CN1325446A - Dna的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种DNA合成方法,它能缩短用聚合酶链式反应(PCR)合成DNA时所需的时间,其特征在于,在下面(A)和(B)中所示条件下进行PCR时它使用有效量的DNA聚合酶,该酶能使每50μl反应液产生超过10ng的约2kb的DNA扩增片段:(A)反应液:含DNA聚合酶、1ng大肠杆菌基因组DNA、各10pmol的引物Eco－1和Eco－2(引物Eco－1和Eco－2的碱基序列分别列于序列表的序列号10和11),且组分适于该酶的体积50μl的反应液,以及(B)反应条件:以99℃、1秒～66℃7秒为1个循环的35个循环的PCR;用于该DNA合成方法的DNA合成用试剂盒;及PCR试剂的产品。上述方法能在与PCR相关的基因工程学研究、产业中加快操作速度。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程学领域中应用的缩短聚合酶链式反应(PCR)所需时间的DNA合成方法，该方法中所使用的试剂盒及其制品
背景技术
在基因工程学领域的研究中，DNA的合成可用于各种目的。其中除寡核苷酸短链DNA引进化学合成外，其中大部分采用利用DNA聚合酶的酶方法。由此，作为DNA碱基序列测定，DNA标记、导入位点特异性突变的试剂，DNA聚合酶具有高价值。
最近，随着PCR法的开发，耐热性DNA聚合酶成为关注的焦点，开发出适于PCR法的各种DNA聚合酶，并商品化。
再者，已知有联合应用多种DNA聚合酶来达到单个DNA聚合酶不能达到的DNA合成方法〔美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)第91卷，第5695～5699页(1994)〕。
已知该方法叫做LA-PCR法，就是将具有3′-5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶(例如，来源于激烈热球菌的α型DNA聚合酶)和它具有该活性的DNA聚合酶〔例如，来源于耐热性古细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)〕混合用于PCR的方法。
通过该方法，与以往只使用1种DNA聚合酶的PCR相比，扩增出的DNA的收量增加。另外，还能扩增出以往的PCR扩增不出的长链DNA。
以往，常规进行的PCR的最适条件显示于表A中。扩增1kbp需大约90分钟的反应时间，扩增10kbp大约需要268分钟的反应时间，扩增20kbp大约需478分钟的反应时间。
表A酶：Takara Ex Taq*1〔1.25U/50μl(PCR反应液)〕模板DNA：大肠杆菌基因组DNA*2〔100ng/50μl(PCR反应液)〕1kbp扩增 94℃ 30秒
55℃ 30秒 30循环(约90分)
72℃ 1分10kbp扩增 98℃ 10秒 30循环(约268
分)
68℃ 8分20kbp扩增 98℃ 10秒 30循环(约478
分)
68℃ 15分
*1：宝酒造社制品
*2：宝酒造社制、LA PCRTM用genome DNA set
由于PCR法能在短时间内将微量DNA扩增数百倍，所以可应用于包括医学、农学的研究、检查、临床等领域，尤其是在癌和艾滋病类感染性疾病的基因诊断等中发挥威力。另外，应用范围也可扩大到市民生活中，如通过基因诊断确认犯罪者和亲子关系，食品中有害菌中的基因检测等。
但是，在某些必须迅速报告检测结果，有必要进行大量PCR的临床检查中，再缩短PCR的反应时间，使PCR高速化成为主要课题。
再者，在DNA芯片制作，基因组分析中，PCR操作是必不可缺少的，提高其速率对提高整个研究的效率也是很重要的。
发明公开
本发明的目的是提供能进行比目前的PCR短时、高速的PCR的DNA合成方法，该合成方法中应用的试剂盒及其制品。
本发明的第1发明是DNA合成方法，它能缩短用聚合酶链式反应(PCR)合成DNA所需要的时间，其特征在于，按下面(A)和(B)中的条件进行PCR时，每50μl反应液中加入有效量的能产生超过10ng的约2kbp DNA扩增片段的DNA聚合酶：
(A)反应液：含DNA聚合酶、1ng大肠杆菌基因组DNA、各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别显示于序列表的序列号10和11中)，且适于该DNA聚合酶的组成体积50μl的反应液，以及
(B)反应条件：99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，进行35个循环。
本发明的第2发明涉及在本发明的第1发明的DNA合成方法中应用的试剂盒，其特征在于，按下文(A)和(B)中条件进行PCR时，按该试剂盒的说明书配备的PCR试剂包含，每50μl反应液中能产生超过10ng的大约2kb的DNA扩增片段的有效量的DNA聚合酶。
(A)反应液：包含DNA聚合酶，1ng大肠杆菌基因组DNA，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别显示于序列表的序列号10和11中)，且适于该DNA聚合酶的组成体积为50μl的反应液，及
(B)反应条件：99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，进行35个循环的PCR。
本发明的第3发明涉及包装材料及封入该包装材料内的PCR试剂组成的制品，该PCR试剂含有DNA聚合酶，该包装材料中附随的记录单或包装材料附随的说明书中表明上述PCR试剂可用于快速PCR；PCR用试剂的制品。
实施本发明的最佳方案(1)本发明的DNA合成方法
本发明的DNA合成方法是用PCR缩短DNA合成时间的DNA合成方法，即高速PCR，其特征在于，按下面(A)和(B)的条件进行PCR时，使用有效量的DNA聚合酶，每50μl反应液，它能产生超过10ng的大约2kb和DNA扩增片段：(A)反应液：含有DNA聚合酶，1ng大肠杆菌基因组织DNA，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别显示于序列表的序列号10及11中)，且适于该DNA聚合酶的组成体积为50μl的反应液，及
(B)反应条件：99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，其进行35个循环的PCR。
本发明DNA合成方法由于使用了“有效量的DNA聚合酶”，大大缩短了一定长度的DNA片段互补链合成反应(延长步骤)的时间，即缩短了1个循环的反应所需的时间。结果，通过PCR可在以前没有过的短时间内扩增目的DNA片段，即发挥缩短PCR总时间的高速PCR的优良效果。
本发明中“有效量的DNA聚合酶”是指，用含有1ng大肠杆菌基因组DNA，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别显示于序列表的序列号10及11中)体积50μl的反应液，99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环进行35的循环的PCR时，DNA聚合酶的量是其活性能达到每50μl反应液产生2kb DNA片段的量超过10ng。因此，在该条件下只要有进行PCR的DNA聚合酶的量，其蛋白质量没有限定。通过使用有效量的DNA聚合酶，可使PCR高速化。
本说明书中记载的“大肠杆菌基因组织DNA”包括，例如按口野嘉幸、平井久丸、樱木郁之助共著，1987年，Soft Science社发行，《基因和蛋白质的实验操作和杂交》中记载的方法，从大肠杆菌JM109(E.Coli JM 109)中制备出的基因组DNA。另外，该制备方法详细记载于生物观(Bio View)，第13号，第6～5页(1994年，宝洒造社发行)。当该基因组DNA作为LA PCRTM用基因组DNA套时可从宝洒造社购入。
反应液组成，只要使用适于所应用的DNA聚合酶的组份的反应液即可。“适于DNA聚合酶的组成”是指它能满足该DNA聚合酶最适种类的缓冲液、最佳pH、最适盐浓度(镁盐等)、最适dNTP浓度、最适引物量、其它添加物等的最适条件。
这里DNA聚合酶的酶活性单位以催化模板DNA摄取核苷酸(例如标记的dNTP)的能力为指标。其活性测定方法记载于1966年，D.R.Harper & Row社发行，Cantoni G.L.等编辑的核酸研究方法(Procedures in Nucleic Acids Research)第264页，来自大肠杆菌的DNA聚合酶(DNA Polymerase from E.coli、Richardson C.C.著)中。例如，测定来源于耐热古细菌(水片栖热菌)的Taq DNA聚合酶的活性时所选用的条件如下所示。(a)模板DNA：活化的鲑精DNA；(b)反应液组成：25mM TAPS(25℃中pH9.3),50mM氯化钾，2mM氯化镁，1mM β-巯基乙醇，各200μM的dATP、dTTP以及100μM的〔α-32P〕dCTP，总量50μl；
(c)活性测定方法：向含有(a)中的模板DNA的(b)组成的反应液中加入含有Taq DNA聚合酶的试剂，74℃孵育10分钟后，回收反应液中的酸性不溶性物质，测定该物中所含有的放射活性。
前面活性测定方法中所应用的活化鲑精DNA如下制备。□将鲑精DNA(Sigma公司)用灭菌水泡胀。□将70U/μl的D NaseⅠ(宝洒造)用150mM氯化钠稀释500倍～4000倍，优选在1500倍～3000倍的范围内稀释。□向20mg上述泡胀的DNA中加入50μl50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、5mM氯化镁、0.05％BSA、上述稀释了的DNaseⅠ，使反应液的体积达10ml。□37℃处理10分钟后，77℃处理10分钟使酶失活。向其中的一部分加入终浓度达0.4M的次氯酸(HClO4)，离心后，得上清，作为A260样品。将剩余部分用酚抽提、氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀。□测定上述酶处理前的DNA的UV260吸光值(A260对照)及上述□中所得A260样品的吸光值，按(A260样品)/(A260对照)×100(％)算出分解率。此时，优选分解率约3％～9％，更优选4.5％～7.5％的酶处理DNA作为上述活性测定的底物。
按照检测摄取活性的酶，应当用各分解率的酶处理DNA进行预实验，以选出最适分解率的酶处理DNA。
通常在上述方法中测定出的DNA聚合酶活性，即1单位(以下记作1U)的dNTP摄取到DNA的活性(以下简单记作dNTP摄取活性)，定义为“每30分钟，将10nmol的dNTP摄取到酸性不溶性物质中的酶量”。
以往，应用DNA聚合酶的PCR中，50μl反应液中添加dNTP摄取活性为1.25U～2.5U的DNA聚合酶，以此为标准。本发明中，在无特殊限定的情况下，可向每50μl的反应液中加入dNTP摄取活性为4～20U的DNA聚合酶进行PCR，由此可在以往达不到的短时间内扩增DNA，也就是说，可使PCR高速化。
本发明的高速PCR的例子列于表B。通过将前面的表A与表B进行比较可以看出，本发明的高速PCR缩短时间的效果很明显。由此，本发明提供PCR总时间缩短了的高速PCR。
表B酶：聚合酶A模板DNA：大肠杆菌基因组DNA〔100ng/50μl(PCR反应液)〕1kbp扩增 98℃ 5秒 30循环(约20分)
66℃ 2秒10kbp扩增 98℃ 5秒 30循环(约53分)
68℃ 70秒20kbp扩增 98℃ 5秒 30循环(约93分)
68℃ 150秒
表B中聚合酶A使用dNTP摄取高活性为5U/50μl(PCR反应液)的DNA聚合酶。表B中大肠杆菌基因组DNA与表A相同
本发明的高速PCR中所使用的有效量DNA聚合酶在本发明的高速PCR条件下用于DNA片段扩增使，与应用dNTP摄取活性1.25U/50μl的Takara Ex Taq进行PCR时扩增产物相同。因此，本发明中所应用的有效量的DNA聚合酶活性单位，对dNTP摄取活性显示比以往技术高的活性单位，但PCR生产力表示活性单位，即用PCR过程中扩增产物量的比较(PCR effective ratio)表示的活性单位与以往技术相同。
本发明的DNA合成方法的方案包括使用1种DNA聚合酶的方法，使用2种以上DNA聚合酶的方法。作为上述使用2种以上DNA聚合酶的方法，具体地讲包括，使用具有3′～5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶(美国国家科学院院刊)的方法，及使用2种以上具有3′～5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的方法，使用α型DNA聚合酶和非α非polyⅠ型DNA聚合酶的方法。这里“基本上不具有”3′～5′核酸外切酶活性的其它DNA聚合酶“中包含天然来源的不具有3′～ 5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶，或者通过认为改变与3′～5′核酸外切酶活性表达相关的功能部分而不表达该或滴定DNA聚合酶。
本发明中使用的DNA聚合酶的量(即前面所讲的“有效量的DNA聚合酶”)超过了标准的PCR方法中所使用的市售酶的量及试剂盒附带的说明书中记载的“dNTP摄取活性”表示中的标准使用的DNA聚合酶的量。该酶活性表示中为了发挥缩短操作时间的效果可使用有效量的酶。
具体而言，本发明中使用的DNA聚合酶的量，从充分发挥缩短操作时间的效果出发，在dNTP摄取活性的表示中，优选以往PCR中使用的酶量的2倍以上，更优选4倍以上，同样的观点，优选在30倍以下，更优选在20倍以下。另外，使用2种以上的DNA聚合酶时，可使用各个酶的有效量，也可应用2种以上的DNA聚合酶中任一酶量作为有效量。结果如下面的实施例所示，在以往的PCR中应用的DNA聚合酶的使用量所扩增的DNA片段在一般的琼脂糖电泳等中确认不出，本发明的DNA合成方法，即高速PCR，即便在缩短时间的条件下也可进行DNA扩增，且用一般的琼脂糖电泳可确认扩增的DNA片段。
前面所讲的“有效量的DNA聚合酶”可如下求出。具体而言，对于任意的模板的DNA，使用扩增该模板DNA的标准酶量，温度曲线等，在标准的PCR条件(标准条件)下进行PCR。然后，调整标准条件中各反应步骤的时间各反应步骤的时间，设定缩短扩增反应整体时间PCR条件，然后改变酶量进行PCR检测能得到与标准条件下，使用标准酶量时的扩增产物量基本上同等量的酶量，将该酶量或其以上的酶量用于本发明的高速PCR，确定出DNA聚合酶的有效量。“扩增产物量”可进行定量，如，PCR终了后，将所得一定量的样品进行电泳，电泳后用溴化乙锭等对胶进行染色，可观察到扩增产物产生的带，然后用能对胶中分离出的带中包含的DNA片段进行定量的机器，如成像分析装置(成像分析仪)和光密度计等测定带中的荧光强度，依此进行量化。再者，也可在纯化样品中扩增产物的基础上，用众所周知的DNA定量方法进行定量。
本发明的高速PCR中设定的各步骤的反应时间，只要是此标准条件下进行反应时间短，且显示同等的PCR生产力所表示的酵活性，则无特殊限定。本发明中，整个过程的反应时间，即PCR总时间可设定为以往PCR总时间的1/2～1/4以下。例如扩增1kbp时，以往1个循环需要3分钟，但本发明的高速PCR中1个循环可为40秒，PCR总时间就是以往的2/9。扩增2kbp的片段时，以往1个循环需要9分钟，但本发明的高速PCR中1个循环约1.8分钟，PCR总时间为以往的1/5。扩增10kbp的片段时，以往1个循环需要16分钟，而本发明的高速PCR中1个循环约3分钟，PCR的总时间约为以往的1/5。
作为优化DNA合成速度，在短时间内扩增DNA的酶，已知有包含来源于热球菌sp.KOD(Pyrococcus sp.KOD1)的DNA聚合酶(KOD DNA聚合酶)的酶组合物(特开平10-42874号公报，商品号：KOD Dash DNA聚合酶，东洋造社制)。但是，即便在使用该酶组成物时，按照其使用说明使用产品中记载的2.5U/50μl的标准使用量，在上述条件下进行反应。将反应液中的一部分进行常规的琼脂糖电泳，肉眼看不到扩增片段，用高灵敏度的成像分析仪进行定量，其扩增产物在10ng以下。另一方面，使用本发明中规定的“有效量的DNA聚合酶”时，在上述条件下，用琼脂糖电泳可确认扩增片段，其扩增产物量超过10ng。
本发明合成方法(即高速PCR)中可使用的DNA聚合酶无特殊限制，如包括polyⅠ型DNA聚合酶(大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ,Klenow片段，Taq DNA聚合酶等)，α型DNA聚合酶〔来源于上述激烈热球菌的α型DNA聚合酶，来自石质热球菌(Thermococcus Litralis)的DNA聚合酶(VENT DNA聚合酶)，来自热球菌sp.GB-D(Pyrococcus sp.GB-D)的DNA聚合酶(DEEP VENT DNA聚合酶)等〕，不属于琼脂任何一属的非α非polyⅠ型DNA聚合酶。polyⅠ型DNA聚合酶、α型DNA聚合酶均是指从氨基酸序列的同源性分类属于一组的酶，其氨基酸序列上的特征是记载于核酸研究(第15卷，4045～4047页(1991))。
非α非polyⅠ型DNA聚合酶可以是，例如国际公开第97/24444号公报中记载的来源于激烈热球菌的DNA聚合酶。
本发明的方法中使用的DNA聚合酶，不限于1种DNA聚合酶，可使用2种以上的DNA聚合酶，例如，具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶与基本上不具有3′→5′核酸外切酶活性的其它DNA聚合酶混合。作为DNA聚合酶组成物使用。2种酶的混合比例，只要按2酶的种类以适于本发明的高速PCR的混合比即可，没有特殊限制，但具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶与不具有3′→5′核酸外切酶活性的其它DNA聚合酶的比可为9∶1～1∶500。该聚合酶组成物的例子是，Takara Ex Taq DNA聚合酶(宝酒造社制)适于应用。
常规的PCR是通过3步反应实现DNA的扩增：双链模板DNA分解或单链DNA(变性)、引物与单链模板DNA的退火、由引物开始合成(延伸)。叫做“穿梭PCR”[《PCR法最前腺》、<蛋白质核酸酵素>分册，第41卷，第5号，第425～428页(1996)]的方法中，前面3步反应中的引物退火阶段与延伸反应阶段在同一温度下进行，通过2步反应进行DNA扩增。本发明的DNA合成方法尤其能缩短上述延伸步骤的时间，所以无论对上述3步反应和2步反应任何一种均能缩短合成反应的整体时间。
本发明的DNA合成方法中进行DNA合成反应时，在具有DNA聚合酶所具有的促进DNA合成活性作用的物质，即使高速PCR更高性能化物质的存在下进行DNA合成反应，所以能更有效地合成DNA。
使高速PCR更高性能化的物质之一是带负电荷的物质或其盐，尤其是酸性物质或其盐。
存在有效量的酸性物质和/或其盐的条件下进行PCR，可使进行高速化的条件普遍化。也就是说，能不受模板性质(例如GC含量)等影响而进行PCR。另外也可添加至少1种选自精胍菌素类、其分解物及其盐的物质。
进行本发明的高速PCR时，有效量的酸性物质及/或其盐可完成更高性能的高速PCR，例如，具有糖链骨架的酸性物质等，其详细功能不明确，但为了进行本发明的高速PCR而使用有效量的DNA聚合酶时，DNA合成反应时间内剩余的DNA聚合酶被收集酸性物质，所以通过酸性物质的效果，可将PCR最适的DNA聚合酶供给模板DNA，由此达到供给性能的高速PCR。
酸性物质或其盐的促进DNA合成活性的作用，可通过检测单位时间内合成的DNA链的长度和PCR的扩增产物量进行确定。本发明的DNA合成方法中，上述酸性物质或其盐的促进DNA合成活性的作用，可通过检测单位时间内新合成的DNA链的长度和PCR的扩增产物量进行确定。本发明的DNA合成方法中，上述酸性物质或其盐使用能发挥该作用的有效量。该有效量可以这样确定，例如，比较用添加了不同量的上述酸性物质或其盐的反应液进行PCR时与不添加这些物质进行PCR时的扩增产物量。扩增产物的量可以定量，例如，将一定量的PCR后反应液进行电泳，用溴化乙锭等对电泳后的胶进行染色，用成像分析仪测定扩增产物带的荧光强度，由此进行定量。
对具有促进DNA合成活性作用的酸性物质没有特殊限定，例如，可使用酸性多糖样的酸性高分子物质。另外，也可使用多聚谷氨酸、多聚丙烯酸、聚乙烯硫酸、聚苯乙烯硫酸、不会成为合成目的DNA模板的DNA等。本说明书的酸性物质也包含上文酸性物质的盐，只要具有促进DNA合成活性的作用即可。可用于本发明的酸性多糖包括，例如，含硫酸岩藻糖的多糖、硫酸葡聚糖、角叉茶胶、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸昆布多糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素(硫酸软骨素B)等代表的含有硫酸基的硫酸化多糖类，透明质酸、海藻酸、果胶等多糖醛酸等。上述含有硫酸岩藻糖的多糖有，例如可使用含有硫酸岩藻糖的多糖-F或多糖-U。含有硫酸岩藻糖的多糖F，可按照，如国际公开第97/26896号公报中记载的方法，或国际公开第97/47208号公报中记载的方法，从褐藻类植物中获得，是基本上不含糖醛酸的含硫酸岩藻糖的多糖。而含硫酸岩藻糖的的多糖-U是按上文公报中记载的方法而得到的含糖醛酸的含硫酸岩藻糖的的多糖。
对前述酸性物质的盐没有特殊限定，只要它具有促进DNA合成活性的作用即可，但优选水溶性盐。例如硫酸钠葡聚糖、褐藻酰钠、多聚谷氨酸钠、肝素钠、硫酸钾葡聚糖、肝素锂等碱金属盐等。
前述酸性物质既可是天然物质也可是化学或酶学合成物质，只要保持促进DNA合成或活性的作用即可。前述酸性物质，可以是含有它的未纯化物质、部分纯化物或纯化物中的任一种。并且可在保持促进DNA合成活性作用的范围内进行适当修饰。另外，本发明中应用的酸性物质，可是对其分子量进行分解操作而得到的适于发挥促进DNA合成活性作用物质，或者是经上述分解操作，后面经分子量分级而得到的物质，只要它是具有促进DNA合成活性作用的物质即可。本发明中优选使用分子量数千以上的酸性物质。且这些物质既可单独又可混合使用。
上述具有促进DNA合成活性作用的酸性物质，在本发明的高速PCR中添加的目的是使DNA聚合酶的活性高效发挥，或保持其活性。其添加量应按酸性物质的种类最适化，每50μl反应液添加0.1ng～100ng，优选1ng～10ng。该酸性物质的作用没有特殊限定，但考虑的出发点是将DNA聚合酶保持在其分子上，抑制DNA聚合酶对模板DNA的非持异性相互作用，因而能提供给模板DNA最适量的DNA聚合酶。也就是说，通过伴随DNA合成反应的进行，使增加了的模板DNA与DNA聚合酶间的相互作用最适化，而高效进行DNA合成反应。
再者，还有减低扩增区域和引物的碱基序列等的影响，得到稳定的扩增产物这样的效果。
上述酸性物质对于促进其活性的DNA聚合酶没有特殊限制，例如可以是适用于使用了上述各种DNA聚合酶的本发明DNA合成方法的酶。
本发明中，将精胍菌素类和/或其盐添加、应用到本发明高速PCR的目的是高效发挥DNA聚合酶的活性，或保持其活性。
对于具有促进DNA合成活性作用的精胍菌素类，没有特殊限定，例如可以是下列通式(Ⅰ)中代表的15-脱氧精胍菌素化合物或其盐。
Gu-(CH2)6-CONHCH(OR)CONH(CH2)4NH-(CH2)3-NH2 (Ⅰ)
〔式中Gu为胍基，R为氢原子或甲苯〕
作为上述精胍菌素类，上文通式(Ⅰ)中R为氢原子的15-脱氧精胍菌素(15-deoxyspergualin)或其盐较适宜。
另外，前述的精胍菌素类盐可以是无机酸盐有机酸盐中任一类，只要是发挥DNA聚合酶活性促进作用的物质即可。
上述精胍菌素类是从杆菌属生产菌分离出的精胍菌素的衍生物，已知衍生物的不同种类，具有抗肿瘤活性、免疫增强活性、免疫抑制活性(特开昭58-62152号公报，特开昭61-129119号公报，特开昭64-90164号公报)。因此，这些精胍菌素类可按已知的方法很容易地进行纯化，或按众知的方法进行合成、制备。
上述15-脱氧精胍菌素或其盐的制造方法记载于特公昭61-23183号公报或美国特许第4,603,015号说明书的实施例6中。
上述精胍菌素类可以是天然物质也可是化学或酶学的合成物质，只要保持促进DNA合成活性的作用即可，上述精胍菌素类可以是含有它的未纯化物、部分纯化物或纯化物中的任一种。再者，可在保持促进DNA合成活性的作用范围内对上述精胍菌素类进行适当修饰，或者用其分解产物。再者，这些物质既可单独应用又可混合使用。
本说明书中对精胍菌素类的分解产物没有特殊限定，只要保持DNA活性促进作用即可。例如，应用NaOH在强碱条件下室温加氢分解而产生的物质，在PCR所用缓冲液等到碱性条件下加热加氢分解而产生的物质等。对上述加氢分解而产生的物质没有特别限制，但应用前面通式(Ⅰ)中代表的15-脱氧精胍菌素化合物时，包括通式(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)所代表的化合物等。上述精胍菌素类的分解产物也包含该精胍菌素类分解产物的盐，只要保持DNA合成活性促进作用就行。
Gu-(CH2)6-CONH2 (Ⅱ)
〔式中Gu与通式(Ⅰ)中的基团相同〕
HO-CH(OR)CONH(CH2)4NH-(CH2)3-NH2 (Ⅲ)
〔式中，R与通式(Ⅰ)中的基团相同〕
OHC-CONH(CH2)4NH-(CH2)3-NH2 (Ⅳ)
上述精胍菌素类的使用量无特殊限制，只要在发挥DNA合成活性促进作用的范围内即可，但应根据所使用的模板DNA的种类及量、扩增对象的长度、DNA聚合酶的种类达到最适浓度的量。例如，15-脱氧精胍菌素3盐酸盐时，添加终浓度为0.1μM～500μM，优选20μM～100μM。
本发明的精胍菌素类的作用没有特殊限定，但考虑有使DNA聚合酶的活性有效发挥，或通过保持DNA聚合酶而抑制酶与DNA的非特异性相互作用。另外考虑作用于模板DNA与引物的复合体，使引物延伸反应容易。
上述精胍菌素类与酸性物质并用时，二者反应可形成盐，但若是保持DNA合成或活性促进作用的物质亦可。
上述精胍菌素类与酸性物质并用时，只要在发挥DNA合成活性促进作用的范围内则无特殊限定，但要根据所使用DNA的种类及数量、扩增对象的长度、DNA聚合酶的种类等而选用达到最佳共存比例的量。
上述精胍菌素类或其盐以及上述具有负电荷的物质或其盐与精胍菌素类或其盐的混合物，可作为DNA合成活性促进剂使用。
以上论述的涉及本发明的DNA合成方法，该方法的详细记载，如记载PCR试剂配备方法、推荐的反应条件等信息的抑制物的提供及通过国际互联网等电子媒体来表明本发明方法的行为均包含于本发明的方法之内。(2)本发明的DNA合成方法中应用的试剂盒
使用本发明的试剂盒可进行高速PCR。该试剂盒只要是用于PCR方法中伴随DNA合成的反应，则无特殊限制，包括在试验管内进行DNA合成反应的高速PCR试剂盒。
本发明的试剂盒是用于试管内合成DNA的试剂盒，接该试剂盒的说明书制备的PCR试剂包括前面(1)中记载的用于DNA合成的“有效量的DNA聚合酶”，即用含有1ng大肠杆菌基因组DNA，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2，及适于该DNA聚合酶的组分的体积50μl的反应液50μl，以99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环进行35个循环的PCR时，每50μl反应液可产生的约2kb DNA片段量超过10ng的有效量的DNA聚合酶。
应用本发明的试剂盒制备的PCR试剂没有特别限制，但包括高速PCR用的DNA聚合酶，例如，每50μl反应液中含有dNTP摄取活性为4～10U的高速PCR DNA聚合酶，如Takara Ex Taq DNA聚合酶。另外试剂的组份适于适于所用DNA聚合酶的组份。
上述的“说明书”是记载了该试剂盒使用方法，如PCR试剂的配制方法、推荐的反应条件等的印刷物，除小册子或散页形式的说明书之外，它包括附随试剂盒的标记、包纳了试剂盒的包装上记载的东西。并且包含借助国际互联网这样的电子媒体而公开，提供的信息。添加了与PCR试剂制备相关的、指导添加上述DNA聚合酶量和/或上述酸性物质或其盐的说明书的试剂盒，或者借助国际互联网这样的电子媒体公开提供发明方法的试剂盒均包含在本发明的试剂盒之内。
另外，试剂盒中可含有具有DNA聚合酶的DNA合成活促进作用的酸性物质或其盐。酸性物质或其盐可使用上文(1)中记载的。这些酸性物质或其盐能使DNA聚合酶活性有效发挥，或通过保持酶而适当调节DNA与酶的相互作用，所以能进一步提高本发明试剂盒的性能。
另外，至少含有1种选自精胍菌素类、其分解产物及其盐。
上述精胍菌素类与酸性物质并用时二者反应可形成盐，可只要保持DNA合成活性的促进作用即可。
对本发明中所包含的DNA聚合酶没有特殊限制，包括上文(1)中所示的各种高速PCR用的DNA聚合酶。
该试剂盒中包含DNA聚合酶反应所必需的试剂，如dNTP、氯化镁、为保持反应液适当pH值的缓冲液成分等。前述的DNA聚合酶、酸性物质及其它试剂可分别作为独立部分，或以几个成分组合在一起的状态，如添加到反应用缓冲液中的状态，包含在试剂盒中。
本发明试剂盒的实施方案之一是，除上述DNA聚合酶之外，包含用PCR法合成DNA所必需的各种成分，如dNTP、氯化镁、为保持反应液的适当pH的缓冲成分等的组成物。再者，该组成物包含上述酸性物质。向该组成物中加入扩增目的DNA片段所需的引物及模板DNA后，必要时加入水或缓冲液就可制备成反应液。再者，当规定了该试剂盒所扩增的DNA片段时，其组成物可包括扩增该片段所适用的引物。通过使用这样的组成物可极其简单，快速的进行DNA缓冲反应，也就是说，可进行高速PCR。
本发明的试剂盒用于PCR及利用PCR进行的筛选、DNA标记、cDNA合成、焦点特异性突变的导入等操作时，发挥缩短操作时间这样的优良效果。例如，用上述试剂盒进行PCR时，扩增相同长度的DNA所需的时间比以往的PCR方法及LA-PCR方法更短。因此，用以往的方法不能扩增的DNA，在高速PCR条件下也能进行扩增。本发明的试剂盒因为能缩短扩增反应的整体时间，所以能发挥在更短的时间内进行基因这样的优良效果，如，通过用于以PCR方法为基础进行的基因诊断法。(3)本发明的高速PCR用试剂的制品
本发明的高速PCR用试剂的制品是由包装材料及封入该包装材料中的PCR用试剂构成的产品，其PCR试剂包含DNA聚合酶，其包装材料中附随的标记或说明书中表明上述PCR试剂可用于短时间内的PCR。上述PCR限制包含DNA聚合酶，该DNA聚合酶所适用的缓冲液和/或dNTP。因此，该领域的专业人员可按照产品中的标记、附加的说明书简便地进行本发明的高速PCR，所以该产品是本发明的高速PCR所必需的在各个领域有用的产品。
应用本发明的DNA合成方法(高速PCR)可缩短扩增反应的整体时间，根据所使用的装置的性能等首次实现PCR的高速化，如扩增2kb的DNA所需PCR总时间为以往的1/2左右，扩增约20kb的DNA则为原来的1/5左右。本发明的方法可发挥更短时间内进行基因诊断法这样的优良效果，如通过用于以PCR方法为基础进行的基因诊断法。该方法特别适合于进行2次PCR的巢式PCR(nested PCR)。
本发明的高速PCR对象DNA芯片这样的大量PCR操作为必要的技术开发，制造中极为有用。DNA芯片就是将大约10000种的DNA固定于拇指大的玻璃芯片上。为了制备这种DNA芯片，就有必要通过PCR扩增出怎样所需的DNA，这样必要的PCR操作次数膨大。例如，假定制作10000枚这样的DNA芯片，用以往的PCR时仅PCR操作一项就可延续3个月，若用本发明的高速PCR，就可在3周这样的短时间内制作出来。
另外，为了阐明枯草菌基因组(500万个碱基)的全部序列而必须的PCR操作，以往的PCR约3.5个月，而本发明的高速PCR在3周内就可完成，差别这么大。
本发明的高速PCR不需使用特殊装置，使用以往的PCR装置就可，本发明的高速PCR作为迅速性、反应性良好或高敏感度的PCR，是极为有用的技术。
用以下实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于实施例的范围之内。
下文的实施例中，市售的DNA聚合酶的活性以各产品说明书中记载的“dNTP摄取活性”中的表示单位为基础进行表示。另外，含市售酶的反应液的配制若无事先声明则按各酶的说明书，或者应用附加的反应缓冲液配制。若无事先声明，PCR中应用Takara ThermalCycler PERSONAL(宝酒造)。
实施例1(1)引物的制作
以λDNA的碱基序列为基础合成λ1-λ5、λ7～λ10、9种引物。引物λ1～λ5、λ8～λ10的碱基序列显示于序列表的序列号9中。以λDNA为模板，组合这些引物进行PCR，扩增出的DNA片段的长度列于表1。
表1引物 DNA扩增片段的长度λ1/λ2 0.5kbλ1/λ3 1kbλ1/λ4 2kbλ1/λ5 4kbλ1/λ7 8kbλ1/λ8 10kbλ1/λ9 12kbλ1/λ10 15kb(2)聚合酶A和聚合酶B的制作
应用5U/μl浓度的Takara Ex Taq DNA聚合酶，制备其浓缩标准品。分别制备出10U/μl浓度的标准品(叫做聚合酶A)。20U/μl浓度的标准(称作聚合酶B)用于以下实施例中。(3)使用聚合酶A和B的高速PCR
按照Takara Ex Taq DNA聚合酶的使用说明书，通常每50μl的PCR试剂中使用1.25U的DNA聚合酶。这次改变DNA聚合酶量，检测高速PCR。
λDNA作模板，制备含引物λ1和λ4的引物对进行PCR.PCR试剂的组成如下所示。PCR试剂组成：
50mM Tris-醋酸(pH8.5)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，3mM醋酸镁，50mM醋酸钾，1pgλDNA，各10pmol的引物λ1和λ4。向上述PCR试剂中加入1.25U Takara Ex TaqDNA聚合酶、0.5μl聚合酶A或0.5μl聚合酶B，终体积分别为50μl。
反应是以98℃、5秒～66℃、10秒为1个循环，进行35个循环的总时间约31.5分的高速PCR。反应终了后，将所得样品5μl进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认约2kb的扩增的目的的片段。结果如表2所示。
表2使用酶 扩增结果1.25U/50μlPCR Takara Ex Taq -DNA聚合酶A ++聚合酶B ++++：可见到强扩增+：可见到扩增±：勉强看到-：看不到
如表2所示使用聚合酶A〔5U/50μl(PCR试剂)〕或聚合酶B〔10U/50μl(PCR试剂)〕可实施高速PCR。
实施例2(1)引物的制作
以大肠杆菌基因组DNA碱基序列为基础合成Eco-1、Eco-2、Eco-2-2、Eco-5、Eco-6、5种引物。引物Eco-1、Eco-2、Eco-2-2、Eco-5、Eco-6的碱基序列分别列于序列号10-14中。组合这些引物以大肠杆菌DNA为模板进行PCR，扩增出的片段长度列于表3。
表3引物对 扩增DNA片段的长度(kb)Eco-1/Eco-2 2Eco-2-2/Eco-5 8Eco-1/Eco-6 20(2)使用聚合酶A时的高速PCR
对使用聚合酶A的高速PCR进行检测。以LA PCRTM中应用的genome DNA set(宝酒造)中的大肠杆菌基因组DNA为模板，制备分别含引物对Eco-1和Eco-2、Eco-2-2和Eco-5、Eco-1和Eco-6的PCR反应液，进行高速PCR。PCR反应液的组成如下所示。PCR反应液组成：
50mM Tris醋酸(pH8.3)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP,3mM醋酸镁，50mM醋酸钾，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2组合、Eco-2-2和Eco-5组合、Eco-1和Eco-6组合。扩增片段的长度为2kb和8kb时使用1ng的大肠杆菌基因组DNA，长度为20kb时使用20ng。向上述PCR反应液中加入0.5μl的聚合酶A和2.5μg的褐藻酸钠，终体积为50μl。
PCR使用Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(宝酒造社制)，在表4所示的温度下在fast状态进行。反应终了后，取5μl所得样品，进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖电泳，确认扩增片段。结果如表4所示。
表4
+～++++：用4个阶段表示扩增程度- ：未见扩增
| 扩增DNA片段的长度(kb) | 反应稳定条件(1个循环) | PCR | 扩增结果 | |
| 循环 | 总时间(分) | 聚合酶A | ||
| 2 | 99℃/1秒、66℃/6秒99℃/1秒、66℃/7秒99℃/1秒、66℃/8秒 | 353535 | 约25.1约25.7约26.3 | ++++++ |
| 8 | 99℃/1秒、68℃/60秒99℃/1秒、68℃/70秒99℃/1秒、68℃/80秒 | 353535 | 约56.6约62.4约68.3 | ++++++++ |
| 20 | 99℃/1秒、68℃/150秒99℃/1秒、68℃/165秒 | 3535 | 约108.5约117.3 | +++++ |
从表4可以确认，使用聚合酶A时，在任一高速PCR条件下均能扩出约2kb、8kb、或20kb的片段。此外，用0.5μl聚合酶B进行同样的PCR时结果与聚合酶A相同。(3)与其它公司的DNA聚合酶进行的比较
在实施例2-(2)中所示的公司PCR实验中扩增出的约2kb的DNA片段，对之进行定量。对照使用KOD dash DNA聚合酶(东洋丝社制)。对KOD dash DNA聚合酶而言，对每50μl PCR反应液中所使用的酶量是产品标准的使用单位量2.5U，增加到5U或10U的PCR反应液同样进行定量。
高速PCR以99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，进行35个循环。使用Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(宝酒造社制)进行PCR，在fast状态下进行。该热循环仪的fast状态时的规格值如表5所示。
表5
规格值的定义 规格值加热速率 从35℃加热到94℃时的最大加热速度 ≥1.5℃/秒冷却速率 从94℃冷却到40℃时的最大冷却速度 ≥1.5℃/秒Over temp 表示阻断温度比设定温度升高几度是稳定的 ≤1.0℃Under temp 表示阻断温度比设定温度降低几度是稳定的 ≤2.0℃
如上设定温度条件时，1个循环的工程需要大约45秒，PCR总时间25.7分钟。反应终了后取各产品8μl进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。其结果是使用5U聚合酶A和10U KOD dash DNA聚合酶时，能看到约2kb的扩增的目的片段。而用2.5U的KOD dash DNA聚合酶时没看到扩增的目的片段。于是进一步用检测灵敏度高的成像分析仪FM-BIO(宝酒造社制)，调整检测灵敏度，以已知量的DNA分子量标记物作对照，检测扩增的目的片段，并定量。结果表明用2.5U的KOD dash DNA聚合酶时勉强能看到扩增片段。其定量值如表6所示。
表6使用酶 定量值(ng)聚合酶A 1532.5U KOD dash ≤105U KOD dash 2810U KOD dash 88
如表6所示，通过成像分析仪定量，使用聚合酶A时的DNA扩增量为；反应后的样品每50μl约153ng。另一方面，通过成像分析仪定量，即便用KOD dash DNA聚合酶时，按其说明书记载的标准使用量〔2.5U/50μl(PCR反应液)〕中得到超过10ng的扩增产物。但使用2倍、4倍的酶量时分别得到28ng、88ng的扩增产物。也就是说，不仅聚合酶A而且KOD dash DNA聚合酶也是，增加其用量可增加DNA扩增量。另外，用实施例2-(2)中使用的聚合酶A应用的PCR反应液配备不含褐藻酸钠的PCR反应液，用聚合酶A在上述反应条件下进行高速PCR，能得到超过10ng的扩增片段。
因此，上述条件下，不属哪种DNA聚合酶，只要使用得到超过10ng的扩增产物的DNA聚合酶量，通过普遍的琼脂糖电泳肉眼能观察到扩增产物，这表明其扩增产物量超过10ng的高速PCR可行。
实施例3
应用Takara Ex Taq DNA聚合酶使用说明书中记载的1.25U/50μl(PCR反应液)Takara Ex Taq DNA聚合酶，以基本的工艺条件为基础，用3种热循环仪检测用聚合酶A得到同样量的扩增产物总需的高速PCR的总时间。基本的工艺条件是，扩增20kb时参照Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(宝酒造社制，1998年5月版)P6记载的条件进行设定；扩增其它长度时参考TakaraLA PCR试剂盒ver2.1(宝酒造社制)中附加的说明书中第8页记载的Takara LA Taq DNA聚合酶的条件进行设定。使用的热循环仪是Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL MP(宝酒造社制，表7中称作MP),Takara PCR Thermal CyclerPERSONAL(宝酒造社制，表7中称作PP),GeneAmp PCR System9600(PE社制，表7中叫做9600)。
表7
| 扩增DNA片段的长度 | 使用机器 | 1个循环温度条件(上段)〔PCR总时间〕(下段) | |
| (kb) | 1.25U/50μl(PCR试药液)Takara Ex Taq | 聚合酶A | |
| 2 | PPMP9600 | 98℃/10秒，68℃/60秒〔约58分〕98℃/10秒，68℃/60秒〔约67分〕98℃/10秒，68℃/60秒〔约70分〕 | 98℃/5秒，66℃/10秒〔约27分〕98℃/1秒，66℃/10秒〔约37分〕98℃/1秒，66℃/10秒〔约36分〕 |
| 8 | PPMP9600 | 98℃/10秒，68℃/5分〔约178分〕98℃/10秒，68℃/5分〔约187分〕98℃/10秒，68℃/5分〔约190分〕 | 98℃/5秒，68℃/75秒〔约58分〕98℃/1秒，68℃/75秒〔约69分〕98℃/1秒，68℃/75秒〔约67分〕 |
| 20 | PPMP9600 | 98℃/10秒，68℃/15分〔约478分〕98℃/10秒，68℃/15分〔约487分〕98℃/10秒，68℃/15分〔约490分〕 | 98℃/5秒，68℃/3分〔约110分〕98℃/1秒，68℃/3分〔约121分〕98℃/1秒，68℃/3分〔约119分〕 |
所使用的模板的种类、模板量、引物对、酶量及PCR试剂液组份与实施例2相同。在表7记载的条件下进行30个循环的PCR后，用实施例2-(3)中的方法对扩增产物进行定量。对于Takara PCRThermal Cycler PERSONAL来讲，使用1.25U时设定在普通状态，使用聚合酶A时设定在fast状态。
结果，使用1.25U/50μl(PCR反应液)的Takara Ex Taq DNA聚合酶、聚合酶A时，在各自的条件下所得的扩增产物量没有差别。也就是说，用PCR产量所代表的酶活性相同。另一方面，表7的结果表明，扩增反应整体的时间，即PCR总时间，通过使用聚合酶A显著缩短到大约1/2～1/5，这表示可以进行高速PCR。这表明，使用本发明的有效量的DNA聚合酶时，1个循环的扩增率与标准反应条件的产率相同，而与设定时间的缩短无关。使用1.25U/50μl(PCR反应液)的Takara Ex Taq DNA聚合酶作对照，在上述聚合酶A所用的反应条件下进行PCR，结果应用任何一种引物对均能看到扩增。
实施例4
使用Takara Ex Taq DNA聚合酶和聚合酶A，在各自适宜的反应条件下进行PCR，比较其扩增产物的量。以λDNA作模板，使用引物λ1和λ2作引物对，以扩增出的约500bp的产物量作指标。a)Takara Ex Taq DNA聚合酶反应体系：使用Takara PCR扩增试剂盒(Amplification Kit)，按照该试剂盒的使用说明书，用附随的反应缓冲液配制PCR反应液：含1ng或100pg的λDNA，各10pmol的引物λ1和λ2,1.25U的Takara Ex Taq DNA聚合酶，终浓度分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，终体积为50μl。使用PCR Sgatem 9600。反应是94℃、30秒～55℃、30秒～72℃、30秒为1个循环，每1个循环设定167秒左右，进行25个循环。反应终了后各取8μl进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。再用成像分析仪FM-BIO，调整检测灵敏度，以已知量的DNA分子量标记物对照，对扩增片段进行定量。b)聚合酶A反应体系：配制含50mM Tris-醋酸(pH8.3)各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、3mM醋酸镁、50mM醋酸钾、1ng或100pg的λDNA、各10pmol的引物λ1和λ2、0.5μl的褐藻酸钠，终体积为50μl的PCR反应液。使用PCR System 9600。PCR是以98℃、5秒～55℃、7秒～72℃、5秒为1个循环，进行25个循环的反应。反应终了后，取8μl样品进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。再用成像分析仪FM-BIO，通过调整其检测灵敏度，以已知量的DNA分子量标记物作对照，对扩增产物进行定量。将该定量所得值与前文1.25U Takara Taq DNA聚合酶所得扩增产物的定量值进行比较。
结果，使用哪一种酶时均是用1ngλDNA模板时的扩增产物量多。另外，用同一模板量时，Takara Taq DNA聚合酶、聚合酶A间扩增产物量没有差别，这表示两种PCR可扩增基本上等量的DNA片段。也就是说，以PCR产量来表示酶活性在2种PCR中是同等的。因而，在相同循环数的反应中，Takara Taq DNA聚合酶体系中延伸反应时间是37℃、30秒，与之相对，聚合酶A反应体系中37℃、5秒的延伸时间就足够了。
也就是说，以往的方法中每个循环约167秒，而每个循环缩短为92秒的高速PCR是可能的，PCR总时间缩短大约1/2的高速PCR是可能的。实施例5酸性物质对Taq DNA聚合酶合成活性的促进作用(1)含有硫酸岩藻糖的多糖-F的制备
以下实施例中使用的含硫酸岩藻糖的多糖-F均用下文的方法纯化来的。以下是含硫酸岩藻糖的多糖-F的制备例。
将Gagome海带充分干燥后，粉碎干重约20kg的Gagome海带。将所得干粉悬浮剂900升7.3kg冰氯化钙的自来水中，边搅拌边升温，40分钟内升高到90℃，保持在90℃～95℃抽提1小时。其后将所得溶液冷却到20℃，停止搅拌，放置1晚，得到提取物。
接着用离心机(Westfalia Separator公司CNA型)进行固液分离。将上述提取物离心，得到大约900升的上清液。将其中的360升用装入3微型滤器(日本食品滤材社)的SPARKLER滤器(日本染色机械社)过滤。用截断分子量为3万的UF膜(FE10-FC-FUS0382，ダイセル化学工业社)将滤液浓缩到20升，然后向所得浓缩液中加入20升自来水，再浓缩到20升。如此的稀释浓缩过程重复3次后，得到大约25L的浓缩液。
向上述浓缩液700ml加入终浓度0.2M氯化钙、20mM醋酸钠，然后对含有0.2M氯化钙的20mM醋酸钠平衡缓冲液(pH6.0)透析处理后的溶液过用上述平衡缓冲液10升平衡过的3500ml DEAE-Sepharose FF柱(柱内径9.7cm)用5升的平衡缓冲液洗涤。然后按如下所示的阶段梯度条件进行洗脱。
色谱的流速设定为3500ml/1小时。梯度条件：1)0～0.5M氯化钠的线性梯度
(洗脱液量：4.5升)2)0.5～1M氯化钠的线性梯度
(洗脱液量：4.5升)3)1.0～2.0M氯化钠的线性梯度
(洗脱液量：4.5升)
每250ml作1级分收集洗脱液。用酚-硫酸法对每一级分进行糖定量，用咔唑硫酸法进行糖醛酸定量。结果得到糖含量高糖醛酸含量低的No.40～53级分。将No.40～53的级分叫做含有硫酸岩藻糖的多糖-F级分。用10万截流的滤膜浓缩含有硫酸岩藻糖的多糖-F级分，然后对50mM柠檬酸钠进行透析，再用蒸馏水透析一晚。接着进行干燥，从含有硫酸岩藻糖的多糖-F级分中得到1.696g含有硫酸岩藻糖的多糖-F。(2)酸性物质对Taq DNA聚合酶的影响
作为酸性物质，使用按实施例5(1)的方法得到的硫酸岩藻糖含有多糖-F、葡聚糖硫酸粉末(オニコ一公司)或褐藻酸钠(100～150センチポズ，和光纯药社制)，检测它们对Takara Taq DNA聚合酶(宝酒造社制)活性的影响。
制备含模板λNDA、引物λ1和λ7作引物对、Taq DNA聚合酶作DNA聚合酶的PCR反应液，进行PCR接下文的组分配制PCR反应液。PCR反应液组成：
Takara Taq DNA聚合酶应用的缓冲液，10U的Takara TaqDNA聚合酶，100pg的λNDA，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，及各5pmol的引物λ1和λ7(终体积为25μl)。再向上述PCR对应于中加入酸性物质0.25ng的硫酸岩藻糖含有多糖-F、0.25ng的葡聚糖硫酸粉末或0.5μg的褐藻酸钠。
反应以98℃、5秒～68℃、3分为1个循环，共30个循环，PCR的总时间大约110分钟。反应终了后，取5μl样品进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳。确认扩增片段。结果如表8所示。
表8酸性物质 添加量 扩增结果硫酸岩藻糖-F 0.25ng ++葡聚糖硫酸粉末 0.25ng ++褐藻酸钠 0.5μg ++无添加 ±++：可见到强扩增+：可见到扩增±：勉强看到-：看不到
表8的结果证实无论添加哪种酸性物质，均能很好地扩增出预想的8kb的片段，可以进行高速PCR。将本实施例中的模板DNA从100pg增加到1ng，即便不添加酸性物质也能增加目的扩增产物的量。而使用1.25U的Takara Taq DNA聚合酶和1ng DNA模板在上述条件下进行PCR时，未得到扩增的目的片段。这表明通过添加酸性物质可进行更高性能的高速PCR。实施例6 LA-PCR应用的DNA聚合酶与酸性物质并用的高速PCR
具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶与不具有该活性DNA聚合酶组合应用的LA-PCR法，在酸性物质存在的条件下检测高速PCR。(1)聚合酶A和酸性物质联用的高速PCR
以λDNA作模板，配制含引物λ1和λ8的PCR反应液，进行PCR。PCR反应液组成如下所示。PCR反应液组成：50mM Tris-醋酸(pH8.5)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP,3mM的醋酸镁，50mM醋酸钾，10pg的λDNA,0.5μl的聚合酶A及各10pmol的引物λ1和λ8(终体积为25μl)。再向上述PCR反应液中加入2.5ng的褐藻酸钠。以不添加该酸性物质的PCR反应液作对照。
反应条件：98℃、5秒-68℃、75秒为1个循环，进行30个循环的反应。使用Takara PCR Thermal Cycler PERSONAL(宝酒造社制)，在fast状态下进行。
反应终止后，所得样品各取6μl进行1％的含0.00005％溴化乙锭的琼脂糖凝胶，确认约10kb的扩增片段。结果如表9所示。
表9酸性物质 扩增结果添加褐藻酸钠 ++无添加++：可见到强扩增+：可见到扩增±：勉强看到-：看不到
如表9所示，添加褐藻酸钠时可看到约10kb的扩增片段。而不添加酸性物质时，在上述反应条件下看不到约10kb的扩增片段，而将模板DNA量从10pg增加到1ng时，进行同样的PCR则能看到目的片段。而模板DNA量即便为1ng时，应用标准用量的Takara ExTaq DNA聚合酶进行PCR却看不到扩增出目的片段。这提示，通过添加酸性物质可进行更高性能的高速PCR。(2)聚合酶B和酸性物质联用的高速PCR
以λDNA为模板，制备含引物λ1和λ9的PCR反应液，进行PCR。PCR反应液的组成如下所示。PCR反应液组成：
Takara Ex Taq DNA聚合酶应用的缓冲液，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP,10g的λDNA,0.5μl的聚合酶B及各5pmol的引物λ1和λ9(终体积为25μl)。向上述PCR反应液中加入0.75ng的硫酸岩藻糖含有多糖-F或5μg的褐藻酸钠。
反应是98℃、5秒～68℃、3分为1个循环，进行30个循环。反应终止后，取5μl所得样品进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。结果如表10所示。
表10酸性物质 添加量 扩增结果含有硫酸岩藻糖的多糖- 0.75ng ++F 5μg +++褐藻酸钠 +无添加
+～+++：用3个阶段表示扩增程度
如表10所示，与不添加酸性物质相比，无经添加哪种酸性物质，均能添加12kb目的扩增片段的量。
实施例7
观察PCR中使用的DNA聚合酶量与酸性物质的效果及反应时间的影响。
以DNA为模板，配制含引物λ1和λ8的PCR反应液进行PCR。该PCR中使用Takara EX Taq DNA聚合酶、聚合酶B。PCR反应液的组成如下所示。PCR反应液组成：
Takara EX Taq、DNA聚合酶用的缓冲液，各0.2mM的dCTP、dGTP及dTTP,10pg的λDNA,1.25u的Takara EX Taq、DNA聚合酶或0.5μl的聚合酶B及各10pmol的引物λ1和λ8(终体积50μl)。
再向上述PCR试剂中加入2.5μg的褐藻酸钠。
反应是98℃·5秒～68℃·2分为1个循环，进行30个循环，PCR的总时间约80分钟。反应终止后，取8μl所得样品，进行含0.00005％溴化乙锭的7％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。其结果如表11所示。
表11使用酶 添加量 扩增结果1.25U/50μl(PCR试药液)Takara Ex- 无添加 -Taq 无添加 +聚合酶B 2.5μg ++聚合酶B
++：可见强扩增
+：可见扩增
±：勉强可见扩增
-：未见扩增
如表11所示，使用聚合酶B时以及向聚合酶B中加入褐藻酸钠时，均能确证预想的10kb的扩增片段，可以进行高速PCR。用成像分析仪PMBIO(宝洒造)对扩增产物进行定量时发现，向聚合酶B中加入褐藻酸钠时的扩增量是不添加的5倍，能进行更高速的PCR。而接Takara EX Taq的使用说明书，单独应用1.25u的Takara EXTaq、DNA聚合酶时，通过高速PCR没有得到扩增。
实施例8
观察精胍菌素类和酸性物质联用对DNA聚合酶的效果(1)配制含以λDNA为模板以λ1和λ8为引物对PCR反应液进行高速PCR。该DNA中使用聚合酶B。精胍菌素类使用15-脱氧精胍菌素3盐酸盐，酸性物质褐藻酸钠(和光纯药)。PCR反应液的组成如下PCR反应液组成：
50mM Tris-醋酸缓冲液(pH8.5)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP,3mM醋酸镁，50mM醋酸钾，10g的λDNA，各10pmol的引物λ1和λ8向上述PCR反应液中加入0.5μl的聚合酶B，再加入如表10中所示浓度的15-脱氧精胍菌素3盐酸盐及褐藻酸钠终体积为50μl。另外配备不添加15-脱氧精胍菌素3盐酸盐，添加2.5μg精胍菌素酸钠均不添加的PCR反应液作对照。
反应是98℃·5秒～68℃·90秒为1个循环，进行30个循环的高速PCR,PCR的总时间约65.5分钟。反应终止后取得样品8μl，进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。结果如表12所示。
表12精胍菌素类/酸性物质(添加量) 扩增结果15-脱氧精胍菌素/褐藻酸钠120μM/2.5μg ++++100μM/2.5μg ++++80μM/2.5μg +++60μM/2.5μg ++20μM/2.5μg +无添加/2.5μg +无添加/无添加 -
+～++++：用4个阶段表示扩增程度
- ：无扩增
如表12所示，添加了15-脱氧精胍菌素3盐酸盐和褐藻酸钠的反应体系能促进10kb的扩增反应，可以进行PCR总时间为65.5分钟的高速PCR。本实施例中，将模板DNA量从10pg增加到1ng时，即便不添加精胍菌素类和酸性物质，也能确认目的扩增产物。而使用1.25UTakara Taq、DNA聚合酶和1ng DNA模板在上述条件下进行PCR，得不到目的扩增产物。这表示通过添加酸性物质可进行更高性能的高速PCR。(2)以大肠杆菌基因组DNA为模板时，观察精胍菌素类和所酸性物质联用的效果。PCR反应液的组成如下所示。PCR反应液组成：
除5ng的大肠杆菌基因组DNA(宝酒造)，各10pmol的引物Eco-1和Eco-6之外，其余与实施例8(1)记载的PCR反应液组成相同。向上述PCR反应液中加入0.5μl的聚合酶A，再加2.5μg的褐藻酸钠和终浓度分别为1μM、5μM、或10μM的15-脱氧精胍菌素3盐酸盐，终体积为50μl。另外，配制不加15-脱氧精胍菌素3盐酸盐只加2.5μg褐藻酸钠的PCR反应液，以及不加15-脱氧精胍菌素3盐酸盐和褐藻酸钠的PCR反应液作对照。
反应是以98℃·5秒～68℃·3分为1个循环，进行30个循环，总时间约110分钟的高速PCR。反应终止后，取8μl所得样品进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。其结果如表13所示。
表13精胍菌素类/酸性物质(添加量) 扩增结果15-脱氧精胍菌素/褐藻酸钠10μM/2.5μg ++5μM/2.5μg ++1μM/2.5μg ++无添加/2.5μg ±无添加/无添加 -
++：可见到强扩增
+：可见到扩增
±：勉强看到
-：看不到
由表13可看出，添加了15-脱氧精胍菌素3盐酸盐和褐藻酸钠的反应体系能促进20KD的DNA扩增反应，可进行PCR总时间为110分钟的高速PCR。本实施例中，当模板DNA量由5ng增加到20ng时，即便不添加精胍菌素类及酸性物质也能扩增目的产物。另一方面，应用1.25U的Takara Taq、DNA聚合酶及1ng模板在上述PCR条件下进行PCR时，得不到目的产物。这表明，添加酸性物质可进行更高性能的高速PCR。
实施例9试剂盒的制备(1)使用聚合酶A或聚合酶B的试剂盒
构建本发明的高速PCR用的试剂盒(20次份)。试剂盒的组成如下所示：·10×反应缓冲液 50μl500mM Tris-醋酸(pH8.5)500mM醋酸钾30mM醋酸镁·2.5mM dNTP混合物 80μl(各2.5mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP)·DNA聚合酶液 10μl聚合酶A或聚合酶B
应用上述试剂盒制备PCR反应液。使用大肠杆菌基因组DNA作模板。PCR反应液组份如下所示。PCR反应液组成：
10×反应缓冲液 5μl
dNTP混合物 4μl
DNA聚合酶酶液 0.5μl
大肠杆菌基因组DNA 1ng
Eco-1引物 10pmol
Eco-2引物 10pmol
灭菌蒸馏水
终体积 50μl
用上述PCR反应液，按实施例2-(3)所示的PCR条件进行反应，可确认约2kbp的目的片段。(2)应用聚合酶A或聚合酶B且含酸性物质的试剂盒
构建本发明的高速PCR应用的试剂盒(20次份)。试剂盒的组成如下：·10×反应缓冲液 50μl500mM Tris-醋酸(pH8.5)500mM醋酸钾30mM醋酸镁25ng褐藻酸钠(100-150厘泊)·2.5mM dNTP混合物 80μl
(各2.5mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP)·DNA聚合酶酶液 10μl聚合酶A或聚合酶B
用上述试剂盒制备PCR反应液。使用λDNA作模板。PCR反应液组成如下。PCR反应液组份：
10×反应缓冲液 5μl
dNTP混合物 4μl
DNA聚合酶酶液 0.5μl
λDNA 1ng
λ1引物 10pmol
λ82引物 10pmol
灭菌蒸馏水
终体积 50μl
用上述PCR反应液按实施例7中所示的PCR条件进行反应后，可确认10kb的目的片段。(3)含聚合酶A或聚合酶B、酸性物质及精胍菌素类的试剂盒
构建本发明的高速PCR应用的试剂盒(20次份)。试剂盒组成如下所示：·10×反应缓冲液 100μl500mM Tris-醋酸(pH8.5)500mM醋酸钾30mM醋酸镁0.04％褐藻酸钠(100～150厘泊)1mM 15-脱氧精胍菌素3盐酸盐·2mM dNTP混合物 160μl(各2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP)·DNA聚合酶酶液 10μl聚合酶B浓缩液
用上述试剂盒制备PCR反应液，使用λDNA作模板。PCR反应液组成如下：
10×反应缓冲液 5μl
dNTP混合物 8μl
DNA聚合酶酶液 0.5μl
λDNA 10pg
λ1引物 10pmol
λ82引物 10pmol
灭菌蒸馏水
终体积 50μl
应用上述PCR反应液按实施例8-(1)所示PCR条件进行反应后可确认约10kbp的目的片段。
产业上利用的可能性
应用的可能性的DNA合成方法及DNA合成反应用的试剂盒可提供基因工程学领域内有用的高速PCR，可在与PCR相关的基因工程学研究、产业中发挥使操作高速度化的优良效果。另外，上述DNA合成方法、DNA合成反应用的试剂盒及本发明的PCR用试剂的制品在可使用PCR的所有领域中，对操作的高速化及活性化极为有用。再者，由于本发明可在短时间内获取多量的DNA扩增样品能制备大量的PCR产物。所以本发明可灵活用于以PCR方法为基础的基因诊断领域、基因诊断应用的DNA芯片制作等多方面。
序列表<110>宝酒造株式会社<120>DNA的合成方法<130>99-038-PCT<150>JP 10-254277<151>1998-9-8<150>JP 10-288534<151>1998-10-9<150>JP 10-289879<151>1998-10-12<150>JP 10-289880<151>1998-10-12<150>JP 10-361456<151>1998-12-18<160>14<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>1gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatg 35<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 25<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3gcgtaccttt gtctcacggg caa 23<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gatagctgtc gtcataggac tc 22<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5cttaaccagt gcgctgagtg act 23<210>6<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>6ttgccacttc cgtcaaccag gcttatca 28<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>7tgtccgtcag ctcataacgg tacttcacg 29<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>8atatctggcg gtgcaatatc ggtactgt 28<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>9gacaatctgg aatacgccac ctgacttg 28<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>10ggtggcgacg caaatgcaat cttcgttgcc ccaac 35<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>11ttatgtatgc cgcgtatcag cttcatgtct ggctc 35<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>12gagccagaca tgaagctgat acgcggcata cataa 35<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>13atcatctaac ctgttctgga aaacgcttgc gcagc 35<210>14<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>14tgcaaatact tctgcgccaa tgcggcattt gaagt 35
Claims (19)
1．DNA合成方法，它能缩短用聚合酶链式反应(PCR)合成DNA时所需的时间，其特征在于，在下面(A)和(B)中所示条件下进行PCR时，使用了有效量的DNA聚合酶，它能每50μl反应液扩增出超过10ng的约2kb的DNA片段：
(A)反应液：体积50μl，含有DNA聚合酶、1ng大肠杆菌基因组DNA、各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别示于序列表的序列号10和11中)，且含有适于该DNA聚合酶组分的反应液，以及
(B)反应条件：99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，进行35个循环的PCR。
2．权利要求1的DNA合成方法，其中使用了2种以上的DNA聚合酶。
3．权利要求2的DNA合成方法，其中应用了具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶和基本上不具有3′→5′核酸外切酶活性的其它DNA聚合酶。
4．权利要求1～3任一项的DNA合成方法，其特征在于，在酸性物质和/或其盐的存在下进行PCR。
5．权利要求4的DNA合成方法，其中酸性物质为酸性高分子物质。
6．权利要求5的DNA合成方法，其中酸性高分子物质为具有糖链骨架的物质。
7．权利要求5或6的DNA合成方法，其中酸性物质和/或其盐选自含硫酸岩藻糖多糖、硫酸葡聚糖、角叉茶胶、肝素、硫酸昆布多糖、硫酸软骨素、硫酸软皮肤素(硫酸软骨素B)、硫酸乙酰肝素、透明质酸、海藻酸、果胶、多聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚乙烯硫酸、聚苯乙烯硫酸、DNA及其盐中的至少一种。
8．权利要求1～7任一项的DNA合成方法，它是在选自精胍菌素类、其分解物及其盐的至少一种物质存在下进行PCR。
9．DNA合成用的试剂盒，它是权利要求1-8任一项的DNA合成方法中所用的试剂盒，其特征在于，按该试剂盒的说明书配制的PCR反应液包含有效量的DNA聚合酶，在下文(A)和(B)所示的反应条件下进行PCR时，它能使每50μl的反应液产生超过10ng的约2kb的扩增DNA片段：
(A)反应液：体积50μl，含DNA聚合酶，1ng大肠杆菌基因组DNA，各10pmol的引物Eco-1和Eco-2(引物Eco-1和Eco-2的碱基序列分别示于序列表的序列号10及11中)，且含有适于该DNA聚合酶的组分，以及
(B)反应条件：99℃、1秒～66℃、7秒为1个循环，进行35个循环的PCR。
10．权利要求9的DNA合成试剂盒，它含有2种以上的DNA聚合酶。
11．权利要求10的DNA合成试剂盒，它含有具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶和基本上不具有3′→5′核酸外切酶活性的其它DNA聚合酶。
12．权利9～11中任一项的DNA的合成试剂盒，其中按其说明书配制的PCR反应液是包含酸性物质和/或其盐的混合液。
13．权利要求12的DNA合成试剂盒，其中酸性物质为酸性高分子物质。
14．权利要求13的DNA合成试剂盒，其中酸性高分子物质是含有糖链骨架的物质。
15．权利要求13或14的DNA合成试剂盒，其中酸性高分子物质和/或其盐选自含硫酸岩藻糖多糖、硫酸葡聚糖、角叉茶胶、肝素、硫酸昆布多糖、硫酸软骨素、硫酸软皮肤素(硫酸软骨素B)、硫酸乙酰肝素、透明质酸、海藻酸、果胶、多聚谷氨酸、聚丙烯酸、聚乙烯硫酸、聚苯乙烯硫酸、DNA及其盐中的至少一种。
16．权利要求9～15任一项中的试剂盒，其中按该试剂盒的说明书配备的PCR反应液选自精胍菌素类，其分解物及其盐中的至少一种。
17．权利要求9～11任一项的DNA合成用试剂盒，其中按该试剂盒的说明书配制的PCR反应液是权利要求13～15任一项中的酸性物质和精胍菌素类或其分解产物及其盐的混合液。
18．PCR试剂制品，它是由包装材料和封入包装材料的PCR用试剂构成的，该PCR用试剂包括DNA聚合酶，附加到该包装材料的标记或说明书中表示前面的PCR试剂可用于短时间内的PCR。
19．权利要求18的PCR用试剂制品，其中PCR用试剂含有DNA聚合酶，和与其相适的缓冲液和/或dNTP。
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