)。未纯化的PCR产物的直接测序，需要将载体引物浓缩到一定水平，使其在扩增过程中能被消化掉，而不影响产物的产量。

利用最初的鸟枪法可进行染料中止法测序，对从1.3kbp和5kbp插入片段到全基因水平(每1Mbp约2000个测序反应)均可，在克隆PCR扩增反应中利用载体特异性引物。它提供较小序列冗余度的基因组较大部分。采用ASIN引物步进法可以获得剩余的基因组序列。序列片段可用商品化购得的测序仪(Sequencher)进行序列组装和程序编辑，如Decker及其同事所述(7)。利用标准方法或ASIN方法，可从50-100kbp的BAC库中随机选择测序约为200的大插入克隆，来填补重叠群之间的缺口。这些序列提供一个支架对重叠进行排序，以得剩余的未知序列。这样可测得全序列，并用合适的计算机程序对编码区进行排序。实施例6

一个通用的反向基因引物库

举例说，在某种情况下，核苷酸序列是未知的，但多肽或蛋白序列的至少有三个氨基酸是已知的，则可用ASIN方法从编码蛋白的模板DNA中得到多肽或蛋白序列。

因此，ASIN方法可用于建立一个通用的反向基因引物库。例如，需要对如上例举的第一变性5′标志九聚引物库进行修饰设计。这个引物库包含一个共同的5′标志序列，及从3′端的7，8，9位点的完全变性。然而，从3′端的位点1至6，由两个变性氨基酸密码子构成。换句话说，每个引物3端可编码两个变性氨基酸。例如，氨基酸Glu-Leu-Asp的引物有序列5′端Tag-NNN CTN GA(T/C)。这一反向基因的九聚引物库有约400个成员，可包括每一可能的两个氨基酸的组合。选用合适的反向引物按ASIN方法可进行PCR扩增和测序。本领域技术人员都清楚，当编码多肽或蛋白的基因的3′端部分氨基酸序列部分是已知时，可用两组变性九聚引物和三联体引物。

本领域技术人员更为清楚的是，当氨基酸之一由一个密码子如met或trp编码时，本方法更为方便。

利用已被包埋的ASIN引物组，通过多样巢式扩增反应可得到特定多肽或蛋白序列的附加特异性。

本领域技术人员对本发明及本发明特定实施例所作的各种改动和/或修改，都不违背本发明的精神和范围。本发明的实施例仅用于举例说明，但不受其限制。

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Claims

1.一种目的核苷酸序列的扩增方法，其特征在于，所述核苷酸序列至少包括一个序列

已知区，所述序列已知区包含从5′端到3′端的两个非常邻近的第一已知区和第二

已知区，所述方法包括：1)第一步扩增至少包含(a)以一个至少包含所述目的核苷酸序列的序列作为模板；和(b)第一引物具有从5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个与第一已知区相应的变性序

列；和一个所述目的核苷酸第二已知区的互补序列；所述扩增步骤产生第一个扩增产物；2)第二步扩增至少包含(a)以所述第一个扩增产物作为模板；和(b)第二引物具有从5′端到3′端的：一个所述第一引物5′标志序列的互补链的杂交序

列，和一个目的核苷酸序列第一已知区的互补序列；所述第二步扩增产生第二个扩增产物。

2.一种目的核苷酸序列的扩增和测序方法，包含如权利要求1所述的方法进行目的核苷酸序列扩增和对第二个扩增产物进行测序。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述扩增步骤是聚合酶链式反应。

4.如权利要求1-3之一所述的方法，其中，分别在第一引物和第二引物中，所述5′标志

序列与所述第一引物5′标志序列的互补链的杂交序列是相同的。

5.如权利要求1至4中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列是个载体特

异性序列。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述5′标志序列来自M13噬菌体，pUC18，pBR322，

pGEM.BLUESCRIPT或pBELOBACII。

7.如权利要求1至6中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是10—25

个碱基。

8.如权利要求1至7中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是15—18个碱基。

9.如权利要求1至8中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是15个碱基。

10.如权利要求1至9中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，所述第二已知区的互补序列的长度是4—8个碱基。

11.如权利要求1至10中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，所述第二已知区的互补序列的长度是6个碱基。

12.如权利要求1至11中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，与所述目的核苷酸第二已知区的互补序列相随的变性序列的长度是6—12个碱基。

13.如权利要求1至12中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第一引物中，与所述目的核苷酸的第二已知区的互补序列相随的变性序列的长度是9个碱基。

14.如权利要求1至13中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第二引物中，所述目的核苷酸第一已知区的互补序列的长度是1—5个碱基。

15.如权利要求1至14中的任一权利要求所述的方法，其中，在所述第二引物中，所述目的核苷酸第一已知区的互补序列的长度是3个碱基。

16.如权利要求2至15中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列，或所述5′标志序列互补链的杂交序列被用作测序引物。

17.如权利要求2至16中的任一权利要求所述的方法，其中，所述第二引物被用作测序引物。

18.如权利要求1至17中的任一权利要求所述的方法，其中，所述第一步扩增和第二步扩增分别包括两个第一引物和两个第二引物；所述第一引物之一在第一步扩增反应中作为反向引物，所述第二引物之一在第二步扩增反应中作为反向引物。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述5′标志序列在每个第一引物上是不相同的。

20.如权利要求1至19中的任一权利要求所述的方法，其中，所述第一步扩增反应与第二步扩增反应是同时进行。

21.一种如权利要求1至20中的任一权利所述的方法得到的产物。

22.一种引物，包含从5′端到3′端的：一个5′标志序列，一个变性序列，和一个预先确定的序列，其中，所述这些序列彼此非常邻近。

23.如权利要求22所述的引物，其中，所述预先确定序列的长度是4—8个碱基。

24.如权利要求23所述的引物，其中，所述预先确定序列的长度是6个碱基。

25.如权利要求24所述的引物，其中，与所述预先确定序列相随的变性序列的长度是6—12个碱基。

26.如权利要求25所述的引物，其中，与所述预先确定序列相随的变性序列的长度是9个碱基。

27.一种引物，包含从5′端到3′端的：一个如权利要求22至26中的任一权利要求所述的5′标志序列互补链的杂交序列和一个预先确定的序列。

28.如权利要求27所述的引物，其中，所述预先确定序列的长度是1—5个碱基。

29.如权利要求28所述的引物，其中，所述预先确定序列的长度是3个碱基。

30.如权利要求22至29中的任一权利要求所述的引物，其中，所述5′标志序列是一个载体特异性序列。

31.如权利要求30所述的引物，其中，所述5′标志序列来自M13噬菌体，pUC18，pBR322，pGEM.BLUESCRIPT或pBELOBACII。

32.如权利要求22至31中的任一权利要求所述的引物，其中，所述5′标志序列的长度是10—25个碱基。

33.如权利要求32所述的引物，其中，所述5′标志序列的长度是15—18个碱基。

34.如权利要求33所述的引物，其中，所述5′标志序列的长度是15个碱基。

35.一组引物，包括至少两个引物，其中，所述引物选自如权利要求22至34中的任一权利要求所述的引物。

36.如权利要求35所述的一组引物，其中，至少一个引物是如权利要求22至26中的任一权利要求所述的引物，和至少一个引物是如权利要求27至29中的任一权利要求所述的引物。

37.一个引物库，包含如权利要求22至26中的任一权利要求所述的引物。

38.一个引物库，包含如权利要求27至29中的任一权利要求所述的引物。

39.一个引物库，包含如权利要求22至34中的任一权利要求所述的引物。

40.一个引物库，包含如权利要求35至36所述的一组引物。

41.如权利要求37至40中的任一权利要求所述的引物库，其中，所述引物库是以亚磷酰胺方法化学合成的。

42.一种试剂盒，包含如权利要求22至34中的任一权利要求所述的引物。

43.一种试剂盒，包含如权利要求35至36中所述的一组引物。

44.一种试剂盒，包含如权利要求37至41中的任一权利要求所述的一个引物库。

45.一种目的核苷酸序列的扩增和测序方法，其中，所述核苷酸序列包含至少一个已知序

列，所述已知序列区包含从5′端到3′端的：一个三碱基的第一已知区和一个六碱

基的第二已知区，所述第一已知区和第二已知区彼此非常邻近，所述方法包含：1)第一步PCR反应，至少包含：(a)以一个至少包含目的核苷酸的序列作为模板；和(b)第一引物，含有从5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个与第一已知区相应的变性序列；和一个目的核苷酸第二已知区的互补序列；

所述PCR步骤产生第一个PCR产物；2)第二步PCR反应，至少包含：(a)以第一个PCR产物作为模板；和(b)第二引物，具有从5′端到3′端的：与第一引物相同的5′标志序列；一个目的核苷酸序列的第一已知区的互补序列；

所述PCR产生第二个PCR产物。3)以所述5′标志序列作为测序引物，对第二个PCR产物进行测序。

46.至少包含一个已知区的目的核苷酸序列的扩增和测序方法，其特征在于，包括：1)PCR反应，至少包含(a)以一个至少含有目的核苷酸的序列作为模板；和(b)一个引物，具有从5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个目的核苷酸序列已知区

的互补序列；

所述PCR反应产生一个PCR产物；2)用测序引物对PCR产物进行测序。

47.目的核苷酸序列的扩增和序列分析方法，其中，所述核苷酸序列包含至少一个已知序

列区，所述已知序列区具有5′端到3′端的第一已知区和第二已知区，所述第一已

知区和第二已知区彼此非常邻近，所述方法包含：1)扩增步骤，至少包含(a)以一个至少包含所述目的核苷酸的序列作为模板；和(c)一个引物，具有5′端到3′端的：一个5′标志序列；一个与第一已知区相应的变性

序列；和一个目的核苷酸第二已知区的互补序列；

所述扩增步骤产生一个扩增产物；2)用测序引物对扩增产物进行测序的测序步骤。

48.如权利要求47所述的方法，其中，所述测序步骤至少包含(a)以所述扩增产物为模板；和(b)所述测序引物具有5′端到3′端的：一个应用在扩增步骤中的所述引物5′标志序

列互补链的杂交序列和一个目的核苷酸序列的第一已知区的互补序列。

49.如权利要求47或48所述的方法，其中，所述扩增步骤是聚合酶链式反应。

50.如权利要求48或49所述的方法，其中，在分别用于扩增步骤和测序步骤的引物中，所

述5′标志序列和用于扩增步骤的5′标志序列互补链的杂交序列是相同的。

51.如权利要求45至50中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列是一个载

体特异性序列。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述5′标志序列来自M13噬菌体，pUC18，pBR322，

pGEM.BLUESCRIPT或pBELOBACII。

53.如权利要求45至52中的任一权利要求所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是

10—25个碱基。

54.如权利要求53所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是15—18个碱基。

55.如权利要求54所述的方法，其中，所述5′标志序列的长度是15—18个碱基。

56.如权利要求46至55中的任一权利要求所述的方法，其中，在扩增步骤所用的引物中，

第二已知区的互补序列的长度是4—8个碱基。

57.如权利要求56所述的方法，其中，在用于扩增步骤的引物中，第二已知区的互补序列

的长度是6个碱基。

58.如权利要求46至57中的任一权利要求所述的方法，其中，在用于扩增步骤的引物中，

与目的核苷酸的第二已知区的互补序列相随的变性序列的长度是6—12个碱基。

59.如权利要求58所述的方法，其中，在用于扩增步骤的引物中，与目的核苷酸的第二已

知区的互补序列相随的变性序列的长度是9个碱基。

60.如权利要求48至59中的任一权利要求所述的方法，其中，在测序引物中，目的核苷酸序列第一已知区的互补序列的长度是1—5个碱基。

61.如权利要求60所述的方法，其中，在测序引物中，目的核苷酸序列第一已知区的互补序列的长度是3个碱基。

62.如权利要求45至61中的任一权利要求所述的方法制备得到的产物。

63.一种试剂盒，包含权利要求21或62的产物。

64.一种可用于引物步进法的，如权利要求1至20或45至61中的任一权利要求所述的方法。

65.一种用于引物步进法的，如权利要求21所述的产物。

66.一种用于引物步进法的，如权利要求22至34中任一权利要求所述的引物。

67.一组用于引物步进法的，如权利要求35或36所述的引物。

68.一个用于引物步进法的，如权利要求37至41中任一权利要求所述的引物库。

69.一个用于引物步进法的，如权利要求42至44中任一权利要求所述的试剂盒。