JP2001258562A - 核酸合成法 - Google Patents

核酸合成法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 核酸合成阻害物質の作用を抑制して、試料中
の核酸を効率よく増幅させる新規な方法を提供すること
を目的とする。 【解決手段】本発明では、試料中の目的とする核酸を増
幅する核酸合成法において、試料をあらかじめポリアニ
オン、硫酸化ポリマー、硫酸化多糖不溶性高分子に接触
させることにより、核酸合成阻害物質を除去する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction :
以下PCRと略す)法による核酸合成法に関する。
【0002】
【従来の技術】PCR法は、 DNA鎖の1本鎖への解
離、DNA鎖の特定の領域をはさんでプライマーの結
合、DNAポリメラーゼの作用によるDNA合成反応を
繰り返すことによって、目的のDNA断片を数十万倍に
も増幅できる方法である。PCR法は、マリス氏らの発
明である特開昭61−274697号に述べられてい
る。
【0003】PCR法は、種々の試料中の核酸の高感度
分析法として使用可能で、特に動物体液由来試料中の核
酸の分析法に使用できる。従って、PCR法は、感染症
や遺伝病やガンの診断・モニタリング等に利用される。
さらに、PCR法は移植や親子鑑定、個人の遺伝子情報
に基づいた医療等でのDNAタイピングの検査にも適し
た方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ば
れる場合が多い。
【0004】PCR法の1つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物によって反応が阻害されるこ
とである。すなわち、代表的な耐熱性DNAポリメラー
ゼであるThermus aquaticus 由来のTaqDNAポリメ
ラーゼをはじめ、多くのDNAポリメラーゼは、微量の
生体由来の夾雑物がPCR反応液中に混在しても、PC
Rが強く阻害されることが広く知られている。 そこ
で、PCR法によるDNA増幅に先立つて被験物から細
胞、原虫、真菌、細菌、ウィルス等(以下、遺伝子包含
体と称する)を分離し、次に、その遺伝子包含体から核
酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵
素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含
体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・
クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核
酸を抽出する方法が従来より使用されている。最近では
核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィ
ルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬が使用さ
れている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ、試料中の核酸の回収量が一
定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、と
りわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合に
は、うまくできない場合もある。また、これら精製法は
操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーシ
ョンの機会が高い。従って、これらの問題点を解決する
ためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望
まれる。
【0006】そこで、本発明は、核酸合成を阻害する物
質を除去して、試料中の核酸を効率よく増幅させる新規
な方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】生体試料中の核酸合成阻
害物質をポリアニオンの不溶性高分子に接触させること
によって除去出来ることを見いだし本発明をなすに至っ
た。本発明は、上記課題を解決するため、試料中の目的
とする核酸を増幅する核酸合成法において、核酸増幅反
応の前に試料をポリアニオンの不溶性高分子に接触させ
ることを特徴とする。
【0008】ここで、ポリアニオンとは、陰イオンを含
有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩を
いう。陰イオンとしては、例えば、硫酸基、亜硫酸基、
燐酸基、カルボキシル基、チオカルボキシル基などを挙
げることができるが、これらに限定されない。特に硫酸
基を含有した繰り返し構造を持つ高分子化合物およびそ
の塩(硫酸化ポリマー)が好ましい。
【0009】硫酸化ポリマーとしては、硫酸化多糖が好
ましく、硫酸化多糖は例えば、ヘパリンおよびその塩、
デキストランサルフェイトおよびその塩が好ましいが、
これに限定されず、例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイ
チン硫酸、デルマタン硫酸、フノラン、硫酸化アガロー
ス、カラギーナン、ポルフィラン、フコイダン、硫酸化
カードランなどを用いることができる。硫酸化ポリマー
は、上記以外にポリビニル硫酸およびその塩などを挙げ
ることができるが、これらに限定されない。なお、その
塩は、ナトリウム塩、カリウム塩などを挙げることがで
きるが、これらに限定されない。
【0010】ポリアニオンの不溶性高分子は1種でも数
種を組み合わせてもよい。またこれら不溶性高分子は均
質なものでなくてもよく、ポリアニオンを含む複合型の
不溶性高分子や、なんらかの不溶性担体にポリアニオン
を結合したものでもよい。
【0011】試料をあらかじめポリアニオンの不溶性高
分子に接触させるには、例えば該不溶性高分子をカラム
に詰めたものや該不溶性高分子製のフィルターに試料を
通過させたり、容器に該不溶性高分子と試料を入れて混
合したのち試料を取り出したり、該不溶性高分子で内壁
をコーティングされた容器、またはそれ自体が該不溶性
高分子で構成される容器に試料を入れたのち取り出すな
どにより行えるが、これらに限定されない。なお、本発
明で「あらかじめ」とは、核酸増幅反応前と言う意味
で、試料を核酸増幅反応液への添加前にポリアニオンの
不溶性高分子に接触させる。
【0012】本発明において、試料は生体由来試料その
ものもしくは、生体由来試料を何らかの方法で処理した
ものをさし、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排
泄物等をさす。体液には血液、髄液、唾液、乳が含ま
れ、排泄物には糞便、尿、汗が含まれるが、これらに限
定されるものではない。生体由来試料は、ポリアニオン
不溶性高分子に接触させること以外、特別な処理なしに
直接核酸増幅反応液に添加することが可能であるが、核
酸抽出等の処理と併用てもよく、これに限定されるもの
ではない。
【0013】核酸増幅反応液は、通常、pH緩衝液並び
にMgCl2、KCl等の塩類、プライマー、デオキシ
リボヌクレオチド類及び核酸合成酵素を含むものであ
る。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用さ
れている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、
ジメチルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加
される場合がある。
【0014】pH緩衝液は、トリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せ
であり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、
トリシン、CAPSO(3ーNーCyclohexylamino −2 −
hydroxypropanesulfonic acid)あるいはCHES(2ー
(Cyclohexylamino )ethanesulfonic acid )と苛性ソ
ーダ、苛性カリとの組み合わせによるpH緩衝液等種々
のpH緩衝液が使用され得る。pH調整された緩衝液
は、核酸増幅反応液の中で10mMから100mMの間
の濃度で使用される。
【0015】プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在
下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい
う。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本
鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合に
は、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができる
し、また、生物界から単離することもできる。
【0016】核酸合成酵素は、デオキシリボヌクレオチ
ド類付加により核酸を合成する酵素、あるいはかような
化学合成系を意味する。適切な核酸合成酵素としては、
E.coliのDNAポリメラーゼI、E.coliのDNAポ
リメラーゼのクレノーフラグメント、T4DNAポリメ
ラーゼ、TaqDNAポリメラーゼ、T.litoralisDN
Aポリメラーゼ、TthDNAポリメラーゼ、PfuD
NAポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これ
らにのみ限定されるものではない。また、本発明では核
酸増幅反応液のpHを調節することにより、相乗効果が
得られる。例えば、pHは、25℃の温度条件下で8.
1以上、好ましくは8.5〜9.5である。また、本発
明では、核酸増幅反応液にポリアミンを添加してもよ
い。
【0017】なお、本発明の核酸合成法の手順は、試料
中の核酸を増幅する前に試料をあらかじめポリアニオ
ン、硫酸化ポリマー、硫酸化多糖不溶性高分子に接触さ
せること以外、通常の方法と何ら変わらない。すなわ
ち、上記の方法で処理した生体由来試料を直接もしくは
核酸抽出等の他の処理と併用処理した後に核酸合成の鋳
型として使用する。例えば核酸合成法としてPCRを使
用する場合においては、先ず、増幅しようとする目的の
2本鎖DNA断片を熱変性により、1本鎖のDNAにする
(ディナチュレーション工程)。次に増幅させたい領域
を挟むプライマーをハイブリダイズさせる(アニーリン
グ工程)。次に4種類のデオキシリボヌクレオチド類
(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)の共存下
にDNAポリメラーゼを作用させ、プライマーの伸長反
応を行う(ポリメライゼーション工程)。
【0018】
【実施例】硫酸化デキストランゲルDextran beads, sul
fated D5650 (SIGMA, Missouri,USA)を詰めたスピンカ
ラムにヒト血清を通過させ、これを硫酸化デキストラン
ゲル処理血清とした。PCR反応液(50μl)に無処理
の血清および硫酸化デキストランゲル処理血清を10〜
0μl添加し、PCRを行った。PCRの鋳型として
は、GeneAmplimer pAW109RNA(PE Biosystems, foster,
USA)5000コピーより逆転写したcDNAを使用し
た。PCRのプライマーはDM151及びDM152
(PE Biosystems, foster, USA )であり、配列は次の
通りである。この2種類のプライマーを用いたPCRの
結果、308bp の増幅産物を得ることができる。 DM151:配列番号1 5’GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCT
ATC3’ DM152:配列番号2 5’CATGTCAAATTTCACTGCTTCAT
CC3’
【0019】PCR反応液には、10mM Tris-HCl, 50mM
KCl,1.5mM MgCl2 , 各200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びdT
TP, 各0.4 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA
ポリメラーゼ(TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Jap
an)反応液を用いた。PCRは、94℃、3分間のプレ
ヒーティングの後、94℃ 30秒間、60℃ 30秒
間、72℃ 1分間の条件で40サイクル、最後に72
℃ 7分間のポリメライゼーションを行った。PCR終
了後、反応液5μlを用いて、2.5%アガロースを含
む、0.5μg/ ml臭化エチジウム添加TAE(40mM
Tris-acetate, 1mM EDTA) 液中で電気泳動を行い検出
した。
【0020】血清をPCR反応液に直接添加して、PC
Rを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図1に示す。
図中Mはサイズマーカー(HincIIで切断した250ng のφ
X174-RF DNA)、Pはポジティブコントロール(血清無
添加のもの)、Nはネガティブコントロール、1、9は
血清10μl 添加、2、10は5μl 添加、3、11は
2.5μl 添加、4、12は1.25μl 添加、5、1
3は0.63μl 添加、6、14は0.31μl 添加、
7、15は0.16μl 添加、8、16は0.08μl
添加したものを示している。なお1〜8は無処理の血
清、9〜16は硫酸化デキストランゲル処理血清を用い
た場合である。結果、無処理の血清は非常に強いPCR
阻害を示し、すべての血清添加量でPCR増幅産物が得
られないのに対し、硫酸化デキストランゲル処理血清
は、すべての血清添加量で良好にPCR増幅産物が得ら
れることがわかる。
【0021】
【発明の効果】本発明により、血清・血漿等のPCR阻
害物質を多く含んだ試料をあらかじめポリアニオンの不
溶性高分子に接触させるという簡便な操作をすることに
よって試料からの核酸の分離・精製の過程を経ずに直
接、目的の核酸を効率よく増幅することが可能となっ
た。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成の操作
を行えるようになり、コンタミネーションの機会の軽減
が可能となった。
【配列表】
<110>shimadzu corp. <120>Method for synthesis of nucleic acids <130>K1000144 <160>2 <210>1 <211>26 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>1 gtctctgaatcagaaatccttctatc <210>2 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>2 catgtcaaatttcactgcttcatcc
【図面の簡単な説明】
【図1】血清をPCR反応液に直接添加して、PCRを
行ったときの増幅産物の電気泳動図

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】試料中の目的とする核酸を増幅する核酸合
    成法において、試料をあらかじめ陰イオンを含有した繰
    り返し構造を持つ高分子化合物(polyanion)およびそ
    の塩(以下総称してポリアニオンと称する)の不溶性高
    分子に接触させることを特徴とする核酸合成法。
  2. 【請求項2】ポリアニオンが、硫酸基を含有した繰り返
    し構造を持つ高分子化合物(polysulfate)およびその
    塩(以下総称して硫酸化ポリマーと称する)である請求
    項1記載の核酸合成法。
  3. 【請求項3】硫酸化ポリマーが、硫酸化多糖(sulfated
    polysaccharide)およびその塩(以下総称して硫酸化
    多糖と称する)である請求項2記載の核酸合成法。
  4. 【請求項4】硫酸化多糖が、ヘパリンおよびその塩、デ
    キストランサルフェイトおよびその塩である請求項3記
    載の核酸合成法。
  5. 【請求項5】試料が生体由来試料そのものである請求項
    1〜4に記載の核酸合成法。
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