JP2001258562A - 核酸合成法 - Google Patents
核酸合成法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 核酸合成阻害物質の作用を抑制して、試料中
の核酸を効率よく増幅させる新規な方法を提供すること
を目的とする。 【解決手段】本発明では、試料中の目的とする核酸を増
幅する核酸合成法において、試料をあらかじめポリアニ
オン、硫酸化ポリマー、硫酸化多糖不溶性高分子に接触
させることにより、核酸合成阻害物質を除去する。
の核酸を効率よく増幅させる新規な方法を提供すること
を目的とする。 【解決手段】本発明では、試料中の目的とする核酸を増
幅する核酸合成法において、試料をあらかじめポリアニ
オン、硫酸化ポリマー、硫酸化多糖不溶性高分子に接触
させることにより、核酸合成阻害物質を除去する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＰＣＲ法は、 ＤＮＡ鎖の１本鎖への解
離、ＤＮＡ鎖の特定の領域をはさんでプライマーの結
合、ＤＮＡポリメラーゼの作用によるＤＮＡ合成反応を
繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍に
も増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発
明である特開昭６１−２７４６９７号に述べられてい
る。
離、ＤＮＡ鎖の特定の領域をはさんでプライマーの結
合、ＤＮＡポリメラーゼの作用によるＤＮＡ合成反応を
繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍に
も増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発
明である特開昭６１−２７４６９７号に述べられてい
る。
【０００３】ＰＣＲ法は、種々の試料中の核酸の高感度
分析法として使用可能で、特に動物体液由来試料中の核
酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、感染症
や遺伝病やガンの診断・モニタリング等に利用される。
さらに、ＰＣＲ法は移植や親子鑑定、個人の遺伝子情報
に基づいた医療等でのＤＮＡタイピングの検査にも適し
た方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ば
れる場合が多い。
分析法として使用可能で、特に動物体液由来試料中の核
酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は、感染症
や遺伝病やガンの診断・モニタリング等に利用される。
さらに、ＰＣＲ法は移植や親子鑑定、個人の遺伝子情報
に基づいた医療等でのＤＮＡタイピングの検査にも適し
た方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ば
れる場合が多い。
【０００４】ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が阻害されるこ
とである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼであるThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の
生体由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣ
Ｒが強く阻害されることが広く知られている。 そこ
で、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立つて被験物から細
胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含
体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体から核
酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵
素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含
体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・
クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核
酸を抽出する方法が従来より使用されている。最近では
核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィ
ルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用さ
れている。
糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が阻害されるこ
とである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼであるThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の
生体由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣ
Ｒが強く阻害されることが広く知られている。 そこ
で、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立つて被験物から細
胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含
体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体から核
酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵
素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含
体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・
クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核
酸を抽出する方法が従来より使用されている。最近では
核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィ
ルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用さ
れている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一
定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、と
りわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合に
は、うまくできない場合もある。また、これら精製法は
操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーシ
ョンの機会が高い。従って、これらの問題点を解決する
ためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望
まれる。
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一
定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、と
りわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合に
は、うまくできない場合もある。また、これら精製法は
操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーシ
ョンの機会が高い。従って、これらの問題点を解決する
ためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望
まれる。
【０００６】そこで、本発明は、核酸合成を阻害する物
質を除去して、試料中の核酸を効率よく増幅させる新規
な方法を提供することを目的とする。
質を除去して、試料中の核酸を効率よく増幅させる新規
な方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】生体試料中の核酸合成阻
害物質をポリアニオンの不溶性高分子に接触させること
によって除去出来ることを見いだし本発明をなすに至っ
た。本発明は、上記課題を解決するため、試料中の目的
とする核酸を増幅する核酸合成法において、核酸増幅反
応の前に試料をポリアニオンの不溶性高分子に接触させ
ることを特徴とする。
害物質をポリアニオンの不溶性高分子に接触させること
によって除去出来ることを見いだし本発明をなすに至っ
た。本発明は、上記課題を解決するため、試料中の目的
とする核酸を増幅する核酸合成法において、核酸増幅反
応の前に試料をポリアニオンの不溶性高分子に接触させ
ることを特徴とする。
【０００８】ここで、ポリアニオンとは、陰イオンを含
有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩を
いう。陰イオンとしては、例えば、硫酸基、亜硫酸基、
燐酸基、カルボキシル基、チオカルボキシル基などを挙
げることができるが、これらに限定されない。特に硫酸
基を含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびそ
の塩（硫酸化ポリマー）が好ましい。
有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩を
いう。陰イオンとしては、例えば、硫酸基、亜硫酸基、
燐酸基、カルボキシル基、チオカルボキシル基などを挙
げることができるが、これらに限定されない。特に硫酸
基を含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびそ
の塩（硫酸化ポリマー）が好ましい。
【０００９】硫酸化ポリマーとしては、硫酸化多糖が好
ましく、硫酸化多糖は例えば、ヘパリンおよびその塩、
デキストランサルフェイトおよびその塩が好ましいが、
これに限定されず、例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイ
チン硫酸、デルマタン硫酸、フノラン、硫酸化アガロー
ス、カラギーナン、ポルフィラン、フコイダン、硫酸化
カードランなどを用いることができる。硫酸化ポリマー
は、上記以外にポリビニル硫酸およびその塩などを挙げ
ることができるが、これらに限定されない。なお、その
塩は、ナトリウム塩、カリウム塩などを挙げることがで
きるが、これらに限定されない。
ましく、硫酸化多糖は例えば、ヘパリンおよびその塩、
デキストランサルフェイトおよびその塩が好ましいが、
これに限定されず、例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイ
チン硫酸、デルマタン硫酸、フノラン、硫酸化アガロー
ス、カラギーナン、ポルフィラン、フコイダン、硫酸化
カードランなどを用いることができる。硫酸化ポリマー
は、上記以外にポリビニル硫酸およびその塩などを挙げ
ることができるが、これらに限定されない。なお、その
塩は、ナトリウム塩、カリウム塩などを挙げることがで
きるが、これらに限定されない。
【００１０】ポリアニオンの不溶性高分子は１種でも数
種を組み合わせてもよい。またこれら不溶性高分子は均
質なものでなくてもよく、ポリアニオンを含む複合型の
不溶性高分子や、なんらかの不溶性担体にポリアニオン
を結合したものでもよい。
種を組み合わせてもよい。またこれら不溶性高分子は均
質なものでなくてもよく、ポリアニオンを含む複合型の
不溶性高分子や、なんらかの不溶性担体にポリアニオン
を結合したものでもよい。
【００１１】試料をあらかじめポリアニオンの不溶性高
分子に接触させるには、例えば該不溶性高分子をカラム
に詰めたものや該不溶性高分子製のフィルターに試料を
通過させたり、容器に該不溶性高分子と試料を入れて混
合したのち試料を取り出したり、該不溶性高分子で内壁
をコーティングされた容器、またはそれ自体が該不溶性
高分子で構成される容器に試料を入れたのち取り出すな
どにより行えるが、これらに限定されない。なお、本発
明で「あらかじめ」とは、核酸増幅反応前と言う意味
で、試料を核酸増幅反応液への添加前にポリアニオンの
不溶性高分子に接触させる。
分子に接触させるには、例えば該不溶性高分子をカラム
に詰めたものや該不溶性高分子製のフィルターに試料を
通過させたり、容器に該不溶性高分子と試料を入れて混
合したのち試料を取り出したり、該不溶性高分子で内壁
をコーティングされた容器、またはそれ自体が該不溶性
高分子で構成される容器に試料を入れたのち取り出すな
どにより行えるが、これらに限定されない。なお、本発
明で「あらかじめ」とは、核酸増幅反応前と言う意味
で、試料を核酸増幅反応液への添加前にポリアニオンの
不溶性高分子に接触させる。
【００１２】本発明において、試料は生体由来試料その
ものもしくは、生体由来試料を何らかの方法で処理した
ものをさし、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排
泄物等をさす。体液には血液、髄液、唾液、乳が含ま
れ、排泄物には糞便、尿、汗が含まれるが、これらに限
定されるものではない。生体由来試料は、ポリアニオン
不溶性高分子に接触させること以外、特別な処理なしに
直接核酸増幅反応液に添加することが可能であるが、核
酸抽出等の処理と併用てもよく、これに限定されるもの
ではない。
ものもしくは、生体由来試料を何らかの方法で処理した
ものをさし、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排
泄物等をさす。体液には血液、髄液、唾液、乳が含ま
れ、排泄物には糞便、尿、汗が含まれるが、これらに限
定されるものではない。生体由来試料は、ポリアニオン
不溶性高分子に接触させること以外、特別な処理なしに
直接核酸増幅反応液に添加することが可能であるが、核
酸抽出等の処理と併用てもよく、これに限定されるもの
ではない。
【００１３】核酸増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並び
にＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシ
リボヌクレオチド類及び核酸合成酵素を含むものであ
る。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用さ
れている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、
ジメチルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加
される場合がある。
にＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシ
リボヌクレオチド類及び核酸合成酵素を含むものであ
る。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用さ
れている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、
ジメチルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加
される場合がある。
【００１４】ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せ
であり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、
トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −
hydroxypropanesulfonic acid）あるいはＣＨＥＳ（2ー
（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソ
ーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々
のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液
は、核酸増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間
の濃度で使用される。
ル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せ
であり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、
トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −
hydroxypropanesulfonic acid）あるいはＣＨＥＳ（2ー
（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソ
ーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々
のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液
は、核酸増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間
の濃度で使用される。
【００１５】プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在
下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい
う。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本
鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合に
は、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができる
し、また、生物界から単離することもできる。
下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい
う。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本
鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合に
は、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができる
し、また、生物界から単離することもできる。
【００１６】核酸合成酵素は、デオキシリボヌクレオチ
ド類付加により核酸を合成する酵素、あるいはかような
化学合成系を意味する。適切な核酸合成酵素としては、
Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポ
リメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤ
ＮＡポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これ
らにのみ限定されるものではない。また、本発明では核
酸増幅反応液のｐＨを調節することにより、相乗効果が
得られる。例えば、ｐＨは、２５℃の温度条件下で８．
１以上、好ましくは８．５〜９．５である。また、本発
明では、核酸増幅反応液にポリアミンを添加してもよ
い。
ド類付加により核酸を合成する酵素、あるいはかような
化学合成系を意味する。適切な核酸合成酵素としては、
Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポ
リメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮ
Ａポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤ
ＮＡポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これ
らにのみ限定されるものではない。また、本発明では核
酸増幅反応液のｐＨを調節することにより、相乗効果が
得られる。例えば、ｐＨは、２５℃の温度条件下で８．
１以上、好ましくは８．５〜９．５である。また、本発
明では、核酸増幅反応液にポリアミンを添加してもよ
い。
【００１７】なお、本発明の核酸合成法の手順は、試料
中の核酸を増幅する前に試料をあらかじめポリアニオ
ン、硫酸化ポリマー、硫酸化多糖不溶性高分子に接触さ
せること以外、通常の方法と何ら変わらない。すなわ
ち、上記の方法で処理した生体由来試料を直接もしくは
核酸抽出等の他の処理と併用処理した後に核酸合成の鋳
型として使用する。例えば核酸合成法としてＰＣＲを使
用する場合においては、先ず、増幅しようとする目的の
2本鎖ＤＮＡ断片を熱変性により、1本鎖のＤＮＡにする
（ディナチュレーション工程）。次に増幅させたい領域
を挟むプライマーをハイブリダイズさせる（アニーリン
グ工程）。次に４種類のデオキシリボヌクレオチド類
（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の共存下
にＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プライマーの伸長反
応を行う（ポリメライゼーション工程）。
中の核酸を増幅する前に試料をあらかじめポリアニオ
ン、硫酸化ポリマー、硫酸化多糖不溶性高分子に接触さ
せること以外、通常の方法と何ら変わらない。すなわ
ち、上記の方法で処理した生体由来試料を直接もしくは
核酸抽出等の他の処理と併用処理した後に核酸合成の鋳
型として使用する。例えば核酸合成法としてＰＣＲを使
用する場合においては、先ず、増幅しようとする目的の
2本鎖ＤＮＡ断片を熱変性により、1本鎖のＤＮＡにする
（ディナチュレーション工程）。次に増幅させたい領域
を挟むプライマーをハイブリダイズさせる（アニーリン
グ工程）。次に４種類のデオキシリボヌクレオチド類
（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の共存下
にＤＮＡポリメラーゼを作用させ、プライマーの伸長反
応を行う（ポリメライゼーション工程）。
【００１８】
【実施例】硫酸化デキストランゲルDextran beads, sul
fated D5650 (SIGMA, Missouri,USA)を詰めたスピンカ
ラムにヒト血清を通過させ、これを硫酸化デキストラン
ゲル処理血清とした。ＰＣＲ反応液（50μｌ）に無処理
の血清および硫酸化デキストランゲル処理血清を１０〜
０μｌ添加し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの鋳型として
は、GeneAmplimer pAW109RNA（PE Biosystems, foster,
USA）５０００コピーより逆転写したｃＤＮＡを使用し
た。ＰＣＲのプライマーはＤＭ１５１及びＤＭ１５２
（PE Biosystems, foster, USA ）であり、配列は次の
通りである。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの
結果、３０８bp の増幅産物を得ることができる。 ＤＭ１５１：配列番号１ ５’ＧＴＣＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴ
ＡＴＣ３’ ＤＭ１５２：配列番号２ ５’ＣＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴ
ＣＣ３’
fated D5650 (SIGMA, Missouri,USA)を詰めたスピンカ
ラムにヒト血清を通過させ、これを硫酸化デキストラン
ゲル処理血清とした。ＰＣＲ反応液（50μｌ）に無処理
の血清および硫酸化デキストランゲル処理血清を１０〜
０μｌ添加し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの鋳型として
は、GeneAmplimer pAW109RNA（PE Biosystems, foster,
USA）５０００コピーより逆転写したｃＤＮＡを使用し
た。ＰＣＲのプライマーはＤＭ１５１及びＤＭ１５２
（PE Biosystems, foster, USA ）であり、配列は次の
通りである。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの
結果、３０８bp の増幅産物を得ることができる。 ＤＭ１５１：配列番号１ ５’ＧＴＣＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴ
ＡＴＣ３’ ＤＭ１５２：配列番号２ ５’ＣＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴ
ＣＣ３’
【００１９】ＰＣＲ反応液には、10mM Tris-HCl, 50mM
KCl,1.5mM MgCl2 , 各200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びdT
TP, 各0.4 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA
ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Jap
an）反応液を用いた。ＰＣＲは、９４℃、３分間のプレ
ヒーティングの後、９４℃ ３０秒間、６０℃ ３０秒
間、７２℃ １分間の条件で４０サイクル、最後に７２
℃ ７分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終
了後、反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含
む、０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM
Tris-acetate, 1mM EDTA) 液中で電気泳動を行い検出
した。
KCl,1.5mM MgCl2 , 各200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びdT
TP, 各0.4 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA
ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Jap
an）反応液を用いた。ＰＣＲは、９４℃、３分間のプレ
ヒーティングの後、９４℃ ３０秒間、６０℃ ３０秒
間、７２℃ １分間の条件で４０サイクル、最後に７２
℃ ７分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終
了後、反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含
む、０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM
Tris-acetate, 1mM EDTA) 液中で電気泳動を行い検出
した。
【００２０】血清をＰＣＲ反応液に直接添加して、ＰＣ
Ｒを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図１に示す。
図中Ｍはサイズマーカー（HincIIで切断した250ng のφ
X174-RF DNA）、Ｐはポジティブコントロール（血清無
添加のもの）、Ｎはネガティブコントロール、１、９は
血清１０μl 添加、２、１０は５μl 添加、３、１１は
２．５μl 添加、４、１２は１．２５μl 添加、５、１
３は０．６３μl 添加、６、１４は０．３１μl 添加、
７、１５は０．１６μl 添加、８、１６は０．０８μl
添加したものを示している。なお１〜８は無処理の血
清、９〜１６は硫酸化デキストランゲル処理血清を用い
た場合である。結果、無処理の血清は非常に強いＰＣＲ
阻害を示し、すべての血清添加量でＰＣＲ増幅産物が得
られないのに対し、硫酸化デキストランゲル処理血清
は、すべての血清添加量で良好にＰＣＲ増幅産物が得ら
れることがわかる。
Ｒを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図１に示す。
図中Ｍはサイズマーカー（HincIIで切断した250ng のφ
X174-RF DNA）、Ｐはポジティブコントロール（血清無
添加のもの）、Ｎはネガティブコントロール、１、９は
血清１０μl 添加、２、１０は５μl 添加、３、１１は
２．５μl 添加、４、１２は１．２５μl 添加、５、１
３は０．６３μl 添加、６、１４は０．３１μl 添加、
７、１５は０．１６μl 添加、８、１６は０．０８μl
添加したものを示している。なお１〜８は無処理の血
清、９〜１６は硫酸化デキストランゲル処理血清を用い
た場合である。結果、無処理の血清は非常に強いＰＣＲ
阻害を示し、すべての血清添加量でＰＣＲ増幅産物が得
られないのに対し、硫酸化デキストランゲル処理血清
は、すべての血清添加量で良好にＰＣＲ増幅産物が得ら
れることがわかる。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、血清・血漿等のＰＣＲ阻
害物質を多く含んだ試料をあらかじめポリアニオンの不
溶性高分子に接触させるという簡便な操作をすることに
よって試料からの核酸の分離・精製の過程を経ずに直
接、目的の核酸を効率よく増幅することが可能となっ
た。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成の操作
を行えるようになり、コンタミネーションの機会の軽減
が可能となった。
害物質を多く含んだ試料をあらかじめポリアニオンの不
溶性高分子に接触させるという簡便な操作をすることに
よって試料からの核酸の分離・精製の過程を経ずに直
接、目的の核酸を効率よく増幅することが可能となっ
た。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成の操作
を行えるようになり、コンタミネーションの機会の軽減
が可能となった。
＜110＞shimadzu corp. ＜120＞Method for synthesis of nucleic acids ＜130＞K1000144 ＜160＞2 ＜210＞１ ＜211＞26 ＜212＞DNA ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞1 gtctctgaatcagaaatccttctatc ＜210＞2 ＜211＞25 ＜212＞DNA ＜213＞Artificial Sequence ＜400＞２ catgtcaaatttcactgcttcatcc
【図１】血清をＰＣＲ反応液に直接添加して、ＰＣＲを
行ったときの増幅産物の電気泳動図
行ったときの増幅産物の電気泳動図
Claims (5)
- 【請求項１】試料中の目的とする核酸を増幅する核酸合
成法において、試料をあらかじめ陰イオンを含有した繰
り返し構造を持つ高分子化合物（polyanion）およびそ
の塩（以下総称してポリアニオンと称する）の不溶性高
分子に接触させることを特徴とする核酸合成法。 - 【請求項２】ポリアニオンが、硫酸基を含有した繰り返
し構造を持つ高分子化合物（polysulfate）およびその
塩（以下総称して硫酸化ポリマーと称する）である請求
項１記載の核酸合成法。 - 【請求項３】硫酸化ポリマーが、硫酸化多糖（sulfated
polysaccharide）およびその塩（以下総称して硫酸化
多糖と称する）である請求項２記載の核酸合成法。 - 【請求項４】硫酸化多糖が、ヘパリンおよびその塩、デ
キストランサルフェイトおよびその塩である請求項３記
載の核酸合成法。 - 【請求項５】試料が生体由来試料そのものである請求項
１〜４に記載の核酸合成法。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2000077746A JP3724321B2 (ja) | 2000-03-21 | 2000-03-21 | 核酸合成法 |
| US09/809,219 US6576447B2 (en) | 2000-03-21 | 2001-03-16 | Method for synthesis of nucleic acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000077746A JP3724321B2 (ja) | 2000-03-21 | 2000-03-21 | 核酸合成法 |
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|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000077746A Expired - Lifetime JP3724321B2 (ja) | 2000-03-21 | 2000-03-21 | 核酸合成法 |
Country Status (2)
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| US (1) | US6576447B2 (ja) |
| JP (1) | JP3724321B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPH06277062A (ja) * | 1992-09-11 | 1994-10-04 | F Hoffmann La Roche Ag | 血液試料中の核酸の増幅および検出 |
| WO1999054455A1 (en) * | 1998-04-23 | 1999-10-28 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for synthesizing dna |
| WO2000014218A1 (fr) * | 1998-09-08 | 2000-03-16 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Procede de synthese de l'adn |
| JP2000093176A (ja) * | 1998-09-21 | 2000-04-04 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
| JP2001008680A (ja) * | 1999-06-30 | 2001-01-16 | Shimadzu Corp | 核酸合成法 |
| JP2001029078A (ja) * | 1999-07-16 | 2001-02-06 | Shimadzu Corp | Ｒｎａ増幅法 |
-
2000
- 2000-03-21 JP JP2000077746A patent/JP3724321B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-16 US US09/809,219 patent/US6576447B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
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|---|---|
| US6576447B2 (en) | 2003-06-10 |
| JP3724321B2 (ja) | 2005-12-07 |
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