CN1153832C - 一种耐热碱性磷酸酯酶及其表达 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物工程技术领域，涉及一种耐热碱性磷酸酯酶。本发明提供了该耐热碱性磷酸酯酶的氨基酸序列，以及编码该氨基酸序列的DNA片段。本发明还包括克隆有该DNA片段或其一部分的表达载体和生产该重组酶的方法。同时还涉及利用该酶标记生物大分子的方法。

Description

一种耐热碱性磷酸酯酶及其表达
本发明属生物工程技术领域，涉及一种耐热碱性磷酸酯酶。
碱性磷酸酯酶是广泛存在于各种生物体内、参与细胞磷代谢的重要酶类。碱性磷酸酯酶是一种非特异性的磷酸单酯酶，通过形成磷酸丝氨酸的中间体，产生无机磷和醇。已经从多种原核生物和真核生物内获得了碱性磷酸酯酶的氨基酸序列以及相应的基因，如大肠杆菌，枯草杆菌，酵母，牛小肠，人胎盘等(BradshawRA：PNAS 1981，78：3473-3477；Kam W：PNAS 1985，82：8715-8719；Milan JL：J BioChem 1986，261：3112-3115；Hulett FM：J Biol Chem.1991，266：1077-84)。
碱性磷酸酯酶是分子生物学研究的重要工具酶，如在基因克隆中用于DNA或RNA片段末端的去磷处理、在免疫学研究中用作酶联试剂、作为核酸标记物用于核酸杂交或检测聚合酶链反应的产物等。
核酸杂交是以一段标记的DNA或RNA做为探针，检测与其互补的核酸序列的一种技术，是分子生物学中最为广泛应用的技术之一。核酸探针的标记物通常是32P或35S等同位素，虽然敏感性高，但由于半衰期短、操作中对人体的危害及同位素废物的处理繁琐等缺点，在生物学和医学常规应用和商业销售试剂盒方面受到明显限制。近十多年来，应用非同位素物质标记核酸探针已进行了广泛的研究(Mattews J.Anal Biochem.1988，169：1-25)。
目前常用的标记物包括酶，荧光素，生物素，地高辛等(欧洲专利EP304934)。根据标记物在杂交后是否能直接检测而分为直接标记和间接标记两种。间接标记主要有生物素和地高辛等半抗原；而直接标记主要有酶和荧光素。碱性磷酸酯酶无论是间接标记还是直接标记中都是最为广泛应用的酶类。在八十年代已有用碱性磷酸酯酶直接标记核酸的报道(Jablonski E：Nucleic Acids Res 1986，14：6115～6128)，所用的碱性磷酸酯酶主要是牛小肠碱性磷酸酯酶或大肠杆菌的碱性磷酸酯酶，这些酶的主要缺点是耐热性不高，不适用于在较高温度下进行杂交，而较高的温度杂交有利于减少杂交背景、增加特异性；也不能耐受如高浓度SDS等强烈的杂交洗脱条件。由于耐热性不高，这些碱性磷酸酯酶直接标记的寡核苷酸也不能作为聚合酶链反应(PCR)的引物。
嗜热菌是一类在55℃以上的环境中生长的微生物。嗜热菌所具有的酶多为耐热酶，有很高的应用价值，如耐热DNA聚合酶在PCR技术中的广泛应用。但在本发明之前，未见来源于嗜热菌碱性磷酸酯酶的报道和专利。
本发明的目的是提供一种耐热性高、用途更为广泛的碱性磷酸酯酶。
本发明所说的“耐热碱性磷酸酯酶”(简记FD-TAP)是指具有下述性质或特征的碱性磷酸酯酶：最适反应温度在50℃以上，并且在70℃的水浴保温30分钟时仍有70％以上的酶活。对同一种酶而言，上述性质或特征是在最适的保存和反应体系中测得的，随着反应体系或条件的改变，该性质或特征可能有所波动。
本发明提供了一种耐热碱性磷酸酯酶，该酶与表1所示的氨基酸序列同源或基本同源。
                   表1.耐热碱性磷酸酯酶的氨基酸序列
  1  Met Lys Arg Arg Asp Ile Leu Lys Gly Gly Leu Ala Ala Gly Ala
 16  Leu Ala Leu Leu Pro Arg Gly His Thr Gln Gly Ala Leu Gln Asn
 31 Gln Pro Ser Leu Gly Arg Arg Tyr Arg Asn Leu Ile Val Phe Val
 46 Tyr Asp Gly Phe Ser Trp Glu Asp Tyr Ala Ile Ala Gln Ala Tyr
 6l Ala Arg Arg Arg Gln Gly Arg Val Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu
 76 Ala Arg Tyr Pro Asn Gly Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Leu Thr Ser
 9l Tyr Val Thr Glu Ser Ser Ala Ala Gly Asn Ala Phe Ser Cys Gly
106 Val Lys Thr Val Asn Gly Gly Leu Ala Ile His Ala Asp Gly Thr
121 Pro Leu Lys Pro Phe Phe Ala Ala Ala Lys Glu Ala Gly Lys Ala
136 Val Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Val Thr His Ala Thr Pro Ala
151 Ser Phe Val Val Ser Asn Pro Asp Arg Asn Ala Glu Glu Arg Ile
166 Ala Glu Gln Tyr Leu Glu Phe Gly Ala Glu Val Tyr Leu Gly Gly
181 Gly Asp Arg Phe Phe Asn Pro Ala Arg Arg Lys Asp Gly Lys Asp
196 Leu Tyr Ala Ala Phe Ala Ala Lys Gly Tyr Gly Val Val Arg Thr
211 Pro Glu Glu Leu Ala Arg Ser Asn Ala Thr Arg Leu Leu Gly Val
226 Phe Ala Asp Gly His Val Pro Tyr Glu Ile Asp Arg Arg Phe Gln
241 Gly Leu Gly Val Pro Ser Leu Lys Glu Met Val Gln Ala Ala Leu
256 Pro Arg Leu Ala Ala His Arg Gly Gly Phe Val Leu Gln Val Glu
271 Ala Gly Arg Ile Asp His Ala Asn His Leu Asn Asp Ala Gly Ala
286 Thr Leu Trp Asp Val Leu Ala Ala Asp Glu Val Leu Glu Leu Leu
301 Thr Ala Phe Val Asp Arg Asn Pro Asp Thr Leu Leu Leu Val Val
316 Ser Asp His Ala Thr Gly Val Gly Ala Leu Tyr Gly Ala Gly Arg
331 Ser Tyr Leu Glu Ser Ser Val Gly Ile Asp Leu Leu Gly Ala Gln
346 Lys Ala Ser Phe Glu Tyr Met Arg Arg Val Leu Gly Ser Ala Pro
361 Asp Ala Ala Gln Val Lys Glu Ala Tyr Gln Thr Leu Lys Gly Val
376 Ser Leu Thr Asp Glu Glu Ala Gln Met Val Val Arg Ala Ile Arg
391 Glu Arg Val Tyr Trp Pro Asp Ala Val Arg Gln Gly Ile Gln Pro
406 Glu Asn Thr Met Ala Trp Ala Met Val Gln Lys Asn Ala Ser Lys
421 Pro Asp Arg Pro Asn Ile Gly Trp Ser Ser Gly Gln His Thr Ala
436 Ser Pro Val Ile Leu Leu Leu Tyr Gly Gln Gly Leu Arg Phe Val
451 Gln Leu Gly Leu Val Asp Asn Thr His Val Phe Arg Leu Met Gly
466 Glu Ala Leu Asn Leu Arg Tyr Gln Asn Pro Val Met Ser Glu Glu
481 Glu Ala Leu Glu Ile Leu Lys Ala Arg Pro Gln Gly Met Arg His
496 Pro Glu Asp Val Trp Ala
氨基酸序列的N端用横线标出了由26个氨基酸残基组成的信号肽。
本发明也提供了与表2所示的编码本发明酶的核苷酸序列同源或基本同源的DNA片段。
           表2.耐热碱性磷酸酯酶基因的核苷酸序列
1    ATG AAG CGA AGG GAC ATC CTG AAA GGT GGC CTG GCT GCG GGG GCC
46   CTG GCC CTC CTG CCC CGG GGC CAT ACC CAG GGG GCT CTG CAG AAC
91   CAG CCT TCC TTG GGA AGG CGG TAC CGC AAC CTC ATC GTC TTC GTC
136  TAC GAC GGG TTT TCC TGG GAG GAC TAC GCC ATC GCC CAG GCC TAC
181  GCC CGG AGG CGG CAG GGC CGG GTT CTC GCC CTG GAG CGC CTC CTC
226  GCC CGC TAC CCC AAC GGG CTC ATC AAC ACC TAC AGC CTC ACC AGC
271  TAC GTC ACC GAG TCC AGC GCC GCG GGG AAC GCC TTC TCC TGC GGG
316  GTG AAG ACG GTG AAC GGG GGG CTC GCC ATC CAC GCC GAC GGG ACC
361  CCC CTC AAG CCC TTC TTC GCC GCG GCC AAG GAG GCG GGG AAG GCC
406  GTG GGG CTC GTG ACC ACC ACC ACC GTC ACC CAC GCC ACC CCG GCG
451  AGC TTC GTG GTG TCC AAT CCC GAC CGG AAC GCC GAG GAG AGG ATC
496  GCC GAG CAG TAC CTG GAG TTC GGG GCC GAG GTG TAC CTT GGG GGC
541  GGG GAC CGC TTT TTC AAC CCC GCC AGG CGC AAG GAC GGG AAG GAC
586  CTC TAC GCC GCC TTC GCC GCC AAG GGG TAC GGG GTG GTG CGC ACC
631  CCC GAG GAG CTC GCC CGT TCC AAC GCC ACC CGG CTC CTG GGC GTC
676  TTC GCC GAC GGC CAC GTG CCC TAC GAG ATT GAC CGC CGC TTC CAG
721  GGC CTT GGG GTG CCG AGC CTC AAG GAA ATG GTC CAG GCC GCT TTG
766  CCC CGG CTT GCC GCC CAC CGC GGG GGC TTC GTC CTT CAG GTG GAA
811  GCG GGG CGG ATT GAC CAC GCC AAC CAT TTG AAC GAC GCC GGG GCC
856  ACC CTT TGG GAC GTG CTG GCG GCG GAC GAG GTC TTG GAG CTT CTC
901  ACC GCC TTC GTG GAC CGG AAC CCG GAC ACC CTC CTC CTC GTG GTC
946  TCG GAC CAC GCC ACC GGG GTG GGG GCC CTC TAC GGG GCG GGC CGG
991  AGC TAC CTG GAG AGC TCC GTG GGC ATT GAC CTC CTG GGG GCG CAA
1036 AAG GCC AGC TTT GAG TAC ATG CGC CGC GTC TTG GGC TCG GCC CCC
1081 GAT GCT GCC CAG GTG AAG GAG GCC TAC CAG ACC CTG AAG GGG GTC
1126 TCC CTC ACG GAC GAG GAG GCG CAG ATG GTG GTC CGG GCC ATC CGC
1171 GAG CGG GTC TAC TGG CCT GAT GCC GTG CGC CAG GGC ATC CAG CCC
1216 GAA AAC ACC ATG GCC TGG GCC ATG GTG CAG AAG AAC GCC AGC AAG
1261 CCC GAC CGG CCC AAC ATC GGC TGG AGC TCT GGG CAG CAC ACG GCG
1306 AGC CCC GTC ATC CTC CTC CTC TAC GGC CAG GGC CTG CGC TTC GTC
1351 CAG CTT GGC CTG GTG GAC AAC ACC CAC GTG TTC CGC CTG ATG GGC
1396 GAG GCC CTG AAC CTC CGC TAC CAG AAC CCG GTG ATG AGC GAG GAG
1441 GAG GCC CTG GAG ATC CTC AAG GCC AGG CCC CAG GGG ATG CGC CAC
1486 CCC GAG GAC GTC TGG GCC TAA
上述短语“DNA片段”在本发明中包括单链或双链的脱氧核糖核酸。
“同源”在本发明中根据具体内容表示：(1)一个DNA片段与另一个DNA片段有完全相同的核苷酸序列；(2)一个蛋白质与另外一个蛋白质有完全相同的氨基酸序列。
“基本同源”表示(1)一个DNA片段与另外一个片段有足够相同的核苷酸序列，使得两者翻译的蛋白质有相似的性质或特征；(2)一个蛋白质与另一个蛋白质有足够相同的氨基酸序列，使得两者表现出相似的性质和特征。
各种生物体都可以作为耐热碱性磷酸酯酶及其DNA片段的来源，如原核生物，酵母和哺乳动物等。但首选为原核生物，尤其是嗜热菌，例如市售的Thermusthermophilus菌等。
编码耐热碱性磷酸酯酶的DNA片段可以通过遗传工程的方法使之部分缺失。可以从DNA片段的5′端向3′端或从3′端向5′端进行连续缺失，或从两端向中间连续缺失，也可以缺失中间部分，再将两端部分的DNA连接起来。缺失后的DNA片段最短可仅有60个碱基。缺失后的DNA片段编码的多肽一般仍保留有耐热碱性磷酸酯酶的性质和特征。
本发明也提供了含有本发明DNA片段(或缺失后的DNA片段)的一个或多个拷贝的重组载体，该载体能够在宿主中表达本发明的耐热碱性磷酸酯酶。
本发明的载体可以是真核载体，也可以是原核载体，但最好是原核载体，以便于在原核生物体中增埴。原核载体可以是λ噬菌体(如λgt11，λDash，λZapII等)，也可以是质粒(如pBR322，pUC系列，pBluescript等)，但最好是质粒。这些载体都可以从商业途径得到。
本发明也提供了一种被本发明重组载体转化的微生物，其中首选的是革兰氏阴性杆菌，尤其是大肠杆菌。
本发明的重组载体可通过以下步骤获得：
(1)分离原核生物的染色体DNA，并用合适的限制性内切酶进行消化，
(2)将消化后的DNA整合到一载体中，用该重组载体转化合适的宿主，并以此方式构建基因文库；
(3)用适当的方法筛选步骤(2)的基因文库；
(4)对步骤(3)筛选的阳性克隆进行分析。
可使用溶菌酶处理原核生物，并加入蛋白酶K来分离染色体DNA。
可按分子生物学领域熟练技术人员熟悉的方法，用合适的限制酶消化DNA。将消化后的DNA连接到合适的克隆载体上，并用重组载体转化合适的生物体以产生基因文库。具体操作方法可参见基因工程的操作手册(Sambrook J，et al.In：Molecular Cloning，A laboratory Manual.2ed，CSH Press，1989)。
可用以下的方法从文库中筛选基因：A.寡核苷酸探针杂交；B.用聚合酶链反应方法；C.用抗体筛选；D.根据酶活性筛选。其中用核酸或寡核苷酸探针进行菌落的原位杂交是常用的方法，但在本发明中，以酶活性筛选为首选，因为耐热碱性磷酸酯酶的活性检测简单方便，且利用该酶的耐热的性质，可在原位菌落上筛选表达耐热碱性磷酸酯酶的阳性克隆。
阳性克隆的插入DNA片段可采用Sanger双脱氧终止法进行双向的DNA测序(常规的放射性同位素手工测序或用自动测序仪进行自动测序)。其结果如图1所示。
本发明还包括生产具有与图1中氨基酸序列同源或基本同源的耐热碱性磷酸酯酶的方法：
(1)用编码本发明酶的DNA片段(或部分缺失后的DNA片段)或含有该DNA片段的重组载体转化合适的宿主；
(2)在合适的培养基中培养转化后的宿主；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
可以在任何合适的启动子和翻译元件控制下在转化的宿主中表达本发明的重组耐热碱性磷酸酯酶。宿主有原核生物、酵母、哺乳动物细胞、昆虫和植物等，最好是原核生物，尤其是大肠杆菌。载体的选择根据受体的不同而异，在大肠杆菌中一般为以质粒为表达载体，如pJLA503(Lehauder B，et al.Gene，1987；53：279-283)，pET系列(Stratagene公司产品)等。大肠杆菌的培养基多为丰富培养基，如2×YT等。根据载体的种类不同，可采用温度或化学方法(如IPTG等)诱导酶蛋白的表达。
可从培养的细胞中或培养基中分离纯化耐热碱性磷酸酯酶。如表达的酶蛋白存在于细胞中，细胞经离心后，可用超声波、溶菌酶、冻融法等破菌后，经离心或过滤，取上清获得酶粗制品；如酶蛋白分泌到培养基中，可经离心去细胞后，再从上清液纯化酶。纯化酶蛋白有多种方法，如盐析法、超滤法、透析法、离子交换层析和HPLC等。在纯化过程中，酶制品在较高的温度下(如60℃)中保温一定的时间可有效去除杂蛋白，使纯化过程大为简化和方便。
耐热碱性磷酸酯酶可用于核酸、蛋白质或其它生物大分子的标记，也可用作基因克隆中DNA或RNA分子的末端去磷处理。其中最主要用途是核酸或寡核苷酸的直接标记，标记的核酸或寡核苷酸主要有三个用途：一是作为探针用于核酸杂交和足迹法分析，包括Southern blot，Northern blot，Slot blot，dot blot，Southern-western blot，原位杂交等；二是用作核酸体外扩增的引物，三是用作DNA序列分析。酶蛋白与核酸或寡核苷酸的连接主要是通过化学或物理等方法进行共价交联，可通过交联臂将核酸或寡核苷酸的末端基团与酶蛋白的氨基基团或巯基基团相连(Ruth et al：DNA 1985；4：93)。检测方法可采用化学、物理或生物学方法。根据固相杂交和液相杂交而不同，前者用BCIP/NBT为底物的显色法或以AMPPD为底物的化学发光法(Schaap A，et al.Clin.Chem.1989，35：1863-1864)为好；后者以对硝基酚(pNPP)为底物为好，可进行定量测定。
附图说明：
图1：耐热碱性磷酸酯酶基因的核苷酸序列及推导所得的氨基酸序列。氨基酸序列标在DNA序列下方(氨基酸残基以三个字母表示)，氨基酸序列的N端用横线标出了有26个氨基酸残基的信号肽。
图2：克隆有FD-TAP基因的高表达质粒pTAP503示意图。
图3：FD-TAP的耐热性。测定方法为酶溶液在95℃水浴保温不同时间，再在70℃测定酶活力。
图4：FD-TAP的最适温度。
图5：pH对FD-TAP活力的影响。
通过以下实例对本发明予以详细说明，但决不是以此限制本发明。
在实例中所用的缩写符号：
TE：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0
TH：0.3％蛋白胨，0.3％酵母抽提物，0.2％NaCl，pH7.0
LB：1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，pH7.0
2×YT：1.6％蛋白胨，1％酵母抽提物，0.5％NaCl，pH7.0
FD-TAP：来源于Thermus sp.FD3041的耐热碱性磷酸酯酶。
实例1：从Thermus sp.FD3041分离染色体DNA
在200ml TH液体培养基中70℃培养Thermus sp.FD3041(可购自复华实业有限公司，上海，中国)。菌液经离心收集菌体，用12ml TE缓冲液悬浮，加入1ml含10mg/ml溶菌酶的TE缓冲液，于37℃水浴2小时，加入1.5ml含10％十二烷基肌酸钠(Sarcosyl)、1mg/ml蛋白酶K的TE缓冲液，37℃水浴1小时，用酚、氯仿/异戌醇(24∶1)各抽提两次，水相加入1/10体积的3mol/L乙酸钠，用2倍体积的乙醇沉淀DNA，用玻棒绕出絮状沉淀物，真空干燥后溶解于3ml TE缓冲液中，加入50μl 10mg/ml RNase A，用氯仿/异戌醇抽提一次，乙醇沉淀后溶于TE缓冲液。
实例2克隆编码耐热碱性磷酸酯酶的DNA片段
用Sau3AI部分消化20μg的Thermus sp.FD3041染色体DNA，用低熔点琼脂糖胶电泳回收3～10kb的DNA片段。为防止自连，其粘性末端用Klenow大片段和dGTP、dATP进行两个碱基的部分填补；载体pUC118用SalI完全酶切，回收大片段，同样用Klenow大片段和dCTP、dTTP部分填补粘性末端的两个碱基。填补后的染色体和载体DNA的粘性末端可以互连。经T4连接酶连接后转化E.coli TG1，在含ITPG、X-gal和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上挑选白色的重组转化子。共获得1.2万个转化子，经抽提质粒鉴定，约85％含有3～10kb的插入片段。由此构建了Thermus sp.FD3041的染色体基因文库。
采用菌落原位碱性磷酸酯酶显色法对上述基因文库进行筛选，方法如下：将菌落转移到3MM滤纸上，浸于破菌缓冲液(1mol/L二乙醇胺，1％SDS)，于85℃水浴保温10min，再浸于反应缓冲液(6mmol/L pNPP，1mol/L二乙醇胺，1％SDS)中置70℃水浴保温10min，菌落颜色转黄者为阳性。通过筛选，获得5个阳性克隆。对其中的1个克隆(pTAP362)进行物理图谱和测定部分缺失的质粒的TAP活性，将FD-TAP基因定位于2kb的DNA片段上。
用Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列，获得的核苷酸序列为2030bp(图1)。经计算机分析，FD-TAP的基因长度为1506bp，G+C％为68.2％，密码子第三位碱基G+C％为92.7％，符合栖热菌属的基因特征。该基因编码一个由501个氨基酸残基组成的原始酶蛋白，在N端有一个26个氨基酸残基的信号肽序列，成热的酶蛋白分子由475个氨基酸残基组成。FD-TAP基因的DNA序列和编码蛋白质的氨基酸序列见图1。
实例3.FD-TAP基因的亚克隆和高表达：
分别在FD-TAP基因的起始密码子处及终止密码子处设计了引物，引物的5’端分别带有NdeI和BamHI酶切位点，通过PCR技术从质粒pTAP118B中扩增获得了成熟的FD-TAP的基因序列。经过酶切将基因克隆到高表达载体pJLA503，经转化phoA基因缺陷菌株E.coli Mph44后，在含氨苄青霉素的LB平板上，用菌落原位显色法筛选重组的转化子，结果50％的转化子为表达FD-TAP的阳性克隆，对其中一个克隆所含的重组质粒(记为pTAP503，见图2)进行DNA序列分析，表明基因内未发生突变。
E.coli Mph44(pTAP503F)经30℃液体培养后于42℃诱导10小时，SDS-PAGE表明在约53kDa处有酶的表达产物。约占总蛋白的10％。
实例4.重组FD-TAP的分离纯化：
挑一环Mph44(pTAP503)菌株，接种于2×YT培养基(含氨苄青霉素100ug/ml)，30℃振荡培养过夜作为种子液，取种子液按2％接种量转接于2×YT培养基，30℃振荡培养至菌体A600＝0.4～0.6时，再在42℃中培养10小时，离心收集菌体，用缓冲液A(50mmol/L Tris pH8.8，甘油，10mmol/Lβ-巯基乙醇)中，冰浴中超声破碎(总处理时间为400s，脉冲作用时间1s，脉冲间隔时间1s，输出功率25％)破菌液于4℃15,000rpm离心15分钟，弃沉淀，收集上清。在上清液中慢慢加入PEI以去除核酸(PEI浓度为0.04％)，15,000rpm离心15分钟，弃沉淀，收集上清。上清中加入NaCl至NaCl终浓度为0.8mmol/L，然后在70℃水浴中热变性处理30分钟，1,5000rpm离心15分钟，去除细胞总蛋白中不耐热的杂蛋白，收集上清。在热变性后的上清中逐步加入固体硫酸铵，达60％的饱和度，4℃搅拌1小时，12,000rpm离心20min，弃上清，沉淀用1/8体积的缓冲液B(10mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.8，5％甘油，10mmol/L β-巯基乙醇)溶解，4℃对相同缓冲液透析除盐。透析后的蛋白样品用CM Sepharose Flast Flow柱进行离子交换层析，上样后用缓冲液B洗脱至样品A280恢复至基线，再用NaCl梯度(0～0.5mol/L)进行线性梯度洗脱，分管收集有酶活峰，每管1.5ml，SDS-PAGE电泳分析蛋白质的纯度，合并纯蛋白峰。冷冻抽干后-20℃保存。
实例5.FD-TAP酶活性测定和性质：
取待测酶液10μl加入1000μl反应体系中(反应体系：6mmol/L，对硝基酚，1mol/L二乙醇胺，pH11.6)，70℃水浴10分钟，加990μL5％三氯醋酸液终止反应，在UV260上测定OD405处生成物的吸光值。酶活单位的定义：在70℃，pH11.6时，每分钟催化产生1μmol/L的对硝基酚的酶量定为一个酶活单位。酶单位＝A405×2/(18.8×10)。其中2为反应总体积，10为反应时间，对硝基酚在405nm处的克分子消光系数为18.8×106。
FD-TAP的部分酶学性质：
最适反应温度：70℃(图3)
耐热性：在50mmol/L Tris，pH8.8，25℃的系统中，95℃中水浴保温30分钟，仍保留原来酶活的90％以上。(图4)
最适pH：pH12(图5)
实例6.FD-TAP基因的部分缺失：
分别于FD-TAP基因的不同位置设计引物，扩增大小不同的片段：79→1506、79→1416、79→960、271→480、271→330。上游引物的5′端带有NdeI酶切位点，下游引物带有终止密码子和BamHI酶切位点，用PCR从质粒pTAP118B中扩增所需的DNA片段。经过酶切将这些DNA片段克隆于高表达载体pJLA503，经转化E.coli Mph44和筛选重组的转化子，获得含有上述各种DNA片段的阳性克隆。诱导表达和分离纯化重组的多肽后，对其酶学性质进行了研究，表明这些多肽仍具有与完整的FD-TAP相似的性质和特征。
                                      序列表
(1)一般信息：
  (i)申请人：复旦大学
  (ii)发明名称：一种耐热碱性磷酸酯酶及其表达
  (iii)序列数目：2
  (v)本申请资料：
    (A)申请号：
  (vi)在先申请资料：
    (A)申请号：CN97106724.4
    (B)申请日：13-11月-1997
(2)SEQ ID NO.1的信息
  (i)序列特征
    (A)长度：1506碱基
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：寡核苷酸
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1
1    ATG AAG CGA AGG GAC ATC CTG AAA GGT GGC CTG GCT GCG GGG GCC
46   CTG GCC CTC CTG CCC CGG GGC CAT ACC CAG GGG GCT CTG CAG AAC
91   CAG CCT TCC TTG GGA AGG CGG TAC CGC AAC CTC ATC GTC TTC GTC
136  TAC GAC GGG TTT TCC TGG GAG GAC TAC GCC ATC GCC CAG GCC TAC
181  GCC CGG AGG CGG CAG GGC CGG GTT CTC GCC CTG GAG CGC CTC CTC
226  GCC CGC TAC CCC AAC GGG CTC ATC AAC ACC TAC AGC CTC ACC AGC
271  TAC GTC ACC GAG TCC AGC GCC GCG GGG AAC GCC TTC TCC TGC GGG
316  GTG AAG ACG GTG AAC GGG GGG CTC GCC ATC CAC GCC GAC GGG ACC
361  CCC CTC AAG CCC TTC TTC GCC GCG GCC AAG GAG GCG GGG AAG GCC
406  GTG GGG CTC GTG ACC ACC ACC ACC GTC ACC CAC GCC ACC CCG GCG
451  AGC TTC GTG GTG TCC AAT CCC GAC CGG AAC GCC GAG GAG AGG ATC
496  GCC GAG CAG TAC CTG GAG TTC GGG GCC GAG GTG TAC CTT GGG GGC
541  GGG GAC CGC TTT TTC AAC CCC GCC AGG CGC AAG GAC GGG AAG GAC
586  CTC TAC GCC GCC TTC GCC GCC AAG GGG TAC GGG GTG GTG CGC ACC
631  CCC GAG GAG CTC GCC CGT TCC AAC GCC ACC CGG CTC CTG GGC GTC
676  TTC GCC GAC GGC CAC GTG CCC TAC GAG ATT GAC CGC CGC TTC CAG
721  GGC CTT GGG GTG CCG AGC CTC AAG GAA ATG GTC CAG GCC GCT TTG
766  CCC CGG CTT GCC GCC CAC CGC GGG GGC TTC GTC CTT CAG GTG GAA
811  GCG GGG CGG ATT GAC CAC GCC AAC CAT TTG AAC GAC GCC GGG GCC
856  ACC CTT TGG GAC GTG CTG GCG GCG GAC GAG GTC TTG GAG CTT CTC
901  ACC GCC TTC GTG GAC CGG AAC CCG GAC ACC CTC CTC CTC GTG GTC
946  TCG GAC CAC GCC ACC GGG GTG GGG GCC CTC TAC GGG GCG GGC CGG
991  AGC TAC CTG GAG AGC TCC GTG GGC ATT GAC CTC CTG GGG GCG CAA
1036 AAG GCC AGC TTT GAG TAC ATG CGC CGC GTC TTG GGC TCG GCC CCC
1081 GAT GCT GCC CAG GTG AAG GAG GCC TAC CAG ACC CTG AAG GGG GTC
1126 TCC CTC ACG GAC GAG GAG GCG CAG ATG GTG GTC CGG GCC ATC CGC
1171 GAG CGG GTC TAC TGG CCT GAT GCC GTG CGC CAG GGC ATC CAG CCC
1216 GAA AAC ACC ATG GCC TGG GCC ATG GTG CAG AAG AAC GCC AGC AAG
1261 CCC GAC CGG CCC AAC ATC GGC TGG AGC TCT GGG CAG CAC ACG GCG
1306 AGC CCC GTC ATC CTC CTC CTC TAC GGC CAG GGC CTG CGC TTC GTC
1351 CAG CTT GGC CTG GTG GAC AAC ACC CAC GTG TTC CGC CTG ATG GGC
1396 GAG GCC CTG AAC CTC CGC TAC CAG AAC CCG GTG ATG AGC GAG GAG
1441 GAG GCC CTG GAG ATC CTC AAG GCC AGG CCC CAG GGG ATG CGC CAC
1486 CCC GAG GAC GTC TGG GCC TAA
(2)SEQ ID NO.2的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：501个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：多肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO.2：
1   Met Lys Arg Arg Asp Ile Leu Lys Gly Gly Leu Ala Ala Gly Ala
16  Leu Ala Leu Leu Pro Arg Gly His Thr Gln Gly Ala Leu Gln Asn
31  Gln Pro Ser Leu Gly Arg Arg Tyr Arg Asn Leu Ile Val Phe Val
46  Tyr Asp Gly Phe Ser Trp Glu Asp Tyr Ala Ile Ala Gln Ala Tyr
61  Ala Arg Arg Arg Gln Gly Arg Val Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu
76  Ala Arg Tyr Pro Asn Gly Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Leu Thr Ser
91  Tyr Val Thr Glu Ser Ser Ala Ala Gly Asn Ala Phe Ser Cys Gly
106 Val Lys Thr Val Asn Gly Gly Leu Ala Ile His Ala Asp Gly Thr
121 Pro Leu Lys Pro Phe Phe Ala Ala Ala Lys Glu Ala Gly Lys Ala
136 Val Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Val Thr His Ala Thr Pro Ala
151 Ser Phe Val Val Ser Asn Pro Asp Arg Asn Ala Glu Glu Arg Ile
166 Ala Glu Gln Tyr Leu Glu Phe Gly Ala Glu Val Tyr Leu Gly Gly
18l Gly Asp Arg Phe Phe Asn Pro Ala Arg Arg Lys Asp Gly Lys Asp
196 Leu Tyr Ala Ala Phe Ala Ala Lys Gly Tyr Gly Val Val Arg Thr
211 Pro Glu Glu Leu Ala Arg Ser Asn Ala Thr Arg Leu Leu Gly Val
226 Phe Ala Asp Gly His Val Pro Tyr Glu Ile Asp Arg Arg Phe Gln
241 Gly Leu Gly Val Pro Ser Leu Lys Glu Met Val Gln Ala Ala Leu
256 Pro Arg Leu Ala Ala His Arg Gly Gly Phe Val Leu Gln Val Glu
271 Ala Gly Arg Ile Asp His Ala Asn His Leu Asn Asp Ala Gly Ala
286 Thr Leu Trp Asp Val Leu Ala Ala Asp Glu Val Leu Glu Leu Leu
301 Thr Ala Phe Val Asp Arg Asn Pro Asp Thr Leu Leu Leu Val Val
316 Ser Asp His Ala Thr Gly Val Gly Ala Leu Tyr Gly Ala Gly Arg
331 Ser Tyr Leu Glu Ser Ser Val Gly Ile Asp Leu Leu Gly Ala Gln
346 Lys Ala Ser Phe Glu Tyr Met Arg Arg Val Leu Gly Ser Ala Pro
361 Asp Ala Ala Gln Val Lys Glu Ala Tyr Gln Thr Leu Lys Gly Val
376 Ser Leu Thr Asp Glu Glu Ala Gln Met Val Val Arg Ala Ile Arg
391 Glu Arg Val Tyr Trp Pro Asp Ala Val Arg Gln Gly Ile Gln Pro
406 Glu Asn Thr Met Ala Trp Ala Met Val Gln Lys Asn Ala Ser Lys
421 Pro Asp Arg Pro Asn Ile Gly Trp Ser Ser Gly Gln His Thr Ala
435 Ser Pro Val Ile Leu Leu Leu Tyr Gly Gln Gly Leu Arg Phe Val
451 Gln Leu Gly Leu Val Asp Asn Thr His Val Phe Arg Leu Met Gly
466 Glu Ala Leu Asn Leu Arg Tyr Gln Asn Pro Val Met Ser Glu Glu
481 Glu Ala Leu Glu Ile Leu Lys Ala Arg Pro Gln Gly Met Arg His
496 Pro Glu Asp Val Trp Ala

Claims (8)

1.一种耐热碱性磷酸酯酶，其特征在于，含有以下氨基酸序列中的27-501位或1-501位：
  1  Met Lys Arg Arg Asp Ile Leu Lys Gly Gly Leu Ala Ala Gly Ala
 16  Leu Ala Leu Leu Pro Arg Gly His Thr Gln Gly Ala Leu Gln Asn
 31 Gln Pro Ser Leu Gly Arg Arg Tyr Arg Asn Leu Ile Val Phe Val
 46 Tyr Asp Gly Phe Ser Trp Glu Asp Tyr Ala Ile Ala Gln Ala Tyr
 61 Ala Arg Arg Arg Gln Gly Arg Val Leu Ala Leu Glu Arg Leu Leu
 76 Ala Arg Tyr Pro Asn Gly Leu Ile Asn Thr Tyr Ser Leu Thr Ser
 91 Tyr Val Thr Glu Ser Ser Ala Ala Gly Asn Ala Phe Ser Cys Gly
106 Val Lys Thr Val Asn Gly Gly Leu Ala Ile His Ala Asp Gly Thr
121 Pro Leu Lys Pro Phe Phe Ala Ala Ala Lys Glu Ala Gly Lys Ala
136 Val Gly Leu Val Thr Thr Thr Thr Val Thr His Ala Thr Pro Ala
151 Ser Phe Val Val Ser Asn Pro Asp Arg Asn Ala Glu Glu Arg Ile
166 Ala Glu Gln Tyr Leu Glu Phe Gly Ala Glu Val Tyr Leu Gly Gly
181 Gly Asp Arg Phe Phe Asn Pro Ala Arg Arg Lys Asp Gly Lys Asp
196 Leu Tyr Ala Ala Phe Ala Ala Lys Gly Tyr Gly Val Val Arg Thr
211 Pro Glu Glu Leu Ala Arg Ser Asn Ala Thr Arg Leu Leu Gly Val
226 Phe Ala Asp Gly His Val Pro Tyr Glu Ile Asp Arg Arg Phe Gln
241 Gly Leu Gly Val Pro Ser Leu Lys Glu Met Val Gln Ala Ala Leu
256 Pro Arg Leu Ala Ala His Arg Gly Gly Phe Val Leu Gln Val Glu
271 Ala Gly Arg Ile Asp His Ala Asn His Leu Asn Asp Ala Gly Ala
286 Thr Leu Trp Asp Val Leu Ala Ala Asp Glu Val Leu Glu Leu Leu
301 Thr Ala Phe Val Asp Arg Asn Pro Asp Thr Leu Leu Leu Val Val
316 Ser Asp His Ala Thr Gly Val Gly Ala Leu Tyr Gly Ala Gly Arg
331 Ser Tyr Leu Glu Ser Ser Val Gly Ile Asp Leu Leu Gly Ala Gln
346 Lys Ala Ser Phe Glu Tyr Met Arg Arg Val Leu Gly Ser Ala Pro
361 Asp Ala Ala Gln Val Lys Glu Ala Tyr Gln Thr Leu Lys Gly Val
376 Ser Leu Thr Asp Glu Glu Ala Gln Met Val Val Arg Ala Ile Arg
391 Glu Arg Val Tyr Trp Pro Asp Ala Val Arg Gln Gly Ile Gln Pro
406 Glu Asn Thr Met Ala Trp Ala Met Val Gln Lys Asn Ala Ser Lys
421 Pro Asp Arg Pro Ash Ile Gly Trp Ser Ser Gly Gln His Thr Ala
436 Ser Pro Val Ile Leu Leu Leu Tyr Gly Gln Gly Leu Arg Phe Val
451 Gln Leu Gly Leu Val Asp Asn Thr His Val Phe Arg Leu Met Gly
466 Glu Ala Leu Asn Leu Arg Tyr Gln Asn Pro Val Met Ser Glu Glu
481 Glu Ala Leu Glu Ile Leu Lys Ala Arg Pro Gln Gly Met Arg His
496 Pro Glu Asp Val Trp Ala。
2.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的耐热碱性磷酸酯酶。
3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：含有以下核苷酸序列：
  1  ATG AAG CGA AGG GAC ATC CTG AAA GGT GGC CTG GCT GCG GGG GCC
 46  CTG GCC CTC CTG CCC CGG GGC CAT ACC CAG GGG GCT CTG CAG AAC
 91  CAG CCT TCC TTG GGA AGG CGG TAC CGC AAC CTC ATC GTC TTC GTC
136  TAC GAC GGG TTT TCC TGG GAG GAC TAC GCC ATC GCC CAG GCC TAC
181  GCC CGG AGG CGG CAG GGC CGG GTT CTC GCC CTG GAG CGC CTC CTC
226  GCC CGC TAC CCC AAC GGG CTC ATC AAC ACC TAC AGC CTC ACC AGC
271  TAC GTC ACC GAG TCC AGC GCC GCG GGG AAC GCC TTC TCC TGC GGG
316  GTG AAG ACG GTG AAC GGG GGG CTC GCC ATC CAC GCC GAC GGG ACC
361  CCC CTC AAG CCC TTC TTC GCC GCG GCC AAG GAG GCG GGG AAG GCC
406  GTG GGG CTC GTG ACC ACC ACC ACC GTC ACC CAC GCC ACC CCG GCG
451  AGC TTC GTG GTG TCC AAT CCC GAC CGG AAC GCC GAG GAG AGG ATC
496  GCC GAG CAG TAC CTG GAG TTC GGG GCC GAG GTG TAC CTT GGG GGC
541  GGG GAC CGC TTT TTC AAC CCC GCC AGG CGC AAG GAC GGG AAG GAC
586  CTC TAC GCC GCC TTC GCC GCC AAG GGG TAC GGG GTG GTG CGC ACC
631  CCC GAG GAG CTC GCC CGT TCC AAC GCC ACC CGG CTC CTG GGC GTC
676  TTC GCC GAC GGC CAC GTG CCC TAC GAG ATT GAC CGC CGC TTC CAG
721  GGC CTT GGG GTG CCG AGC CTC AAG GAA ATG GTC CAG GCC GCT TTG
766  CCC CGG CTT GCC GCC CAC CGC GGG GGC TTC GTC CTT CAG GTG GAA
811  GCG GGG CGG ATT GAC CAC GCC AAC CAT TTG AAC GAC GCC GGG GCC
856  ACC CTT TGG GAC GTG CTG GCG GCG GAC GAG GTC TTG GAG CTT CTC
901  ACC GCC TTC GTG GAC CGG AAC CCG GAC ACC CTC CTC CTC GTG GTC
946  TCG GAC CAC GCC ACC GGG GTG GGG GCC CTC TAC GGG GCG GGC CGG
991  AGC TAC CTG GAG AGC TCC GTG GGC ATT GAC CTC CTG GGG GCG CAA
1036 AAG GCC AGC TTT GAG TAC ATG CGC CGC GTC TTG GGC TCG GCC CCC
1081 GAT GCT GCC CAG GTG AAG GAG GCC TAC CAG ACC CTG AAG GGG GTC
1126 TCC CTC ACG GAC GAG GAG GCG CAG ATG GTG GTC CGG GCC ATC CGC
1171 GAG CGG GTC TAC TGG CCT GAT GCC GTG CGC CAG GGC ATC CAG CCC
1216 GAA AAC ACC ATG GCC TGG GCC ATG GTG CAG AAG AAC GCC AGC AAG
1261 CCC GAC CGG CCC AAC ATC GGC TGG AGC TCT GGG CAG CAC ACG GCG
1306 AGC CCC GTC ATC CTC CTC CTC TAC GGC CAG GGC CTG CGC TTC GTC
1351 CAG CTT GGC CTG GTG GAC AAC ACC CAC GTG TTC CGC CTG ATG GGC
1396 GAG GCC CTG AAC CTC CGC TAC CAG AAC CCG GTG ATG AGC GAG GAG
1441 GAG GCC CTG GAG ATC CTC AAG GCC AGG CCC CAG GGG ATG CGC CAC
1486 CCC GAG GAC GTC TGG GCC TAA。
4.一种能够在宿主中表达耐热碱性磷酸酯酶的重组载体，其特征在于该载体含有权利要求2所述DNA分子。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于该载体为原核载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于该载体为质粒。
7.根据权利要求4所述的重组载体，其中所述的DNA分子在一启动子的控制之下。
8.一种生产如权利要求1所述的耐热碱性磷酸酯酶的方法，其特征在于其步骤如下：
(1)用权利要求2所述的DNA分子或权利要求4所述的重组载体转化合适的宿主；
(2)在合适的培养基中培养转化后的宿主；
(3)从培养基或细胞中分离纯化蛋白质。
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