CN1249784A - 一种体外构建dna文库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了通过在多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同的起始DNA模板和引物体外构建重组同源多核苷酸基因文库的一种方法,其中:A.通过a)DNA模板变性,b)将引物与模板退火,c)使用聚合酶延伸上述引物,d)终止合成,及e)从模板中分离延伸的引物来合成延伸的引物;B.通过a)从模板中分离延伸引物并使用延伸引物作为引物和模板重复A.b)至A.e)步骤,或b)重复A.b)至A.e)步骤来诱导模板移位,C.在适当数量循环的步骤A.和B.a),A.和B.b),或其组合的过程后终止此过程。可选择地在使用特定引物的标准PCR反应中扩增多核苷酸,以选择性扩增感兴趣的同源多核苷酸。

Description

一种体外构建DNA文库的方法
本发明的领域
本发明涉及优化DNA序列以(a)通过使用称为基因或DNA改组技术产生“基因”的大容量库人工产生有遗传差异的编码感兴趣蛋白的基因，在适当的表达系统中表达上述基因文库并依据特定特征筛选表达的蛋白以确定表现所需特征的蛋白质，从而改进感兴趣蛋白质的特性或(b)通过产生元件文库，与结构基因可操纵连接后转化适当的宿主，表达上述结构基因并筛选调节元件中的所需特征，从而改进诸如启动子或终止子等调节元件的特性。本发明的背景
在不同属之间，常发现行使特定生物活性的蛋白质表现出一定差异，甚至在同一种的个体间也存在差异。这种差异当然更多的在基因组水平得以表现。
这种编码基本具有相同生物活性蛋白质的基因之间的天然遗传差异是在亿万年中自然产生的，反映了相对于所研究生物体的环境而产生的编码蛋白的自然优化。
在当今社会中，生活环境大大脱离了自然环境并且已经发现在人类将它们用于不同用途特别是用于工业目的是，天然产生的生物活性分子并没有最优化。
因而确认依据所需用途表现最优化特征的那些生物活性蛋白质就成为工业兴趣。
这已经在许多年来通过筛选天然资源，或使用诱变进行。例如，在将酶用于例如洗涤剂的技术领域，通过酶的体外修饰，显著改进了例如天然产生的蛋白酶，脂酶，淀粉酶和纤维素酶的洗衣和/或洗碟应用。
在多数情况下，这些改进是通过定点突变产生依据类型或在成熟酶二级或三级结构中的定位选择的特定氨基酸残基的替代，缺失或插入获得的(参看例如US patent no.4,518,584)。
以这种方式，成功制备了新的多肽变种和突变体，诸如具有改变特性，例如专一活性，底物活性，热，pH和盐稳定性，最适pH，pI，Km，Vmax等的新修饰酶，以获得具有改进特性的多肽。
例如，在酶技术领域，例如蛋白酶，脂酶，淀粉酶和纤维素酶的洗衣和/或洗碟应用得到显著改进。
修饰蛋白质和酶的另一种方法基于随机突变，例如，如US4,894,331和WO93/01285中所述。
由于获得具有改进功能特征的多肽变种或突变体是麻烦和费时的过程，建议了一些快速制备修饰多肽的其它方法。
Weber等(1983)在核酸研究(Nucleic Acids Research)，vol.11，5661中描述了一种通过同源基因间体内重组修饰基因的方法。构建了含有质粒载体并在5’末端侧翼有编码α-1人干扰素的DNA序列，在3’-末端侧翼有编码α-2人干扰素的DNA序列的一段线性DNA序列，并转染到rec A阳性大肠杆菌菌株。使用抗性标记确认和分离重组体。
Pompon等(1989)在Gene 83，p.15-24中描述了一种改组哺乳动物细胞色素P-450基因域的方法，将使用具有补平末端的线性质粒转化酿酒酵母产生的酿酒酵母中的部分同源序列与和上述质粒末端部分同源的DNA片段进行体内重组。
在WO97/07205中描述了一种方法，利用使用质粒性DNA作为模板的体内重组，通过改组同源性DNA序列的不同核苷酸序列制备多肽变体。
美国专利No.5,093,257(Assignee：Genencor Int.Inc.)中公开了一种通过体内重组产生杂合多肽的方法。通过形成含有一个复制序列，编码杂合多肽氨基末端部分的第一段DNA序列，编码上述杂合多肽羧基末端部分的第二段DNA序列的环状载体产生杂合DNA序列。将环状载体转化到rec阳性微生物并在其中扩增环状载体。这样通过rec阳性微生物，包括诸如芽胞杆菌和大肠杆菌等原核生物和诸如酿酒酵母等的真核生物中天然发生的重组机制介导产生了上述环状载体的重组。
Stemmer描述了一种改组同源DNA序列的方法(Stemmer，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol，91，10747-10751；Stemmer，(1994)，Nature，vol.370，389-391)。该方法涉及通过使用体外PCR技术改组同源DNA序列。基于表达蛋白的改进功能从DNA文库中筛选含有改组DNA序列的阳性重组基因。
上述方法亦描述于WO95/22625。WO95/22625涉及一种改组同源DNA序列的方法。WO95/22625中描述方法的一个重经步骤是将同源模板双链多核苷酸切割成所需大小的随机片段，随后将片段同源重装配成全长基因。
然而，WO95/22625中方法的内在缺点是由于使用同源基因序列，通过该方法产生的多样性是有限的(如WO95/22625中所述)。
WO95/22625方法中另一个缺点在于通过切割模板双链多核苷酸产生随机片段。
感兴趣的另一个参考是WO95/17413描述的一种通过重组称为设计元件(DE)的特定DNA序列改组基因或DNA的方法，通过重组合成的双链片段或重组PCR生成的序列产生至少含有两个设计元件的所谓功能元件(FE)。依据WO95/17413中所述的方法，重组必须发生于含有具有足够序列同源性的DNA序列的设计元件之间，以使不同的序列杂合重组。
因而WO95/17413亦具有缺点，产生的多样性是相对有限的。此外，描述的方法是费时的，昂贵的，并且不适于自动化。
尽管存在上述方法，仍需要更好重复性的体外重组方法以制备新的多肽变体。这种方法亦应能以小体积进行，并适于自动化。
本发明的总结
本发明主要涉及在体外DNA合成中利用新合成DNA链的模板移位(template shift)以获得DNA改组。使用这一技术，可能更方便地获得这种结果，并且在某种程序上比上述方法有更多的变异。
本发明的方法亦十分适于匹配自动化。
在一个优选实施例中，将该技术与易出错聚合酶组合以在产生的文库中引入更多的变异。
更特定地，本发明涉及通过在使用聚合酶的体外多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同起始单或双链亲代DNA模板和引物构建重组同源多核苷酸文库的方法，其中A.通过下面方法合成延伸的引物或多核苷酸
a)将亲代双链DNA模板变性产生单链模板，
b)将上述引物与单链DNA模板退火，
c)使用上述聚合酶通过起始合成延伸上述引物，
d)进行合成的抑制，并
e)将双链变性从模板分离延伸的引物，B.通过下列步骤诱导模板移位
a)从模板分离新合成的单链延伸引物并使用(A)中产生的上述延伸引物
作为引物和模板重复步骤(A.b)至A.e)，或
b)重复步骤A.b)至A.e)，C.在适当数目循环的步骤A.和B.a)，A.和B.b)，或其组合后终止上述过程，并且D.可选择地使用特定引物在标准PCR反应中扩增产生的多核苷酸以选择性扩增感兴趣的同源多核苷酸。在特定实施例中，本发明的工艺可以有各种修饰。例如使用有缺陷的聚合酶是有利的，或使用易出错聚合酶引入与模板相比较的突变，或使用能过早中断多核苷酸合成的聚合酶以抑制反应。
下面将描述其它的修饰。
本发明的另一方面涉及鉴定与具有相同生物活性天然多肽相比显示改进特性的多肽的方法，其中将通过上述过程产生的重组同源多核苷酸文库克隆到合适的载体，然后将上述载体转化到合适的宿主系统，表达成相应多肽并展示，然后在合适的检测中筛选上述多肽，并选择阳性结果。
本发明的进一个方面涉及产生上面过程确定的感兴趣多肽的方法，其中将含有编码上述多肽的多核苷酸的载体转化到适当的宿主，培养上述宿主以表达上述多肽，回收并纯化多肽。
最后，本发明的另一个最后方面涉及一种重组/改组蛋白，它是通过依据本发明的任何方法可获得的，并且是一种含有此处公开的(参看下文)序列的重组/改组蛋白。
在本发明的最后方面中，术语“可获得的”表示上述蛋白优选地通过依据本发明的方法获得。然而也可使用诸如WO95/22625或WO95/17413中所述的现有技术中已知重组/改组技术，单独或与依据本发明的方法组合，以获得上述重组蛋白。
相应地，本发明的进一个最后方面是：
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组蛋白酶，包含重组的序列，其中至少含有来自至少两种不同野生型蛋白酶的两段不同的部分序列；
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组脂肪酶，包含重组的序列，其中至少含有两种不同的部分野生型序列。
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组假单胞杆菌脂肪酶，包含重组的序列，其中至少含有来自至少两种不同野生型假单胞杆菌脂肪酶的两段不同的部分序列；
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组木聚糖酶，包含重组的序列，其中至少含有来自至少两种不同野生型木聚糖酶的两段不同的部分序列；
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组纤维素酶，包含重组的序列，其中至少含有来自至少两种不同野生型纤维素酶的两段不同的部分序列；
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组淀粉酶，包含重组的序列，其中至少含有来自至少两种不同野生型淀粉酶的两段不同的部分序列；
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组漆酶，包含重组的序列，其中含有来自至少两种不同野生型漆酶的至少两段不同的部分序列；
通过依据本发明的任何方法可获得的重组/改组肌醇六磷酸酶，包含重组的序列，其中至少含有来自至少两种不同野生型肌醇六磷酸酶的两段不同的部分序列。定义
在进一步详细讨论本发明之前，首先定义下列术语。
“改组”：术语改组意思是两个或多个同源多核苷酸之间的核苷酸序列片段的重组，产生与输入多核苷酸(即起始点  同源多核苷酸)相比较具有一系列核苷酸片段交换的输出多核苷酸(即已进行改组循环的多核苷酸)。
“DNA序列或多核苷酸的同源性”：在本文中DNA序列同源程度确定为两个序列间的相同程序，表示一个序列从第二个序列的衍生。同源性适于通过本技术领域熟知的计算机程序确定，例如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin Packlage程序手册，版本8，1994年8月，Genetic ComputerGroup，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，CD.，(1970)，Joumal of Molecular Biology，48，443-453)。
“同源的”：术语同源的意思是一个单链核酸序列可以和互补单链核酸序列杂交。杂交的程度依赖于多种因子，包括序列之间相同程度以及诸如温度和盐浓度等杂交条件，下面将予叙述(参看下文)。
使用计算机程序GAP(参看上文)，用下面的设置进行DNA序列比较：GAP产生惩罚5.0及GAP延伸惩罚0.3，在本文中认为如果相互显示的相同程度优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少85％，则两段DNA序列能够杂交(使用如下所述的低严格杂交条件)。
“异源的”：如果两个或多个DNA序列相互显示低于上述相同程序，在本文中认为它们是“异源的”。
“杂交”：确定感兴趣的两个或多个DNA序列是否真正杂交的合适实验条件此处定义为在如下详述低严格条件下的杂交。
使用x射线膜或磷酸显影检测在这些条件下寡核苷酸探针杂交的分子。
“引物”：此处特别是与PCR反应相联系的术语“引物”是依据本技术领域熟知的一般标准特性(“PCR一种实用方法”IRL Press，(1991)定义和构建的一段寡核苷酸(特别是“PCR-引物”)。
“针对序列的引物”：术语“针对序列的引物”意思是将引物(优选地将用于PCR反应)构建成与上述引物随后“针对的”感兴趣序列片段至少显示80％的序列相同，优选地至少90％的序列相同。引物设计为在给定温度下在它针对的序列片段或区域特异性退火。特别地，在引物3’末端的相同性是最重要的。
“侧翼”：此处与包含于PCR-片段的DNA序列联系使用的术语“侧翼”意思是PCR一片段的最外侧部分序列，包括在PCR片段的5’和3’末端。
“多肽”：氨基酸的聚合物，有时指蛋白质。氨基酸的序列决定多肽呈现的折叠构象，并随之决定生物学特征和活性。一些多肽含有一个单多肽链(单体的)，而其它的含有多个相连的多肽(多亚基)。所有的酶和抗体是多肽。
“酶”：一种能够催化化学反应的蛋白质。将要提及的特定类型的酶是例如淀粉酶，蛋白酶，糖酶，脂肪酶，纤维素酶，氧化还原酶，酯酶等。与本发明相关的特别感兴趣的是用于洗涤剂的酶，诸如蛋白酶，脂肪酶，纤维素酶，淀粉酶等。本发明的详细描述
本发明的第一方面涉及通过在使用聚合酶的体外多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同的起始的单或双链亲本DNA模板和引物构建重组同源多核苷酸文库的一种方法，其中A.通过下面方法合成延伸引物或多核苷酸
a)将亲本双链DNA模板变性以产生单链模板，
b)将上述引物与单链DNA模板退火，
c)使用上述聚合酶通过起始合成延伸上述引物，
d)使合成抑制，并且
e)将双链变性以从模板中分离延伸引物，B.通过下面方法诱导模板移位
a)从模板中分离新合成的单链延伸引物并使用(A)中产生的上述延伸引物作为模板和引物重复步骤Ab)至Ae)，
或b)重复步骤Ab)至Ae)，C.在适当数目循环的步骤A和Ba)，A和Bb)，或其组合后终止上述过程，并且D.可选择地使用特异性引物在标准PCR反应中扩增产生的多核苷酸以选择性扩增感兴趣的同源多核苷酸。
依据本发明，聚合酶可以是DNA或RNA聚合酶，要提及的特定聚合酶是诸如DNA聚合酶如T4聚合酶，T7聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I或DNA聚合酶I Klenow片段，或热稳定聚合酶如Taq，Amplitaq，Vent，Pwo.
本发明的一个优点是它能够在反应中方便地控制引物延伸的长度。
这一点可通过多种方法完成，诸如聚合酶的选择，聚合酶作用过程中的物理和化学条件，例如pH值，温度，缓冲液，盐浓度，以及加入不同的化学试剂。
已经知道不同的聚合酶以不同的速度(每秒钟掺入的核苷酸)进行DNA合成。例如与诸如Taq聚合酶相比DNA聚合酶I Klenow片段具有有限的延伸速度。
聚合酶亦显示不同的持续合成能力，即聚合酶从模板/延伸引物解离前掺入的平均核苷酸数目；Klenow聚合酶也是具有有限的持续合成能力的聚合酶的例子。
因而聚合酶的选择是控制引物平均延伸的重要方法。
这些条件亦可影响聚合酶的保真性(点突变引入的比率，人免疫缺陷病毒(HIV)反转录酶是低保真性聚合酶的例子)，这是将改组和突变结合的有用参数。
在特定实施方案中，在本发明的方法中可进行多种改进。例如使用有缺陷的聚合酶是有利的，即或是使用易出错聚合酶以与模板相比引入突变，或是使用能提前终止多核苷酸合成的聚合酶以抑制反应。可提及的这种缺陷聚合酶是一种具有低持续合成能力的Klenow聚合酶。
在本发明的另一实施方案中，如果使用的聚合酶不是热稳定性的，可以在每一循环后加入聚合酶。
依据本发明，起始单链或双链亲本模板可以是不同的，它们可是在同一天然多核苷酸上含有不同的点突变，或是从天然分离的可通过PCR扩增的同源多核苷酸(基因)，或其组合。用于本发明方法的模板在此是同源的，在DNA水平上显示例如超过95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或甚至超过50％的相同性。
使用预先选择的包含具感兴趣的改进特性的突变的模板是有利的。然后本发明的当前重组方法将重组上述改进突变，随后筛选感兴趣特征的进一步改进。
上述预先选择的具感兴趣的改进特性的模板可通过本技术领域标准方法鉴定，包括例如i)将感兴趣模板进行易出错PCR，随后ii)筛选/选择具感兴趣改进特征的模板。易出错PCR步骤的诱变频率(低或高诱变频率)优选地与随后的筛选能力相联系进行调节，即如果筛选能力有限，易出错PCR频率优选地较低(即每模板一至两个突变)(进一步的细节参看WO92/18645)。
步骤A.d)中聚合酶反应的抑制如上所示可通过多种方法获得，诸如升高温度，或如WO95/17413所述加入特定试剂。
当为此目的升高温度时，优选地使用90℃至99℃的温度。
使用化学试剂时DMSO是一种可能性。合适的步骤描述于例如WO95/17413。
本发明的方法中在步骤1.b.使用了引物与模板的退火。在本文中退火可以是随机的或特异的，意思是依据引物的性质可在多核苷酸的任意处或在特定位置。
并且，使用的引物可以是完全随机引物(NNNNNNNNNNN)(N意思是四种碱基的混合物(A，T，G，C)在合成中用于引物的特定位置)，半随机引物，或特定引物。
在过程中，如果要将产生的延伸引物从引物中分离，使用标记模板可方便地提供一种简单的分离方法，优选的标记是生物素或地高辛配基。
依据本发明，需要的循环数将会少于500，大多数情况下少于200，正常低于100循环。
在本发明的一个实施方案中，上述体外改组与随后的通过诸如WO97/07205所述的方法进行的体内改组相结合。
本发明第二个方面涉及鉴定与具有相同生物活性的天然多肽相比显示改进特性的多肽的方法，其中将通过上面过程产生的重组同源多肽文库克隆到合适的载体，然后将上述载体转化到合适的宿主系统，表达相应多肽，然后用合适的检测方法筛选上述多肽，并选择阳性多肽。
在一个实施方案中期望将改组文库编码的感兴趣多肽表达为适当的融合蛋白(例如作为与噬菌体ml3/fd的gIII的杂合体)以在噬菌体或细菌表面展示上述重组多肽。
本发明第三个方面涉及产生在前面过程中鉴定的感兴趣多肽的一种方法，其中将含有编码上述多肽的多核苷酸的载体转化到合适的宿主，培养上述宿主以表达上述多肽，并回收和纯化多肽。
使用部分随机(半随机)或完全随机引物(在引物中所有位置或选择数目的碱基的混合物)作为DNA合成的起始点，提供联合使用改组和随机诱变的一定的新可能性。
获得显示相对有限同源性的多核苷酸的体外重组通常是困难的。使用本发明的实施方案，可强迫甚至非常相异的多核苷酸重组。
依据该实施方案，至少应用了两个模板(或两个相异模板库)。一个多核苷酸的新的合成可只基于一条链(即有义或反义链)，而另一条核苷酸的合成基于相反的链。
这可通过将互补链从两个模板中分离来完成，例如通过使用生物素标记这些链。通过将特定的，部分随机的或完全随机引物与模板退火并加入适当的聚合酶起始DNA的合成。这可对于不同模板单独反应或仅在一个反应中进行。合成应当优选地在利于产生相对短的新片段的条件下进行。这些片段随后可基于亲合标记从模板中分离。对这些片段进行PCR反应并作为来源于两不同链的起始材料，新合成片段必须是重组的以产生全长PCR产物-一种强迫性重组。
亦对此实施方案，为了增强重组，使用短或无延伸时间的快速PCR是有利的以增加重组，特别是模板库用于两条链。
过程中使用的引物长度和退火温度决定了随机引物是否退火以及可容许的模板和引物间的错配数目。通过改变引物长度和退火温度，本发明的方法提供了一种在代表引物长度的特定核苷酸窗内获得随机诱变的方法。本发明的方法从而提供了与其它随机诱变方法相比实质上的有利之处，特别是提供了在一级序列上相互接近的多个碱基置换的高可能性，例如依据理论在给定实验条件下使用完全随机20基体(在20个位置上均为所有4种核苷酸的混合物)将可提供相互接近的多个碱基置换的某些相当高可能性。
易出错PCR(＝高诱变频率PCR)不能提供这种可能性。易出错PCR对在一个密码子(在翻译多肽中编码一个氨基酸)内具多于一个碱基的置换提供非常低的可能性。
显然在一个密码子内只替换一个碱基不能提供完全随机诱变(在蛋白质水平)，因为通过在DNA水平的一个碱基置换只能获得有限的氨基酸置换(例如由ATG密码子编码的甲硫氨酸需要三个碱基置换才能变成TGT或TGC密码子编码的半胱氨酸)。
在本发明的一个实施方案中，该过程因而使用具有长度6至200碱基对(bp)，优选地10至70bp，更优选地15至40bp的随机或半随机引物进行。
本发明方法的一个优点是其而耐久性。在一些实施方案中全长模板的稳定出现提供了进一步的优势，避免了PCR污染问题。此外，与其它所述方法相比它费力更少，需人手少，从而提供了自动化的出色可能性。PCR-引物：
依据本技术领域标准描述构建PCR引物。正常它们是10-75碱基对(bp)长度。然而，对于使用随机或半随机引物的特定实施方案，长度实际上可更长至上面所述。PCR-反应：
如果没有另外提及，依据本发明的PCR反应按照本技术领域的标准方法进行。
术语“分离PCR片段”是为了覆盖象只要含有PCR片段的等份那样宽的范围。然而优选地PCR片段分离到去除了多余的引物，核苷酸模板等的程度。
在本发明的一个实施方案中，DNA片段是在产生低，中或高随机诱变频率的条件下制备的。
为了获得低诱变频率，DNA序列(含有DNA片段)可通过标准PCR扩增方法(US4,683,202或Saiki et al.，((1988)，Science 239，487-491)制备。
可通过在能够增加核苷酸错误掺入的条件下进行PCR扩增获得中或高诱变频率，例如Deshler所述，(1992)，GATA9(4)，103-1 ob；Leung et al.，(1989)，Technique，Vol.1，No.1，11-15。
依据本发明，亦期望将PCR扩增(即依据该实施方案亦为DNA片段突变)与使用适当的例如诱导转换，颠换，倒位，混杂(scrambling)，删除，和/或插入的物理或化学诱变剂的诱变步骤相结合。从重组改组序列表达重组蛋白
按照本发明第二和第三方面，改组序列编码的重组蛋白的表达可通过使用本技术领域熟知的标准表达载体和相应表达系统进行。筛选和选择
在本发明文中术语“阳性多肽变体”是指产生的多肽变体，其与从相应的输入DNA序列可产生的多肽相比具有改进的功能特征。例如，这些改进特性可有如下不同，例如增进或降低的生物活性，增进的洗涤效果，热稳定性，氧化稳定性，底物专一性，抗生素抗性等。
随后，用于鉴定阳性变体的筛选方法依赖于研究的多肽所要改变的性质，以及需要的改变方向。
本技术领域描述了筛选或选择所需生物活性的多种适当的筛选或选择系统。例如：
Strauberg等(Biotechnology 13：669-673(1995))描述了对具有钙不依赖稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体的筛选系统；
Bryan等(Proteins 1：326-334(1986))描述了对具有增强的热稳定性的蛋白酶的筛选检测；以及
PCT-DK 96/00322描述了对在洗涤剂中具有改进洗涤功效的脂肪酶的筛选检测。
本发明的一个实施方案包括筛选或选择重组蛋白，其中所需的生物活性是在洗碟或洗衣洗涤剂中的功效。合适的洗碟或洗衣洗涤剂的例子公开于PCT-DK 96/00322和WO95/30011。
如果，例如，研究的多肽是一种酶并且所需的改进功能特性是洗涤效果，筛选可方便地通过使用基于下面原理的滤膜检测进行：
在适当的培养基上和适当条件下培养重组宿主细胞以分泌酶，培养基通过双层滤膜提供，包括第一个结合蛋白的滤膜和其上显示低蛋白结合能力的第二滤膜。重组宿主细胞位于第二滤膜上。培养之后，将含有从重组宿主细胞分泌的酶的第一滤膜从含有上述细胞的第二滤膜分离。将第一滤膜用于筛选所需的酶活性并鉴定在第二滤膜上的相应微生物菌落。
用于结合酶活性的滤膜可以是任何蛋白结合滤膜例如尼龙或硝酸纤维素。载有表达微生物菌落的上层滤层可以是任何对结合蛋白无或低亲合的滤膜例如醋酸纤维素或Durapore。滤膜可使用任何用于筛选的条件预处理或可在测定酶活性时处理。
酶活性可通过染料，荧光，沉淀，pH显示器，红外吸收或任何其它用于检测酶活性的已知技术检测。
检测的化合物可通过任何固定化试剂例如琼脂糖，琼脂，明胶，聚丙烯酰胺，淀粉，滤纸，布或固定化试剂的任何组合等固定化。
如果一个循环的改组后多肽的改进功能特性不是足够好，可将多肽用于另一循环。
在本发明的一个实施方案中其中将代表相同基因的一系列突变的同源多核苷酸用作模板时，至少一个改组循环是用初始使用DNA片段，其可能是野生型DNA片段的回交循环。这就消除了不必要的突变。亦可通过使用野生型DNA片段作为起始使用的输入DNA材料来消除不必要的突变。
亦考虑在本发明范围内的是具有诸如胰岛素，促肾上腺皮质激素(ACTH)，胰高血糖素，促生长素抑制素，促生长素，胸腺素，甲状旁腺素，垂体激素，生长调节素，(促)红细胞生长素，促黄体素，绒毛膜促性腺激素，下丘脑释放因子，抗利尿素，促甲状腺素，松弛素，干扰素，血小板生成素(TPO)和催乳素等生物活性的多肽。
对将要改组的，编码多肽的起始亲本DNA序列的要求是它们至少50％，60％，70％，80％，90％，或95％同源。较低同源性的DNA序列将更少倾向于相互作用和重组。
依据本发明亦期望改组如上所示来源自不同属的野生型生物体的同源的亲本多核苷酸。
进一步，将要改组的起始亲本模板可优选地具有大约50碱基对(bp)至20千碱基对(kb)的长度，优选地大约100bp至10kb，更优选地大约200bp至7kb，特别地大约400bp至2kb。
起始亲本DNA序列可以是任何DNA序列，包括野生型DNA序列，编码变种或突变体的DNA序列，或其修饰物，诸如延伸或延长DNA序列，亦可为用于依据本发明的或任何其它方法(例如任何描述于前面部分的方法)的一次或多次改组的产出DNA序列(即输出DNA序列)。
使用本发明方法产生的重组同源多核苷酸(即改组的DNA序列)有多个核苷酸片段交换。与其亲本多肽相比，这在多肽变体上至少产生一个氨基酸的替代。亦应理解考虑了沉默交换(即不导致氨基酸序列改变的核苷酸交换)。材料和方法实施例中使用的特定方法：A)将编码相同基因不同酶变体的或由同源基因编码的具相同类型活性的不同酶的DNA相混合。DNA以PCR片段，质粒，噬菌体或基因组DNA提供。B)将产生的DNA库与DNA聚合酶，dNTP，合适的缓冲液和引物(随机寡聚体(6-30核苷酸长度)或特定寡聚体(6-50核苷的长度)或两种类型的组合)混合。C)将在合适试管中的PCR混合物放入PCR热循环仪(冷或热的)。
(1)将热循环仪加热至90至100℃一段时间(典型为1-10分钟)以便将DNA模板变性。
(2)随后跟随(重复)下面的流程(循环)：将模板变性(典型为90-100℃0-5分钟)。随后降低温度(典型值为10℃至90℃之间某值0-5分钟)使引物与单链模板退火。重新将温度升至变性温度(90-100℃)使在斜度(ramping)中通过DNA聚合酶合成引物的小的延伸。或者还可引入短的延伸时期(典型为70-75℃0-30秒)使产生较大的引物延伸。当温度达到变性发生的值时，延伸的引物和模板重新分离。可重复这一过程(典型为1至99个循环)。D)所需数目的循环完成后，可从用作引物的寡聚体中纯化产生的小DNA聚合物。一种方法是分离和克隆一个含有编码感兴趣多肽的基因的特定扩增带到合适的载体。这可在琼脂糖凝胶(典型地，分离50至1000碱基对的片段)，玻珠(对模板或引物使用亲合标记)上或通过柱进行。E)然后将纯化的(或未纯化的)DNA聚合物组合到标准PCR反应中(例如94℃，5分钟，(94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，2分钟)*25，72℃5分钟，4℃)。
可加入特定引物或由特定引物产生的DNA聚合物以产生含感兴趣基因的特定DNA聚合物。如D要点中提及，可将此DNA聚合物纯化并克隆到感兴趣的载体。
实施例实施例1方法1
由于亲本模板的稳定存在，本实施例方法的重大优势在于其而耐久性和没有PCR污染问题。此外与本技术领域以前所述方法相比这种方法需劳动更少，从而提供了自动化的极好的可能性。
含有编码H.Lanuginosa脂肪酶基因的9种不同变体的DNA序列的9种不同质粒等摩尔量混合。变体基因含有2至7个散布于整个基因的突变。
H.Lanuginosa脂肪酶基因的DNA序列和该脂肪酶的氨基酸序列公布于EP 0 305 216
如例如EP 0 396 608和WO97/07202中所述，变体依据标准术语表明。
改组了以下9个变体基因：
1′.N94K+D96L+E99K
2′.SPPRRP+N94K+D96L+T231R+N233R+D234R+Q249R
3′.SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L+Q249R
4′.STPRRP+N94R
5′.SCIRR+N94K+D96L+E239C+Q249R
6′.D137G+D167G+E210V
7′.D96L+E99K+V187A
8′.SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R
9′.N94R+F95L将下列成分混合于小试管中：
2微升(μl)质粒混合物(0.15微克/微升(μg/μl))，该基因侧翼的特定引物(1pmol/μl)，2μl 2.5mM dNTP，2.5mM MgCl2，2μl 10*taq缓冲液(Perkin Elmer)，0.5μltaq酶，总体积20μl。
将试管置于Perkin Elmer 2400热循环仪上。运行下列PCR程序：(94℃，5分钟)1循环：(94℃，30秒，70℃，0秒)99循环(72℃，2分钟，4℃未定)1循环。
PCR反应在1.5％琼脂糖凝胶上跑胶。将具有特定预期大小的DNA带从琼脂糖凝胶上切下并使用JETsorb(来自GENOMED Inc.)纯化。将纯化的PCR产物克隆到TA-载体(来自Invitrogen(原始TA克隆试剂盒)。将连接产物转化到标准大肠杆菌菌株(DH5a)。
贯穿感兴趣基因的20个转化体完全测序。结果：发现了下面20个变体：1.D137G+D167G+E210V+Y213C2.SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R3.N94R+F95L4.SPPRRP+D137G+D167G+E210V5.N94K+D96L+E99K+V187A+T267I6.D137G+D167G+E210V7.N94K+D96L+E99K+V187A8.D57G+N94R+F95L+Q249R9.N94K+D96L+E99K+E210V10.SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L11.N94R+F95L12.D137G+D167G+E210V13.N94K+D96L+Q249R14.SPPRRP+Q15P+A19C+C36A+N94K+D96L15.SPPRRP+N94K+D96L+T231R+N233R+D234R+Q249R16.D137G+D167G+E210V17.SCIRR+N94K+D96L+Q249R18.N94K+D96L+E99K19.N94R+F95L20.SPPRRP+N94R+F95L+F113S+Q249R
表现的几乎所有突变(20个中有19个)与特定模板显示出几乎没有偏差。统计：未改组的
在至少2个模板间改组的    8
在至少3个模板间改组的    2然后可将改组序列以BamHI-XbaI片段从大肠杆菌TA载体亚克隆到酵母载体pJSO 26(参看WO97/07205)，并例如筛选在洗涤剂中具改进的效果的新改组序列(参看WO97/07205)。实施例2方法2：
如上产生10个不同脂肪酶变体基因的PCR产物并以等摩尔量合并。
改组了下面10个突变基因。
1′.D137G+D167G+E210V
2′.D96L+E99K+V187A
3′.N94K+D96L+E99K
4′.SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R
5′.D111N+F211A+G225P
6′.SPPRRP+N94K+D96L+T231R+N233R+D234R+Q249R
7′.SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L+Q249R
8′.STPRRP+N94R
9′.N94R+F95L
10′.SCIRR+N94K+D96L+E239C+Q249R在合适的试管中产生下面混合物：
1μlPCR混合物(0.1μg)，十聚体(decamer)随机引物(300pmol)，2μl 10*klenow缓冲液(Promega)，0.25mM dNTP，2.5mM MgCl2，总体积20μl。
将混合液置入PE2400热循环仪并运行下面程序：96℃，5分钟，25℃5分钟，加入0.5mlklenow酶，25℃60分钟，35℃90分钟。
这一程序产生很多来自该基因所有部分的小DNA聚合物。
取出10μl在琼脂糖凝胶上检测。
将10μlPCR混合物(0.25mM dNTP，1μl 10*Taq缓冲液(Perkin Elmer)，2.5mM MgCl2，0.5μl Taq酶)加到热循环仪上试管中的10μl。然后运行下面的标准PCR程序：(94℃，5分钟)1循环，(94℃，30秒，45℃，30秒，72℃30秒)25循环，72℃7分钟，4℃未定。
将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上跑胶。看到清楚的无偏差成片条带。从凝胶上分离400和800bp之间的DNA。
将一半纯化的PCR产物在试管中与感兴趣基因侧翼的两个特定引物(40pmol)，0.25mM dNTP，2μl 10*Taq缓冲液，2.5mM MgCl2混合。然后运行下面标准PCR程序：(94℃，5分钟)1循环，(94℃30秒，50℃，30秒，72℃，30秒)25循环，72℃7分钟，4℃未定。
将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上跑胶。分离到虽然很弱但为预期大小的特定条带。使用特定引物(如上面提及)再进行PCR，以在克隆前扩增PCR产物。
用适当的限制性酶(BamHI/XhoI)切割PCR产物和所需载体。将载体和PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上跑胶，并从凝胶中纯化。
将切割的PCR产物和切割的载体在含T4 DNA连接酶(Promega)的连接缓冲液中混合。在16℃过夜连接后将混合液转化到大肠杆菌菌株DH5a。
将跨在基因上的19个克隆完全测序。结果：发现了下面19个变体：1.STPRRP+N94R+N233R+D234R+Q249R2.SPPRRP+N233R+D234R+Q249R3.D96L+D167G+Q249R4.N94R5.D167G6.SPPRRP+A19C+A28T+N94K+D96L+D111N+E239C7.SPPRRP+A19C+C36A+N94K+D96L+Q249R8.N94K+D96L9.N25T+D57G+N94R+E99K+D167G+T231R+N233R+D234R+Q249R10.N94R+Q249R11.D167G12.D167G13.T32I+N94R+F95L+D167G+Q249R14.E87K+N94K+D96L15.N94R+F95L+Q249R16.N94K+D96L+D111N17.STPRRP+S17T
18.N94K+D96L+V187A
19.SPPRRP+D57G+N94K+D96L+D111N+L151S
表现的所有模板变体与特定模板显示几乎没有偏差。
未显示明显的突变交换热点，看来它们在基因上平均分布。
  统计
  未改组的                       1
  在至少2个模板之间改组的        10
  在至少3个模板之间改组的        6
  在至少4个模板之间改组的        1
  在至少5个模板之间改组的        0
  在至少6个模板之间改组的        1
然后可将改组序列作为BamHI-XbaI片段从大肠杆菌TA载体亚克隆到酵母载体pJSO 26，(参看WO97/07205)，并筛选在洗涤剂中具改进效果的新改组序列(参看WO97/07205)。实施例3：淀粉酶变体改组：
在实施例1中，说明了H.Lanuginosa脂肪酶的一系列多个变体是怎样改组的。使用类似方式，亦可改组芽胞杆菌α-淀粉酶变体。
早些的专利申请鉴定了来自芽胞杆菌属菌株的具有改进特性的不同α-淀粉酶变体，例如热稳定性，在无钙条件下的稳定性，增进的洗涤特性等(参看WO95/10603，WO96/23874，WO96/23873，以及PCT/DK 97/00197)。
可如下改组B地衣形芽孢杆菌o-淀粉酶amyL变体。变体均位于WO95/10603所述的枯草芽胞杆菌表达载体pDN1528。
除了用于起始DNA合成的侧翼27基体引物不同之外，实验在如实施例1完全相同条件下进行。
从琼脂糖凝胶纯化大约1500bp的PCR扩增带并如实施例1所述进行克隆。可使用位于amyL基因内的可替换的限制性位点将改组基因文库克隆到芽孢杆菌质粒pDN1528或含有野生型amyL基因的大肠杆菌载体，例如WO96/23874中所述的pJeEN1。实施例4：
两个编码同源α-淀粉酶基因的改组：amyL和描述于WO96/23873的由序列2(氨基酸)和序列5(DNA)确认的淀粉酶。可通过使用标准条件的PCR扩增amyL的正向链(与mRNA相同)。
基于其对链霉抗生物素蛋白包被磁珠的亲合性和用NaOH变性双链从反向链分离出正向链。类似地可扩增和分离序列5(WO96/23873)编码的淀粉酶的反向链(与mRNA互补)。
在PCR中将两引物链用作模板：(94℃5分钟)+99循环的(94℃，30秒；60℃，0秒)+(72℃，5分钟)，使用不同长度的随机引物，Tag聚合酶和标准缓冲液条件，如实施例1中所述。
将产生的大约1500bp产物克隆为实施例1中所述的TA克隆(为了证实产生克隆的序列)或使用SfiI和PstI限制性位点克隆到芽孢杆菌载体pTVB110。
可在任一步骤(例5，10或20循环后)，基于生物素标记将原始模板从PCR中去除。

Claims (27)

1.通过在使用聚合酶的体外多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同的起始单或双链亲代DNA模板和引物构建重组同源多核苷酸文库的一种方法，其中A.通过下面方法合成延伸引物或多核苷酸
a)将亲代双链DNA模板变性产生单链模板，
b)将上述引物与单链DNA模板退火，
c)使用上述聚合酶通过起始合成延伸上述引物，
d)引起合成的抑制，并
e)将双链变性，从模板分离延伸的引物，B.通过下面方法诱异模板移位
a)从模板分离新合成的单链延伸引物并使用(A)中产生的上述延伸引物
作为引物和模板重复步骤A.b)至A.e)，或
b)重复步骤A.b)至A.e)，C.在适当数目循环的步骤A.和B.a)，A.和B.b)，或其组合后终止上述过程，并且D.可选择地使用特定引物在标准PCR反应中扩增产生的多核苷酸以选择性扩增感兴趣的同源多核苷酸。
2.权利要求1所述的方法，其中上述聚合酶是热稳定DNA聚合酶，诸如Taq，Amplitaq，Vent，Pwo。
3.权利要求1所述的方法，其中上述聚合酶是一种DNA聚合酶，诸如T4聚合酶，T7聚合酶，大肠杆菌聚合酶I或DNA聚合酶I的Klenow片段，并且在每一循环后将上述聚合酶加入反应混合物。
4.权利要求1所述的方法，其中上述聚合酶是一种RNA聚合酶。
5.权利要求1至4的任一个所述的方法，其中上述聚合酶是一种易出错聚合酶，诸如反转录酶例如HIV反转录酶。
6.权利要求1至5的任一个所述的方法，其中上述起始单或双链亲本模板是不同的，它们在相同天然多核苷酸(基因)上含不同点突变，或是从天然分离的同源多核苷酸(基因)。
7.权利要求6所述的方法，其中上述起始单或双链亲本模板在DNA水平显示例如超过95％，90％，85％，80％，75％，70％，65％，60％，55％，或甚至超过50％的相同性。
8.权利要求1至7中任一个所述的方法，其中通过升高温度抑制在步骤Ad)中的聚合酶反应。
9.权利要求8所述的方法，其中温度升至90℃和99℃之间的某值，优选地94℃。
10.权利要求1至7中任一个所述的方法，其中在步骤1.d中聚合酶反应的抑制是通过加入特定试剂，如DMSO达到的。
11.权利要求1至10中任一个所述的方法，其中上述引物包括一组完全随机引物。
12.权利要求1至10中任一个所述的方法，其中上述引物包括一组半随机引物。
13.权利要求1至10中任一个所述的方法，其中上述引物包括一组特定引物。
14.权利要求1至13中任一个所述的方法，其中上述引物是标记的，优选地用生物素或地高辛配基标记。
15.权利要求11，12或14中任一个所述的方法，其中上述随机或半随机引物具有6至500bp的长度，优选地15至300bp，更优选地25至150bp。
16.权利要求13或14所述的方法，其中上述引物长6至75bp。
17.权利要求1至16中任一个所述的方法，其中上述起始亲本DNA模板至少50％，60％，70％，80％，90％，或95％同源。
18.权利要求17所述的方法，其中上述起始亲本DNA模板来自不同属的野生型有机体。
19.权利要求17或18所述的方法，其中上述起始亲本模板长度大约50bp至20kb，优选地大约100bp至10kb，更优选地200bp至7kb，特别优选地大约400bp至2kb。
20.权利要求1至19中任一个所述的方法，其中上述起始亲本模板是由PCR反应产生的线性DNA片段。
21.权利要求1至20中任一个所述的方法，其中将上述起始亲本模板克隆到适当的载体，如质粒。
22.权利要求1至21中任一个所述的方法，其中上述起始亲本模板代表编码酶，诸如羰基水解酶，糖酶，或酯酶，诸如蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶，氧化酶，氧化还原酶等的一种多核苷酸。
23.权利要求1至21中任一个所述的方法，其中上述起始亲本模板代表编码具有诸如胰岛素，促肾上腺皮质激素(ACTH)，胰高血糖素，促生长素抑制素，促生长素，胸腺素，甲状旁腺素，垂体激素，生长调节素，(促)红细胞生长素，促黄体素，绒毛膜促性腺激素，下丘脑释放因子，抗利尿素，促甲状腺素，松驰素，干扰素，血小板生成素(TPO)和催乳素等生物活性的多肽的多核苷酸。
24.权利要求1至21中任一个所述的方法，其中所述起始亲本模板代表含有诸如涉及基因表达的转录起始(启始子)或终止，翻译起始，操纵基因位点等生物功能的多核苷酸。
25.权利要求1至24所述的方法，其中上述循环数目少于500，200，或少于100个循环。
26.鉴定与天然或其它有相同活性的已知多肽相比表现改进特性的感兴趣多肽的一种方法，其中将依据权利要求1至25中任一个的过程产生的重组同源多核苷酸文库克隆到适当的载体，将上述载体转化到适当的宿主系统，表达出相应多肽并展示，并在适当的检测中筛选上述多肽，以及选择阳性多肽。
27.生产依据权利要求26鉴定的感兴趣多肽的一种方法，其中将含有编码上述鉴定的多肽的多核苷酸的载体转化入适当的宿主，培养上述宿主以表达上述多肽，并回收和纯化该多肽。
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