WO2000014218A1 - Procede de synthese de l'adn - Google Patents

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WO2000014218A1
WO2000014218A1 PCT/JP1999/004815 JP9904815W WO0014218A1 WO 2000014218 A1 WO2000014218 A1 WO 2000014218A1 JP 9904815 W JP9904815 W JP 9904815W WO 0014218 A1 WO0014218 A1 WO 0014218A1
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dna
pcr
polymerase
dna polymerase
kit
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PCT/JP1999/004815
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Uemori
Yoshimi Sato
Mariko Okawa
Tomoko Fujita
Kazue Miyake
Osamu Takeda
Hiroaki Sagawa
Michio Hagiya
Hiroyuki Mukai
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Shuzo Co., Ltd.
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a DNA synthesis method that is useful in the field of genetic engineering and can reduce the time required for a polymerase reaction (PCR) method, and a kit and an article of manufacture used in the method.
  • PCR polymerase reaction
  • DNA synthesis is used for various purposes. Except for the chemical synthesis of short-chain DNAs such as oligonucleotides, most of them are carried out by enzymatic methods using DNA polymerase. Therefore, DNA polymerase has high value as a reagent for DNA sequencing, DNA labeling, and site-specific mutagenesis.
  • thermostable DNA polymerases have attracted attention, and various DNA polymerases suitable for the PCR method have been developed and commercialized. Furthermore, there is known a method that enables efficient DNA synthesis by using a combination of a plurality of DNA polymerases, which was impossible with a single DNA polymerase [Procedures of the National Academy] Abb. Science Inc. of the USA (Pro Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 91, pp. 5695-5699 (1994)].
  • the method comprises a DNA polymerase having a 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity (eg, a template DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus) and a DNA polymerase having no such activity [eg, A. aquaticus (Thermus aquaticus) -derived DNA polymerase (Taq DNA polymerase)]
  • a DNA polymerase having a 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity eg, a template DNA polymerase derived from Pyrococcus furiosus
  • a DNA polymerase having no such activity eg, A. aquaticus (Thermus aquaticus) -derived DNA polymerase (Taq DNA polymerase)
  • This method is used for CR, and is known as the LA-PCR method.
  • the yield of the amplified DNA is increased as compared with the conventional PCR using only one type of DNA polymerase.
  • Table A shows the most commonly used optimal PCR conditions.
  • the amplification time of each DNA was about 90 minutes for lkbp amplification, about 268 minutes for 10 kbp amplification, and about 478 minutes for 20 kbp amplification. finish
  • ⁇ DNA E. coli genomic DNA * 2 C 100 ng / 50 ⁇ 1 (PCR reagent solution)
  • this PCR method Due to its ability to amplify trace amounts of DNA in millions of times in a short time, this PCR method has applications in all research, testing, and clinical fields, including medicine and agriculture, and particularly in infections such as cancer and AIDS. It is effective in genetic diagnosis of illness. In civilian life, its applications are expanding, including confirmation of criminal and parent-child relationships by genetic diagnosis, and detection of harmful bacteria in foods.
  • An object of the present invention is to provide a DNA synthesis method, a kit used for the synthesis method, and a manufactured product for performing a high-speed PCR in a shorter time than the conventional PCR.
  • the first invention of the present invention is a DNA synthesis method in which the time required for DNA synthesis by the polymerase chain reaction (PCR) method is shortened, and the PCR method is carried out under the following conditions (A) and (B).
  • a DNA synthesis method characterized by using an effective amount of DNA polymerase to give an amplified DNA fragment of about 2 kb in excess of 10 ng per 50 a of a reaction solution when the reaction is performed.
  • A Reaction solution: DNA polymerase, 1 ng of E. coli genomic DNA, 1 Opmol of each primer Eco-1 and Eco-2 (base sequences of primers Eco-1 and Eco-2 are listed in the sequence listing, respectively) Nos. 10 and 11) and having a composition suitable for the DNA polymerase and having a volume of 501.
  • a second invention of the present invention relates to a kit used in the DNA synthesis method of the first invention of the present invention, wherein the PCR reagent solution prepared according to the instructions for the kit comprises the following (A) and When PCR is performed under the conditions shown in (B), an amount of DNA polymer that is effective to give an amplified DNA fragment of about 2 kb exceeding 10 ng per 50 I of reaction solution —Kit for DNA synthesis characterized by containing ze:
  • A Reaction solution: DNA polymerase, 1 ng of Escherichia coli genomic DNA, 1 Opmol of each of the primers Eco-1 and Eco-2 (base sequences of primers Eco-1 and Eco-2 are shown in SEQ ID NO: 10 and 11), and having a composition suitable for the DNA polymerase and having a volume of 50;
  • a third invention of the present invention is an article of manufacture comprising a packaging material and a PCR reagent enclosed in the packaging material, wherein the PCR reagent contains a DNA polymerase and is attached to the packaging material.
  • a label or a label attached to a packaging material indicating that the PCR reagent can be used for PCR in a short time.
  • the DNA synthesis method of the present invention is a DNA synthesis method in which the time required for DNA synthesis by the PCR method is shortened, that is, a high-speed PCR, when PCR is performed under the conditions shown in (A) and (B) below.
  • the use of an effective amount of DNA polymerase to give an amplified DNA fragment of about 2 kb in excess of 10 ng per reaction 501 is characterized by:
  • A Reaction solution: DNA polymerase, 1 ng of Escherichia coli genomic DNA, 1 Opraol primer each Eco-1 and Eco-2 (base sequences of primers Eco-1 and Eco-2 are shown in SEQ ID NO: And a reaction solution having a volume of 50 a1 having a composition suitable for the DNA polymerase, and
  • the DNA synthesis method of the present invention since an “effective amount of DNA polymerase” is used, the time required for a complementary synthesis reaction (extension step) of a DNA fragment having a fixed length can be significantly reduced. That is, the time required for one cycle of the reaction can be reduced. As a result, an excellent effect of amplifying a target DNA fragment in a shorter time than ever before, that is, enabling high-speed PCR in which the total time required for PCR is reduced, is exhibited.
  • “effective amount of DNA polymerase” means 1 ng of E. coli genomic DNA, 1 Opmol of each of primers Eco-1 and Eco-2 (base sequences of primers Eco-1 and Eco-2, respectively).
  • it means an amount of DNA polymerase having an activity sufficient for an amount of about 2 kb DNA fragment to exceed 10 ng per 50 reaction liquids. Therefore, the amount of protein is not limited as long as the amount of DNA polymerase under which PCR can be performed under these conditions. By using this effective amount of DNA polymerase, the PCR can be accelerated.
  • the “Escherichia coli genomic DNA” described in the present specification is, for example, from Escherichia coli JM109 (Escherichia coli J109), co-authored by Yoshiyuki Kuchino, Hisamaru Hirai, and Ikunosuke Sakuragi, 1987, published by Soft Science Inc. And genomic DNA prepared by the method described in “Gene“ Protein experimental manipulation blotting ””. Details of the preparation method are also described in Bio View, No. 13, pages 6 to 5 (issued by Takara Shuzo in 1994). Further, the genomic DNA can be obtained from Takara Shuzo as a genome DNA set for LA PCR TM .
  • the composition of the reaction solution may be a reaction solution having a composition suitable for the DNA polymerase to be used.
  • composition suitable for DNA polymerase refers to the optimal type of buffer, optimal pH, optimal salt concentration (such as magnesium salt), It means a composition that gives optimal conditions such as optimal dNTP concentration, optimal primer amount, and other additives.
  • the enzyme activity unit of the DNA polymerase is expressed using the ability to catalyze the incorporation of a nucleotide (eg, labeled dNTP) into type I DNA as an index.
  • a nucleotide eg, labeled dNTP
  • Such an activity measurement method is described, for example, in 1966, published by DR Harper & Row, edited by Cantoni GL, Procedures in Nucleic Acids Research, p. 264, DNA polymerase from Escherichia coli. (DNA Polymerase from Escherichia coli, by Richardson C.).
  • Taq DNA polymerase which is a DNA polymerase derived from Thermus aquaticus, by the method.
  • Type I DNA activated salmon sperm DNA
  • Reaction solution composition 25 mM TAPS (pH 9.3 at 25 ° C), 50 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, ImM-mercaptoethanol, 200 M each of dATP, dGTP and dTTP, and 100 mM M [Hiichi 32 P] dCTP, total amount 50 ⁇ 1;
  • (c) Activity measuring method A sample containing Taq DNA polymerase is added to the reaction solution having the composition of (b) containing the type I DNA of (a), and the mixture is incubated for 10 minutes at 74, followed by incubation in the reaction solution. The acid-insoluble substance is recovered, and the radioactivity contained in the acid-insoluble substance is measured.
  • the activated salmon sperm D ⁇ ⁇ used for the activity measurement method is prepared as follows.
  • UV UV 26 of DNA before the above enzyme treatment The absorbance (A 26. Control) and A 26 obtained above 4. Samples were measured to calculate the degradation rate (A 26. Sample) / (A 26. Control) X 1 00 (%).
  • an enzyme-treated DNA having a decomposition rate of preferably about 3% to about 9%, and more preferably about 4.5% to 7.5% can be used as a substrate for measuring the uptake activity. .
  • the DNA polymerase activity measured by the above-mentioned method that is, one unit (hereinafter simply referred to as 1 U) of dNTP uptake activity to DNA (hereinafter simply referred to as dNTP uptake activity) is defined as “ It is defined as the amount of enzyme J that can incorporate 1 Onmol of dNTP into an acid-insoluble substance per 30 minutes.
  • Table B shows an example of the high-speed PCR of the present invention. By comparing Table A and Table B, The time reduction effect of the high-speed PCR of the invention is clear. According to the present invention, high-speed PCR with a reduced total PCR time is provided.
  • Type I DNA E. coli genomic DNA [100 ng / 50/1 (PCR reagent solution)]
  • polymerase II uses 5UZ501 (PCR reagent solution) DNA polymerase as the dNTP uptake activity.
  • 5UZ501 PCR reagent solution
  • E. coli genome DNA is the same as in Table A.
  • the dNTP uptake activity shown in Table A was 1%.
  • the effective amount of the DNA polymerase activity unit used in the present invention shows a higher activity unit in dNTP incorporation activity than the prior art, but the activity unit represented by the PCR performance, that is, the amplification product in the PCR process.
  • the activity unit represented by the comparison of the amounts (PCR effect ratio) is equivalent to the conventional technology.
  • Embodiments of the DNA synthesis method of the present invention include a method using one kind of DNA polymerase, a method using two or more kinds of DNA polymerases, and a method using two or more kinds of DNA polymerases.
  • 3 ' ⁇ 5' A method using a DNA polymerase having exonuclease activity and another DNA polymerase having substantially no 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity (see above-mentioned Proceedings of the National Academy of Sciences). (Science of the USA), a method using two or more DNA polymerases having 3 'to 5' exonuclease activity, a method using a template DNA polymerase and a non-type non-pol I type DNA polymerase And the like.
  • another DNA polymerase having substantially no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity includes a DNA polymerase or a naturally occurring DNA polymerase having no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity. Includes DNA polymerase that does not express the 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity by artificially modifying the functional part involved in the expression.
  • the amount of DNA polymerase used in the present invention is determined according to the instructions attached to a commercially available enzyme or kit for use in a standard PCR method.
  • the amount exceeds the amount of DNA polymerase used as standard.
  • an amount effective for reducing the time required for the operation may be used.
  • the amount of the DNA polymerase used in the present invention is preferably used for the conventional PCR in the dNTP incorporation activity display from the viewpoint of sufficiently exhibiting the effect of shortening the time required for the operation.
  • the amount is at least twice the amount of the enzyme used, more preferably at least four times, and from the same viewpoint, preferably at most 30 times, more preferably at most 20 times. desirable.
  • an effective amount of each enzyme may be used, and the amount of two or more DNA polymerases or any one of the enzymes is regarded as an effective amount. May be used.
  • PCR conditions with reduced time were used so that amplification of the target DNA fragment could not be confirmed by general agarose electrophoresis etc. with the amount of DNA polymerase used in conventional PCR.
  • the “effective amount of DNA polymerase” may be determined, for example, as follows. Specifically, PCR is performed on any type I DNA under standard PCR conditions (standard conditions) such as the amount of enzyme and temperature profile that are typically used for amplification of the type II DNA.
  • the amount of enzyme or more can be used for the high-speed PCR of the present invention. It can be determined as an effective amount of DNA polymerase used.
  • ⁇ amplification product amount '' for example, a fixed amount of sample obtained after PCR is subjected to electrophoresis, and the gel after electrophoresis is stained with ethidium-mide or the like to visualize the band derived from the amplification product. Then, using a device capable of quantifying the amount of DNA fragments contained in the band separated on the gel, such as an image analyzer (Image Analyzer I) or a densitometer, the intensity of the fluorescence derived from the band is used. Can be quantified by measuring Further, the amplification product in the sample may be purified and then quantified by a known DNA quantification method.
  • the set step reaction time is not particularly limited as long as it is shorter than the reaction time under standard conditions and shows an enzyme activity represented by equivalent PCR performance. Absent.
  • the reaction time of all the steps that is, the total PCR time is 1/2 to 1/4 or less of the conventional total PCR time.
  • the total PCR time is 1/2 to 1/4 or less of the conventional total PCR time.
  • the total PCR time is 2Z9 in the past.
  • 2 kbp amplification one cycle required about 9 minutes in the past.
  • the cycle can be about 1.8 minutes, and the total PCR time is about 1/5 of the conventional time.
  • the total PCR time is about 1 / It becomes 5.
  • the amplified fragment could not be confirmed with the naked eye, and the amount of the amplified product quantified by a high-sensitivity image analyzer was 1 Ong or less.
  • the ⁇ effective amount of DNA polymerase '' defined in the present invention is used, amplified fragments can be confirmed by agarose electrophoresis even under the above conditions, and the amount of the amplified product is more than 1 ng. .
  • the DNA polymerase that can be used in the DNA synthesis method (that is, high-speed PCR) of the present invention is not particularly limited.
  • Pol I type DNA polymerase E. coli DNA polymerase I, Klenow fragment, Taq DNA) Polymerase, etc.
  • type DNA polymerase [the above-mentioned Pyrococcus furiosus-derived DNA polymerase, Thermococcus litralis-derived DNA polymerase (VENT DNA polymerase), pyrococcus sp. K0D1 (Pyrococcus sp. K0D1) -derived DNA polymerase (KOD DNA polymerase), Pyrococcus sp. GB-D (Pyrococcus sp.
  • GB-D GB-D -derived DNA polymerase (DEEP VENT DNA polymerase), etc.)
  • Non-porous non-pol type I DNA polymerases both Pol I type DNA polymerase and template DNA polymerase have their amino acids. It refers to a group of enzymes classified based on sequence homology, and their amino acid sequence characteristics are described in Nucleic Acids Research, Vol. 15, pp. 4045-4057 (1991).
  • the non- ⁇ non-pol I type DNA polymerase includes, for example, Pyrococcus florosa-derived DN DN polymerase described in WO 97/24444.
  • the DNA polymerase that can be used in the method of the present invention is not limited to one kind of DNA polymerase, and two or more kinds of DNA polymerases, for example, DNA having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity
  • a polymerase and a DNA polymerase having substantially no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity can be mixed with other DNA polymerases and used as a DNA polymerase composition.
  • the mixing ratio of both enzymes may be a mixing ratio suitable for the high-speed PCR of the present invention depending on the type of both enzymes, and is not particularly limited, and a DNA polymerase having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity It may be used in a ratio of 9: 1 to 1: 500 with another DNA polymerase having no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity.
  • a DNA polymerase having 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity It may be used in a ratio of 9: 1 to 1: 500 with another DNA polymerase having no 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity.
  • Takara Ex Taq DNA polymerase (Takara Shuzo) can be suitably used.
  • PCR involves three steps: dissociation (denaturation) of double-stranded ⁇ DNA into single strand, annealing of primer to single-stranded ⁇ DNA, synthesis of complementary strand from primer (elongation)
  • the amplification of DNA is performed by the reaction.
  • the "Shuttle PCR" [The Forefront of PCR Method], "Protein Nucleic Acid Enzymes", separate volume, Vol. 41, No. 5, pp. 425-428 (1996)] DNA amplification is also performed in a two-step reaction in which the annealing and extension reactions are performed at the same temperature. Since the DNA synthesis method of the present invention can particularly reduce the time required for the above-mentioned extension step, the time required for the entire synthesis reaction can be reduced in both the three-step reaction and the two-step reaction. .
  • the DNA synthesis reaction More efficient DNA synthesis can be achieved by performing a DNA synthesis reaction in the presence of a substance that has an activity to promote the DNA synthesis activity of polymerase, that is, a substance that further enhances high-speed PCR. it can.
  • One of the substances that further improve the performance of the high-speed PCR is a substance having a negative charge in electric charge or a salt thereof, and among them, an acidic substance or a salt thereof.
  • the details of the function of an effective amount of an acidic substance and / or a salt thereof, for example, an acidic substance having a sugar chain skeleton, etc. are unknown.
  • an effective amount of DNA polymerase is used, excess DNA polymerase is trapped by acidic substances during the DNA synthesis reaction. By being supplied, it will be a high-performance, high-speed PCR.
  • the action of the acidic substance or its salt to promote the DNA synthesis activity can be examined based on the length of a newly synthesized DNA chain per unit time or the amount of amplification product in PCR.
  • the acidic substance or a salt thereof is used in an amount effective to exert its action.
  • the effective amount may be, for example, an amplification product obtained when PCR is performed using a reaction solution to which various amounts of the above-described acidic substances or salts thereof are added, and an amplification product obtained when PCR is performed without adding the same. Can be compared and examined.
  • the amount of the amplification product can be determined, for example, by subjecting a fixed amount of the reaction solution after PCR to electrophoresis, staining the gel after electrophoresis with ethidium amide, and measuring the fluorescence intensity of the band derived from the amplification product using an imaging analyzer. It can be quantified by measuring using one or the like.
  • the acidic substance having an action of promoting the DNA synthesis activity is not particularly limited, and for example, an acidic high molecular substance such as an acidic polysaccharide can be used.
  • the acidic substance also includes a salt of the acidic substance as long as it has an action of promoting DNA synthesis activity.
  • acidic polysaccharides examples include fucose sulfate-containing polysaccharides, dextran sulfate, carrageenan, heparin, heparan sulfate, rhamnan sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate (chondroitin sulfate B), and the like.
  • examples include sulfated polysaccharides containing a sulfate group, and polyperonic acids such as hyaluronic acid, alginic acid, and pectin.
  • sulfated-fucose-containing polysaccharide for example, sulfated-fucose-containing polysaccharide-F or sulfated-fucose-containing polysaccharide-U can be used.
  • the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F is described, for example, by the method described in International Patent Publication No. 977Z286689 pamphlet or described in International Publication No. 97/472708 pamphlet.
  • sulfated-fucose-containing polysaccharide substantially free of peronic acid obtained from a brown alga plant or the like by the method of
  • the sulfated-fucose-containing polysaccharide-U refers to a sulfated-fucose-containing polysaccharide containing peronic acid obtained by the method described in the pamphlet.
  • the salt of the acidic substance is not particularly limited as long as it has an action of promoting DNA synthesis activity, but a water-soluble salt is preferable.
  • alkali metal salts such as dextran sulfate sodium, sodium alginate, sodium sodium polyglutamate, sodium heparin, potassium dextran sulfate, and lithium heparin.
  • the acidic substance may be, for example, a natural substance or a chemically or enzymatically synthesized substance as long as it retains the action of promoting DNA synthesis activity.
  • the acidic substance may be any of an unpurified substance, a partially purified substance, and a purified substance containing the acidic substance.
  • appropriate modifications have been made to the extent that they retain the action of promoting DNA synthesis activity. Is also good.
  • the acidic substance used in the present invention has a function of promoting DNA synthesis activity, the molecular weight of the acidic substance is suitable for exerting an action of promoting DNA synthesis activity.
  • a substance obtained by performing the decomposition operation as described above may be used, or a substance obtained by further performing a molecular weight fractionation after the decomposition operation may be used.
  • an acidic substance having a molecular weight of several thousands or more can be preferably used. Furthermore, these substances can be used alone or in combination.
  • the acidic substance having an action of promoting the DNA synthesis activity is added for the purpose of efficiently exhibiting the activity of the DNA polymerase in the high-speed PCR of the present invention or maintaining the activity.
  • the addition amount may be optimized according to the type of the acidic substance, and 0.1 ng to 100 g, preferably 1 ng to 1 g, per reaction liquid 501 may be added.
  • the action of the acidic substance is not particularly limited, but by holding DNA polymerase on the molecule, the non-specific interaction of DNA polymerase with type I DNA can be suppressed, It is thought to be based on providing an optimal amount of DNA polymerase for type I DNA.
  • the DNA synthesis reaction proceeds efficiently. Further, the effect of the amplification region and the base sequence of the primer is reduced, and the amplification product can be obtained stably.
  • the DNA polymerase whose acidic substance promotes its activity is not particularly limited, and can be applied, for example, to the DNA synthesis method of the present invention using the above-described various DNA polymerases.
  • spargins and Z or a salt thereof may be added to and used in a PCR solution for the purpose of efficiently exhibiting the activity of DNA polymerase in the high-speed PCR of the present invention or maintaining the activity. it can.
  • Spagarins having an activity of promoting DNA synthesis activity are not particularly limited. However, for example, the following general formula (I):
  • Gu represents a guanidino group
  • R represents a hydrogen atom or a methyl group
  • spargulins for example, 15-dexoxyspargarine (15-deoxysperganol) or a salt thereof, in which R in the general formula (I) is a hydrogen atom, is preferable.
  • the salt of the spargulin may be a salt with an inorganic acid or a salt with an organic acid, as long as it can exert a DNA polymerase activity promoting action.
  • the above spargins are derivatives of spargin isolated from Bacillus-producing bacteria, and are known to have antitumor activity, immunopotentiating activity, and immunosuppressive activity depending on the type of derivative. (JP-A-58-62152, JP-A-6-112919, JP-A-64-90164). Therefore, these spargins can be easily purified by a known method, or synthesized and prepared by a known method.
  • the spargins may be natural or chemically or enzymatically synthesized as long as they retain Sakugawa that promotes DNA synthesis activity.
  • the spagharis may be unpurified, partially purified or purified products containing the same. Further, the spargins are suitable as long as they have an action of promoting DNA synthesis activity. It may be a modified product or a degraded product. Further, these substances can be used alone or as a mixture.
  • the degradation product of spagarins is not particularly limited as long as it has a function of promoting DNA synthesis activity.
  • sodium hydroxide is used under strong alkaline conditions.
  • examples include substances generated by hydrolysis at room temperature and substances generated by hydrolysis under heating, such as a buffer solution for PCR, under weak conditions.
  • the substance produced by the hydrolysis under the above-mentioned conditions is not particularly limited, but when the 15-dexoxyspargarine compound represented by the above general formula (I) is used, for example, the following general formula (II):
  • the decomposed product of the spargin may be a salt of the decomposed product of the spargin if it has a function of promoting DNA synthesis activity. Is also included.
  • the amount of the spagarins used is not particularly limited as long as it can exert the action of promoting DNA synthesis activity, but the type and amount of type I DNA to be used, the length of the region to be amplified, the DNA polymerase It is sufficient that the amount is such that the optimum concentration is obtained according to the type. For example, in the case of 15-dexoxysparingine trihydrochloride, it may be added so that the final concentration is 0.1 M to 500 M, preferably 20 M to 100 M.
  • the action of the spargins of the present invention is not particularly limited, the action of the DNA polymerase to exert its activity efficiently or to suppress the nonspecific interaction of the enzyme with DNA by retaining the DNA polymerase is provided. It is thought that there is. In addition, it is thought that it acts on the complex of type I DNA and the primer to facilitate the primer extension reaction.
  • the two may react to form a salt, but may be any substance that retains the action of promoting DNA synthesis activity.
  • a salt may be any substance that retains the action of promoting DNA synthesis activity.
  • the spargin or the salt thereof, and the mixture of the substance having a negative electric charge or the salt thereof and the spargin or the salt thereof can be used as a DNA synthesis activity promoter.
  • kits of the present invention high-speed PCR becomes possible.
  • a kit is not particularly limited as long as it is a kit used for a reaction involving DNA synthesis by the PCR method, and a high-speed PCR kit for performing a DNA synthesis reaction in a test tube is available. No.
  • the kit of the present invention is a kit used for in vitro DNA synthesis, wherein a PCR reagent solution prepared according to the kit instructions is used in the DNA synthesis method described in (1) above.
  • Amount of DNA polymerase '' i.e., 1 ng of Escherichia coli genomic DNA, each containing 1 Opmol of primers Eco-1 and Eco-2, and using a reaction solution with a volume of 501 suitable for the DNA polymerase Effective when the amount of about 2 kb DNA fragment per reaction solution exceeds 10 ng per 35 cycles of PCR with 1 cycle of 1 second to 66 ° C and 7 seconds. Contains significant amounts of DNA polymerase.
  • the PCR reagent solution prepared using the kit of the present invention is not particularly limited, for example, a DNA polymerase for high-speed PCR having a dNTP incorporation activity of 4 to 10 U in a 50/1 reaction solution can be used.
  • a DNA polymerase for high-speed PCR having a dNTP incorporation activity of 4 to 10 U in a 50/1 reaction solution can be used.
  • it contains Ex Taq DNA polymerase.
  • the composition of the reagent solution a reagent solution having a composition suitable for the DNA polymerase to be used is used.
  • kits are printed materials that describe how to use the kit, for example, how to prepare PCR reagents, recommended reaction conditions, etc., as well as instruction manuals in pamphlet or leaflet format. , Includes the label attached to the kit and the one described on the package containing the kit. It also includes information disclosed and provided through electronic media such as the Internet. For the preparation of the PCR reagent solution, use a kit or an electronic medium such as the Internet attached with an instruction that instructs the use of the above DNA polymerase amount and the addition of Z or the above acidic substance or its salt. Throughout this, kits that disclose and provide the method of the present invention are also included in the kit of the present invention.
  • the kit may contain an acidic substance or a salt thereof having an action of promoting the DNA synthesis activity of DNA polymerase.
  • the acidic substance or a salt thereof those described in the above (1) can be used.
  • Such an acidic substance or a salt thereof can exhibit the DNA polymerase activity efficiently or can appropriately regulate the interaction between DNA and the enzyme by retaining the enzyme. The performance of the kit is further improved.
  • At least one selected from the group consisting of spargins, their degradation products and salts thereof may be contained.
  • the two may react to form a salt, but any substance may be used as long as it retains the action of promoting the DNA synthesis activity.
  • the DNA polymerase contained in the present invention is not particularly limited, and includes the various DNA polymerases for high-speed PCR shown in the above (I).
  • the kit may contain, for example, reagents necessary for the reaction of DNA polymerase, such as dNTP, magnesium chloride, and a buffer component for keeping the reaction solution at an appropriate pH.
  • reagents necessary for the reaction of DNA polymerase such as dNTP, magnesium chloride, and a buffer component for keeping the reaction solution at an appropriate pH.
  • the DNA polymerase, acidic substance, and other reagents may be contained in the kit as independent components or in a state where some of them are combined, for example, added to a reaction buffer or the like. .
  • kits of the present invention in addition to the above DNA polymerase, various components required for DNA synthesis by PCR method, such as dNTP, magnesium chloride, a buffer component for maintaining the reaction solution at an appropriate pH, etc. And compositions comprising the same. Further, the composition may contain the above-mentioned acidic substance. Such a composition should be prepared so that a reaction solution can be prepared by adding a primer for amplifying the desired DNA fragment and type I DNA, and then adding water or a buffer, if necessary. Can be. Furthermore, when the DNA fragment to be amplified by the kit is determined, the composition may include a primer suitable for amplifying the fragment. By using such a composition, the DNA synthesis reaction, that is, high-speed PCR can be performed extremely simply and quickly.
  • the kit of the present invention when applied to PCR and other operations such as sequencing using DNA, DNA labeling, cDNA synthesis, and site-directed mutagenesis, has the excellent effect of reducing the time required for the operation. I do.
  • the time required for amplification of DNA of the same length is shorter than that of the conventional PCR or LA-PCR method. Therefore, DNA can be amplified even under high-speed PCR conditions, which was not possible with conventional methods.
  • the kit of the present invention can reduce the time required for the entire amplification reaction, so that it can be used for gene diagnosis based on PCR, for example, to perform genetic diagnosis in a shorter time. Demonstrates excellent effects.
  • the article of manufacture of the high-speed PCR reagent of the present invention is a product comprising a packaging material and a PCR reagent enclosed in the packaging material, wherein the PCR reagent contains a DNA polymerase, and the packaging material contains This is a manufactured product whose label or the instruction attached to the packaging material indicates that the PCR reagent can be used for PCR in a short time.
  • the PCR reagent may contain a DNA polymerase, a buffer suitable for the DNA polymerase, and / or dNTP. Therefore, those skilled in the art can easily perform the high-speed PCR of the present invention according to the label displayed on the product and the instruction for use attached to the product. It is useful in various industrial fields that require R.
  • the time required for the entire amplification reaction is about one-half that of the conventional one, and for a DNA of about 20 kb, It was shortened to about 1 to 5, respectively, and the first speedup of PCR became possible.
  • the method of the present invention exerts an excellent effect that, for example, a gene diagnosis method or the like can be performed in a shorter time by using the method for a gene diagnosis method based on a PCR method. This method is particularly suitable for nested PCR in which two PCRs are performed.
  • the high-speed PCR of the present invention is extremely useful in the development and manufacture of technologies that require a large amount of PCR operation, such as DNA chips.
  • the DNA chip has about 1000 kinds of DNA immobilized on a thumb-sized glass chip.
  • it is necessary to amplify and prepare a DNA requiring a spot by PCR, and the number of necessary PCR operations is enormous. For example, assuming that 10,000 such DNA chips are made, the conventional PCR requires only about three months for the PCR operation alone, whereas the high-speed PCR of the present invention takes about three weeks. It can be manufactured in a short time.
  • the high-speed PCR of the present invention can perform PCR using a conventional PCR device without using a special device, and the high-speed PCR of the present invention has excellent speed and reactivity. This is an extremely useful technique for high-sensitivity PCR.
  • the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the scope of the examples.
  • the activity of commercially available DNA polymerases The results are shown based on the units indicated in the “dNTP uptake activity” described in the instructions.
  • the reaction solution containing a commercially available enzyme was prepared according to the instructions for each enzyme unless otherwise specified, or was prepared using the attached reaction buffer. Unless otherwise specified, PCR was carried out using Evening PCR Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo).
  • primers ⁇ 1 to I5 and ⁇ 7 to I10 were synthesized based on the DNA base sequence.
  • the nucleotide sequences of the primers ⁇ 1 to ⁇ 5 and primers 8 to 110 are shown in SEQ ID NOs: 1 to 8 in the sequence listing, respectively.
  • the nucleotide sequence of I7 is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • Table 1 shows the chain length of the amplified DNA fragment amplified by the PCR in which ⁇ is changed to ⁇ by combination of these primers.
  • a concentrated sample was prepared using evening dye EX Taq DNA polymerase at a concentration of 5 UZ ⁇ 1.
  • a sample having a concentration of 10 UZ1 (referred to as polymerase A) and a sample having a concentration of 2 OUZ / zl (referred to as polymerase B) were prepared and used in the following Examples.
  • DNA polymerase typically uses 1.25 U per 501 PCR reagents. This time, we changed the amount of DNA polymerase and examined high-speed PCR. P containing ADNA as type ⁇ , primer as primer pair; I 1 and; 4
  • a CR reagent solution was prepared and PCR was performed.
  • the composition of the PCR reagent solution is shown below.
  • the reaction was performed at a high speed PCR of 35 cycles for a total time of about 31.5 minutes, with one cycle consisting of 98 ° C, 5 seconds to 66 ° C, and 10 seconds.
  • the obtained sample 51 was subjected to electrophoresis in a 1% agarose gel containing 0.0005% of ethidium ore, and a target amplified fragment of about 2 kb was confirmed.
  • the PCR was performed in fast mode under the temperature conditions shown in Table 4 using the evening color PCR Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo). After completion of the reaction, 5 l of each sample obtained was electrophoresed on a 1% agarose gel containing 0.0005% of ethidium ore-mide to confirm amplified fragments. The results are shown in Table 4.
  • Example 2 Among the high-speed PCR experiments shown in (2), the amount of the amplified fragment of a DNA fragment of 2 kb amplified was quantified.
  • KOD dash DNA polymerase manufactured by Toyobo
  • the amount of enzyme used per 50 a of PCR reagent solution should be 2.5 U, 5 U or 10 U, which is the standard amount of enzyme used as described in the product.
  • the same procedure was used for the increased PCR reagent solution.
  • the high-speed PCR was performed at 99 ° C. for 1 second to 66 for 35 cycles, each cycle consisting of 7 seconds. PCR was performed in fast mode using evening color PCR (Saimaru Cycler Personal) (Takara Shuzo). Table 5 shows the standard values of the thermal cycler in fast mode.
  • Cool rate Maximum cooling rate when cooling from 94 ° C to 40 ° C ⁇ 1.5.
  • C / s Over temp block n'y Indicates how many times the work temperature has risen above the set temperature and has stabilized ⁇ 1.0 ° C
  • Under temp Shows how many times the work temperature has dropped below the set temperature and has stabilized ⁇ 2.0 ° C
  • one cycle step required about 45 seconds, and the total PCR time was about 25.7 minutes.
  • each sample 81 was subjected to electrophoresis on a 1-agarose gel containing 0.005% ethidium ore, and the amplified fragment was confirmed.
  • a PCR reagent solution containing no sodium alginate was prepared from the PCR reagent solution for polymerase A used in Example 2- (2), and high-speed PCR was performed using polymerase A under the above reaction conditions. It was confirmed that an amplified fragment in an amount exceeding 10 ng was obtained.
  • Yukara EX Taq DNA polymerase is described in the instruction manual etc. 1. High-speed PC required to obtain the same amount of amplified product using polymerase A, based on the basic protocol conditions using 25U / 50/1 (PCR reagent solution) EX Taq DNA polymerase. The total PCR time of R was studied for three commercially available thermal cyclers.
  • the basic protocol conditions are the conditions described in p. 6 for 20 kb amplification, and those described in p. 6 for Takara Shuzo Co., Ltd. (May 1998 version).
  • the conditions of the evening LA Ta qDNA polymerase described on page 8 in the instruction manual attached to Ver. 2.1 (Takara Shuzo) were set as a reference.
  • Thermal cyclers include Yukara PCR Samarucycla MP (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., MP in Table 7), Yukakara PCR Thermo Marucycler Personal (Takara Shuzo Co., Ltd., refer to PP in Table 7), Gene Three units of amplifier measuring system 9600 (manufactured by Perkin-Elma Co., Ltd., 9600 in Table 7) were used.
  • the amount of amplification product was compared when PCR was performed using Taq DNA polymerase and polymerase A under appropriate reaction conditions.
  • the amount of the product of about 500 bp amplified using ⁇ as the ⁇ type and primers; 1 and; I2 as the primer pair.
  • a) Evening Taq DNA polymerase reaction system Using the TaKaRa PCR Amplification Kit, according to the instruction manual of the kit, lng or 100 pg of ADNA using the attached reaction buffer, Primer with 10 pmo 1 each; I 1 and; 12, 1.25 U evening color Taq DNA polymerase, final volume containing 0.2 mM each of dATP, dCTP, d GTP and d TTP 50 II 1 PCR reagent solution was prepared.
  • the thermal cycler used a PCR system 9600. The reaction was performed at 94 ° C, 30 seconds to 55, 30 seconds to 72, and 30 seconds, one cycle, and 25 cycles at a setting of about 167 seconds per cycle.
  • the sample 81 was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel containing 0.0005% ethidium promide to confirm an amplified fragment. Further, the amount of the amplified product was quantified using a known amount of DNA molecular weight as a control while adjusting the detection sensitivity using an image analyzer FM-BIII. This quantitative value was calculated as described in 1.
  • the amount of amplification product was larger when 1 ng of 1 ng; type 1 DNA was used for both enzymes.
  • extension reaction time was 30 seconds
  • extension reaction time of 5 seconds at 72 ° C. was sufficient for the polymerase A reaction system.
  • the sulfated-fucose-containing polysaccharide mono-F used in the following Examples was all purified by the following method.
  • An example of preparing sulfated-fucose-containing polysaccharide-F is shown below. After thoroughly drying the gagome kelp, the gagome kelp with a dry weight of 20 kg was crushed. Then, the obtained dry powder was suspended in 900 liters of tap water containing 7.3 kg of calcium chloride dihydrate, and the temperature was raised to 90 ° C. over 40 minutes with stirring. , 90 ° C to 95 ° C, and extraction was performed for 1 hour. Thereafter, the obtained solution was cooled to 20 ° C, the stirring was stopped, and the solution was left overnight to obtain an extract.
  • a 20 mM sodium acetate equilibration buffer containing 0.2 M calcium chloride (pH 6.0) Dialysis was performed. The dialyzed solution was applied to a 350 ml DEAE-Sepharose FF column (column inner diameter: 9.7 cm) equilibrated with 10 liters of the above equilibration buffer, and washed with 5 liters of the equilibration buffer. Next, elution was performed under the following three gradient conditions.
  • the eluate was collected at 250 ml per fraction.
  • sugar was determined by the phenol-sulfuric acid method, and peronic acid was determined by the rubazole-sulfuric acid method.
  • fractions Nos. 40 to 53 which are high in sugar content and low in peronic acid, were obtained.
  • the fractions of fraction Nos. 40 to 53 are referred to as sulfated-fucose-containing polysaccharide-F fractions.
  • the sulfated-fucose-containing polysaccharide mono-F fraction was concentrated with a 100,000 ultrafiltration membrane, dialyzed with 5 OmM sodium citrate, and further dialyzed overnight with distilled water.
  • the sulfated-fucose-containing polysaccharide-F obtained by the method described in Example 5 (1), dextran sulfate powder (manufactured by ONCO) or sodium alginate (100 to 150 centipoise, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ) was used to examine the effects of these on the activity of Kara Taq DNA polymerase (Takara Shuzo).
  • PCR was performed by preparing a PCR reagent solution containing IDNA, primers ⁇ 1 and s7 as a primer pair, and Yukari Taq DNA polymerase as a DNA polymerase.
  • the PCR reagent solution was prepared to have the following composition.
  • PCR reagent composition :
  • the reaction was performed at 98 ° C., 5 seconds to 68 ° C., 3 minutes, 1 cycle, 30 cycles, total PCR time, about 110 minutes.
  • the sample 51 was electrophoresed on a 1% agarose gel containing 0.0005% ethidium bromide to confirm the amplified fragment. Table 8 shows the results.
  • PCR reagent solution containing primers; 1 and 8 was prepared and subjected to PCR.
  • the composition of the PCR reagent solution is shown below.
  • Reaction conditions 30 cycles of 98 ° C, 5 seconds to 68, with 75 seconds as one cycle. Evening was performed in fast mode using PCR Thermal Cycler Personal (Takara Shuzo).
  • each of the obtained samples 61 was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel containing 0.00005% ethidium orifice, and an amplified fragment of about 10 kb was confirmed.
  • Table 9 shows the results. Acidic substance amplification result
  • PCR reagent composition A CR reagent solution containing ⁇ as a type II and primers ⁇ 1 and; I 9 as a primer pair was prepared and subjected to PCR.
  • the composition of the PCR reagent solution is shown below. PCR reagent composition:
  • the reaction is performed in 30 cycles of 98 ° C, 5 seconds to 68 ° C, and 3 minutes. I got it. After the completion of the reaction, the obtained sample 51 was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel containing 0.0005% ethidium orifice to confirm an amplified fragment. Table 10 shows the results.
  • a PCR reagent solution containing type I; IDNA, primers as a pair of primers; I1 and I8 was prepared and subjected to PCR.
  • PCR evening color EX Taq DNA polymerase, polymerase B was used.
  • the composition of the PCR reagent solution is shown below.
  • EX Taq DNA polymerase buffer 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP and dTTP, l Opg respectively; IDNA, 1.25 U Evening EX Taq DNA polymerase or 0.5 1 Primers for each of polymerase B and 10 pmo; I1 and I8 (final volume 501).
  • a PCR reagent solution was prepared by adding 2.5 ⁇ g of sodium alginate to the PCR reagent solution. The reaction was performed at 98 ° C., 5 seconds to 68 ° C., 2 minutes, 1 cycle, 30 cycles, and the total PCR time was about 80 minutes. After the reaction was completed, the obtained sample 81 was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel containing 0.05% ethidium ore, and the amplified fragment was confirmed. Table 11 shows the results.
  • IDNA including primers; I1 and; I8 as primer pair
  • a PCR reagent solution was prepared and high-speed PCR was performed. Polymerase B was used for this PCR. 15-Doxyspargarine trihydrochloride was used as spargalins, and sodium alginate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as an acidic substance.
  • the composition of the PCR reagent solution is shown below.
  • PCR reagent solution containing 2.5 g of sodium alginate without adding 15-dexpasparin trihydrochloride, and both a 15-dexpasparin trihydrochloride and sodium alginate were used as a control.
  • PCR reagent solutions to which was not added was prepared.
  • the reaction was performed at 98 ° C., 5 seconds to 68 ° C., 90 seconds, one cycle, 30 cycles, and a high-speed PCR of about 65.5 minutes in total PCR time.
  • the obtained sample solution 8/1 was electrophoresed on a 1% agarose gel containing 0.0005% ethidium diamide, and the amplified fragment was confirmed. Table 12 shows the results.
  • the PCR reagent solution composition was the same as that of Example 8 (1).
  • PCR reagent solution containing only 2.5 g of sodium alginate without adding 15-dexoxyspergaline trihydrochloride, and a reagent containing 15-dexoxyspergaline trihydrochloride and sodium alginate were used.
  • Each of the PCR reagent solutions to which both were not added was prepared.
  • the reaction was performed at 98 ° C., 5 seconds to 68 ° C., 3 minutes, 1 cycle, 30 cycles, and a high-speed PCR of about 110 minutes in total PCR time.
  • the obtained sample 81 was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel containing 0.0005 ethanol, and the amplified fragment was confirmed. Table 13 shows the results.
  • a kit (for 20 runs) for high-speed PCR of the present invention was constructed.
  • kit composition is shown below:
  • DNA polymerase enzyme solution 101 Polymerase A or Polymerase B
  • a PCR reagent solution was prepared using the kit described above. Escherichia coli genome DNA was used as type ⁇ . The composition of the PCR reagent solution is shown below.
  • Kit containing polymerase A or polymerase B and further containing an acidic substance A kit for high-speed PCR (for 20 times) of the present invention was constructed.
  • kit composition is shown below:
  • DNA polymerase enzyme solution 101 Polymerase A or polymerase B A PCR reagent solution was prepared using the above kit. As type ⁇ ; IDNA was used. The composition of the PCR reagent solution is shown below.
  • kit for high-speed PCR (for 20 times) of the present invention was constructed.
  • the kit composition is shown below:
  • a PCR reagent solution was prepared using the above kit. As type ;; IDN A was used. The composition of the PCR reagent solution is shown below.
  • the DNA synthesis method and the DNA synthesis reaction kit of the present invention provide a high-speed PCR useful in the field of genetic engineering, and have an excellent effect of accelerating genetic engineering research and industrial operations involving PCR. To play.
  • the DNA synthesis method, the DNA synthesis reaction kit, and the manufactured product of the PCR reagent of the present invention are extremely useful for speeding up and activating operations in all fields where the PCR method can be used.
  • the present invention provides a field of gene diagnosis based on PCR, and a method of producing a DNA chip for genetic diagnosis. It can be used in various fields.

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Description

明細書
DNAの合成方法 技術分野
本発明は、 遺伝子工学分野において有用であり、 ポリメラ一ゼ チヱ一ン リ アクション （PCR) 法に要する時間を短縮しうる DNA合成方法、 該方法に使 用されるキット及び製造品に関する。 背景技術
遺伝子工学分野の研究において DNAの合成は種々の目的に使用される。 この うちオリゴヌクレオチドのような短鎖の DN Aの化学合成を除けば、 そのほとん どは DNAポリメラ一ゼを利用した酵素的方法により実施されている。 したがつ て DNA塩基配列決定、 DNAの標識、 部位特異的変異導入のための試薬として 、 DNAポリメラ一ゼは高い価値を有している。
また最近、 PCR法の開発により、 耐熱性 DNAポリメラーゼが注目を集め、 PCR法に適した種々の DNAポリメラーゼが開発され、 商品化されている。 さらに、 複数の DNAポリメラ一ゼを組み合わせて使用することによって単独 の D N Aポリメラーゼでは不可能であつた効率のよい D N A合成を可能とした方 法が知られている [プロシ一ディングズ ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンシーズ ォブ ザ USA (Pro Natl. Acad. Sci. USA) 、 第 91巻、 第 5695〜5699頁 (1994) ] 。
該方法は、 3' →5' ェキソヌクレア一ゼ活性を有する DNAポリメラーゼ （ 例えば、 ピロコッカス フリオサス由来ひ型 DNAポリメラ一ゼ） と該活性を有 していない DNAポリメラ一ゼ [例えば、 サ一マス アクアティカス （Thermus aquaticus)由来の DNAポリメラ一ゼ （Taq DNA polymerase) ] とを混合して P CRに使用するという方法であり、 LA— PC R法として知られている。
この方法により、 従来行われてきた 1種の DNAポリメラーゼのみを使用する PCRに比べて増幅される DNAの収量が増加する。 また、 従来の PCRでは増 幅できなかった長鎖長の DN Aを増幅することも可能となっている。
従来、 一般的に行われていた最適 PC R条件を表 Aに示す。 l kb p増幅にお いては約 9 0分の反応時間、 1 0 kb p増幅においては約 26 8分の反応時間、 20 k b p増幅においては約 4 78分の反応時間で、 各 DNAの増幅が終了する
表 A 夕カラ Ex Ta q*1 C1.25U /50 zl (PCR試薬液） 〕
铸型 DNA：大腸菌ゲノム DNA*2 C100 n g/50 ζ 1 (PCR試薬液） 〕
1 kb p増幅 94 °C 3 0秒 ~i
55°C 30秒 30サイクル （約 9 0分） 72°C 1分 -
1 0 k b p増幅 9 8 °C 1 0秒，
30サイクル （約 268分）
6 8°C 8分一
20 k b p増幅 9 8°C 1 0秒，
30サイクル （約 4 78分） 68°C 1 5分一
* 1 ：宝酒造社製品
* 2 :宝酒造社製、 LA PCRTM用 g e n ome DNA s e t
この PCR法は、 微量の DNAを短時間に数百万倍に増幅する能力があること から、 医学、 農学を含むあらゆる研究、 検査、 臨床の分野で応用され、 特にガン やエイズのような感染症の遺伝子診断等に威力を発揮している。 また市民生活に おいても、 犯罪者や親子関係の遺伝子診断による確認、 食品中の有害菌の遺伝子 検出等その応用範囲は拡大している。
しかしながら、 迅速な結果を出す必要がある食品検査や、 大量に PC Rを行な う必要がある臨床検査においては、 PCRの反応時間を更に短縮し、 PCRを高 速化することが重要な課題となっている。
さらに、 DN Aチップ作製、 ゲノム解析等において、 PCR操作は必要不可欠 なものであり、 その効率を向上させることは研究全体を効率よく行なう上でも重 要である。 発明の開示
本発明の目的は、 これまでの P C Rに比べてより短時間の高速 P C Rを行なう ための、 DNA合成方法、 該合成方法に使用するキッ ト及び製造品を提供するこ とにのる。
本発明の第 1の発明は、 ポリメラーゼ チヱ一ン リアクション （PCR) 法 による DNAの合成に要する時間を短縮させた DNA合成方法であって、 下記 （ A) 及び （B) に示す条件で PC Rを行なった場合に、 反応液 50 a 1あたりに 1 0 n gを超える約 2 kbの増幅 DNA断片を与えるに有効な量の DNAボリメ ラーゼを使用することを特徴とする DNA合成方法：
(A) 反応液： DNAポリメラ一ゼ、 1 ngの大腸菌ゲノム DNA、 それぞれ 1 Opmolのプライマ一 Eco-1 及び Eco-2 (プライマー Eco-1 及び Eco- 2の塩基配 列をそれぞれ配列表の配列番号： 1 0及び 1 1に示す） を含有し、 かつ該 DNA ポリメラ一ゼに適した組成の容量 50 1の反応液、 ならびに
(B) 反応条件： 99で、 1秒〜 66°C、 7秒を 1サイクルとする 35サイク ルの PCR、
に関する。
本発明の第 2の発明は、 本発明の第 1の発明の DNA合成方法に用いられるキ ットであって、 該キッ卜の指示書に従って調製される PCR試薬液が、 下記 （A ) 及び （B) に示す条件で PCRを行なった場合に、 反応液 50 I 1あたりに 1 0 n gを超える約 2 kbの増幅 DNA断片を与えるに有効な量の DNAポリメラ —ゼを含むことを特徴とする DNA合成用キット ：
(A) 反応液： DNAポリメラーゼ、 1 ngの大腸菌ゲノム DNA、 それぞれ 1 Opmolのプライマ一 Eco-1 及び Eco-2 (プライマー Eco- 1 及び Eco- 2 の塩基配 列をそれぞれ配列表の配列番号： 1 0及び 1 1に示す） を含有し、 かつ該 DNA ポリメラーゼに適した組成の容量 5 0 の反応液、 ならびに
(B) 反応条件： 9 9°C、 1秒〜 6 6°C、 7秒を 1サイクルとする 35サイク ルの P CR、
に関する。
本発明の第 3の発明は、 包装材と該包装材中に封入された PC R用試薬からな る製造品であって、 該 PCR用試薬が DNAポリメラーゼを含有し、 該包装材に 付されたラベルまたは包装材に添付された指示書に前記 PC R試薬が短時間での PCRに使用できることが表示されてなる、 PCR用試薬の製造品、
に関する。 発明を実施するための最良の形態
( 1 ) 本発明の DN A合成方法
本発明の DNA合成方法は、 PCR法による DNAの合成時間を短縮させた D NA合成方法、 すなわち高速 PCRであって、 下記 （A) 及び （B) に示す条件 で PC Rを行なった場合に、 反応液 5 0 1あたりに 1 0 n gを超える約 2 kb の増幅 DNA断片を与えるに有効な量の DNAポリメラ一ゼを使用することを特 徵とする ：
(A) 反応液： DNAポリメラーゼ、 1 ngの大腸菌ゲノム DNA、 それぞれ 1 Opraolのプライマ一 Eco- 1 及び Eco-2 (プライマー Eco-1 及び Eco-2 の塩基配 列をそれぞれ配列表の配列番号： 1 0及び 1 1に示す） を含有し、 かつ該 DNA ポリメラ一ゼに適した組成の容量 5 0 a 1の反応液、 ならびに
(B) 反応条件： 9 9°C、 1秒〜 6 6°C、 7秒を 1サイクルとする 35サイク ルの PCR。
本発明の DNA合成方法によれば、 「有効な量の DNAポリメラ一ゼ」 を使用 するため、 一定の鎖長の DNA断片の相補鎮合成反応 （伸長ステップ） に要する 時間を大幅に短縮すること、 すなわち、 1サイクルの反応に要する時間を短縮す ることができる。 この結果、 PCRにおいて、 従来にない短時間で目的の DNA 断片を増幅すること、 すなわち、 PCRに要する総時間が短縮された高速 PCR を可能にするという優れた効果を発揮する。
本発明において、 「有効な量の DNAポリメラーゼ」 とは、 l ngの大腸菌ゲ ノム DNA、 それぞれ 1 Opmolのプライマー Eco-1 及び Eco-2 (プライマー Eco- 1 及び Eco- 2の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号： 1 0及び 1 1に示す） を 含む容量 50 1 の反応液を用い、 99°C、 1秒〜 66°C、 7秒を 1サイクルと する 35サイクルの PCRを行なった場合に、 反応液 50 1あたり、 約 2kb の DNA断片量が 1 0 n gを超えるに十分な活性の量の DNAポリメラ一ゼ量を 意味する。 従って、 この条件下で、 PCRを行ないうる DNAポリメラーゼ量で あれば、 そのタンパク質量に限定はない。 この有効な量の DNAポリメラーゼを 使用することにより、 当該 PC Rを高速化することができる。
本明細書に記載の 「大腸菌ゲノム DNA」 としては、 例えば、 大腸菌 JM1 0 9株 （Escherichia coli J 109) より、 口野嘉幸、 平井久丸、 櫻木郁之助共著、 1 987年、 ソフトサイエンス社発行、 「遺伝子 'タンパク質 実験操作ブロッ ティング」 記載の方法で調製されたゲノム DNAが挙げられる。 また、 その調製 法の詳細はバイオ ビュー （Bio View) 、 第 13号、 第 6〜5頁 （1994年、 宝酒造 社発行） にも記載されている。 さらに、 当該ゲノム DNAは、 LA PCRTM用 genome DNA s e tとして宝酒造社より入手できる。
なお、 反応液組成は、 使用する DNAポリメラーゼに適した組成の反応液を使 用すればよい。 なお、 「DNAポリメラーゼに適した組成」 とは、 該 DNAポリ メーゼに至適な種類の緩衝液、 至適 pH、 至適塩濃度 （マグネシウム塩など） 、 至適 dNTP濃度、 至適プライマ一量、 その他の添加物などの至適条件を与えう る組成を意味する。
ここで、 DNAポリメラーゼの酵素活性単位として、 铸型 DNAへのヌクレオ チド （例えば標識 dNTP) の取り込みを触媒する能力を指標として表される。 このような活性測定の方法は、 例えば 1966年、 D. R. Harper & Row社発行、 Cant oni G. L. ら編集、 プロシージャーズ イン ヌクレイック ァシッズ リサ一 チ （Procedures in Nucleic Acids Research)第 264頁、 DNAポリメラーゼ フロム ェシエリヒア コリ （DNA Polymerase from Escherichia coli、 Richar dson C. 著） に記載されている。 たとえば、 サーマス アクアティカス （Ther mus aquaticus ) 由来の DNAポリメラーゼである Taq DNA polymeraseの活性を 該方法により測定する際の条件として、 下記のような条件が例示される。
(a)铸型 DNA：活性化サケ精子 DNA；
(b) 反応液組成： 25mM TAPS (25°Cにおいて pH9. 3) 、 50m M 塩化カリウム、 2mM 塩化マグネシウム、 ImM 一メルカプトェタノ ール、 200 Mずつの d ATP、 dGTP及び dTTP並びに 1 00〃M [ ひ一32 P] dCTP、 全量 50^ 1 ;
(c) 活性測定方法： （a) の铸型 DNAを含む （b) の組成の反応液に Taq DN A polymeraseを含む試料を添加して 74 で 1 0分間ィンキュベートした後、 反 応液中の酸不溶性物質を回収し、 該酸不溶性物質中に含まれる放射活性を測定す 前記活性測定方法に用レ、られる活性化サケ精子 D Ν Αは、 以下のように調製す
•So
① Salmon testes DNA ( シグマ社製） を滅菌水で、 膨潤させる。
② 7 OUZ^ 10DNa s e I (宝酒造社製） を 1 50 mM 塩化ナトリウ ムで 500倍〜 4000倍の範囲で、 好ましくは 1 500倍〜 3000倍の範囲 で希釈 る。 ③ 20mgの上記膨潤したDNAを5 OmM トリス—塩酸緩衝液 （pH7. 5) 、 5mM 塩化マグネシウム、 0. 05% B S A、 上記希釈した DN a s e Iを 50 1添加し、 反応液容量を 1 0 m 1にする。
④ 37°C、 1 0分間処理後、 77°C、 1 0分間処理して酵素を失活させる。 そ の一部に最終濃度約 0. 4Mになるように過塩素酸 （HC 104 ) を添加し、 遠 心後、 得られた上清を A26。 試料とする。 残部は、 フヱノール抽出、 クロ口ホル ム ·イソアミルアルコール抽出、 エタノール沈澱を行ない精製する。
⑤ 上記酵素処理前の DNAの UV26。 の吸光度 （A26。 対照） 及び上記④で得 た A26。 試料を測定し、 （A26。 試料） / (A26。 対照） X 1 00 (%) で分解 率を算出する。 この時、 好ましくは分解率が約 3%から約 9%の、 さらに好まし くは約 4. 5%〜7. 5%の酵素処理 DN Aが上記取り込み活性測定用の基質と して使用できる。
なお、 取り込み活性を調べる酵素に応じて、 各分解率の酵素処理 DN Aを用い た予備実験で、 最も至適な分解率の酵素処理 DNAを選択することは当然のこと である。
通常、 上記の方法で測定された DN Aポリメラ一ゼ活性、 すなわち、 DNAへ の dNTP取り込み活性 （以下、 単に dNTP取り込み活性と記載する） の 1単 位 （以下 1 Uと記載する） は、 「30分間あたりに 1 Onmolの dNTPを酸不溶 性物質中に取り込ませる酵素量 J と定義される。
従来、 DNAポリメラーゼを使用する PCRでは、 50〃 1の反応液中に dN TP取り込み活性として 1. 25U〜2. 5Uの DNAポリメラーゼを添加する ことが標準的である。 本発明においては、 特に限定するものではないが、 例えば 50 / 1の反応液あたりに、 dNTP取り込み活性として 4〜20Uの DNAポ リメラーゼを添加して P C Rを実施することにより、 従来になレ、短時間での D N Aの増幅、 すなわち PCRの高速化が可能になる。
本発明の高速 PC Rの例を表 Bに示す。 前出の表 Aと表 Bとの比較により、 本 発明の高速 PCRによる時間短縮効果は明白である。 本発明により、 PCR総時 間が短縮された高速 P C Rが提供される。
表 B ポリメラーゼ A
铸型 DNA：大腸菌ゲノム DNA 〔100 n g/50/ 1 (PCR試薬液） 〕
1 kbp増幅 98°C 5秒，
30サイクル （約 20分）
66°C 2秒一
1 0 k b p増幅 98。C 5秒，
30サイクル （約 53分）
68°C 70秒一
20 k b 増幅 98°C 5秒つ
30サイクル （約 93分）
68°C 1 50秒一
表 Β中、 ポリメラーゼ Αは、 dNTP取り込み活性として 5UZ50 1 (P CR試薬液） の DNAポリメラーゼを使用する。 また、 表 B中、 大腸菌ゲノム D NAは、 表 Aと同じである。
本発明の高速 PCRに使用される有効量の DNAポリメラーゼを、 本発明の高 速 PC R条件下で DN A断片の増幅に使用した場合には、 表 Aに記載の、 dNT P取り込み活性として 1. 25UZ50 1の夕カラ Ex Taqを用いた PC Rと同等の増幅産物量を与える。 従って、 本発明に使用される有効量の DNAポ リメラーゼ活性単位は、 d NT P取り込み活性では従来技術より高活性単位を示 すが、 PCRパフォーマンスで表される活性単位、 即ち PCRプロセスにおける 増幅産物量の比較 （PCR e f f e c t i ve r a t i o) で表される活性 単位では従来技術と同等である。
本発明の DNA合成方法の態様としては、 1種類の DNAポリメラ一ゼを使用 する方法、 2種以上の DNAポリメラーゼを使用する方法が挙げられ、 前記 2種 以上の DNAポリメラーゼを使用する方法としては、 具体的には、 3' →5' ェ キソヌクレア一ゼ活性を有する DNAポリメラ一ゼと 3' →5' ェキソヌクレア ーゼ活性を実質的に有さない他の DNAポリメラーゼとを使用する方法 （前出プ ロシーディングズ ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンシーズ ォブ ザ USA)、 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する 2種以上の DNAポリメラーゼを使用する方法、 ひ型の DNAポリメラーゼと非ひ非ポル I 型の DNAポリメラーゼとを使用する方法等が挙げられる。 ここで、 「3' →5 ' ェキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない他の DNAポリメラ一ゼ」 には、 天然由来の 3' →5' ェキソヌクレア一ゼ活性を持たない DNAポリメラ一ゼ又 は人為的に 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性発現に関与する機能部分を改変す ることにより該活性を発現しない D N Aポリメラ一ゼを含む。
本発明において使用される DNAポリメラ一ゼの量 （すなわち前記 「有効な量 の DNAポリメラ一ゼ」 ） は、 標準的な PCR法に使用するための市販の酵素や キットに添付された取扱説明書などに記載の 「dNTPの取り込み活性」 表示に おいては、 標準的に使用されている DNAポリメラ一ゼの使用量を超える量とな る。 この酵素活性表示において、 操作に要する時間を短縮する効果を発揮させる のに有効な量を使用すればよい。
具体的には、 本発明に使用される DNAポリメラーゼ量は、 操作に要する時間 を短縮する効果を十分に発揮させる観点から、 d NT P取り込み活性表示におい ては、 好ましくは、 従来 PC Rに使用されていた酵素量の 2倍量以上であり、 さ らに好ましくは 4倍量以上であり、 同様の観点から、 好ましくは 30倍量以下で あり、 さらに好ましくは 20倍量以下であることが望ましい。 また、 2種以上の DNAポリメラーゼを使用する場合においては、 それぞれの酵素の有効量を使用 してもよく、 また 2種以上の D N Aポリメラ一ゼのレ、ずれかの酵素量を有効量と して使用してもよい。 その結果、 下記実施例に示すように、 従来の PCRでの D NAポリメラーゼ使用量においては目的の DNA断片の増幅が一般的なァガロー ス電気泳動等で確認できないような、 時間を短縮した P C R条件下においても、 本発明の DNA合成方法、 すなわち高速 PCRによれば、 短時間での DNA増幅 が可能になり、 一般的なァガロース電気泳動で増幅 D N Aの確認が可能となる。 前記 「有効な量の DNAポリメラーゼ」 は、 例えば、 以下のようにして求めれ ばよい。 具体的には、 任意の铸型 DNAについて、 該铸型 DNAの増幅に標準的 に使用される酵素量、 温度プロフィール等、 標準的な PCR条件 （標準条件） で PCRを行なう。 次に、 標準条件の各反応ステップ時間を調整し、 増幅反応全体 に要する時間が短くなるような P C R条件を設定し、 次に酵素量を変えて P C R を行ない、 標準条件下、 標準的に使用される酵素量を用いた場合の増幅産物量と 、 PCRパフォーマンスにおいて実質的に同等の量が得られる酵素量を調べるこ とにより、 該酵素量もしくはそれ以上の酵素量を本発明の高速 PCRに使用され る、 DNAポリメラ一ゼの有効な量として決定することができる。 なお、 「増幅 産物量」 は、 例えば、 PCR終了後に得られた一定量の試料を電気泳動に供し、 電気泳動後のゲルをェチジゥムブ口マイドなどで染色して増幅産物に由来するバ ンドを可視化させ、 ついでゲル上で分離されたバンドに含まれる DNA断片量を 定量することが可能な機器、 例えば、 画像解析装置 （イメージアナライザ一） や デンシトメーター等を用いてバンドに由来する蛍光の強度を測定することにより 定量化することができる。 さらに、 試料中の増幅産物を精製のうえ、 公知の DN A定量方法により定量してもよい。
本発明の高速 PCRにおいて、 設定されたステップ反応時間は、 標準条件下に おける反応時間と比較して短く、 かつ同等の PC Rパフォーマンスで表される酵 素活性を示せば特に限定されるものではない。 本発明において、 全工程の反応時 間、 すなわち P C R総時間を従来の P C R総時間の 1 / 2〜 1 / 4以下となるよ うな PCR条件を設定することが可能になる。 例えば 1 kbp増幅の場合は、 従 来 1サイクル 3分を要したものが、 本発明の高速 P C Rにおいては 1サイクル 4 0秒とすることができ、 PCR総時間は従来の 2Z9となる。 2kbp増幅の場 合は、 従来 1サイクル約 9分を要したものが、 本発明の高速 PCRにおいては 1 サイクル約 1. 8分とすることができ、 PCR総時間は従来の約 1/5となる。 また 1 0 kbp増幅の場合は、 従来 1サイクル約 1 6分を要したものが、 本発明 の高速 P C Rにおいては 1サイクル約 3分とすることができ、 P C R総時間は従 来の約 1/5となる。
従来、 DN A合成速度に優れ、 短時間での DN A増幅が可能であった酵素とし てピロコッカス sp, K0D1 (Pyrococcus sp. K0D1 ) 由来 DNAポリメラーゼ （ KOD DNAポリメラ一ゼ） を含有する酵素組成物が知られている （特開平 1 0 - 42874号公報、 商品名 ： KOD Da s h DNAポリメラ一ゼ、 東洋 紡社製） 。 しかしながら、 該酵素組成物を使用した場合であっても、 その使用指 示書に従い、 製品に記載の 2. 5U/50 a 1の標準的な使用量では上記の条件 下では、 反応液の一部を一般的なァガロース電気泳動に供しても、 肉眼では増幅 断片を確認できず、 高感度ィメージアナライザ一により定量されたその増幅産物 量は、 1 O ng以下である。 一方、 本発明に規定される 「有効量の DNAポリメ ラーゼ」 を使用した場合、 上記条件下でも、 ァガロース電気泳動で増幅断片を確 認でき、 その増幅産物量は 1 O ngを超える量である。
本発明の DNA合成方法 （すなわち高速 PCR) に使用することができる DN Aポリメラーゼとしては、 特に限定はなく、 例えば、 ポル I型 DNAポリメラー ゼ （大腸菌 DNAポリメラ一ゼ I、 クレノウ · フラグメント、 Taq DNAポ リメラーゼなど） 、 型 DNAポリメラーゼ [上記のピロコッカス フリオサス 由来 型 DN Aポリメラ一ゼ、 サ一モコッカス リ トラリス （Thermococcus lit ralis ) 由来 DNAポリメラ一ゼ （VENT DNAポリメラーゼ） 、 ピロコッ カス sp. K0D1 (Pyrococcus sp. K0D1 ) 由来 DNAポリメラーゼ （KOD DNAポリメラ一ゼ） 、 ピロコッカス sp. GB-D (Pyrococcus sp. GB-D ) 由来 DNAポリメラ一ゼ （DEEP VENT DNAポリメラーゼ） など] 、 これ らのどちらにも属さない非ひ非ポル I型 DNAポリメラーゼが挙げられる。 なお 、 ポル I型 DNAポリメラーゼ、 ひ型 DNAポリメラーゼはともにそのアミノ酸 配列上の相同性から分類される一群の酵素を指し、 そのァミノ酸配列上の特徴は ヌクレイック ァシッズ リサーチ、 第 15巻、 4045〜4057頁 （1991) に記載され ている。
また、 非 α非ポル I型 DNAポリメラーゼとしては、 例えば、 国際公開第 97 /24444号パンフレットに記載のピロコッカス フリォサス由来 DN Αポリ メラーゼが挙げられる。
本発明の方法に使用できる DN Aポリメラ一ゼは、 1種の DNAポリメラ一ゼ に限定されるものではなく、 2種以上の DNAポリメラーゼ、 例えば、 3' →5 ' ェキソヌクレア一ゼ活性を有する DNAポリメラーゼと 3' →5' ェキソヌク レア一ゼ活性を実質的に有しなレ、他の D N Aポリメラーゼとを混合し、 D N Aポ リメラーゼ組成物として使用することもできる。 両酵素の混合比は、 両酵素の種 類に応じて本発明の高速 PC Rに適した混合比とすればよく、 特に限定はないが 、 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラーゼと 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有しない他の DNAポリメラ一ゼとの比が 9 ： 1〜1 ： 500の範囲で使用すればよい。 そのポリメラーゼ組成物の例としては、 タカ ラ Ex Ta q DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） が好適に使用できる。
—般に PCRにおいては、 二本鎖铸型 DNAの一本鎖への解離 （変性） 、 一本 鎖铸型 DNAへのプライマーのアニーリング、 プライマ一からの相補鎖合成 （伸 長） の 3ステップ反応により DNAの増幅が実施される。 また、 " シャトル PC R" [ 『PCR法最前線』 、 「蛋白質 核酸 酵素」 別冊、 第 41巻、 第 5号、 第 425〜428頁 （1996) ] と呼ばれる前述の 3ステップ反応のうちプライマーのァ ニーリング段階、 伸長反応の段階を同一温度で行なう 2ステップ反応でも DNA の増幅が実施される。 本発明の DNA合成方法は、 特に上記の伸長のステップに 要する時間を短縮することができため、 前記 3ステップ反応と 2ステツプ反応の いずれにおいても、 合成反応全体に要する時間を短縮することができる。
本発明の DNA合成方法においては、 DNA合成反応を行なうに際し、 DNA ポリメラーゼの有する D NA合成活性を促進する作用を有する物質、 すなわち、 高速 P C Rを更に高性能化する物質の存在下に D N A合成反応を行なうことによ り、 さらに効率よく D N Aの合成を行なうことができる。
高速 P C Rを更に高性能化する物質の 1つとして、 電荷的に負の電荷を有する 物質又はその塩、 なかでも酸性物質又はその塩があげられる。
有効量の酸性物質及び/又はその塩の存在下に P C Rを行なうことにより、 そ の高速化を行なうための条件を普遍化することができる。 すなわち铸型の性質 （ 例えば、 G C含量等） 等により影響を受けない高性能高速 P C Rを実施すること ができる。 またスパガリン類、 その分解物及びそれらの塩から選択される少なく とも 1種を添加してもよい。
本発明の高速 P C Rを行なう際に、 有効量の酸性物質及び/又はその塩、 例え ば、 糖鎖骨格を有する酸性物質等の機能の詳細は不明であるが、 本発明の高速 P C Rを行なうための有効量の D N Aポリメラ一ゼを使用した場合、 D N Aの合成 反応時に余剰の D N Aポリメラ一ゼは酸性物質にトラップされるため、 酸性物質 の効果により、 P C Rに最適の D N Aポリメラーゼが鐯型 D N Aに供給されるこ とにより、 更に高性能高速 P C Rとなる。
酸性物質又はその塩の D N A合成活性を促進する作用は、 単位時間あたりの新 規に合成された D N A鎖の鎖長や P C Rにおける増幅産物量によつて調べること ができる。 本発明の D N A合成方法において、 上記の酸性物質又はその塩はその 作用を発揮するに有効な量が使用される。 当該有効量は、 例えば、 種々の量の上 記の酸性物質又はその塩を添加した反応液を用いて P C Rを行なつた場合と、 こ れを添加せず P C Rを行なつた場合の増幅産物の量を比較して調べることができ る。 増幅産物の量は、 例えば、 P C R後の反応液の一定量を電気泳動に供し、 電 気泳動後のゲルをェチジゥムブ口マイド等で染色し、 増幅産物に由来するバンド の蛍光の強度をイメージングアナライザ一等を用いて測定することにより定量化 することができる。 D N A合成活性を促進する作用を有する酸性物質としては、 特に限定されるも のではないが、 例えば、 酸性多糖のような酸性高分子物質を使用することができ る。 またポリグルタミン酸、 ポリアクリル酸、 ポリビニル硫酸、 ポリスチレン硫 酸、 目的とする D N Aの合成のための铸型とはならない D N A等も使用すること ができる。 なお、 本明細書において酸性物質には、 D N A合成活性を促進する作 用を有するものであれば前記酸性物質の塩をも包含する。 本発明に使用すること ができる酸性多糖としては、 例えば、 フコース硫酸含有多糖、 デキストラン硫酸 、 カラギーナン、 へパリン、 へパラン硫酸、 ラムナン硫酸、 コンドロィチン硫酸 、 デルマタン硫酸 （コンドロィチン硫酸 B ) などに代表される硫酸基を含有する 硫酸化多糖類、 ヒアルロン酸、 アルギン酸、 ぺクチンなどのポリゥロン酸などが 包含される。 前記フコース硫酸含有多糖としては、 例えば、 フコース硫酸含有多 糖一 F又はフコース硫酸含有多糖一 Uを使用することができる。 ここで、 フコー ス硫酸含有多糖— Fとは、 例えば国際公開第 9 7 Z 2 6 8 9 6号パンフレッ トに 記載の方法により、 あるいは国際公開第 9 7 / 4 7 2 0 8号パンフレツトに記載 の方法により褐藻植物などより得られる、 ゥロン酸を実質的に含まないフコース 硫酸含有多糖をいう。 また、 フコース硫酸含有多糖— Uとは、 前記パンフレッ ト に記載の方法により得られるゥロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をいう。
前記酸性物質の塩としては、 D NA合成活性を促進する作用を有するものであ れば特に限定されないが、 水溶性の塩が好ましい。 例えば、 デキストラン硫酸ナ トリゥム、 アルギン酸ナトリゥム、 ポリグル夕ミン酸ナトリゥム、 へパリンナト リウム、 デキストラン硫酸カリウム、 へパリンリチウムなどのアルカリ金属塩な どが挙げられる。
前記酸性物質は、 例えば、 D N A合成活性を促進する作用を保持している物質 であれば天然物でもよく、 化学的又は酵素的な合成物でもよい。 前記酸性物質は 、 それを含有する未精製物、 部分精製物又は精製物のいずれでもよい。 さらに、 D N A合成活性を促進する作用を保持している範囲で適当な修飾を施されていて もよい。 また、 本発明に用いられる酸性物質は、 D N A合成活性を促進する作用 を有する物質であれば、 前記酸性物質の分子量が、 D NA合成活性を促進する作 用を発揮するに適当なものとなるように分解操作を施し得られた物質であつても よく、 あるいは前記分解操作後に、 さらに分子量分画を行なって得られた物質で あってもよい。 本発明においては、 分子量数千以上の酸性物質を好ましく使用す ることができる。 さらに、 これらの物質は単独で又は混合して使用することがで きる。
上記の D NA合成活性を促進する作用を有する酸性物質は、 本発明の高速 P C Rにおいて D NAポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめ、 もしくはその活性 を保持させる目的で添加される。 その添加量は、 酸性物質の種類に応じて至適化 すればよく、 反応液 5 0 1あたりに 0 . 1 n g〜 1 0 0 g、 好ましくは 1 n g〜l 添加すればよい。 当該酸性物質の作用は、 特に限定するものではな いが、 その分子上に D NAポリメラーゼを保持することによって D NAポリメラ 一ゼの铸型 D N Aへの非特異的な相互作用を抑制するとともに、 铸型 D N Aに対 して至適量の D N Aポリメラーゼを提供することに基づくと考えられる。 すなわ ち、 D N A合成反応の進行に伴って増加していく铸型 D N Aと D N Aポリメラ一 ゼとの相互作用を最適化することにより、 効率よく D N A合成反応が進行する。 さらに、 増幅領域やプライマーの塩基配列等の影響が低減され、 増幅産物を安 定して得られるという効果も有する。
前記の酸性物質がその活性を促進する D NAポリメラーゼには特に限定はなく 、 例えば、 上記の種々の D N Aポリメラーゼを使用した本発明の D NA合成方法 に適用することができる。
本発明においては、 スパガリン類及び Z又はその塩を本発明の高速 P C Rにお いて D N Aポリメラ一ゼの活性を効率よく発揮せしめ、 もしくはその活性を保持 させる目的で P C R溶液に添加、 使用することができる。
D N A合成活性を促進する作用を有するスパガリン類としては、 特に限定され るものではないが、 例えば、 下記一般式 （I) ：
Gu-(CH2)6― CONHCH(OR)CONH(CH2)4 H— (CH2)3— ΝΉ2
(ェ）
〔式中、 Guはグァニジノ基、 Rは、 水素原子又はメチル基を示す〕 で表わされ る 1 5—デォキシスパガリン化合物又はその塩等が挙げられる。
前記スパガリン類としては、 例えば、 前記一般式 （I) の Rが水素原子である 1 5—デォキシスパガリン （1 5— d e oxy s p e r gua l i n) 又はその 塩が好適である。
また、 前記スパガリン類の塩としては、 DNAポリメラ一ゼ活性促進作用を発 揮しうる物質であれば、 無機酸との塩又は有機酸との塩のレ、ずれであつてもよい ο
なお、 上記スパガリン類はバチルス属の生産菌より単離されたスパガリンの誘 導体で、 誘導体の種類によっては抗腫瘍活性、 免疫増強活性、 免疫抑制活性のあ ることが知られている物質である （特開昭 58 - 621 52号公報、 特開昭 6 1 - 1 29 1 1 9号公報、 特開昭 64 - 90 1 64号公報） 。 したがって、 これら のスパガリン類は公知の方法により容易に精製し、 あるいは公知の方法により合 成し、 調製することができる。
前記 1 5—デォキシスパガリン又はその塩の製造方法は、 例えば、 特公昭 6 1 一 23 1 83号公報又は米国特許第 4, 603, 0 1 5号明細書の実施例 6等に I 示されている。
前記スパガリン類は、 DNA合成活性を促進する作川を保持している物質であ れば、 天然物でも良く化学的又は酵素的な合成物でもよい。 前記スパガリ、ン類は 、 それを含有する未精製物、 部分精製物又は精製物のいずれでもよい。 さらに、 前記スパガリン類は、 DNA合成活性を促進する作用を保持している範囲で適当 な修飾を施されたものや、 あるいは分解物であってもよい。 さらに、 これらの物 質は、 単独で又は混合して使用することができる。
本明細書において、 スパガリン類の分解物としては、 DNA合成活性を促進す る作用を保持している物質であれば、 特に限定されないが、 例えば、 水酸化ナト リウムを用いて強ァルカリ条件下に室温で加水分解することにより生じる物質、 P C R用緩衝液等の弱アル力リ性条件下に加熱して加水分解することにより生じ る物質等が挙げられる。 前記条件下に加水分解により生じる物質としては、 特に 限定されないが、 前記一般式 （I) で表わされる 1 5—デォキシスパガリ ン化合 物を用いた場合、 例えば、 一般式 （II) ：
Gu— (CH2)6— C〇NH2 (ェェ）
〔式中、 Guは一般式 （I) と同じ基を示す〕
で表わされる化合物、 一般式（III) ：
HO-CH(OR)CONH(CH2)4NH— (CH2)3— NH2 (ェ11 )
〔式中、 Rは一般式 （I) と同じ基を示す〕
で表わされる化合物、 一般式 （IV) ：
OHC— CONH(CH2)4NH— (CH2)3— H2 (IV) で表わされる化合物等が挙げられる。 前記スパガリン類の分解物は、 DNA合成 活性を促進する作用を保持している物質であれば、 該スパガリン類の分解物の塩 をも包含する。
前記スパガリン類の使用量は、 DNA合成活性を促進する作用を発揮しうる範 囲であれば特に限定されないが、 使用する铸型 DNAの種類及び量、 増幅対象の 領域の長さ、 DNAポリメラーゼの種類に応じて最適の濃度になるような量であ ればよい。 例えば、 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩の場合、 最終濃度が 0. 1 M〜 5 0 0 M、 好ましくは 20 M〜 1 0 0〃Mになるように添加すれば よい。
本発明のスパガリン類の作用は、 特に限定されないが、 DNAポリメラーゼの 活性を効率よく発揮せしめ、 若しくは DNAポリメラーゼを保持することによつ て酵素の DNAへの非特異的な相互作用を抑制することにあると考えられる。 ま た、 铸型 DN Aとプライマーの複合体に作用してプライマー伸長反応を容易にす ることにあると考えられる。
前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、 両者が反応して塩を形成する こともあるが、 DNA合成活性を促進する作用を保持している物質であればよい 前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、 DNA合成活性を促進する作 用を発揮しうる範囲であれば特に限定されないが、 使用する铸型 DNAの種類及 び量、 増幅対象の領域の長さ、 DNAポリメラーゼの種類等に応じて最適の共存 比率になるような量であればよい。
なお、 前記スパガリン類又はその塩、 ならびに前記電荷的に負の電荷を有する 物質又はその塩とスパガリン類又はその塩との混合物は、 DNA合成活性促進剤 として使用することができる。
以上に記載された本発明の DN A合成方法に関して、 該方法の詳細な記載、 例 えば P CR試薬液の調製方法、 推奨される反応条件等の情報を記載した印刷物の 提供ならびに該情報のィンターネットのような電子媒体を通じて本発明の方法を 指示する行為も本発明の方法に包含される。 (2)本発明の DNA合成方法に使用されるキット
本発明のキットを使用することにより、 高速 PCRが可能となる。 このような キッ トとしては、 PCR法による DNAの合成を伴う反応に用いられるキッ トで あれば特に限定されるものではなく、 試験管内での DN A合成反応を行なうため の高速 PC Rキットが挙げられる。
本発明のキットは、 試験管内 DNA合成に使用されるキットであって、 該キッ トの指示書に従って調製される PCR試薬液が、 前記 （1) に記載の DNA合成 方法に用いられる 「有効な量の DNAポリメラーゼ」 、 すなわち、 l ngの大腸 菌ゲノム DNA、 それぞれ 1 Opmolのプライマー Eco-1 及び Eco-2を含有し、 か っ該 DNAポリメラーゼに適した組成の容量 50 1 の反応液を用い、 99て、 1秒〜 66°C、 7秒を 1サイクルとする 35サイクルの PC Rを行なった場合に 、 反応液 50 1あたり、 約 2 kbの DNA断片量が 1 0 n gを超えるに有効な 量の DNAポリメラーゼを含有する。
本発明のキットを使用して調製される PCR試薬液は、 特に限定するものでは ないが、 例えば、 50〃 1の反応液中に dNTP取り込み活性として 4〜1 0U の高速 PCR用 DNAポリメラ一ゼ、 例えば、 夕カラ Ex Ta q DNAポリ メラーゼを含有している。 また試薬液組成は、 使用する DNAポリメラーゼに適 した組成の試薬液を使用される。
上記の 「指示書」 とは、 当該キットの使用方法、 例えば PCR試薬液の調製方 法、 推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、 パンフレッ ト又はリーフレ ット形式の取扱い説明書の他、 キットに添付されたラベル、 キットが納められた パッケージ等に記載されたものを含む。 さらに、 インターネッ トのような電子媒 体を通し、 開示、 提供された情報も含まれる。 PCR試薬液の調製に関して、 上 記の DNAポリメラ一ゼ量の使用及び Z又は上記の酸性物質又はその塩の添加を 指示した指示書が添付されたキットあるいはインターネットのような電子媒体を 通して、 本発明の方法が開示、 提供されているキットも本発明のキットに包含さ れる。
また、 キット中に DNAポリメラ一ゼの DNA合成活性を促進する作用を有す る酸性物質又はその塩を含有させてもよい。 酸性物質又はその塩としては、 上記 の （1) に記載されたものを使用することができる。 このような酸性物質又はそ の塩は、 DNAポリメラ一ゼ活性を効率よく発揮せしめ、 もしくは酵素を保持す ることによって DN Aと酵素との相互作用を適切に調節し得ることから、 本発明 のキットの性能はさらに向上する。
また、 スパガリン類、 その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される少 なくとも 1種を含有させてもよい。
前記スバガリン類と酸性物質とを併用する場合、 両者が反応して塩を形成する こともあるが、 DNA合成活性を促進する作用を保持している物質であればよい o
本発明に含有される DNAポリメラ一ゼとしては、 特に限定はなく、 上記の （ I ) に示された各種の高速 PCR用 DNAポリメラ一ゼが挙げられる。
当該キットには、 例えば、 dNTP、 塩化マグネシウム、 反応液を適正な pH に保っための緩衝成分などの DNAポリメラ一ゼの反応に必要な試薬を含んでい てもよい。 前記 DNAポリメラ一ゼ、 酸性物質、 その他の試薬はそれぞれ独立し たコンポーネントとして、 又はそのいくつかが組み合わされた状態、 例えば反応 用緩衝液などに添加された状態でキットに含有されていてもよい。
本発明のキットの 1つの態様としては、 上記の DNAポリメラーゼの他、 PC R法による DNA合成に必要な各種成分、 例えば dNTP、 塩化マグネシウム、 反応液を適正な pHを保っための緩衝成分等を含んだ組成物が挙げられる。 さら に該組成物は上記の酸性物質を含んでいてもよい。 このような組成物は、 目的の DN A断片を増幅するためのプライマー及び铸型 DN Aを添加したうえ、 必要に 応じて水又は緩衝液を加えることにより反応液を調製できるように作成すること ができる。 さらに、 当該キットが増幅すべき DNA断片が決まっている場合には 、 該組成物は該断片の増幅に適したプライマ一を含んでいてもよい。 このような 組成物を使用することにより、 極めて簡便、 迅速に DN A合成反応、 すなわち高 速 PC Rを行なうことができる。
本発明のキットは、 PCRならびに PCRを利用したシークェンシング、 DN A標識、 cDNA合成、 部位特異的変異導入等の操作に適用した場合、 操作に要 する時間を短縮できるという優れた効果を発揮する。 例えば、 前記キッ トを PC Rに適用した場合、 同一鎖長の D N Aの増幅に要する時間は従来の P C R法や L A-PCR法に比べてより短い。 したがつて従来法では D N Aの増幅が不可能で あった高速 PCR条件下においても DNAの増幅が可能となる。 また、 本発明の キットは、 増幅反応全体に要する時間を短縮できるため、 例えば、 PCR法に基 づく遺伝子診断法などに使用することによって、 より短時間で遺伝子診断法など を行なうことができるという優れた効果を発揮する。
(3)本発明の高速 PC R用試薬の製造品
本発明の高速 P CR用試薬の製造品は、 包装材と該包装材中に封入された P C R用試薬からなる製造品であつて、 該 P C R用試薬が D N Aポリメラーゼを含有 し、 該包装材に付されたラベルまたは包装材に添付された指示書に前記 PCR試 薬が短時間での PC Rに使用できることが表示された製造品である。 前記 PCR 用試薬は、 DNAポリメラーゼと、 該 DNAポリメラーゼに適する緩衝液及び 又は d NT Pとを含有していてもよい。 従って当業者であれば当該製造品に表示 されたラベル、 当該製品に添付された使用指示書に従い簡便に、 本発明の高速 P CRを行なうことができ、 当該製造品は、 本発明の高速 PC Rを必要とする各産 業分野において有用である。 本発明の DN A合成方法 （高速 PCR) によれば、 増幅反応全体に要する時間 を短縮することができ、 使用される装置の性能等にもよるが、 例えば 2 kbの D N Aの増幅に要する PC R総時間は従来の約 1/2に、 また、 約 20 kbの DN Aでは約 1ノ 5にそれぞれ短縮され、 PCRの高速化が初めて可能となった。 本 発明の方法は、 例えば、 PCR法に基づく遺伝子診断法などに使用することによ つて、 より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を 発揮する。 該方法は 2回の PCRが実施されるネスティッ ド PCR (nested PCR ) 等に特に好適である。
本発明の高速 P C Rは、 DN Aチップのように大量の P C R操作が必要な技術 の開発 ·製造において極めて有用である。 DNAチップは、 親指大のガラスチッ プ上に約 1 0 0 0 0種類の DNAを固定させたものである。 かかる DNAチップ を製造するためには、 スポットを要する DNAを PCRによって増幅調製する必 要があり、 それに必要な PCR操作の回数は膨大なものとなる。 例えば、 このよ うな DNAチップを 1 0000枚作ると仮定すると、 従来の PCRを用いた場合 PCR操作だけで延べ約 3力月かかるのに対し、 本発明の高速 PC Rによれば、 約 3週間という短時間で製造できるという効果を有する。
また、 枯草菌のゲノム （50 0万塩基） の全配列の解明するために必要な PC R操作は従来の PCRでは約 3. 5力月かかるのに対し、 本発明の高速 PCRを によれば約 3週間で済むという大きな差となる。
本発明の高速 PC Rは、 特殊な装置を使用することなく、 従来の PC R装置を 使用して PCRを行なうことができ、 本発明の高速 PC Rは迅速性、 反応性に優 れ、 また高感度の PCRとして極めて有用な技術である。 以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、 本発明は実施例の範 囲に限定されるものではない。 下記実施例において、 市販の DNAポリメラーゼの活性は、 各酵素製品の使用 指示書に記載の 「dNTP取り込み活性」 での表示単位に基づいて示した。 また 、 市販の酵素を含む反応液の調製は、 特に断りのない限り各酵素の説明書にした がうか、 あるいは添付されている反応用緩衝液を使用して調製した。 PCRは、 特に断りのない限り夕カラ PCRサーマルサイクラ一パーソナル （宝酒造社製） を使用して実施した。 実施例 1
(1) プライマーの作製
DNAの塩基配列をもとに； I 1〜 I 5、 λ 7〜 I 1 0の 9種類のプライマー を合成した。 プライマー λ 1〜λ 5、 ス 8〜； 11 0の塩基配列をそれぞれ配列表 の配列番号： 1〜8に示す。 さらに； I 7の塩基配列を配列表の配列番号： 9に示 す。 これらのプライマ一の組み合わせによって λϋΝ Αを铸型とした PC Rで増 幅される増幅 DNA断片の鎖長を表 1に示す。
表 1 プライマー対 増幅 DNA断片の鎖長
λ 1/X 2 0 , 5 kb
λ 1 /λ 3 1 kb
λ 1 /λ 4 2 kb
λ 1 /λ 5 4 kb
λ 1 /λ 7 8 kb
λ 1 /λ 8 1 0 kb
λ 1 /λ 9 1 2 kb
λ 1 /λ 1 0 1 5 kb
(2) ポリメラ一ゼ A及びポリメラーゼ Bの作成 5UZ〃 1の濃度の夕カラ EX Taq DN Aポリメラーゼを使用し、 その 濃縮標品を調製した。 1 0UZ 1の濃度の標品 （ポリメラーゼ Aと称す） 、 2 OUZ/z lの濃度の標品 （ポリメラーゼ Bと称す） のそれぞれを調製し、 以下の 実施例において使用した。
(3) ポリメラ一ゼ A及びポリメラ一ゼ Bを使用した高速 PCR
夕カラ EX Taq DNAボリメラ一ゼに添付の取扱い説明書によれば、 該
DNAポリメラーゼは、 通常、 50 1の PCR試薬液あたり 1. 25 Uを使用 する。 今回、 DNAポリメラ一ゼの量を変更し、 高速 PCRについて検討した。 铸型として ADNA、 プライマ一対としてプライマー； I 1および； 4を含む P
CR試薬液を調製し、 PCRを行なった。 PCR試薬液の組成を以下に示す。
PCR試薬液組成：
5 OmM トリスー酢酸 （pH8. 5) 、 それぞれ 0. 2mMの dATP、 dC TP、 dGTPおよび dTTP、 3mM 酢酸マグネシウム、 50 mM 酢酸力 リウム、 l pgの； IDNA、 1 0 pmo 1ずつのプライマ一； I 1および； I 4。 前 記 PCR試薬液に 1. 25Uの夕カラ EX Taq DNAポリメラーゼ、 0. 5 n 1のポリメラーゼ Aまたは 0. 5 a 1のポリメラーゼ Bを添加し、 それぞれ 最終容量を 50 1とした。
反応は 98°C、 5秒〜 66°C、 1 0秒を 1サイクルとし、 35サイクルで総時 間、 約 31. 5分の高速 PC Rで行なった。 反応終了後、 得られた試料 5 1を 0. 00005 %のェチジゥムブ口マイドを含む 1 %ァガロースゲルにて電気泳 動し、 目的の約 2 kbの増幅断片を確認した。 その結果を表 2に示す。 表 2 使用酵素 増幅結果
1.25U/50 /1 PCR タカラ EX-Taq 一
ポリメラーゼ A + +
ポリメラーゼ B + +
++ ：強い増幅が見られる
+：増幅が見られる
士：わずかな増幅が見られる
- ：増幅は見られない
表 2に示されるようにボリメラーゼ A (5 U/5 0 1 (PCR試薬液） 〕 も しくはポリメラ一ゼ B 〔1 0 U/5 0 β 1 (PCR試薬液） 〕 を使用することに より、 高速 PC Rが実施可能であることが確認できた。
実施例 2
( 1 ) プライマーの作製
大腸菌ゲノム DNAの塩基配列をもとに Eco-1 、 Eco-2、 Eco-2-2、 Eco-5、 Eco-6 の 5種類のプライマーを合成した。 プライマー Eco-1 、 Eco-2、 Eco-2-2 、 Eco-5、 Eco-6 の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号： 1 0〜1 4に示す。 これらのプライマーの組合わせによって大腸菌 DN Aを铸型とした PC Rで増幅 される増幅断片の鎖長を表 3に示す。
表 3 プライマ一対 増幅 DNA断片の鎖長 (kb)
Figure imgf000027_0001
(2) ポリメラーゼ Aを使用した場合の高速 PCR
ポリメラーゼ Aを使用した高速 PCRについて検討した。 LA PCRTM用 g e n ome DNA s e t (宝酒造社製） 中の大腸菌ゲノム DNAを铸型とし て用い、 プライマー対としてプライマー Eco- 1 および Eco-2、 プライマー Eco-2- 2 および Eco- 5、 プライマー Eco-1 および Eco-6 の組合わせをそれぞれ含む P C R試薬液を調製し、 高速 PCRを行なった。 PCR試薬液の組成を以下に示す。 PCR試薬液組成：
5 OmM トリス—酢酸 （pH8. 5) 、 それぞれ 2mMの dATP、 dC TP、 dGTPおよび dTTP、 3mM 酢酸マグネシウム、 5 OmM 酢酸力 リウ厶、 1 O pmo 1ずつのプライマ一 Eco- 1 および Eco-2、 プライマー Eco-2 - 2 および Eco-5、 プライマー Eco-1 および Eco-6 の組合わせをそれぞれ含む。 な お、 増幅対象断片の鎖長が 2 kbおよび 8 kbの場合は 1 n gまたは 20 kbの 場合は 2 O ngの大腸菌ゲノム DN Aを使用した。 前記 PCR試薬液に 0. 5
1のポリメラーゼ Αと 2. 5 gのアルギン酸ナトリウムとを添加し最終容量を
5 0 1 とした。
PCRは、 夕カラ PCRサーマルサイクラ一パーソナル （宝酒造社製） を使用 し、 表 4に示した温度条件で fastモードで行なった。 反応終了後、 得られた各試 料 5 lを 0. 00 0 0 5 %のェチジゥムブ口マイドを含む 1 %ァガロースゲル にて電気泳動し、 増幅断片を確認した。 その結果を表 4に示す。
表 4 増幅 DNA 反応温度条件 PCR 増幅結果 断片の鎖長 ( 1サイクル）
(kb) サイクル数 総時間 （分） ボリメラ-ゼ A
99で 1 秒、 66°C/6秒 35 約 25.1 +
2 99°C/1 秒、 66 7秒 35 約 25.7 ++
99°C/1 秒、 66で 8秒 35 約 26.3 +++
99°C/1 秒、 68°CZ60秒 35 約 56.6 +
8 99°CZ1 秒、 68。CZ70秒 35 約 62.4 +++
99°C/1 秒、 68で 80秒 35 約 68.3 ++++
99°C/1 秒、 68°C/150秒 35 約 108.5 ++
20
99°C/1 秒、 68。CZ165秒 35 約 117.3 ++十
+〜+ + + + :増幅の程度を 4段階で示す
一：増幅は見られない
表 4に示されるようにポリメラーゼ Aを使用した場合には、 いずれの高速 P C R条件下でも予想される 2 kb、 8 kb又は 20 kbの断片が増幅されているこ とが確認された。 更に、 0. 5 1のポリメラ一ゼ Bについても同様の PCRを 行なつたところ、 ポリメラーゼ Aと同じ結果であつた。
(3) 他社市販 DNAポリメラーゼとの比較
実施例 2— (2) に示した高速 PCR実験のうち、 2 kbの DNA断片を増幅 したものについてその増幅断片量を定量した。 対照として、 KOD dash DNA ポリメラーゼ （東洋紡社製） を使用した。 K〇D dash DNAポリメラ一ゼにつ いては、 PCR試薬液 5 0 a 1あたりの使用酵素量を製品記載の標準的な使用酵 素単位量の 2. 5 Uと、 5U又は 1 0 Uに増やした PCR試薬液についても同様 に疋里した。 高速 PCRは、 9 9°C、 1秒〜6 6で、 7秒を 1サイクルとした 3 5サイクル で行なった。 PCRは夕カラ PCRサ一マルサイクラ一パーソナル （宝酒造社製 ) を使用し、 fastモードで行なった。 当該サーマルサイクラ一の fastモードにお ける規格値を表 5に示す。
表 5 規格値の定義 規格値
Heat rate 35°Cから 94°Cに加熱する場合の最大加熱速度 ≥1.5 °C/秒
Cool rate 94°Cから 40°Cに冷却する場合の最大冷却速度 ≥1.5 。C/秒 Over temp ブ n'yク温度が設定温度より何度上昇して安定したかを示す ≤1.0 °C Under temp ブ ク温度が設定温度より何度下がって安定したかを示す ≤2.0 °C 上記のとおりに温度条件を設定した場合、 1サイクルの工程には約 4 5秒を要 し、 PCR総時間は、 約 25. 7分であった。 反応終了後の各試料 8 1を 0. 0 0 0 0 5 %ェチジゥムブ口マイドを含む 1 ァガロースゲルにて電気泳動し、 増幅断片を確認した。 その結果、 ポリメラーゼ八、 5 U及び 1 OU0K〇D das h DNAポリメラーゼ使用の場合、 目的の約 2Kbの増幅断片が確認できた。 一 方、 2. 5Uの K〇D dash DNAポリメラーゼ使用の場合は、 目的の増幅断片 は確認できなかった。 そこで、 さらに検出感度の高いイメージアナライザー FM 一 B I 0 (宝酒造社製） を使用し、 検出感度を調整しながら、 既知量の DNA分 子量マーカーを対照として目的の増幅断片を検出 ·定量した。 その結果、 2. 5 Uの KOD dash DNAポリメラーゼにおいてもわずかに増幅されていることが 確認できた。 その定量値を表 6に示す。 表 6 使用酵素 定量値（ng)
ポリメラーゼ A 153
2. 5U KOD dash ≤\0
5 U KOD dash 28
1 0 U KOD dash 88 表 6に示すようにイメージアナライザ一による定量では、 ポリメラ一ゼ Aを用 いた場合の増幅 DN A量は反応後の試料 5 0 a 1あたり約 1 5 3 η であった。 一方、 イメージアナライザ一による定量では、 KOD dash DNAポリメラ一 ゼの場合でも、 その使用指示書に記載の標準使用量 〔2. 5U/5 0 1 (PC R試薬液） 〕 においては 1 0 n gを超える量の増幅産物は得られなかった。 しか しながら、 使用する酵素量を 2倍量、 4倍量にした場合には、 それぞれ 28 n g 、 8 8 n gの増幅産物が得られた。 すなわち、 ポリメラーゼ Aのみならず KOD dash DNAポリメラ一ゼにおいても、 その量を増やすことにより増幅 DN A量 が増加した。 また、 実施例 2— (2) で使用したポリメラ一ゼ A用 PC R試薬液 でアルギン酸ナトリゥム無添加の PC R試薬液を調製し、 ポリメラーゼ Aを用い て上記反応条件で高速 PCRを行なったところ、 1 0 n gを超える量の増幅断片 が得られることを確認した。
従って、 上記条件下において、 DNAポリメラ一ゼの種類にかかわらず、 1 0 n gを超える量の増幅産物が得られる DN Aポリメラ一ゼ量を使用することによ り、 一般的なァガロース電気泳動により肉眼で増幅産物を確認できたため、 その 増幅産物量が 1 O n gを超える高速 PCRが可能となることが明らかになつた。 実施例 3
夕カラ EX Ta q DNAポリメラーゼの取扱い説明書等に記載されている 1. 25U/5 0 / 1 (PCR試薬液） の夕カラ EX Ta q DNAポリメラ ーゼを用いた基本プロトコール条件を基準とし、 ポリメラーゼ Aを用いて同じ増 幅産物量を得るために要する高速 PC Rの PC R総時間を、 市販のサ一マルサイ クラ一 3種について検討した。 基本プロトコ一ル条件は、 20 kb増幅の場合は 夕カラ PCRェンザィムズ （宝酒造社製、 1 9 98年 5月版） p 6記載の条件、 それ以外の鎖長増幅の場合は夕カラ L A PCR キッ ト v e r. 2. 1 (宝酒 造社製） に添付された説明書中の第 8頁記載の夕カラ LA Ta qDNAポリメ ラ一ゼの条件を参考に設定した。 サーマルサイクラ一としては、 夕カラ PCRサ 一マルサイクラ一 MP (宝酒造社製、 表 7中、 MPと称す） 、 夕カラ PCRサー マルサイクラ一パーソナル （宝酒造社製、 表 7中、 PPと称す） 、 ジーンアンプ ?じ尺システ厶9 6 00 (パーキン一エルマ一社製、 表 7中、 9 6 00と称す） の 3台を使用した。
表 7 増幅 1サイクルの温度条件 （上段）
DNA 使用機器 〔PCR総時間〕 （下段）
断片
の鎖長 (kb) 1.25U/50^1(PCR 試薬液） ポリメラ一ゼ A タカラ EX Taq
P P 98°C/10 秒， 68°C/60秒 98°C/5秒， 66°C/10秒 〔約 58分〕 〔約 27分〕
MP 98°C/10秒， 68°C/60秒 98°C 秒， 66°C/10秒 〔約 67分〕 〔約 37分〕
9 6 0 0 98°C/10秒， 68°C/60秒 98°C/ 少, 66°C/10秒
〔約 70分〕 〔約 36分〕
PP 98°C/10秒， 68°C/5分 98°C/5秒， 68°C/75秒 〔約 178 分〕 〔約 58分〕
MP 98°C/10秒， 68°C/5分 98 秒， 68で /75秒 〔約 187分〕 〔約 69分〕
9 6 0 0 98°C/10秒， 68°C/5分 98°C/1秒， 68°C/75秒 〔約 190分〕 〔約 67分〕
P P 98°C/10秒， 68°C/15分 98°C/5秒， 68°C/3分 〔約 478 分〕 〔約 110 分〕
MP 98°C/10秒， 68°C/15 分 98°C/1秒, 68°C/3分 2 0 〔約 487分〕 〔約 121 分〕
9 6 0 0 98°C/10秒， 68°C/15分 98°C/1秒, 68。C/3分 〔約 490 分〕 〔約 119 分〕 使用した铸型の種類、 铸型量、 プライマー対、 酵素量および PC R試薬液組成 は、 実施例 2と同一とした。 表 7記載の条件で 3 0サイクルの PCRを実施した 後、 その増幅産物量を実施例 2— ( 3) 記載の方法で定量した。 なお、 夕カラ P CRサーマルサイクラ一パーソナルについては、 1. 2 5 U使用の場合はノーマ ルモ一ド、 ポリメラーゼ A使用の場合は fastモードで設定した。
この結果、 1. 2 5 U/5 0 / 1 (PCR試薬液） の夕カラ EX Ta q D NAポリメラ一ゼ、 ポリメラ一ゼ Aを用いてそれぞれの条件で得られた増幅産物 量に差は見られなかった。 すなわち、 PCRパフォーマンスで表される酵素活性 は同等であった。 一方、 表 7の結果より、 増幅反応全体に要する時間、 すなわち P C R総時間はポリメラーゼ Aを使用することにより約 1 / 2〜約 1 / 5に著し く短縮され、 高速 PCRが可能であることが示された。 このことから、 本発明の 有効量の DNAポリメラ一ゼを使用した場合には、 設定時間が短縮されているに もかかわらず、 1サイクルあたりの増幅率は標準的な反応条件のものと同等であ ることが示された。 なお対照として 1. 25UZ50 1 (PCR試薬液） の夕 カラ EX Taq DNAポリメラ一ゼを使用して、 上記のポリメラーゼ Aにつ いて用いられた反応条件で PC Rを行なったところ、 どのプライマ一対を用いた 場合も増幅は確認できなかつた。 実施例 4
夕カラ Taq DNAポリメラ一ゼおよびポリメラーゼ Aを使用した、 それぞ れに適した反応条件での P C Rを実施した場合の増幅産物量の比較を行つた。 铸 型として λϋΝΑ、 プライマ一対としてプライマー； 1および; I 2を使用して増 幅される約 500 b ρの産物の量を指標とした。
a) 夕カラ Taq DNAポリメラ一ゼ反応系： TaKaRa PCR Amplification Ki t を使用して、 該キットの取扱い説明書の記載に従い、 添付の反応用緩衝液を用 いて l ngもしくは l O O pgの ADNA、 1 0 pmo 1ずつのプライマ一； I 1 および； 12、 1. 25Uの夕カラ Taq DNAポリメラ一ゼ、 それぞれ終濃度 0. 2mMの dATP、 dCTP、 d G T Pおよび d TT Pを含む最終容量 50 II 1の PCR試薬液を調製した。 サ一マルサイクラ一は、 PCRシステム 960 0を使用した。 反応は、 94°C、 30秒〜55 、 30秒〜72 、 30秒を1 サイクル、 1サイクルあたり約 1 67秒の設定で 25サイクル行なった。 反応終 了後、 8 z lずつを、 0. 00005 %ェチジゥムブロマイドを含む 1 %ァガロ ースゲルにて電気泳動し、 増幅断片を確認した。 さらにイメージアナライザー F M-B I 0にて検出感度を調整しながら、 既知量の DN A分子量マーカーを対照 として増幅産物断片量を定量した。
b) ポリメラーゼ A反応系： 5 OmM トリス—酢酸 （pH8. 5) 、 それぞれ 0. 2mMの dATP、 dCTP、 dGTPおよび dTTP、 3mM 酢酸マグ ネシゥ厶、 5 OmM 酢酸カリウム、 1 ngもしくは 1 00 pgの； IDNA、 1 0 pmo 1ずつのプライマー； I 1および； I 2、 0. 5 1のポリメラ一ゼ八、 2 . 5 gのアルギン酸ナトリウムとを含む最終容量 50 1の PCR試薬液を調 製した。 サーマルサイクラ一は、 PCRシステム 9600を使用した。 PCRは 、 98°C、 5秒〜 55eC、 5秒〜 72°C、 5秒を 1サイクルとした 25サイクル の反応を行なった。 反応終了後の試料 8 1を 0. 00005 %ェチジゥムプロ マイドを含む 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、 増幅断片を確認した。 さらに イメージアナライザー FM— B I〇にて検出感度を調整しながら、 既知量の DN A分子量マ一力一を対照として増幅産物量を定量した。 この定量値を前記の 1.
25Uの夕カラ Ta q DNAポリメラーゼについて得られた増幅産物の定量値 と比較した。
その結果、 どちらの酵素を使用した場合も 1 ngの；lDNAを铸型に用ぃた場 合の方が増幅産物量は多かった。 また、 同一の铸型量での増幅産物量はタカラ T a q DNAポリメラ一ゼ、 ポリメラ一ゼ Aの間で差は見られず、 両 PCRで実 質的に同量の DN A断片が増幅されていることが示された。 すなわち PC Rパフ オーマンスで表される酵素活性は両 PCRにおいては同等であった。 従って、 同 じサイクル数の反応において、 夕カラ Taq DNAポリメラーゼ系で 72 °C、
30秒間の伸長反応時間であつたのに対し、 ポリメラ一ゼ A反応系では、 72°C 、 5秒間の伸長反応時間で十分であった。
即ち、 従来法で 1サイクル当たり約 1 67秒が、 1サイクル当たり約 92秒に 短縮された高速 PC Rが可能であり、 PCR総時間、 は約 1/2に短縮された高 速 P C Rが可能となることが確認できた。 実施例 5 酸性物質による Ta q DNAポリメラーゼ合成活性の促進
( 1) フコース硫酸含有多糖一 Fの調製
以下の実施例において使用されたフコース硫酸含有多糖一 Fはすべて下記の方 法で精製されたものである。 以下にフコース硫酸含有多糖— Fの調製例を示す。 ガゴメ昆布を充分乾燥後、 乾燥重量 20 kgのガゴメ昆布を粉砕した。 ついで 、 得られた乾燥粉末を 7. 3 kgの塩化カルシウム · 2水和物を含む 9 0 0リツ トルの水道水に懸濁し、 攪拌しながら 4 0分かけて 9 0°Cまで昇温し、 9 0°C〜 9 5 °Cに保持して 1時間抽出を行なった。 その後、 得られた溶液を 20°Cまで冷 却し、 攪拌を止めて、 一晩放置し、 抽出物を得た。
次に遠心分離機 （ウェストファリアセパレーター社製 CNA型） を用いて固液 分離を行なった。 上記抽出物を遠心分離機により、 固液分離上清液を約 9 0 0リ ットル得た。 その内の 3 60リットルを 3ミクロンサイズのフィルター （日本食 品濾材社製） を組込んだスパクラフィルター （日本染色機械社製） にてろ過した 。 分画分子量 3万の UF膜 （FE 1 0-FC-FUS 0 382、 ダイセル化学ェ 業社製） により 20リットルまでろ過液を濃縮した後、 得られた濃縮液に水道水 を 20リツトル加えて、 再度 20リッ トルまで濃縮した。 上記のように希釈濃縮 操作を 5回繰返した後、 濃縮液を約 25リットル得た。
上記濃縮液 70 0 m 1に最終濃度が 0. 2M塩化カルシウム、 20mM酢酸ナ トリウムになるように添加した後、 0. 2M塩化カルシウムを含む、 20mM酢 酸ナトリウム平衡化バッファー （pH 6. 0) にて透析した。 透析処理後の溶液 を上記平衡化バッファー 1 0リツトルで平衡化した 350 0 m lの DEAE—セ ファロース FFカラム （カラム内径： 9, 7 cm) にかけ、 5リットルの平衡化 バッファーで洗浄した。 次に以下に示す 3段階のグラジェント条件で溶出を行な つた。
なお、 クロマトグラフィーの流速は、 35 0 0 m 1ノ 1時間に設定した。 グラジェント条件：
1〕 0〜0. 5M 塩化ナトリウムのリニアグラジェント
(溶出液量： 4. 5リッ トル）
2〕 0. 5〜し 0M 塩化ナトリウムのリニアグラジェント
(溶出液量： 4. 5リツ トル）
3) 1. 0〜2. 0M 塩化ナトリウムのリニアグラジェント
(溶出液量： 4. 5リッ トル）
溶出液は、 1フラクション当たり 250 mlずつ集めた。 各フラクションにつ いて、 フエノール硫酸法で糖定量、 力ルバゾール硫酸法でゥロン酸定量を行なつ た。 その結果、 糖含有量が高く、 ゥロン酸の量が低いフラクションであるフラク シヨン No. 40〜53の画分を得た。 フラクション No. 40〜53の画分を フコース硫酸含有多糖一 F画分と称す。 フコース硫酸含有多糖一 F画分を 1 0万 の限外ろ過膜にて濃縮後、 5 OmMクェン酸ナトリウムにて透析を行い、 さらに 蒸留水にて一晩透析した。 引き続き、 凍結乾燥を行ない、 フコース硫酸含有多糖 —F画分よりフコース硫酸含有多糖一 Fを 1. 696 g得た。
(2) Taq DNAポリメラーゼに対する酸性物質の影響
酸性物質として実施例 5 (1)記載の方法により得られたフコース硫酸含有多 糖— F、 デキストラン硫酸パウダー （オンコ一社製） またはアルギン酸ナトリウ ム （ 1 00〜1 50センチポアズ、 和光純薬社製） を使用し、 これらが夕カラ T a q DNAポリメラーゼ （宝酒造社製） の活性に与える影響を調べた。
铸型として； IDNA、 プライマ一対としてプライマ一 λ 1およびス 7、 DNA ポリメラ一ゼとして夕カラ Ta q DNAポリメラーゼを含む PCR試薬液を調 製し、 PCRを行なった。 PCR試薬液は以下の組成になるように調製した。 PCR試薬液組成：
夕カラ Taq DNAポリメラーゼ用緩衝液、 1 0Uの夕カラ Taq DNAポ リメラーゼ、 1 0 0 p gの； DNA、 それぞれ 0. 2mMの dATP、 dCTP 、 d GTPおよび dTTP、 ならびに 5 pmo 1ずつのプライマ一 λ 1および； I 7 (最終容量は 25 1 ) 。 さらに前記 PC R試薬液中に、 酸性物質として 0. 25 n gのフコース硫酸含有多糖一 F、 0. 25 n gのデキストラン硫酸パウダ —または 0. 5 gのアルギン酸ナトリゥムを添加した。
反応は 9 8°C、 5秒〜 6 8°C、 3分を 1サイクノレとし、 3 0サイクル、 PCR 総時間、 約 1 1 0分で行なった。 反応終了後、 試料 5 1を 0. 00 0 0 5 %ェ チジゥムブロマイドを含む 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、 増幅断片を確認 した。 その結果を表 8に示す。
表 8 酸性物質 添加量 増幅結果
フコース硫酸含有多糖一 F 0. 25 n g + +
デキストラン硫酸パウダー 0. 25 n g + +
アルギン酸ナトリウム 0. 5 z g + +
無添加
++：強い増幅が見られる
+：増幅が見られる
土：わずかな増幅が見られる
一 ：増幅は見られない
表 8に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも予想される 8 k bの断 片が良好に増幅されていることが確認され、 高速 PC Rを行うことができた。 な お、 本実施例において鐯型 DNAを 1 0 O p gから 1 n gに増やすと、 酸性物質 無添加の場合^: 'も目的の増幅産物量が向上した。 一方、 1. 25Uの夕カラ Ta q DNAポリメラーゼ及び铸型 DNAを 1 n g使用して上記 P C R条件で行つ ても、 目的の増幅産物は得られなかった。 酸性物質の添加により、 一層高性能な 高速 P C Rが可能であることが示された。 実施例 6 LA— PCR用 DNAポリメラーゼと酸性物質の組み合わせによる高 速 PCR
3' →5' ェキソヌクレア一ゼ活性を有する DNAポリメラ一ゼと該活性を有 しない DN Aポリメラーゼの組合わせからなる LA— PC R法において酸性物質 存在下の高速 P C Rについて検討した。
( 1 ) ポリメラーゼ Aと酸性物質の組み合わせによる高速 PC R
λϋΝΑを铸型として用い、 プライマ一； 1 および； 8を含む PCR試薬液を 調製し、 PCRを行った。 PCR試薬液組成を以下に示す。
PCR試薬液組成：
5 OmM トリス—酢酸 （pH8. 5) 、 それぞれ 2mMの dATP、 dC TP、 dGTPおよび dTTP、 3 mMの酢酸マグネシウム、 5 OmM 酢酸力 リウム、 1 0pgの；lDNA、 0. 5 1のポリメラ一ゼ Aならびに 1 0 pmo 1ずつのプライマ一； I 1および λ 8 (最終容量は 25 1)。 さらに前記 PCR 試薬液中に、 2. 5 U gのアルギン酸ナトリウムを添加した。 対照としてアルギ ン酸ナトリゥム無添加の P CR試薬液も調製した。
反応条件： 98°C、 5秒〜 68で、 75秒を 1サイクルとする 30サイクル反 応。 夕カラ PCRサーマルサイクラ一パーソナル （宝酒造社製） を使用し、 fast モードで行なった。
反応終了後、 得られた各試料 6 1づっを 0. 00005 %のェチジゥムブ口 マイドを含む 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、 約 1 0 kbの増幅断片を確認 した。 その結果を表 9に示す。 酸性物質 増幅結果
アルギン酸ナトリゥム添加 + +
無添加
++ ：強い増幅が見られる
+：増幅が見られる
土：わずかな増幅が見られる
一 ：増幅は見られない
表 9に示したようにアルギン酸ナトリウムを添加した場合には、 約 1 O kbの 断片が増幅されていることが確認された。 一方、 アルギン酸ナトリウム無添加の 場合は、 上記の反応条件では約 1 0 kbの増幅断片は確認できなかったが、 铸型 DNA量を 1 0 p gから 1 n gに増やして、 同様の P C Rを行うと目的の増幅断 片が確認できた。 なお、 铸型 DNA量を 1 ngにした場合でも、 標準的な使用量 の夕カラ EX Ta q DNAポリメラ一ゼを用いた PCRでは、 目的断片の増 幅は確認できなかった。 酸性物質の添加により、 一層高性能な高速 PC Rが可能 であることが示された。
(2) ポリメラ一ゼ Bと酸性物質の組み合わせによる高速 PC R
铸型として λϋΝΑ、 プライマー対としてプライマ一 λ 1および; I 9を含む Ρ CR試薬液を調製し、 PCRを行なった。 PCR試薬液の組成を以下に示す。 PCR試薬液組成：
夕カラ EX Ta q DNAポリメラ一ゼ用緩衝液、 それぞれ 0. 2mMの dA TP、 dCTP、 dGTPおよび dTTP、 1 0 pgの； IDNA、 0. 5 ^ 1の ポリメラ一ゼ Bならびに 5 pmo 1ずつのプライマ一； I 1および； I 9 (最終容量 は 25 1 )。 さらに前記 PC R試薬液中に、 それぞれ 75 n gのフコース 硫酸含有多糖一 Fまたは 5 gのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は、 98°C、 5秒〜 68°C、 3分を 1サイクルとした 30サイクルで行な つた。 反応終了後、 得られた試料 5 1を 0. 00005 %ェチジゥムブ口マイ ドを含む 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、 増幅断片を確認した。 その結果を 表 1 0に示す。
表 1 0 酸性物質 添加量 増幅結果 フコース硫酸含有多糖一 F 5 n g + + アルギン酸ナトリウム 5 g
無添加 +
+〜 +++ ：増幅の程度を 3段階で示す
表 1 0に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも酸性物質無添加の場 合に比べて、 目的の 1 2 kbの増幅断片量が向上していることが確認された。 実施例 7
PCRに使用する D N Aポリメラ一ゼ酵素量と酸性物質の効果および反応時間 への影響について検討した。
铸型として; IDNA、 プライマ一対としてプライマー； I 1および; I 8を含む P CR試薬液を調製し、 PCRを行なった。 この PCRには夕カラ EX Ta q DNAポリメラーゼ、 ポリメラーゼ Bを使用した。 PCR試薬液の組成を以下に 示す。
PCR試薬液組成：
夕カラ EX Ta q DNAポリメラ一ゼ用緩衝液、 それぞれ 0. 2mM d A TP、 dCTP、 dGTPおよび dTTP、 l Opgの； IDNA、 1. 25Uの 夕カラ EX Taq DNAポリメラ一ゼまたは 0. 5 1のポリメラーゼ Bお よび 1 0 pmo 1ずつのプライマー； I 1および; I 8 (最終容量は 50 1 ) 。 さらに前記 PC R試薬液中に、 2. 5〃 gのアルギン酸ナトリウムを添加した PCR試薬液を調製した。 反応は 9 8°C、 5秒〜 6 8°C、 2分を 1サイクルとし、 30サイクル、 PCR 総時間、 約 80分で行なった。 反応終了後、 得られた試料 8 1を 0. 0 0 0 0 5%ェチジゥムブ口マイドを含む 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、 増幅断片 を確認した。 その結果を表 1 1に示す。
表 1 1 使用酵素 添加量 増幅結果
1.25U/50 /1 (PCR試薬液）タカラ EX-Taq 無添加
ポリメラーゼ B 無添加 +
ポリメラ一ゼ B 2. 5 / g + +
++：強い増幅が見られる
+：増幅が見られる
土：わずかな増幅が見られる
一：増幅は見られない
表 1 1に示されるようにポリメラ一ゼ Bを使用した場合およびポリメラーゼ B にアルギン酸ナトリウムを添加した場合の両方において、 予想される 1 O kbの 断片が増幅されていることが確認され、 高速 PCRを行なうことができた。 さら に、 増幅産物量をイメージアナライザー FM— B I 0 (宝酒造社製） にて定量し たところポリメラーゼ Bにアルギン酸ナトリウムを添加した場合が添加していな レ、場合に比べて約 5倍の増幅産物量であり、 より高速の P C Rが可能になつた。 一方、 夕カラ EX T a q取扱い説明書に記載の標準的な使用量である 1. 25
Uの夕カラ EX Ta q DN Aポリメラ一ゼを単独で使用した場合、 高速 PC
Rによる増幅は確認されなかった。
実施例 8
DNAポリメラーゼに対するスパガリン類と酸性物質の組合わせの効果を検討 した。
( 1 ) 铸型として； IDNA、 プライマー対としてプライマー； I 1及び； I 8を含む PCR試薬液を調製し、 高速 PCRを行なった。 この PCRにはポリメラーゼ B を使用した。 スパガリン類として 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩、 酸性物質 としてアルギン酸ナトリウム （和光純薬社製） を使用した。 PCR試薬液の組成 を以下に示す。
PCR試薬液組成：
5 OmM トリスー酢酸緩衝液 （pH8. 5) 、 それぞれ 0. 2mMの dATP 、 dCTP、 dGTP及び dTTP、 3mM 酢酸マグネシウム、 5 0 mM 酢 酸カリウム、 1 0 p gの； IDNA、 1 0 pmo 1ずつのプライマ一 λ 1及び λ 8 。 前記 PCR試薬液に 0. 5 1のポリメラ一ゼ Bを添加し、 さらに表 1 0に示 した濃度の 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩及びアルギン酸ナトリゥムを組合 わせて添加して最終容量を 50 L 1 とした。 また、 対照として、 1 5—デォキシ スパガリン 3塩酸塩を添加せず 2. 5 gのアルギン酸ナトリゥムを添加した P CR試薬液、 並びに 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩及びアルギン酸ナトリウ ムの両方が添加されていない PC R試薬液のそれぞれを調製した。
反応は 9 8°C、 5秒〜 6 8°C、 90秒を 1サイクルとし、 30サイクル、 PC R総時間約 65. 5分の高速 PC Rで行なった。 反応終了後、 得られた試料液 8 / 1を 0. 0 0 0 0 5 %のェチジゥムブ口マイドを含む 1 %ァガロースゲルにて 電気泳動し、 増幅断片を確認した。 その結果を表 1 2に示す。
表 1 2 スパガリン類 酸性物質 （添加量） 増幅結果
15-デ才キシスパガリン Z了ルギン酸ナトリウム
1 20 M / 2. iig
1 0 0 M / 2. 5 z g + + + +
8 0 M / 2. 5 g
6 0 /M / 2. 5 / g + +
2 0 zM / 2. 5 g + 無添加 / 2. 5 g + 無添加 無添加
+〜+ + + + :増幅の程度を 4段階で示す
一 ：増幅はみられない
表 1 2に示されるように 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩とアルギン酸ナト リウムを組合わせて添加する系において 1 0 kbの DNA増幅反応が促進され、
?〇尺総時間約6 5. 5分の高速 PCRが可能となることを確認した。 なお、 本 実施例において、 铸型 DNA量を 1 0 p gから 1 n gに増やした場合は、 スパガ リン類及び酸性物質が両方無添加であつても目的とする増幅産物が確認できた。 一方、 1. 2511のタカラ丁& 9 DNAポリメラ一ゼ及び铸型 DNAを 1 n g 使用して上記 PCR条件で行っても、 目的の増幅産物は得られなかった。 酸性物 質の添加により、 一層高性能な高速 PCRが可能であることが示された。
(2) 铸型 DNAが大腸菌ゲノム DN Aの場合について、 スパガリン類と酸性物 質の組合わせの効果を検討した。 P C R試薬液の組成を以下に示す。
PCR試薬液組成：
5 n gの大腸菌ゲノム DNA (宝酒造社製） 、 1 0 pmo 1ずつのブライマー Ec 0-1 及び Eco-6以外は、 実施例 8 ( 1 ) 記載の PCR試薬液組成と同一にした。 前記 PCR試薬液に 0. 5 1のポリメラ一ゼ Aを添加し、 さらに 2. 5〃gの アルギン酸ナトリウムと最終濃度が、 1 M、 5 M、 又は 1 0 Mになるよう に 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩をそれぞれ組合わせて添加し、 最終容量を 5 0 1 とした。 また、 対照として、 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩を添加 せず 2. 5 gのアルギン酸ナトリウムのみ添加した PCR試薬液、 並びに 1 5 —デォキシスパガリン 3塩酸塩及びアルギン酸ナトリウムの両方が添加されてい ない PC R試薬液のそれぞれを調製した。
反応は 9 8°C、 5秒〜 6 8°C、 3分を 1サイクノレとし、 3 0サイクル、 PCR 総時間約 1 1 0分の高速 PC Rで行なった。 反応終了後、 得られた試料 8 1を 0. 0 0 0 0 5 のェチジゥムブ口マイ ドを含む 1 %ァガロースゲルにて電気泳 動し、 増幅断片を確認した。 その結果を表 1 3に示す。
表 1 3 スパガリン類/酸性物質 （添加量） 増幅結果
15-デ才キシスパガリン 了;レギン酸ナトリウム
Figure imgf000045_0001
5 μ,Μ/2. 5 z g + +
Figure imgf000045_0002
無添加/ 2. 5 g 土
無添加 Z無添加 一
++ ：強い増幅が見られる
+ ：増幅が見られる
土 ：わずかな増幅が見られる
―：増幅は見られない
表 1 3に示されるように 1 5—デォキシスパガリン 3塩酸塩とアルギン酸ナト リゥ厶を組合わせて添加する系において 2 0 kbの DNA増幅反応が促進され、
PCR総時間約 1 1 0分の高速 PCRが可能となることを確認した。 なお、 本実 施例において、 铸型 DNA量を 5 n gから 2 0 n gに増やした場合、 スパガリン 類及び酸性物質が両方無添加であつても目的とする増幅産物が確認できた。 一方 、 1. 2511の夕カラ丁39 DNAポリメラ一ゼ及び铸型 DNAを 1 n g使用 して上記 PCR条件で行っても、 目的の増幅産物は得られなかった。 酸性物質の 添加により、 一層高性能な高速 P C Rが可能であることが示された。
実施例 9 キッ トの調製
(1) ポリメラーゼ A又はポリメラーゼ Bを使用するキット
本発明の高速 PCR用のキット （20回分） を構築した。
キッ ト組成を以下に示す：
• 1 0 X反応バッファー 50 / 1 50 OmM トリス—酢酸 （pH8. 5)
50 OmM 酢酸力リウム
3 OmM 酢酸マグネシウム
• 2. 5mM dNTPミックス 80 1
(各 2. 5mMの dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP)
• DNAポリメラーゼ酵素液 1 0 1 ポリメラ一ゼ Aまたはポリメラ一ゼ B 上記のキットを用いて PC R試薬液を調製した。 铸型として大腸菌ゲノム DN Aを使用した。 以下に PC R試薬液組成を示す。
PCR試薬液組成：
1 0 X反応バッファー 1
dNTPミ ックス a 1
DNAポリメラ一ゼ酵素液 H 1
大腸菌ゲノム DNA n g
Eco-1 プライマー pm o
Eco-2プライマー 0 p m o 1
滅菌蒸留水
50 / 1
上記 PCR試薬液を実施例 2— (3) に示した PCR条件で反応させたところ 約 2 k b pの目的の増幅断片が確認できた。
(2) ポリメラーゼ A又はポリメラーゼ Bを使用しさらに酸性物質を含むキット 本発明の高速 PCR用のキット （2 0回分） を構築した。
キッ ト組成を以下に示す：
• 1 0 X反応バッファー 5 0 1
5 0 OmM トリス—酢酸 （pH 8. 5)
5 0 OmM 酢酸力リウム
3 OmM 酢酸マグネシウム
25〃 g アルギン酸ナトリウム （ 1 0 0〜 1 50センチポアズ）
• 2. 5mM dNTPミ ックス 8 0 1
(各 2. 5mMの dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP)
DNAポリメラ一ゼ酵素液 1 0 1 ポリメラ一ゼ Aまたはポリメラ一ゼ B 上記のキットを用いて PCR試薬液を調製した。 铸型として; IDNAを使用し た。 以下に PC R試薬液組成を示す。
PCR試薬液組成：
1 0 X反応バッファー 5 1
dNTPミ ックス 4 1
DNAポリメラーゼ酵素液 . 5 1
ADNA 1 n g
λ 1プライマ一 1 0 pm ο 1
λ 8プライマー 1 0 p m o 1
滅菌蒸留水
5 0 z 1
上記 PCR試薬液を実施例 7に示した PCR条件で反応させたところ約 1 0 k b pの目的の増幅断片が確認できた。
(3) ポリメラーゼ A又はポリメラーゼ8、 酸性物質及びスパガリン類を含むキ ッ卜
本発明の高速 PCR用のキット （2 0回分） を構築した。 キット組成を以下に示す：
• 1 0 X反応バッファ一 1 00 1
50 Om トリスー酢酸 （pH 8. 5)
50 OmM 酢酸力リウム
3 OmM 酢酸マグネシウム
0. 04% アルギン酸ナトリウム （ 1 00〜1 50センチポアズ）
ImM 1 5—デォキシスパガリ ン 3塩酸塩
2mM dNTPミ ックス 1 60 / 1 各 2mMの dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP)
DNAポリメラーゼ酵素液 1 0 1 ポリメラーゼ B濃縮液
上記のキットを用いて PCR試薬液を調製した。 铸型として； IDN Aを使用し た。 以下に PC R試薬液組成を示す。
1 0 X反応バッファー 5 1
dNTPミ ックス 8 1
DNAポリメラーゼ酵素液 5 a 1
ADNA 0 P g
λ 1プライマ一 0 p m o
λ 8プライマー 0 p m o
滅菌蒸留水
最終容量 50 1
上記 PCR試薬液を実施例 8—（1) に示した PCR条件で反応させたところ 約 1 0 kb pの目的の増幅断片が確認できた。
産業上の利用可能性
本発明の DN A合成方法及び DN A合成反応用キットにより、 遺伝子工学の分 野において有用な高速 P C Rが提供され、 P C Rが関与する遺伝子工学的研究、 産業における操作を高速化できるという優れた効果を奏する。 また、 前記 DNA 合成方法、 DNA合成反応用キット及び本発明の PCR用試薬の製造品は、 PC R法が使用できる全分野における操作の高速化及び活性化に極めて有用である。 さらに、 本発明によれば、 短時間で多量の DNA増幅サンプルの取り扱い、 多量 の PCR産物の調製が可能になり、 本発明は、 PCR法に基づく遺伝子診断分野 、 遺伝子診断用 DN Aチップの作製等多方面で活用することができる。

Claims

請求の範囲
1. ポリメラーゼ チェーン リアクション （PCR) 法による DNAの合成 に要する時間を短縮させた DNA合成方法であって、 下記 （A) 及び （B) に示 す条件で PC Rを行なった場合に、 反応液 50 a 1あたりに 1 O ngを超える約 2 kbの増幅 DNA断片を与えるに有効な量の DNAポリメラーゼを使用するこ とを特徴とする DNA合成方法：
(A) 反応液： DNAポリメラ一ゼ、 1 ngの大腸菌ゲノム DNA、 それぞれ 1 Opmolのプライマ一 Eco- 1 及び Eco-2 (プライマ一 Eco- 1 及び Eco-2 の塩基配 列をそれぞれ配列表の配列番号： 1 0及び 1 1に示す） を含有し、 かつ該 DNA ボリメラーゼに適した組成の容量 5 0 a 1の反応液、 ならびに
(B) 反応条件： 9 9°C、 1秒〜 6 6°C、 7秒を 1サイクルとする 35サイク ルの P CR。
2. 2種以上の DNAポリメラーゼを使用する請求項 1記載の DN A合成方法
3. 3' →5' ェキソヌクレア一ゼ活性を有する DNAポリメラ一ゼと 3' → 5' ェキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない他の DN Aポリメラーゼとを使 用する請求項 2記載の D N A合成方法。
4. 酸性物質及び/又はその塩の存在下に PCRを行なうことを特徴とする請 求項 1〜 3いずれか記載の DN A合成方法。
5. 酸性物質が酸性高分子物質である請求項 4記載の DN A合成方法。
6. 酸性高分子物質が糖鎖骨格を有する物質である請求項 5記載の DN A合成 方法。
7. 酸性高分子物質及び/又はその塩が、 フコース硫酸含有多糖、 デキストラ ン硫酸、 カラギ一ナン、 へパリン、 ラムナン硫酸、 コンドロイチン硫酸、 デルマ タン硫酸 （コンドロイチン硫酸 B) 、 へパラン硫酸、 ヒアルロン酸、 アルギン酸 、 ぺクチン、 ポリグル夕ミン酸、 ポリアクリル酸、 ポリビニル硫酸、 ポリスチレ ン硫酸、 D N A及びそれらの塩からなる群より選択された 1種以上である請求項 5又は 6記載の DN A合成方法。
8. スパガリン類、 その分解物及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なく とも 1種の存在下に P C Rを行なう、 請求項 1〜 7レ、ずれかに記載の D N A合成 方法。
9. 請求項 1〜8いずれか記載の DNA合成方法に用いられるキットであって 、 該キットの指示書に従って調製される PC R試薬液が、 下記 （A) 及び （B) に示す条件で PC Rを行なった場合に、 反応液 5 0 / 1あたりに 1 O n gを超え る約 2 kbの増幅 DN A断片を与えるに有効な量の DN Aポリメラーゼを含むこ とを特徴とする DNA合成用キット ：
(A) 反応液： DNAポリメラ一ゼ、 1 n gの大腸菌ゲノム DNA、 それぞれ 1 Opmolのプライマ一 Eco- 1 及び Eco- 2 (プライマ一 Eco- 1 及び Eco-2 の塩基配 列をそれぞれ配列表の配列番号： 1 0及び 1 1に示す） を含有し、 かつ該 DNA ポリメラ一ゼに適した組成の容量 5 0 1 の反応液、 ならびに
(B) 反応条件： 9 9°C、 1秒〜 6 6°C、 7秒を 1サイクルとする 35サイク ルの PCR。
1 0. 2種以上の DNAボリメラーゼを含有する請求項 9記載の DNA合成用 キッ 卜 o
1 1. 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を有する DNAポリメラ一ゼと 3' →5' ェキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない他の DN Aポリメラーゼとを 含有する請求項 1 0記載の DN A合成用キッ ト。
1 2. 該キッ トの指示書に従って調製される PCR試薬液が酸性物質及び/又 はその塩を含有してなる混合液である、 請求項 9〜1 1いずれか記載の DN A合 成用キッ ト。
1 3. 酸性物質が酸性高分子物質である請求項 1 2記載の DN A合成用キッ ト
1 4. 酸性高分子物質が糖鎖骨格を有する物質である請求項 1 3記載の DNA 合成用キッ ト。
1 5. 酸性高分子物質及び 又はその塩が、 フコース硫酸含有多糖、 デキスト ラン硫酸、 カラギ一ナン、 へパリン、 ラムナン硫酸、 コンドロィチン硫酸、 デル マタン硫酸 （コンドロイチン硫酸 B) 、 へパラン硫酸、 ヒアルロン酸、 アルギン 酸、 ぺクチン、 ポリグル夕ミン酸、 ポリアクリル酸、 ポリビニル硫酸、 ポリスチ レン硫酸、 DNA及びそれらの塩からなる群より選択された 1種以上である請求 項 1 3又は 1 4記載の DN A合成用キッ ト。
1 6. 該キッ 卜の指示書に従って調製される PCR試薬液が、 スパガリン類、 その分解物及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なくとも 1種をさらに含有 してなる混合液である、 請求項 9〜1 5いずれか記載の DN A合成用キット。
1 7. 該キットの指示書に従って調製される PCR試薬液が、 請求項 1 3〜1 5レ、ずれか記載の酸性物質とスパガリン類またはその分解物との塩を含有してな る混合液である、 請求項 9〜1 1いずれか記載の DNA合成用キット。
1 8. 包装材と該包装材中に封入された PCR用試薬からなる製造品であって 、 該 PCR用試薬が DNAポリメラーゼを含有し、 該包装材に付されたラベルま たは包装材に添付された指示書に前記 PCR試薬が短時間での PCRに使用でき ることが表示されてなる、 PCR用試薬の製造品。
1 9. PCR用試薬が、 DNAポリメラーゼと、 該 DNAポリメラーゼに適す る緩衝液及び Z又は dNTPとを含有してなる、 請求項 1 8記載の PCR用試薬 の製造品。
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