JPH08322597A - 核酸の増幅方法およびその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 短い反応時間で正確性の高い核酸を増幅する
酵素および増幅方法を提供する。 【構成】 ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０塩基／秒で
あり、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
る、超好熱始原菌ＫＯＤ１由来の熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼならびに該酵素を使用する核酸の増幅法、検出法
およびこれらの方法に使用される試薬キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、短い反応時間で正確性
の高いＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する核酸の増幅方法、
該増幅法を利用する核酸の検出方法およびこれらの方法
に使用されるＤＮＡポリメラーゼおよび試薬キットに関
する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、大腸菌のような中温性細菌の
ＤＮＡポリメラーゼおよび中温性細菌に感染するファー
ジ由来のＤＮＡポリメラーゼについては、既に多くの研
究がなされている。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）等の核酸増幅を用いる組換えＤＮＡ技術に有用な耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する研究も多くなされてい
る。ＰＣＲ反応に用いられる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
としては、主としてサーマス・サーモフィラス(Thermus
thermophilus)由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリ
メラーゼ) や、サーマス・アクアチカス(Thermus aquat
icus) 由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラー
ゼ）などがある。またパイロコッカス・フリオサス(Pyr
ococcus furiosus）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ
ポリメラーゼ）、サーモコッカス・リトラリス(Thermoc
occus litoralis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖ
ｅｎｔポリメラーゼ）なども知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、Ｔａｑ
ポリメラーゼはＤＮＡ合成の際の正確性や熱安定性が不
十分でない。また、正確性や熱安定性に優れたＰｆｕポ
リメラーゼが開発されたが、このＰｆｕポリメラーゼは
ＤＮＡ合成速度が低く、プロセッシビリティが低い等の
問題があり、特殊なＰＣＲにのみ利用されていた。最
近、２０ｋｂ以上のＤＮＡを増幅するＰＣＲ（以後、ｌ
ｏｎｇ−ＰＣＲと呼ぶ）が開発されたが、このｌｏｎｇ
−ＰＣＲ法はＴａｑポリメラーゼとＰｆｕポリメラーゼ
の両酵素を混合し、両酵素の特性を利用したものであっ
た。異なる性質をもつ２つの酵素を同じ反応系で作用さ
せた場合、適正な反応条件に、ずれが生じて、それぞれ
の長所である高い合成速度や正確性が本当に保たれてい
るのか疑問がある。また、両酵素の熱安定性や保存溶液
の組成の相違から同じ容器内で保存した場合の安定性に
も疑問がある。そのため、これらの長所を合わせ持つ新
規な熱安定性ポリメラ−ゼが待ち望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、新規な超
好熱始原菌ＫＯＤ１株より熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
を得ることに成功し、更にその特性を調査したところ、
前記の２つの酵素の長所、すなわち高い合成速度と高い
正確性を合わせもつことを見い出し、本発明に到達し
た。

【０００５】すなわち本発明は、標的核酸に、該核酸と
相補的な塩基配列を有するプライマーおよび４種のｄＮ
ＴＰを、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０塩基／秒であ
り、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で反応させ
て、標的核酸に上記プライマーをアニールさせ、プライ
マー伸長反応を行うことを特徴とする核酸の増幅方法で
ある。

【０００６】また本発明は、下記工程Ａ．〜Ｄ．を含む
試料中の標的核酸を増幅する方法において、熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼとして、ＤＮＡ合成速度が少なくとも
３０塩基／秒であり、かつ３’−５’エキソヌクレアー
ゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用するこ
とを特徴とする核酸の増幅方法である。 Ａ．必要により標的核酸を変性して、１本鎖核酸とする
工程、 Ｂ．該１本鎖核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を有す
る正方向および逆方向プライマーおよび４種のｄＮＴＰ
を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で反
応させて、１本鎖核酸に上記プライマーをアニールさ
せ、プライマー伸長反応を行う工程、 Ｃ．プライマー伸長物を分離して、１本鎖とする工程お
よび Ｄ．上記工程Ｂ．および工程Ｃ．を繰り返す工程。

【０００７】また、本発明は、下記工程Ａ．〜Ｅ．を含
む試料中の標的核酸を検出する方法において、熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼとして、ＤＮＡ合成速度が少なくと
も３０塩基／秒であり、かつ３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する
ことを特徴とする核酸の検出方法である。 Ａ．必要により標的核酸を熱変性して、１本鎖核酸とす
る工程、 Ｂ．該１本鎖核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を有す
る正方向および逆方向プライマーおよび４種のｄＮＴＰ
を熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で反応
させて、１本鎖核酸に上記プライマーをアニールさせ、
プライマー伸長反応を行う工程、 Ｃ．プライマー伸長物を分離して、１本鎖とする工程、 Ｄ．上記工程Ｂ．および工程Ｃ．を繰り返す工程および Ｅ．増幅産物を検出する工程。

【０００８】さらに本発明は、標的核酸に相補的な塩基
配列を有する正方向および逆方向プライマー、４種のｄ
ＮＴＰ、２価陽イオン、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３
０塩基／秒であり、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液を
含む核酸増幅用試薬キットである。

【０００９】また本発明は、標的核酸に相補的な塩基配
列を有する正方向および逆方向プライマー、４種のｄＮ
ＴＰ、２価陽イオン、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０
塩基／秒であり、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活
性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび増幅用緩衝
液を含む核酸増幅用試薬および標的核酸プローブおよび
検出用緩衝液を含む核酸検出用試薬キットである。

【００１０】本発明は超好熱始原菌ＫＯＤ１由来のＤＮ
Ａポリメラーゼである。

【００１１】また本発明は超好熱始原菌ＫＯＤ１由来の
ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡであ
る。

【００１２】さらに本発明は超好熱始原菌ＫＯＤ１由来
のＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡを
ベクターに挿入した組換えＤＮＡ発現ベクターである。

【００１３】また本発明は超好熱始原菌ＫＯＤ１由来の
ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベ
クターに挿入した組換えＤＮＡ発現ベクターを用いて形
質転換された組換え宿主細胞である。

【００１４】本発明は、超好熱始原菌ＫＯＤ１由来のＤ
ＮＡポリメラーゼをコードする単離されたＤＮＡをベク
ターに挿入した組換えＤＮＡ発現ベクターを用いて形質
転換された組換え宿主細胞を培養し、培養物からＤＮＡ
ポリメラーゼを採取することを特徴とする超好熱始原菌
ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼの製造法である。

【００１５】また本発明は、上記組換え宿主細胞を培養
し、（ａ）該組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、細胞
抽出物を調製し、（ｂ）組換え宿主細胞由来の不純蛋白
質を除去する工程を含むことを特徴とする超好熱始原菌
ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを精製する方法であ
る。

【００１６】本発明において増幅しようとする核酸は、
ＤＮＡまたはＲＮＡである。その核酸が含有される試料
はなんら制限されない。

【００１７】本発明に使用する熱安定性酵素は、ＤＮＡ
合成速度が少なくとも３０塩基／秒であり、かつ３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼである。具体例としては、超好熱始原菌ＫＯ
Ｄ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤポリメラーゼ
とも呼ぶ）があり、該酵素は天然から精製された熱安定
性酵素であっても、遺伝子組み換え法によって製造され
た酵素であってもよい。

【００１８】本発明においてＤＮＡ合成速度は、Ｍ１３
の１本鎖ＤＮＡ(1.6μg)とこれに相補的なプライマー(1
6pmole) をアニーリングさせたものを基質として、各種
ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｄｅｅｐ Ｖｅ
ｎｔ、Ｔａｑなど(5U)をそれぞれの緩衝液にて反応さ
せ、その反応時間と合成されるＤＮＡの大きさの関係か
ら算出する。本発明においては、ＤＮＡ合成速度が少な
くとも３０塩基／秒であることが必須である。各ポリメ
ラーゼのＤＮＡ合成速度は、ＫＯＤポリメラーゼ 105〜
130 塩基／秒、Ｐｆｕポリメラーゼ 24.8 塩基／秒、Ｄ
ｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ 23.3塩基／秒、Ｔａｑ
ポリメラーゼ 61.0 塩基／秒である。

【００１９】一方、本発明では熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するこ
とが必須である。本発明において３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性は、λＤＮＡのHindIII 分解産物の３’端
を ³Ｈでラベルしたものを基質として、各ポリメラーゼ
の至適条件で、 ³Ｈの脱離する割合を調べる。各ポリメ
ラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、Ｔａｑ
ポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼでは反応時間３時間
において、 ³Ｈの遊離が１０〜２０％しか認められない
が、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼでは、５
０〜７０％見られる。本発明において使用するＫＯＤポ
リメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
し、また、ＫＯＤポリメラーゼをコードする遺伝子に
は、Ｐｆｕポリメラーゼと同様の３’−５’エキソヌク
レアーゼ活性を示すＤＮＡ保存配列が存在することが確
認されている。

【００２０】本発明の実施例において、３’−５’エキ
ソヌクレアーゼ活性の有無は、λＤＮＡ HindIII分解物
の[³H]ＴＴＰを取り込ませたＤＮＡ断片を基質として、
ＫＯＤポリメラーゼを７５℃の反応温度で、緩衝液 (20
mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH6.5、10mMＫＣｌ、6mM(ＮＨ₄)₂
ＳＯ₄ 、2mM ＭｇＣｌ₂ 、0.1%Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、10μg/mlＢＳＡ) 中に放置し、遊離してくる[³H]Ｔ
ＴＰの割合を調べた。また、このとき、コントロール実
験として、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有しな
いＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラー
ゼについても、それぞれの緩衝液を用いて同様に調べ
た。各ポリメラーゼの使用力価は 2.5単位とした。

【００２１】基質ＤＮＡは、まずλＤＮＡの HindIII分
解物(10 μg)に、0.2mM のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴ
Ｐおよび[³H]ＴＴＰを添加して、クレノー・ポリメラー
ゼで３’端部を伸長反応した後、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿してＤＮＡ断片を回収し、さらにスパンカラ
ム（クローンテック社製）で遊離モノヌクレオチドを除
去して調製した。

【００２２】ＫＯＤポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ
は反応時間３時間で５０〜７０％の遊離[³H]ＴＴＰが検
出されるが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ
においては、１０〜２０％の遊離[³H]ＴＴＰしか認めら
れなかった。

【００２３】該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、配列番
号１に記載されるアミノ酸配列を含有することが好まし
い。

【００２４】さらに該熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、
下記理化学的性質を有する酵素であることが好ましい。 作用：ＤＮＡ合成活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ
活性を有する。 ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒である。 至適ｐＨ：６．５〜７．５（７５℃にて） 至適温度：７５℃ 分子量：約８８〜９０Ｋｄａ アミノ酸配列：配列番号・配列表１に記載

【００２５】超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリ
メラーゼを製造する方法は、その一例として鹿児島県子
宝島の硫化坑から単離した菌株であるＫＯＤ１株から耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングし、組換
え発現ベクターを構築し、該組換えベクターで形質転換
した形質転換体を培養し、培養物から耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼを採取し、精製して製造する。

【００２６】本発明では上記超熱好始原菌ＫＯＤ１株由
来のＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ合成活性と３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を有し、ＤＮＡ合成速度が少な
くとも３０塩基／秒である。この性質を利用して、核酸
の増幅反応を行う。

【００２７】本発明の核酸の増幅方法は、下記工程Ａ．
〜Ｄ．を含む。 Ａ．必要により標的核酸を変性して、１本鎖核酸とする
工程、 Ｂ．該１本鎖核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を有す
る正方向および逆方向プライマーおよび４種のｄＮＴＰ
を、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０塩基／秒であり、
かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で反応させて、１
本鎖核酸に上記プライマーをアニールさせ、プライマー
伸長反応を行う工程、 Ｃ．プライマー伸長物を分離して、１本鎖とする工程お
よび Ｄ．上記工程Ｂ．および工程Ｃ．を繰り返す工程。

【００２８】工程Ａにおいて、必要により標的核酸を変
性して、１本鎖核酸とする。その手段は熱的処理であっ
ても、化学的変性であっても、あるいは酵素的処理であ
ってもよい。好ましくは熱処理である。

【００２９】工程Ｂにおいて、該１本鎖核酸と標的核酸
に相補的な塩基配列を有する正方向および逆方向プライ
マーおよび４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）を、熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼを含む緩衝溶液中で反応させて、１本鎖核酸
に上記プライマーをアニールさせ、プライマー伸長反応
を行う。標的核酸に相補的な塩基配列を有する正方向プ
ライマーおよび逆方向プライマーとは、標的核酸のうち
の一方に相補的であり、他方に対して相同的である塩基
配列を有するオリゴヌレオチドである。したがって１種
のプライマーは、他のプライマー伸長物に対して、相補
的となる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液
としては、２価陽イオン、例えばマグネシウムイオンを
含む、トリス緩衝液が好ましい。プライマーをアニール
させ、伸長反応を行う条件としては、例えば９８℃、１
秒〜１分−６８℃、１秒〜１０分を３０回繰り返す方法
が挙げられる。

【００３０】工程Ｃにおいて、プライマー伸長物を分離
して、１本鎖とする工程は、熱処理、化学的処理または
酵素的処理であってもよい。好ましくは熱処理またはＲ
Ｎａｓｅによる酵素処理である。

【００３１】工程Ｄにおいて、上記工程Ｂ．〜Ｃ．を繰
り返す。具体的には、９８℃、２０秒−６８℃、３０秒
の加熱、冷却を少なくとも３０サイクル繰り返すことが
好ましい。

【００３２】本発明の増幅法は、２０ｋｂ以上のＤＮＡ
を増幅するＰＣＲ（以後、ｌｏｎｇ−ＰＣＲと呼ぶ）に
も適用される。このｌｏｎｇ−ＰＣＲでは、Ｔａｑポリ
メラーゼの高いＤＮＡ合成速度とＰｆｕポリメラーゼの
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に起因するＤＮＡ合
成時の高い正確性の両方の長所が必要であり、両酵素を
混合して使用する。この場合、両酵素の熱安定性や保存
溶液の組成の相違から同じ容器内で保存した場合の安定
性に疑問が生じる。しかし、超好熱始原菌ＫＯＤ１由来
ＤＮＡポリメラーゼは、高いＤＮＡ合成速度と３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性をもつことによる高い正確
性の両方を唯１種の酵素が併せもつことにより、単独で
ｌｏｎｇ−ＰＣＲを行える可能性を有する。

【００３３】本発明では上記増幅反応により生成した増
幅産物を例えば標識プローブを用いて標的核酸を検出す
ることができる。標識プローブとしては、標識核酸に相
補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、標
識物質または標識結合物質を結合するものである。標識
物質としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダ
ーゼ、ガラクトシダーゼなどの酵素、蛍光物質または放
射性物質があり、標識結合物質としてはビオチン、ジゴ
キシゲニンなどが例示される。標識物質はビオチン、ジ
ゴキシゲニンあるいはアビジンを経由して結合されてい
てもよい。これらの標識をプローブに導入する方法とし
ては、オリゴヌクレオチドの合成時に、ｄＮＴＰの一成
分として、これらの標識物質または標識結合物質を結合
するｄＮＴＰを使用して合成する。

【００３４】標識プローブと結合した核酸の検出には、
従来公知の方法、例えばサザンハイブリダイゼーション
やノーザンハイブリダイゼーション法などが挙げられ
る。これらの方法は１本鎖ＤＮＡやＲＮＡが互いに相補
性をもっていると、ハイブリッドを形成することを利用
して、未知の核酸断片群を例えばアガロース電気泳動法
により、そのサイズを分離し、次いでゲル中の核酸断片
を例えばアルカリ処理等により、１本鎖とした後、フィ
ルターに転写し、固定し、さらに標識プローブとハイブ
リダイズさせるものである。標識の検出には、例えば標
識物質として、アルカリホスファターゼを使用した場
合、化学発光基質、例えば１，２−ジオキセタン化合物
（ＰＰＤ）を反応させると、ハイブリッドを形成した核
酸のみが発光する。これをＸ線フィルムに感光して標的
核酸の大きさや電気泳動上での位置を確かめることがで
きる。

【００３５】本発明の核酸増幅用試薬キットは、標的核
酸に相補的な塩基配列を有する正方向および逆方向プラ
イマー、４種のｄＮＴＰ、２価陽イオン、ＤＮＡ合成速
度が少なくとも３０塩基／秒であり、かつ３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼおよび緩衝液を含む。２価陽イオンとしては、マグネ
シウムイオンが挙げられる。その濃度は１〜３ｍＭ程度
であることが好ましい。また緩衝液としては、トリス緩
衝液 (pH6.5 、75℃) 、トリシン緩衝液 (pH6.5 、75
℃) などが挙げられる。

【００３６】具体的な組成の１つは、下記のとおりであ
る。 ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (pH6.5 、75℃) １０ｍＭ ＫＣｌ ６ｍＭ （ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄ １〜３ｍＭ Ｍｇ₂ Ｃｌ₂ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ２０〜２００μＭ ｄＮＴＰｓ ０．１ｐＭ〜１μＭ プライマー ０．１〜２５０ｎｇ 鋳型ＤＮＡ

【００３７】本発明の核酸検出用試薬キットは、標的核
酸に相補的な塩基配列を有する正方向および逆方向プラ
イマー、４種のｄＮＴＰ、２価陽イオン、ＤＮＡ合成速
度が少なくとも３０塩基／秒であり、かつ３’−５’エ
キソヌクレアーゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼおよび増幅用緩衝液を含む核酸増幅用試薬および標的
核酸プローブおよび検出用緩衝液を含む。検出用緩衝液
としては、検出試薬が、標識によって種々異なるもので
ある。例えば発色試薬または発光試薬などを含む。

【００３８】本発明において使用する超好熱始原菌の１
種であるＫＯＤ１は、鹿児島県小宝島の硫気抗から単離
した菌株である。該菌株の菌学的性質を以下に記載す
る。 細胞形態 球菌・二連球菌、鞭毛あり 生育温度範囲 ６５〜１００℃ 最適生育温度 ９５℃ 生育ｐＨ範囲 ５〜９ 最適ｐＨ ６ 最適塩濃度 ２〜３％ 栄養要求性 従属栄養 酸素要求性 嫌気性 細胞膜脂質 エーテル型 ＤＮＡのＧＣ含量 ３８％

【００３９】超好熱始原菌ＫＯＤ１株は、直径約１μｍ
の球菌であり、複数の極鞭毛を有していた。この菌株は
菌学的性質からＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ生産菌(Pyroc
occus furiosus) およびＴｌｉ（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリ
メラーゼ生産菌(Thermococcus litoralis)との菌縁関係
が示唆された。

【００４０】本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子
のクローニングは、以下の方法により行う。クロ−ニン
グの方法は、ＰｆｕＤＮＡポリメラ−ゼの保存領域アミ
ノ酸配列(Nucleic Acids Research, 1993, vol.21, No.
2, 259-265) に基づき、プライマーを設計し、合成す
る。

【００４１】まず超好熱始原菌ＫＯＤ１株の染色体ＤＮ
Ａを鋳型に、上記調製したプライマー（例、配列番号７
と８）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片を増幅さ
せる。増幅された断片のＤＮＡ配列 (例、配列番号９)
を決定し、当初設定したアミノ酸配列をコードしている
ことを確認後、該断片をプローブとし、染色体ＤＮＡの
制限酵素切断産物に対し、サザンハイブリダイゼーショ
ンを実施する。目的とするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を
含む断片のおおよその大きさを約４〜７Ｋｂｐに限定す
ることが好ましい。

【００４２】更に、約４〜７ＫｂｐのＤＮＡ断片をゲル
から回収し、これを用いて、大腸菌にてＤＮＡライブラ
リーを作製し、上記記載のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片（例、
配列番号９）をプローブにコロニーハイブリダイゼ−シ
ョンを行い、クローン株を取得する。

【００４３】本発明においてクローン化したＫＯＤ１株
のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基（推定アミ
ノ酸１６７０個）から構成されている (配列番号５) 。
他のＤＮＡポリメラ−ゼと比較したところ、本発明の遺
伝子には真核生物型であるαＤＮＡポリメラ−ゼの保存
領域、Ｒｅｇｉｏｎ１〜５が存在している。また該遺伝
子のＮ末端側に３’→５’エキソヌクレア−ゼモチ−フ
であるＥＸＯ１，２，３が存在している。超好熱始原菌
ＫＯＤ１株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子の保
存領域、Ｒｅｇｉｏｎ１，２内には、各々介在配列が存
在しており、かつオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）の保存された形でつながっている。

【００４４】超好熱始原菌ＫＯＤ１株の耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子を、既知酵素であるピロコッカス・フ
リオサス(Pyrococcus furiosus) 由来のＰｆｕＤＮＡポ
リメラ−ゼ遺伝子（特開平 5-328969 号公報) 、及びサ
ーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由
来のＴｌｉ（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子（特
開平 6-7160 号公報）と比較すると、本発明のＫＯＤ１
株の遺伝子には介在配列が存在するが、上記ＰｆｕＤＮ
Ａポリメラーゼの遺伝子には介在配列は存在せず、また
ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼ遺伝子には、２種の介在配列
が存在するものの、その存在箇所は各々保存領域である
Ｒｅｇｉｏｎ２，３の内であり、本発明のＫＯＤ１株の
耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子内の介在配列の存在箇
所とは大きく異なっている (図７参照）。

【００４５】本発明の遺伝子は超好熱始原菌ＫＯＤ１由
来のＤＮＡポリメラ−ゼをコ−ドするＤＮＡである。該
ＤＮＡの一例は配列番号１または５に記載されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列を含有する。また、このよ
うなＤＮＡは配列番号５または６に記載される塩基配列
またはその一部分を含有する。本発明の超好熱始原菌Ｋ
ＯＤ１株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを大腸菌で発
現させるため、配列番号５に示される塩基配列の１３７
４〜２４５３ｂｐ、２７０８〜４３１６ｂｐの介在配列
をＰＣＲ遺伝子融合法により取り除き、完全な形のＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子を構築する。具体的には、介在配
列を含むクローン化した遺伝子を３組のプライマーの組
み合わせによりＰＣＲ反応を行い、介在配列により分断
される３断片を増幅する。ここで使用するプライマーを
設計する際、その末端に結合すべき断片の一部をその
５’端に含ませておく。次いで、結合すべき断片同志を
用いてその末端の重複する配列を利用してＰＣＲ反応を
行い、各々断片を結合する。更に得られた２種の断片を
用い同様にＰＣＲ反応を行い、介在配列を含まないＫＯ
Ｄ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含まない、完
全な形のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を得る。

【００４６】本発明において使用するベクターは、ＫＯ
Ｄ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのクローニングお
よび発現を可能とするものであれば、いかなるものでも
よく、例えばファージおよびプラスミドが挙げられる。
プラスミドとしては、Ｔ７プロモーターで誘導発現が可
能なプラスミドベクター、例えばｐＥＴ−８ｃなどを挙
げることができる。また別なプラスミドの例としては、
ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、
ｐＳＰ７３、ｐＧＷ７、ｐＥＴ３Ａ、ｐＥＴ１１Ｃなど
がある。ファージとしては、たとえばλｇｔ１１、λＤ
ＡＳＨ、λＺａｐＩＩなどが挙げられる。本発明におい
て使用する宿主細胞としては、大腸菌、酵母などが挙げ
られる。大腸菌としては、例えばＪＭ１０９、１０１、
ＸＬ１、ＰＲ１、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳなどが
挙げられる。本発明では上記ＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼをコードする遺伝子を上記ベクターに挿
入して組換え発現ベクターとし、更に、この組換え発現
ベクターにて宿主細胞を形質転換する。

【００４７】本発明の製造法では、上記組換え宿主細胞
を培養して、ＫＯＤ１株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−
ゼ遺伝子を誘導発現させる。組換え宿主細胞の培養に使
用する培地ならびに条件は常法に従う。具体例として
は、ＫＯＤ１株由来の介在配列を含まない完全な形のＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むｐＥＴ−８ｃプラスミド
により形質転換された大腸菌を、例えばＴＢ培地にて培
養し、誘導処理する。Ｔ７プロモーターの誘導処理はイ
ソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドの添加により
行なうことが好ましい。

【００４８】本発明の精製法では、組換え宿主細胞を培
養した後、（ａ）組換え宿主細胞を集めた後、破砕し、
細胞抽出物を調製し、（ｂ）宿主細胞由来の不純蛋白質
を除去する工程を含む。組換え宿主細胞より産出された
耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼは、宿主菌体を培地で培養・
誘導処理後、培養液から遠心分離等にて分離・回収す
る。該菌体を緩衝液に再懸濁した後、超音波処理、ダイ
ノミル、フレンチプレス等により菌体を破砕する。次い
で、熱処理を実施し、上清より耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを回収する。菌体破砕方法は、超音波処理、ダイノミ
ル、フレンチプレス法などが好ましい。宿主細胞由来の
不純タンパク質を除去する工程の１つとして、熱処理が
好ましい。熱処理条件は７０℃以上、好ましくは９０℃
以上である。他の不純タンパク質の除去法としては各種
クロマトグラフィーなどを実施する。

【００４９】この様にして取得した超好熱始原菌ＫＯＤ
１株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼの分子量は、約９
０ＫＤａである（図５参照）。

【００５０】また、この耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼを用
いポリメラーゼ連鎖反応を実施すると、十分な目的ＤＮ
Ａ断片の増幅が確認される（図６参照）。

【００５１】

【実施例】次に本発明を実施例を用いて説明する。 実施例１超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子
のクロ−ニング 鹿児島県小宝島にて単離した超好熱始原菌ＫＯＤ１株を
９５℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から
常法に従い超好熱始原菌ＫＯＤ１株の染色体ＤＮＡを調
製した。Pyrococcus furiosus 由来のＤＮＡポリメラ−
ゼ（Ｐｆｕポリメラ−ゼ）の保存領域アミノ酸配列に基
づき、２種のプライマ−（5'-GGATTAGTATAGTGCCAATGGAA
GGCGAC-3'(配列番号７), 5'-GAGGGCGAAGTTTATTCCGAGCTT
-3'(配列番号８) を合成した。この２種のプライマーを
使用し、調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反
応を行った。

【００５２】ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の塩基配列 (配列番
号９) を決定し、アミノ酸配列（配列番号１０）を決定
した後、この増幅ＤＮＡ断片をプロ−ブとして、ＫＯＤ
１株染色体ＤＮＡ制限酵素処理産物に対してサザンハイ
ブリダイゼーションを行い、ＤＮＡポリメラーゼをコー
ドする断片のサイズを求めた（約４〜７Ｋｂｐ）。さら
に、この大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収
し、プラスミドｐＢＳ（ストラタジーン社製）に挿入
し、これらの混合物により大腸菌(E.coli JM109)を形質
転換して、ライブラリーを作製した。サザンハイブリダ
イゼーションに使用したプローブ（配列番号９）を用い
て、コロニーハイブリダイゼーションを行い、上記ライ
ブラリーから、ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子を含有すると考えられるクローン株(E.coli JM109/
pBSK0D1)を取得した。

【００５３】実施例２クロ−ン断片の塩基配列の決定 実施例１で取得したクロ−ン株、E.coli JM109/pBSK0D1
よりプラスミド、pBSKOD1 を回収し、常法に従い塩基配
列 (配列番号５) を決定した。さらに求められた塩基配
列からアミノ酸配列を推定した。ＫＯＤ１株由来のＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子は５０１０塩基からなり、１６７
０個のアミノ酸がコードされていた。

【００５４】実施例３組換え発現ベクタ−の構築 完全なポリメラ−ゼ遺伝子を作成するため、２箇所の介
在配列部分（１３７４〜２４５３ｂｐ、２７０８〜４３
１６ｂｐ）をＰＣＲ融合法により取り除いた。ＰＣＲ融
合法では、クローン株より回収したプラスミドを鋳型
に、３組のプライマー (配列番号１１〜１６) を組み合
わせて、各々ＰＣＲを行い、介在配列を除いた３断片を
増幅した。この際、ＰＣＲに用いるプライマーは、他の
断片と結合する側に結合相手と同様な配列がくるように
設計した。また、両端には別々の制限酵素サイト（Ｎ末
端側：ＥｃｏＲＶ、Ｃ末端側：ＢａｍＨＩ）が創出され
るように設計した。次いで、ＰＣＲ増幅断片中、構造上
中央に位置する断片と、Ｎ末端側に位置する断片を混合
し、ＰＣＲを各々の断片をプライマーとして行った。ま
た、同様に構造上、中央に位置する断片と、Ｃ末端側に
位置する断片を混合し、ＰＣＲを各々の断片をプライマ
ーとして行った。このようにして得られた２種の断片を
用いて再度ＰＣＲを行い、介在配列が取り除かれ、Ｎ末
端にＥｃｏＲＶ、Ｃ末端にＢａｍＨＩサイトを有するＫ
ＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼをコードする完全な
形の遺伝子断片を取得した。更に、同遺伝子をＴ７プロ
モーターで誘導可能な発現ベクター、ｐＥＴ−８ｃのＮ
ｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイト、先に創出した制限酵素サイ
トを利用し、サブクローニングして、組換え発現ベクタ
ー (ｐＥＴ−ｐｏｌ) を得た。

【００５５】実施例４ＫＯＤ１由来ＤＮＡポリメラ−ゼの発現と精製 実施例３で取得した組換え発現ベクター (ｐＥＴ−ｐｏ
ｌ) を用いて大腸菌(E.coli JM109)を形質転換し、得ら
れた形質転換体をＴＢ培地(Molecular Cloning, p.A.2,
1989 に記載) で培養し、集菌１時間前にＴ７プロモ−
タ−の誘導処理をイソプロピオチ- β-D- ガラクトピレ
ノシドの添加により行った。培養液より菌体を遠心分離
により回収した。緩衝液に再懸濁した後、超音波処理に
よって菌体を破砕し、細胞抽出物を得た。さらに宿主細
胞由来の不純タンパク質を除去するために、細胞破砕液
を９４℃にて２０分間処理し、宿主細胞由来の不純タン
パク質を不溶化した。不溶画分を遠心分離して除去し、
ＫＯＤ１株由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。

【００５６】実施例５ＫＯＤ１由来耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼの精製 実施例４で得られたＫＯＤ１由来耐熱性ＤＮＡポリメラ
−ゼの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって求めたとこ
ろ、約８６〜９２ｋＤａであった（図５）。また、実施
例４で得たＫＯＤ１由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
既知の鋳型・プライマーを用いてＰＣＲを実施したとこ
ろ、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litora
lis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合と同
様に標的とするＤＮＡ断片が確認され（図６）、高い熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性が確認された。

【００５７】比較例１本発明の超好熱始原菌ＫＯＤ１と類縁菌であると思われ
るピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus) ま
たはサーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litora
lis)由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子との比較 本発明の超好熱始原菌ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子（配列番号６）、ピロコッカス・フリオサス(P
yrococcus furiosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子（特開平 5-328969 号公報) 、サーモコッカス・
リトラリス（Thermococcus litoralis）由来の耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラ−ゼ遺伝子（特開平 6-7160 号公報) のＤ
ＮＡ配列からアミノ酸配列を推定し、比較検討した。本
発明のＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラ−ゼは、真核生物
型であるαＤＮＡポリメラ−ゼの保存領域であるＲｅｇ
ｉｏｎ１〜５が存在していた。またＮ末端側には３’→
５’エキソヌクレア−ゼモチ−フであるＥＸＯ１，２，
３が存在していた。しかし、αＤＮＡポリメラ−ゼ保存
領域Ｒｅｇｉｏｎ１とＲｅｇｉｏｎ２の内には、各々介
在配列ＩＶＳ−Ａ、ＩＶＳ−Ｂが存在していた (図７参
照）。一方、ピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus fu
riosus) 由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼであるＰｆｕ
ポリメラーゼには介在配列が存在しなかった。またサー
モコッカス・リトラリス (Thermococcus litoralis) 由
来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼであるＶｅｎｔポリメラ
ーゼでは、αＤＮＡポリメラ−ゼ保存領域Ｒｅｇｉｏｎ
２とＲｅｇｉｏｎ３の内に、介在配列ＩＶＳ１とＩＶＳ
２が認められた（図７参照）。

【００５８】実施例６ 超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼのＤ
ＮＡ合成速度の測定 Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡに、配列番号２に記載される塩基
配列を有するＭ１３Ｐ７プライマーをアニーリングさせ
たＤＮＡを基質として、実施例１〜５にて製造した超好
熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼを含む反
応緩衝液〔20mMTris-HCl(pH7.5 75 ℃), 10mM KCl, 6m
M (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂, 0.1% TritonX-100, 10μg/ml
nuclease-free BSA 〕中で、反応時間、２０、４０、６
０、８０、１００秒（図１）または４０、６０、８０、
１００秒（図２）におけるＤＮＡの合成速度を調べた。
その結果を図１および２に示す。各反応時間ごとに伸長
反応中のＤＮＡサンプルを一部抜き取り、等量の反応停
止溶液 (60mM EDTA 、60μM NaOH、0.1% BPB、30% グリ
セロール) に添加する。上記過程で得たＤＮＡサンプル
をアルカリアガロース電気泳動法により分離分析し、合
成されたＤＮＡの大きさを調べた。

【００５９】図１中、１は反応時間、０．３分（２０
秒）、２は０．７分（４０秒）、３は１分（６０秒）、
４は１．３分（８０秒）、５は１．７分（１００秒）の
結果を示す。図１から明らかなように、超好熱始原菌Ｋ
ＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼのＤＮＡ合成速度は、
１０５塩基／秒であった。図２中、１は反応時間、０．
７分（４０秒）、２は１分（６０秒）、３は１．３分
（８０秒）、４は１．７分（１００秒）の結果を示す。
図２から明らかなように、超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来
ＤＮＡポリメラ−ゼのＤＮＡ合成速度は、１３８塩基／
秒であった。

【００６０】一方、Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラトジー
ン社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ニュー・イ
ングランド・バイオラボ社）、Ｔａｑポリメラーゼ（宝
酒造社) の各ポリメラーゼを、それぞれの緩衝液にて、
同様にＤＮＡ合成速度を測定した（図２ａ、２ｂ）。そ
れぞれのＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成速度は、Ｐｆ
ｕポリメラーゼ２４．８塩基／秒，Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ
ポリメラーゼ２３．２塩基／秒、Ｔａｑポリメラーゼ６
１．０塩基／秒であった。上記結果から、超好熱始原菌
ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラ−ゼはＰｆｕポリメラ
ーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼの約６倍、Ｔａ
ｑポリメラーゼの約２倍大きいＤＮＡ合成速度を持つこ
とが示唆された。

【００６１】実施例７ 超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼのＤＮ
Ａ合成反応における正確性測定 Ｋｕｎｋｅｌの方法(Kunkel, 1985, Journal of Biolog
ical Chemistry, 260,5787-5796)により、ＤＮＡ合成に
おける間違いの生じる割合を測定した。この方法は、β
−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子の一部を含むｌ
ａｑＺ部分にギャップをもったＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを
基質として、実施例１〜５にて製造した超好熱始原菌Ｋ
ＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼでＤＮＡ合成反応を行
い、ｌａｃＺ部が２本鎖となったＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ
を用いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトシドとイソプロピル−チオ−β−Ｄ−
ガラクトシドを含むＮＺＹ培地で、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９にトランスフェクションする。ＤＮＡ合成反応時
に、読み違いやフレイムシフトを起こし、機能が失われ
た、あるいは低下したβ−ガラクトシダーゼが発現され
た場合、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトシドを利用することができず、プラーク
の色が無色あるいは薄青色となる。一方、合成ＤＮＡに
誤りがなく、完全なβ−ガラクトシダーゼが発現した場
合には、プラークが青色となる。プラーク全体に占める
無色と薄青色のプラークの合計の割合から、ＤＮＡ合成
における間違いの生じる割合を測定した。

【００６２】それぞれの緩衝液にて、同様に反応したＰ
ｆｕポリメラーゼ（ストラトジーン社）、Ｔａｑポリメ
ラーゼ（宝酒造社）、△Ｔｔｈポリメラーゼ（東洋紡
績）についても、ＤＮＡ合成における間違いの生じる割
合を測定した。また、ＴａｑポリメラーゼとＰｆｕポリ
メラーゼの混合物についても、同様にＤＮＡ合成におけ
る間違いの生じる割合を測定した。その結果を表１に示
す。

【００６３】

【表１】

【００６４】表１から明らかなように、超好熱始原菌Ｋ
ＯＤ１株由来ＤＮＡポリメラ−ゼのＤＮＡ合成反応にお
ける正確性は、Ｔａｑポリメラーゼより優れ、Ｐｆｕポ
リメラーゼと同等であることが示唆された。また、Ｔａ
ｑポリメラーゼとＰｆｕポリメラーゼの混合物ではＴａ
ｑポリメラーゼより優れ、Ｐｆｕポリメラーゼよりも劣
るという中間の正確性となった。

【００６５】実施例８ 各種熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの反応時間の違いによ
るＰＣＲの比較 標的核酸としてはλＤＮＡ (3 μg)、プライマーとして
配列番号・配列表３および４に記載される配列を有する
オリゴヌクレオチド、緩衝液として、20mM Tris-HCl (p
H7.5, 75℃), 10mM KCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgCl₂,
0.1% Triton X-100, 10μg/ml BSA、 200μM ｄＮＴＰ
ｓを含む緩衝液を使用した。各種熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼとしては、超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポ
リメラ−ゼ（ＫＯＤポリメラーゼ）、ＰＣＲに広く使用
されているＴａｑポリメラーゼおよび３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有するＰｆｕポリメラーゼも使用し
た。各ポリメラーゼの使用力価は２単位であった。

【００６６】９４℃、２０秒−６８℃、Ｘ秒（Ｘは反応
時間）を３０サイクル繰り返すスケジュールで、ＤＮＡ
Thermal Cycler （パーキンエルマー社）にてＰＣＲ増
幅反応を行った。超好熱始原菌ＫＯＤ１株由来ＤＮＡポ
リメラ−ゼ（ＫＯＤポリメラーゼ）は９４℃、２０秒−
６８℃、１秒を３０サイクル繰り返すことで、標的ＤＮ
Ａの増幅が確認できるが、Ｔａｑポリメラーゼでは、９
４℃、２０秒−６８℃、１０秒を３０サイクル繰り返し
て、はじめてＤＮＡの増幅が確認された。また、Ｐｆｕ
ポリメラーゼに至っては、９４℃、２０秒−６８℃、１
分を３０サイクル繰り返すことで、はじめてＤＮＡの増
幅が確認できた。その結果を図３に示す。

【００６７】

【発明の効果】本発明では、ＤＮＡ合成速度が少なくと
も３０塩基／秒であり、かつ３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、超好熱始
原菌ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラーゼを使うことによ
り、短い反応時間で正確性の高いＤＮＡの増幅が可能に
なる。また、この方法を試薬キット化することにより簡
便性を向上させることができる。さらに今までに例のな
い高い合成速度（少なくとも３０塩基／秒）と３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性を合わせもつ、唯、１種類
の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、
プライマー伸長反応の時間を短縮し、正確性の高い比較
的大きな生成産物を増幅することが可能となる。

【００６８】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：774 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr 50 55 60 Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Gly Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Gln Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Pro Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr 370 375 380 Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Asn Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Gly Thr 770

【００６９】配列番号２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24

【００７０】配列番号３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGGCGGCGAC CTCGCGGGTT 20

【００７１】配列番号４ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCCATAATA ATCTGCCGGT CAAT 24

【００７２】配列番号５ 配列の長さ：5342 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源：超好熱始原菌 株名：ＫＯＤ１ 配列の特徴 156-5165 P CDS 1374-2453 介在配列 2708-4316 介在配列 配列 GCTTGAGGGC CTGCGGTTAT GGGACGTTGC AGTTTGCGCC TACTCAAAGA TGCCGGTTTT 60 ATAACGGAGA AAAATGGGGA GCTATTACGA TCTCTCCTTG ATGTGGGGTT TACAATAAAG 120 CCTGGATTGT TCTACAAGAT TATGGGGGAT GAAAG ATG ATC CTC GAC ACT GAC 173 Met Ile Leu Asp Thr Asp 1 5 TAC ATA ACC GAG GAT GGA AAG CCT GTC ATA AGA ATT TTC AAG AAG GAA 221 Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile Arg Ile Phe Lys Lys Glu 10 15 20 AAC GGC GAG TTT AAG ATT GAG TAC GAC CGG ACT TTT GAA CCC TAC TTC 269 Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg Thr Phe Glu Pro Tyr Phe 25 30 35 TAC GCC CTC CTG AAG GAC GAT TCT GCC ATT GAG GAA GTC AAG AAG ATA 317 Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile Glu Glu Val Lys Lys Ile 40 45 50 ACC GCC GAG AGG CAC GGG ACG GTT GTA ACG GTT AAG CGG GTT GAA AAG 365 Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr Val Lys Arg Val Glu Lys 55 60 65 70 GTT CAG AAG AAG TTC CTC GGG AGA CCA GTT GAG GTC TGG AAA CTC TAC 413 Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Trp Lys Leu Tyr 75 80 85 TTT ACT CAT CCG CAG GAC GTC CCA GCG ATA AGG GAC AAG ATA CGA GAG 461 Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile Arg Asp Lys Ile Arg Glu 90 95 100 CAT GGA GCA GTT ATT GAC ATC TAC GAG TAC GAC ATA CCC TTC GCC AAG 509 His Gly Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr Asp Ile Pro Phe Ala Lys 105 110 115 CGC TAC CTC ATA GAC AAG GGA TTA GTG CCA ATG GAA GGC GAC GAG GAG 557 Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu 120 125 130 CTG AAA ATG CTC GCC TTC GAC ATT CAA ACT CTC TAC CAT GAG GGC GAG 605 Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Gln Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu 135 140 145 150 GAG TTC GCC GAG GGG CCA ATC CTT ATG ATA AGC TAC GCC GAC GAG GAA 653 Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu 155 160 165 GGG GCC AGG GTG ATA ACT TGG AAG AAC GTG GAT CTC CCC TAC GTT GAC 701 Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Val Asp Leu Pro Tyr Val Asp 170 175 180 GTC GTC TCG ACG GAG AGG GAG ATG ATA AAG CGC TTC CTC CGT GTT GTG 749 Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Val Val 185 190 195 AAG GAG AAA GAC CCG GAC GTT CTC ATA ACC TAC AAC GGC GAC AAC TTC 797 Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe 200 205 210 GAC TTC GCC TAT CTG AAA AAG CGC TGT GAA AAG CTC GGA ATA AAC TTC 845 Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu Lys Leu Gly Ile Asn Phe 215 220 225 230 GCC CTC GGA AGG GAT GGA AGC GAG CCG AAG ATT CAG AGG ATG GGC GAC 893 Ala Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Ile Gln Arg Met Gly Asp 235 240 245 AGG TTT GCC GTC GAA GTG AAG GGA CGG ATA CAC TTC GAT CTC TAT CCT 941 Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Leu Tyr Pro 250 255 260 GTG ATA AGA CGG ACG ATA AAC CTG CCC ACA TAC ACG CTT GAG GCC GTT 989 Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu Ala Val 265 270 275 TAT GAA GCC GTC TTC GGT CAG CCG AAG GAG AAG GTT TAC GCT GAG GAA 1037 Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu Lys Val Tyr Ala Glu Glu 280 285 290 ATA ACA CCA GCC TGG GAA ACC GGC GAG AAC CTT GAG AGA GTC GCC CGC 1085 Ile Thr Pro Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn Leu Glu Arg Val Ala Arg 295 300 305 310 TAC TCG ATG GAA GAT GCG AAG GTC ACA TAC GAG CTT GGG AAG GAG TTC 1133 Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Lys Glu Phe 315 320 325 CTT CCG ATG GAG GCC CAG CTT TCT CGC TTA ATC GGC CAG TCC CTC TGG 1181 Leu Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu Ile Gly Gln Ser Leu Trp 330 335 340 GAC GTC TCC CGC TCC AGC ACT GGC AAC CTC GTT GAG TGG TTC CTC CTC 1229 Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe Leu Leu 345 350 355 AGG AAG GCC TAT GAG AGG AAT GAG CTG GCC CCG AAC AAG CCC GAT GAA 1277 Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Lys Pro Asp Glu 360 365 370 AAG GAG CTG GCC AGA AGA CGG CAG AGC TAT GAA GGA GGC TAT GTA AAA 1325 Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr Glu Gly Gly Tyr Val Lys 375 380 385 390 GAG CCC GAG AGA GGG TTG TGG GAG AAC ATA GTG TAC CTA GAT TTT AGA 1373 Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile Val Tyr Leu Asp Phe Arg 395 400 405 TGC CAT CCA GCC GAT ACG AAG GTT GTC GTC AAG GGG AAG GGG ATT ATA 1421 Cys His Pro Ala Asp Thr Lys Val Val Val Lys Gly Lys Gly Ile Ile 410 415 420 Asn Ile Ser Glu Val Gln Glu Gly Asp Tyr Val Leu Gly Ile Asp Gly 425 430 435 TGG CAG AGA GTT AGA AAA GTA TGG GAA TAC GAC TAC AAA GGG GAG CTT 1517 Trp Gln Arg Val Arg Lys Val Trp Glu Tyr Asp Tyr Lys Gly Glu Leu 440 445 450 GTA AAC ATA AAC GGG TTA AAG TGT ACG CCC AAT CAT AAG CTT CCC GTT 1565 Val Asn Ile Asn Gly Leu Lys Cys Thr Pro Asn His Lys Leu Pro Val 455 460 465 470 GTT ACA AAG AAC GAA CGA CAA ACG AGA ATA AGA GAC AGT CTT GCT AAG 1613 Val Thr Lys Asn Glu Arg Gln Thr Arg Ile Arg Asp Ser Leu Ala Lys 475 480 485 TCT TTC CTT ACT AAA AAA GTT AAG GGC AAG ATA ATA ACC ACT CCC CTT 1661 Ser Phe Leu Thr Lys Lys Val Lys Gly Lys Ile Ile Thr Thr Pro Leu 490 495 500 TTC TAT GAA ATA GGC AGA GCG ACA AGT GAG AAT ATT CCA GAA GAA GAG 1709 Phe Tyr Glu Ile Gly Arg Ala Thr Ser Glu Asn Ile Pro Glu Glu Glu 505 510 515 GTT CTC AAG GGA GAG CTC GCT GGC ATA CTA TTG GCT GAA GGA ACG CTC 1757 Val Leu Lys Gly Glu Leu Ala Gly Ile Leu Leu Ala Glu Gly Thr Leu 520 525 530 TTG AGG AAA GAC GTT GAA TAC TTT GAT TCA TCC CGC AAA AAA CGG AGG 1805 Leu Arg Lys Asp Val Glu Tyr Phe Asp Ser Ser Arg Lys Lys Arg Arg 535 540 545 550 ATT TCA CAC CAG TAT CGT GTT GAG ATA ACC ATT GGG AAA GAC GAG GAG 1853 Ile Ser His Gln Tyr Arg Val Glu Ile Thr Ile Gly Lys Asp Glu Glu 555 560 565 GAG TTT AGG GAT CGT ATC ACA TAC ATT TTT GAG CGT TTG TTT GGG ATT 1901 Glu Phe Arg Asp Arg Ile Thr Tyr Ile Phe Glu Arg Leu Phe Gly Ile 570 575 580 ACT CCA AGC ATC TCG GAG AAG AAA GGA ACT AAC GCA GTA ACA CTC AAA 1949 Thr Pro Ser Ile Ser Glu Lys Lys Gly Thr Asn Ala Val Thr Leu Lys 585 590 595 GTT GCG AAG AAG AAT GTT TAT CTT AAA GTC AAG GAA ATT ATG GAC AAC 1997 Val Ala Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys Val Lys Glu Ile Met Asp Asn 600 605 610 ATA GAG TCC CTA CAT GCC CCC TCG GTT CTC AGG GGA TTC TTC GAA GGC 2045 Ile Glu Ser Leu His Ala Pro Ser Val Leu Arg Gly Phe Phe Glu Gly 615 620 625 630 GAC GGT TCA GTA AAC AGG GTT AGG AGG AGT ATT GTT GCA ACC CAG GGT 2093 Asp Gly Ser Val Asn Arg Val Arg Arg Ser Ile Val Ala Thr Gln Gly 635 640 645 ACA AAG AAC GAG TGG AAG ATT AAA CTG GTG TCA AAA CTG CTC TCC CAG 2141 Thr Lys Asn Glu Trp Lys Ile Lys Leu Val Ser Lys Leu Leu Ser Gln 650 655 660 CTT GGT ATC CCT CAT CAA ACG TAC ACG TAT CAG TAT CAG GAA AAT GGG 2189 Leu Gly Ile Pro His Gln Thr Tyr Thr Tyr Gln Tyr Gln Glu Asn Gly 665 670 675 AAA GAT CGG AGC AGG TAT ATA CTG GAG ATA ACT GGA AAG GAC GGA TTG 2237 Lys Asp Arg Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Ile Thr Gly Lys Asp Gly Leu 680 685 690 ATA CTG TTC CAA ACA CTC ATT GGA TTC ATC AGT GAA AGA AAG AAC GCT 2285 Ile Leu Phe Gln Thr Leu Ile Gly Phe Ile Ser Glu Arg Lys Asn Ala 695 700 705 710 CTG CTT AAT AAG GCA ATA TCT CAG AGG GAA ATG AAC AAC TTG GAA AAC 2333 Leu Leu Asn Lys Ala Ile Ser Gln Arg Glu Met Asn Asn Leu Glu Asn 715 720 725 AAT GGA TTT TAC AGG CTC AGT GAA TTC AAT GTC AGC ACG GAA TAC TAT 2381 Asn Gly Phe Tyr Arg Leu Ser Glu Phe Asn Val Ser Thr Glu Tyr Tyr 730 735 740 GAG GGC AAG GTC TAT GAC TTA ACT CTT GAA GGA ACT CCC TAC TAC TTT 2429 Glu Gly Lys Val Tyr Asp Leu Thr Leu Glu Gly Thr Pro Tyr Tyr Phe 745 750 755 GCC AAT GGC ATA TTG ACC CAT AAC TCC CTG TAC CCC TCA ATC ATC ATC 2477 Ala Asn Gly Ile Leu Thr His Asn Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile 760 765 770 ACC CAC AAC GTC TCG CCG GAT ACG CTC AAC AGA GAA GGA TGC AAG GAA 2525 Thr His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu 775 780 785 790 TAT GAC GTT GCC CCA CAG GTC GGC CAC CGC TTC TGC AAG GAC TTC CCA 2573 Tyr Asp Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro 795 800 805 GGA TTT ATC CCG AGC CTG CTT GGA GAC CTC CTA GAG GAG AGG CAG AAG 2621 Gly Phe Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys 810 815 820 ATA AAG AAG AAG ATG AAG GCC ACG ATT GAC CCG ATC GAG AGG AAG CTC 2669 Ile Lys Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu 825 830 835 CTC GAT TAC AGG CAG AGG GCC ATC AAG ATC CTG GCA AAC AGC ATC CTA 2717 Leu Asp Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Ile Leu 840 845 850 CCC GAG GAA TGG CTT CCA GTC CTC GAG GAA GGG GAG GTT CAC TTC GTC 2765 Pro Glu Glu Trp Leu Pro Val Leu Glu Glu Gly Glu Val His Phe Val 855 860 865 870 AGG ATT GGA GAG CTC ATA GAC CGG ATG ATG GAG GAA AAT GCT GGG AAA 2813 Arg Ile Gly Glu Leu Ile Asp Arg Met Met Glu Glu Asn Ala Gly Lys 875 880 885 GTA AAG AGA GAG GGC GAG ACG GAA GTG CTT GAG GTC AGT GGG CTT GAA 2861 Val Lys Arg Glu Gly Glu Thr Glu Val Leu Glu Val Ser Gly Leu Glu 890 895 900 GTC CCG TCC TTT AAC AGG AGA ACT AAC AAG GCC GAG CTC AAG AGA GTA 2909 Val Pro Ser Phe Asn Arg Arg Thr Asn Lys Ala Glu Leu Lys Arg Val 905 910 915 AAG GCC CTG ATT AGG CAC GAT TAT TCT GGC AAG GTC TAC ACC ATC AGA 2957 Lys Ala Leu Ile Arg His Asp Tyr Ser Gly Lys Val Tyr Thr Ile Arg 920 925 930 CTG AAG TCG GGG AGG AGA ATA AAG ATA ACC TCT GGC CAC AGC CTC TTC 3005 Leu Lys Ser Gly Arg Arg Ile Lys Ile Thr Ser Gly His Ser Leu Phe 935 940 945 950 TCT GTG AGA AAC GGG GAG CTC GTT GAA GTT ACG GGC GAT GAA CTA AAG 3053 Ser Val Arg Asn Gly Glu Leu Val Glu Val Thr Gly Asp Glu Leu Lys 955 960 965 CCA GGT GAC CTC GTT GCA GTC CCG CGG AGA TTG GAG CTT CCT GAG AGA 3101 Pro Gly Asp Leu Val Ala Val Pro Arg Arg Leu Glu Leu Pro Glu Arg 970 975 980 AAC CAC GTG CTG AAC CTC GTT GAA CTG CTC CTT GGA ACG CCA GAA GAA 3149 Asn His Val Leu Asn Leu Val Glu Leu Leu Leu Gly Thr Pro Glu Glu 985 990 995 GAA ACT TTG GAC ATC GTC ATG ACG ATC CCA GTC AAG GGT AAG AAG AAC 3197 Glu Thr Leu Asp Ile Val Met Thr Ile Pro Val Lys Gly Lys Lys Asn 1000 1005 1010 TTC TTT AAA GGG ATG CTC AGG ACT TTG CGC TGG ATT TTC GGA GAG GAA 3245 Phe Phe Lys Gly Met Leu Arg Thr Leu Arg Trp Ile Phe Gly Glu Glu 1015 1020 1025 1030 AAG AGG CCC AGA ACC GCG AGA CGC TAT CTC AGG CAC CTT GAG GAT CTG 3293 Lys Arg Pro Arg Thr Ala Arg Arg Tyr Leu Arg His Leu Glu Asp Leu 1035 1040 1045 GGC TAT GTC CGG CTT AAG AAG ATC GGC TAC GAA GTC CTC GAC TGG GAC 3341 Gly Tyr Val Arg Leu Lys Lys Ile Gly Tyr Glu Val Leu Asp Trp Asp 1050 1055 1060 TCA CTT AAG AAC TAC AGA AGG CTC TAC GAG GCG CTT GTC GAG AAC GTC 3389 Ser Leu Lys Asn Tyr Arg Arg Leu Tyr Glu Ala Leu Val Glu Asn Val 1065 1070 1075 AGA TAC AAC GGC AAC AAG AGG GAG TAC CTC GTT GAA TTC AAT TCC ATC 3437 Arg Tyr Asn Gly Asn Lys Arg Glu Tyr Leu Val Glu Phe Asn Ser Ile 1080 1085 1090 CGG GAT GCA GTT GGC ATA ATG CCC CTA AAA GAG CTG AAG GAG TGG AAG 3485 Arg Asp Ala Val Gly Ile Met Pro Leu Lys Glu Leu Lys Glu Trp Lys 1095 1100 1105 1110 ATC GGC ACG CTG AAC GGC TTC AGA ATG AGA AAG CTC ATT GAA GTG GAC 3533 Ile Gly Thr Leu Asn Gly Phe Arg Met Arg Lys Leu Ile Glu Val Asp 1115 1120 1125 GAG TCG TTA GCA AAG CTC CTC GGC TAC TAC GTG AGC GAG GGC TAT GCA 3581 Glu Ser Leu Ala Lys Leu Leu Gly Tyr Tyr Val Ser Glu Gly Tyr Ala 1130 1135 1140 AGA AAG CAG AGG AAT CCC AAA AAC GGC TGG AGC TAC AGC GTG AAG CTC 3629 Arg Lys Gln Arg Asn Pro Lys Asn Gly Trp Ser Tyr Ser Val Lys Leu 1145 1150 1155 TAC AAC GAA GAC CCT GAA GTG CTG GAC GAT ATG GAG AGA CTC GCC AGC 3677 Tyr Asn Glu Asp Pro Glu Val Leu Asp Asp Met Glu Arg Leu Ala Ser 1160 1165 1170 AGG TTT TTC GGG AAG GTG AGG CGG GGC AGG AAC TAC GTT GAG ATA CCG 3725 Arg Phe Phe Gly Lys Val Arg Arg Gly Arg Asn Tyr Val Glu Ile Pro 1175 1180 1185 1190 AAG AAG ATC GGC TAC CTG CTC TTT GAG AAC ATG TGC GGT GTC CTA GCG 3773 Lys Lys Ile Gly Tyr Leu Leu Phe Glu Asn Met Cys Gly Val Leu Ala 1195 1200 1205 GAG AAC AAG AGG ATT CCC GAG TTC GTC TTC ACG TCC CCG AAA GGG GTT 3821 Glu Asn Lys Arg Ile Pro Glu Phe Val Phe Thr Ser Pro Lys Gly Val 1210 1215 1220 CGG CTG GCC TTC CTT GAG GGG TAC TCA TCG GCG ATG GCG ACG TCC ACC 3869 Arg Leu Ala Phe Leu Glu Gly Tyr Ser Ser Ala Met Ala Thr Ser Thr 1225 1230 1235 GAA CAA GAG ACT CAG GCT CTC AAC GAA AAG CGA GCT TTA GCG AAC CAG 3917 Glu Gln Glu Thr Gln Ala Leu Asn Glu Lys Arg Ala Leu Ala Asn Gln 1240 1245 1250 CTC GTC CTC CTC TTG AAC TCG GTG GGG GTC TCT GCT GTA AAA CTT GGG 3965 Leu Val Leu Leu Leu Asn Ser Val Gly Val Ser Ala Val Lys Leu Gly 1255 1260 1265 1270 CAC GAC AGC GGC GTT TAC AGG GTC TAT ATA AAC GAG GAG CTC CCG TTC 4013 His Asp Ser Gly Val Tyr Arg Val Tyr Ile Asn Glu Glu Leu Pro Phe 1275 1280 1285 GTA AAG CTG GAC AAG AAA AAG AAC GCC TAC TAC TCA CAC GTG ATC CCC 4061 Val Lys Leu Asp Lys Lys Lys Asn Ala Tyr Tyr Ser His Val Ile Pro 1290 1295 1300 AAG GAA GTC CTG AGC GAG GTC TTT GGG AAG GTT TTC CAG AAA AAC GTC 4109 Lys Glu Val Leu Ser Glu Val Phe Gly Lys Val Phe Gln Lys Asn Val 1305 1310 1315 AGT CCT CAG ACC TTC AGG AAG ATG GTC GAG GAC GGA AGA CTC GAT CCC 4157 Ser Pro Gln Thr Phe Arg Lys Met Val Glu Asp Gly Arg Leu Asp Pro 1320 1325 1330 GAA AAG GCC CAG AGG CTC TCC TGG CTC ATT GAG GGG GAC GTA GTG CTC 4205 Glu Lys Ala Gln Arg Leu Ser Trp Leu Ile Glu Gly Asp Val Val Leu 1335 1340 1345 1350 GAC CGC GTT GAG TCC GTT GAT GTG GAA GAC TAC GAT GGT TAT GTC TAT 4253 Asp Arg Val Glu Ser Val Asp Val Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Val Tyr 1355 1360 1365 GAC CTG AGC GTC GAG GAC AAC GAG AAC TTC CTC GTT GGC TTT GGG TTG 4301 Asp Leu Ser Val Glu Asp Asn Glu Asn Phe Leu Val Gly Phe Gly Leu 1370 1375 1380 GTC TAT GCT CAC AAC AGC TAC TAC GGT TAC TAC GGC TAT GCA AGG GCG 4349 Val Tyr Ala His Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala 1385 1390 1395 CGC TGG TAC TGC AAG GAG TGT GCA GAG AGC GTA ACG GCC TGG GGA AGG 4397 Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg 1400 1405 1410 GAG TAC ATA ACG ATG ACC ATC AAG GAG ATA GAG GAA AAG TAC GGC TTT 4445 Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile Glu Glu Lys Tyr Gly Phe 1415 1420 1425 1430 AAG GTA ATC TAC AGC GAC ACC GAC GGA TTT TTT GCC ACA ATA CCT GGA 4493 Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe Phe Ala Thr Ile Pro Gly 1435 1440 1445 GCC GAT GCT GAA ACC GTC AAA AAG AAG GCT ATG GAG TTC CTC AAC TAT 4541 Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala Met Glu Phe Leu Asn Tyr 1450 1455 1460 ATC AAC GCC AAA CTT CCG GGC GCG CTT GAG CTC GAG TAC GAG GGC TTC 4589 Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe 1465 1470 1475 TAC AAA CGC GGC TTC TTC GTC ACG AAG AAG AAG TAT GCG GTG ATA GAC 4637 Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala Val Ile Asp 1480 1485 1490 GAG GAA GGC AAG ATA ACA ACG CGC GGA CTT GAG ATT GTG AGG CGT GAC 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ATA CCG TTC GAC GAG TTC GAC CCG ACG AAG CAC AAG 5021 Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe Asp Pro Thr Lys His Lys 1610 1615 1620 TAC GAC GCC GAG TAC TAC ATT GAG AAC CAG GTT CTC CCA GCC GTT GAG 5069 Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro Ala Val Glu 1625 1630 1635 AGA ATT CTG AGA GCC TTC GGT TAC CGC AAG GAA GAC CTG CGC TAC CAG 5117 Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys Glu Asp Leu Arg Tyr Gln 1640 1645 1650 AAG ACG AGA CAG GTT GGT TTG AGT GCT TGG CTG AAG CCG AAG GGA ACT 5165 Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp Leu Lys Pro Lys Gly Thr 1655 1660 1665 1670 TGACCTTTCC ATTTGTTTTC CAGCGGATAA CCCTTTAACT TCCCTTTCAA AAACTCCCT 5225 TAGGGAAAGA CCATGAAGAT AGAAATCCGG CGGCGCCCGG TTAAATACGC TAGGATAGA 5285 GTGAAGCCAG ACGGCAGGGT AGTCGTCACT GCCCCGAGGG TTCAACGTTG AGAAGTT 5342

【００７３】配列番号６ 配列の長さ：5342 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源：超好熱始原菌 株名：ＫＯＤ１ 配列 GCTTGAGGGC CTGCGGTTAT GGGACGTTGC AGTTTGCGCC TACTCAAAGA TGCCGGTTTT 60 ATAACGGAGA AAAATGGGGA GCTATTACGA TCTCTCCTTG ATGTGGGGTT TACAATAAAG 120 CCTGGATTGT TCTACAAGAT TATGGGGGAT GAAAGATGAT CCTCGACACT GACTACATAA 180 CCGAGGATGG AAAGCCTGTC ATAAGAATTT TCAAGAAGGA AAACGGCGAG TTTAAGATTG 240 AGTACGACCG GACTTTTGAA CCCTACTTCT ACGCCCTCCT GAAGGACGAT TCTGCCATTG 300 AGGAAGTCAA GAAGATAACC GCCGAGAGGC ACGGGACGGT TGTAACGGTT AAGCGGGTTG 360 AAAAGGTTCA GAAGAAGTTC CTCGGGAGAC CAGTTGAGGT CTGGAAACTC TACTTTACTC 420 ATCCGCAGGA CGTCCCAGCG ATAAGGGACA AGATACGAGA GCATGGAGCA GTTATTGACA 480 TCTACGAGTA CGACATACCC TTCGCCAAGC GCTACCTCAT AGACAAGGGA TTAGTGCCAA 540 TGGAAGGCGA CGAGGAGCTG AAAATGCTCG CCTTCGACAT TCAAACTCTC TACCATGAGG 600 GCGAGGAGTT CGCCGAGGGG CCAATCCTTA TGATAAGCTA CGCCGACGAG GAAGGGGCCA 660 GGGTGATAAC TTGGAAGAAC GTGGATCTCC CCTACGTTGA CGTCGTCTCG ACGGAGAGGG 720 AGATGATAAA GCGCTTCCTC CGTGTTGTGA AGGAGAAAGA CCCGGACGTT CTCATAACCT 780 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CTTACTAAAA AAGTTAAGGG CAAGATAATA ACCACTCCCC TTTTCTATGA AATAGGCAGA,1680 GCGACAAGTG AGAATATTCC AGAAGAAGAG GTTCTCAAGG GAGAGCTCGC TGGCATAGTA,1740 TTGGCTGAAG GAACGCTCTT GAGGAAAGAC GTTGAATACT TTGATTCATC CCGCAAAAAA 1800 CGGAGGATTT CACACCAGTA TCGTGTTGAG ATAACCATTG GGAAAGACGA GGAGGAGTTT 1860 AGGGATCGTA TCACATACAT TTTTGAGCGT TTGTTTGGGA TTACTCCAAG CATCTCGGAG 1920 AAGAAAGGAA CTAACGCAGT AACACTCAAA GTTGCGAAGA AGAATGTTTA TCTTAAAGTC 1980 AAGGAAATTA TGGACAACAT AGAGTCCCTA CATGCCCCCT CGGTTCTCAG GGGATTCTTC 2040 GAAGGCGACG GTTCAGTAAA CAGGTTAGGA GGAGTATTGT TGCAACCCAG GGTACAAAGA 2100 ACGAGTGGAA GATTAAACTG GTGTCAAAAC TGCTCTCCCA GCTTGGTATC CCTCATCAAA 2160 CGTACACGTA TCAGTATCAG GAAAATGGGA AAGATCGGAG CAGGTATATA CTGGAGATAA 2220 CTGGAAAGGA CGGATTGATA CTGTTCCAAA CACTCATTGG ATTCATCAGT GAAAGAAAGA 2280 ACGCTCTGCT TAATAAGGCA ATATCTCAGA GGGAAATGAA CAACTTGGAA AACAATGGAT 2340 TTTACAGGCT CAGTGAATTC AATGTCAGCA CGGAATACTA TGAGGGCAAG GTCTATGACT 2400 TAACTCTTGA AGGAACTCCC TACTTTGCCA ATGGCATATT GACCCATAAC TCCCTGTACC 2460 CCTCAATCAT CATCACCCAC AACGTCTCGC CGGATACGCT CAACAGAGAA GGATGCAAGG 2520 AATATGACGT TGCCCCACAG GTCGGCCACC GCTTCTGCAA GGACTTCCCA GGATTTATCC 2580 CGAGCCTGCT TGGAGACCTC CTAGAGGAGA GGCAGAAGAT AAAGAAGAAG ATGAAGGCCA 2640 CGATTGACCC GATCGAGAGG AAGCTCCTCG ATTACAGGCA GAGGGCCATC AAGATCCTGG 2700 CAAACAGCAT CCTACCCGAG GAATGGCTTC CAGTCCTCGA GGAAGGGGAG GTTCACTTCG 2760 TCAGGATTGG AGAGCTCATA GACCGGATGA TGGAGGAAAA TGCTGGGAAA GTAAAGAGAG 2820 AGGGCGAGAC GGAAGTGCTT GAGGTCAGTG GGCTTGAAGT CCCGTCCTTT AACAGGAGAA 2880 CTAACAAGGC CGAGCTCAAG AGAGTAAAGG CCCTGATTAG GCACGATTAT TCTGGCAAGG 2940 TCTACACCAT CAGACTGAAG TCGGGGAGGA GAATAAAGAT AACCTCTGGC CACAGCCTCT 3000 TCTCTGTGAG AAACGGGGAG CTCGTTGAAG TTACGGGCGA TGAACTAAAG CCAGGTGACC 3060 TCGTTGCAGT CCCGCGGAGA TTGGAGCTTC CTGAGAGAAA CCACGTGCTG AACCTCGTTG 3120 AACTGCTCCT TGGAACGCCA GAAGAAGAAA CTTTGGACAT CGTCATGACG ATCCCAGTCA 3180 AGGGTAAGAA GAACTTCTTT AAAGGGATGC TCAGGACTTT GCGCTGGATT TTCGGAGAGG 3240 AAAAGAGGCC CAGAACCGCG AGACGCTATC TCAGGCACCT TGAGGATCTG GGCTATGTCC 3300 GGCTTAAGAA GATCGGCTAC GAAGTCCTCG ACTGGGACTC ACTTAAGAAC TACAGAAGGC 3360 TCTACGAGGC GCTTGTCGAG AACGTCAGAT ACAACGGCAA CAAGAGGGAG TACCTCGTTG 3420 AATTCAATTC CATCCGGGAT GCAGTTGGCA TAATGCCCCT AAAAGAGCTG AAGGAGTGGA 3480 AGATCGGCAC GCTGAACGGC TTCAGAATGA GAAAGCTCAT TGAAGTGGAC GAGTCGTTAG 3540 CAAAGCTCCT CGGCTACTAC GTGAGCGAGG GCTATGCAAG AAAGCAGAGG AATCCCAAAA 3600 ACGGCTGGAG CTACAGCGTG AAGCTCTACA ACGAAGACCC TGAAGTGCTG GACGATATGG 3660 AGAGACTCGC CAGCAGGTTT TTCGGGAAGG TGAGGCGGGG CAGGAACTAC GTTGAGATAC 3720 CGAAGAAGAT CGGCTACCTG CTCTTTGAGA ACATGTGCGG TGTCCTAGCG GAGAACAAGA 3780 GGATTCCCGA GTTCGTCTTC ACGTCCCCGA AAGGGGTTCG,GCTGGCCTTC CTTGAGGGGT 3840 ACTCATCGGC GATGGCGACG TCCACCGAAC AAGAGACTCA GGCTCTCAAC GAAAAGCGAG 3900 CTTTAGCGAA CCAGCTCGTC CTCCTCTTGA ACTCGGTGGG GGTCTCTGCT GTAAAACTTG 3960 GGCACGACAG CGGCGTTTAC AGGGTCTATA TAAACGAGGA GCTCCCGTTC GTAAAGCTGG 4020 ACAAGAAAAA GAACGCCTAC TACTCACACG TGATCCCCAA GGAAGTCCTG AGCGAGGTCT 4080 TTGGGAAGGT TTTCCAGAAA AACGTCAGTC CTCAGACCTT CAGGAAGATG GTCGAGGACG 4140 GAAGACTCGA TCCCGAAAAG GCCCAGAGGC TCTCCTGGCT CATTGAGGGG GACGTAGTGC 4200 TCGACCGCGT TGAGTCCGTT GATGTGGAAG ACTACGATGG TTATGTCTAT GACCTGAGCG 4260 TCGAGGACAA CGAGAACTTC CTCGTTGGCT TTGGGTTGGT CTATGCTCAC AACAGCTACT 4320 ACGGTTACTA CGGCTATGCA AGGGCGCGCT GGTACTGCAA GGAGTGTGCA GAGAGCGTAA 4380 CGGCCTGGGG AAGGGAGTAC ATAACGATGA CCATCAAGGA GATAGAGGAA AAGTACGGCT 4440 TTAAGGTAAT CTACAGCGAC ACCGACGGAT TTTTTGCCAC AATACCTGGA GCCGATGCTG 4500 AAACCGTCAA AAAGAAGGCT ATGGAGTTCC TCAACTATAT CAACGCCAAA CTTCCGGGCG 4560 CGCTTGAGCT CGAGTACGAG GGCTTCTACA AACGCGGCTT CTTCGTCACG AAGAAGAAGT 4620 ATGCGGTGAT AGACGAGGAA GGCAAGATAA CAACGCGCGG ACTTGAGATT GTGAGGCGTG 4680 ACTGGAGCGA GATAGCGAAA GAGACGCAGG CGAGGGTTCT TGAAGCTTTG CTAAAGGACG 4740 GTGACGTCGA GAAGGCCGTG AGGATAGTCA AAGAAGTTAC CGAAAAGCTG AGCAAGTACG 4800 AGGTTCCGCC GGAGAAGCTG GTGATCCACG AGCAGATAAC GAGGGATTTA AAGGACTACA 4860 AGGCAACCGG TCCCCACGTT GCCGTTGCCA AGAGGTTGGC CGCGAGAGGA GTCAAAATAC 4920 GCCCTGGAAC GGTGATAAGC TACATCGTGC TCAAGGGCTC TGGGAGGATA GGCGACAGGG 4980 CGATACCGTT CGACGAGTTC GACCCGACGA AGCACAAGTA CGATGCCGAG TACTACATTG 5040 AGAACCAGGT TCTCCCAGCC GTTGAGAGAA TTCTGAGAGC CTTCGGTTAC CGCAAGGAAG 5100 ACCTGCGCTA CCAGAAGACG AGACAGGTTG GTTTGAGTGC TTGGCTGAAG CCGAAGGGAA 5160 CTTGACCTTT CCATTTGTTT TCCAGCGGAT AACCCTTTAA CTTCCCTTTC AAAAACTCCC 5220 TTTAGGGAAA GACCATGAAG ATAGAAATCC GGCGGCGCCC GGTTAAATAC GCTAGGATAG 5280 AAGTGAAGCC AGACGGCAGG GTAGTCGTCA CTGCCCCGAG GGTTCAACGT TGAGAAGTT 5339

【００７４】配列番号７ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGATTAGTGC CAATGGAAGG CGAC 24

【００７５】配列番号８ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAGGGCGAAG TTTATTCCGA GCTT 24

【００７６】配列番号９ 配列の長さ：324 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：２本鎖 トロポジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGATTAGTGC CAATGGAAGG CGACGAGGAG CTGAAAATGC TCGCCTTCGA CATTCAAACT 60 CTCTACCATG AGGGCGAGGA GTTCGCCGAG GGGCCAATCC TTATGATAAG CTACGCCGAC 120 GAGGAAGGGG CCAGGGTGAT AACTTGGAAG AACGTGGATC TCCCCTACGT TGACGTCGTC 180 TCGACGGAGA GGGAGATGAT AAAGCGCTTC CTCCGTGTTG TGAAGGAGAA AGACCCGGAC 240 GTTCTCATAA CCTACAACGG CGACAACTTC GACTTCGCCT ATCTGAAAAA GCGCTGTGAA 300 AAGCTCGGAA TAAACTTCGC CCTC 324

【００７７】配列番号１０ 配列の長さ：108 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gly Leu Val Pro Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe 1 5 10 15 Asp Ile Gln Thr Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro 20 25 30 Ile Leu Met Ile Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr 35 40 45 Trp Lys Asn Val Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg 50 55 60 Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp 65 70 75 80 Val Leu Ile Thr Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys 85 90 95 Lys Arg Cys Glu Lys Leu Gly Ile Asn Phe Ala Leu 100 105

【００７８】配列番号１１ 配列の長さ：42 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数： 1本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCATCAAGA TCCTGGCAAA CAGCTACTAC GGTTACTACG GC 42

【００７９】配列番号１２ 配列の長さ：32 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数： 1本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATGGATCCA ACTTCTCAAC GTTGAACCCT CG 32

【００８０】配列番号１３ 配列の長さ：46 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数： 1本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GAACATAGTG TACCTAGATT TTAGATCCCT GTACCCCTCA ATCATC 46

【００８１】配列番号１４ 配列の長さ：42 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数： 1本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCGTAGTAA CCGTAGTAGC TGTTTGCCAG GATCTTGATG GC 42

【００８２】配列番号１５ 配列の長さ：33 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数： 1本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 ATCGATATCC TCGACACTGA CTACATAACC GAG 33

【００８３】配列番号１６ 配列の長さ：46 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数： 1本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GATGATTGAG GGGTACAGGG ATCTAAAATC TAGGTACACT ATGTTC 46

【図面の簡単な説明】

【図１】ＫＯＤポリメラ−ゼのＤＮＡ合成速度の測定結
果を示す電気泳動写真の代用図面である。

【図２】各種熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成
速度の比較を示す電気泳動写真の代用図面である。図２
ａはＫＯＤポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼの場
合を示す。図２ｂはＤｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼお
よびＴａｑポリメラーゼの場合を示す。

【図３】各種熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの反応時間の
違いによるＰＣＲの比較を示す電気泳動写真の代用図面
である。

【図４】組換え発現ベクタ−の構築図を示す。

【図５】ＫＯＤ１由来耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ分子量
測定結果を示す電気泳動の写真の代用図面である。

【図６】ＫＯＤ１由来耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼによる
ＰＣＲの結果を示す電気泳動の写真の代用図面である。

【図７】超好熱始原菌ＫＯＤ１由来のＤＮＡポリメラ−
ゼ遺伝子と類縁菌と思われる Pyrococcus furiosus由来
の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子およびThermococcus
litoralis由来の耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ遺伝子との
比較を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 今中 忠行 大阪府吹田市藤白台２−28−11 (72)発明者 高木 昌宏 大阪府吹田市青山台１−３ Ｃ−58−207 (72)発明者 森川 正章 大阪府箕面市小野原東５丁目４−12−406

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的核酸に、該核酸と相補的な塩基配列
   を有するプライマーおよび４種のｄＮＴＰを、ＤＮＡ合
   成速度が少なくとも３０塩基／秒であり、かつ３’−
   ５’エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポ
   リメラーゼを含む緩衝溶液中で反応させて、標的核酸に
   上記プライマーをアニールさせ、プライマー伸長反応を
   行うことを特徴とする核酸の増幅方法。
2. 【請求項２】 下記工程Ａ．〜Ｄ．を含む試料中の標的
   核酸を増幅する方法において、熱安定性ＤＮＡポリメラ
   ーゼとして、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０塩基／秒
   であり、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有す
   る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴と
   する核酸の増幅方法。 Ａ．必要により標的核酸を変性して、１本鎖核酸とする
   工程、 Ｂ．該１本鎖核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を有す
   る正方向および逆方向プライマーおよび４種のｄＮＴＰ
   を、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で反
   応させて、１本鎖核酸に上記プライマーをアニールさ
   せ、プライマー伸長反応を行う工程、 Ｃ．プライマー伸長物を分離して、１本鎖とする工程お
   よび Ｄ．上記工程Ｂ．および工程Ｃ．を繰り返す工程。
3. 【請求項３】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、超好熱
   始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼである請求
   項１または２記載の核酸の増幅方法。
4. 【請求項４】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、配列表
   ・配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含有する請求
   項１または２記載の核酸の増幅方法。
5. 【請求項５】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、下記理
   化学的性質を有する酵素である請求項１または２記載の
   核酸の増幅方法。 作用：ＤＮＡ合成活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ
   活性を有する。 ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒である。 至適ｐＨ：６．５〜７．５（７５℃にて） 至適温度：７５℃ 分子量：約８８〜９０Ｋｄａ アミノ酸配列：配列番号・配列表１に記載
6. 【請求項６】 下記工程Ａ．〜Ｅ．を含む試料中の標的
   核酸を検出する方法において、熱安定性ＤＮＡポリメラ
   ーゼとして、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０塩基／秒
   であり、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつ
   熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とす
   る核酸の検出方法。 Ａ．必要により標的核酸を熱変性して、１本鎖核酸とす
   る工程、 Ｂ．該１本鎖核酸と標的核酸に相補的な塩基配列を有す
   る正方向および逆方向プライマーおよび４種のｄＮＴＰ
   を熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む緩衝溶液中で反応
   させて、１本鎖核酸に上記プライマーをアニールさせ、
   プライマー伸長反応を行う工程、 Ｃ．プライマー伸長物を分離して、１本鎖とする工程 Ｄ．上記工程Ｂ．および工程Ｃ．を繰り返す工程および Ｅ．増幅産物を検出する工程。
7. 【請求項７】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、超好熱
   始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼである請求
   項６記載の核酸検出方法。
8. 【請求項８】 標的核酸に相補的な塩基配列を有する正
   方向および逆方向プライマー、４種のｄＮＴＰ、２価陽
   イオン、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０塩基／秒であ
   り、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつ熱安
   定性ＤＮＡポリメラーゼおよび緩衝液を含む核酸増幅用
   試薬キット。
9. 【請求項９】 ＤＮＡポリメラーゼが、超好熱始原菌Ｋ
   ＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼである請求項８記載
   の核酸増幅用試薬キット。
10. 【請求項１０】 標的核酸に相補的な塩基配列を有する
    正方向および逆方向プライマー、４種のｄＮＴＰ、２価
    陽イオン、ＤＮＡ合成速度が少なくとも３０塩基／秒で
    あり、かつ３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をもつ熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび増幅用緩衝液を含む核
    酸増幅用試薬および標的核酸プローブおよび検出用緩衝
    液を含む核酸検出用試薬キット。
11. 【請求項１１】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、超好
    熱始原菌ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼである請
    求項１０記載の核酸検出用試薬キット。
12. 【請求項１２】 超好熱始原菌ＫＯＤ１由来のＤＮＡポ
    リメラーゼ。
13. 【請求項１３】 下記理化学的性質を有する請求項１２
    記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。 作用：ＤＮＡ合成活性と３’−５’エキソヌクレアーゼ
    活性を有する。 ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒である。 至適ｐＨ：６．５〜７．５（７５℃にて） 至適温度：７５℃ 分子量：８８〜９０Ｋｄａ
14. 【請求項１４】 組換え宿主細胞を用いて生産されたこ
    とを特徴とする請求項１２記載のＤＮＡポリメラーゼ。
15. 【請求項１５】 配列番号１に記載されるアミノ酸配列
    を含有することを特徴とする請求項１２記載のＤＮＡポ
    リメラーゼ。
16. 【請求項１６】 超好熱始原菌ＫＯＤ１由来のＤＮＡポ
    リメラーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
17. 【請求項１７】 配列番号１に記載されるアミノ酸配列
    をコードする塩基配列を含有することを特徴とする請求
    項１６に記載される単離されたＤＮＡ。
18. 【請求項１８】 配列番号５に記載される塩基配列また
    はその一部分を含有することを特徴とする請求項１６に
    記載される単離されたＤＮＡ。
19. 【請求項１９】 請求項１６に記載されたＤＮＡをベク
    ターに挿入したＤＮＡ組換え発現ベクター。
20. 【請求項２０】 ベクターがｐＥＴ−８ｃ由来のベクタ
    ーであることを特徴とする請求項１９記載のＤＮＡ組換
    え発現ベクター（ｐＥＴ−ｐｏｌ）。
21. 【請求項２１】 請求項１９に記載されるＤＮＡ組換え
    発現ＤＮＡベクターを用いて形質転換された組換え宿主
    細胞。
22. 【請求項２２】 宿主細胞が大腸菌であることを特徴と
    する請求項２１記載の組換え宿主細胞。
23. 【請求項２３】 請求項２１に記載される組換え宿主細
    胞を培養し、培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取する
    ことを特徴とする超好熱始原菌ＫＯＤ１由来のＤＮＡポ
    リメラーゼの製造法。
24. 【請求項２４】 請求項２１に記載される組換え宿主細
    胞を培養し、（ａ）該組換え宿主細胞を集めた後、破砕
    し、細胞抽出物を調製し、（ｂ）組換え宿主細胞由来の
    不純蛋白質を除去する工程を含むことを特徴とする超好
    熱始原菌ＫＯＤ１由来ＤＮＡポリメラーゼを精製する方
    法。