CN1637146A

CN1637146A - Dna的合成方法

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Publication number: CN1637146A
Application number: CNA2004100825674A
Authority: CN
Inventors: 浅田起代蔵; 上森隆司; 佐藤好美; 藤田朋子; 三宅一惠; 武田理; 向井博之; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Takara Bio Inc
Priority date: 1998-04-23
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2005-07-13
Also published as: AU3534199A; EP1072678A1; EP2116600B1; EP1072678A4; EP1816197B1; EP1816197A2; EP2116600A2; KR100519895B1; DE69941441D1; US20090098613A1; EP2116600A3; US8367328B2; JP4214142B2; KR20010042958A; CN1177931C; JP3748378B2; EP1816197A3; CA2326725A1; JP2006061164A; WO1999054455A1

Abstract

DNA合成反应促进剂，它至少含有1种选自酸性物质和阳离子络合物的物质；DNA合成方法，它是在上述促进剂存在的情况下应用DNA聚合酶进行的DNA合成反应；DNA合成反应促进剂，它包含上述促进剂；DNA合成反应组合物，它至少含有2种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶；DNA合成方法，它在进行DNA合成反应时应用了至少2种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶；用于体外合成DNA试剂盒，它至少包含2种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶；用于体外合成DNA的试剂盒，它包含上述DNA合成反应促进剂和DNA聚合酶。因此可以比传统的DNA合成反应更有效地合成DNA。

Description

DNA的合成方法

本发明申请是申请号为CN99807709.7(国际申请日为1999年4月21日)的进入国家阶段的PCT申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因工程学领域中有用的DNA合成反应促进剂。DNA合成方法、DNA合成反应组合物及用于该DNA合成方法的试剂盒。

技术背景

在基因工程学领域的研究中，DNA的合成可用于各种不同的目的。其中除了合成象寡核苷酸那样的短链DNA之外，基本上是通过利用DNA聚合酶的酶学方法来合成的。因此，作为DNA碱基序列测定、DNA标记或导入位点特异的突变的试剂，DNA聚合酶具有很高的价值。最近，由于聚合酶链式反应(PCR)方法和该PCR方法与逆转录酶反应相结合的逆转录-PCR(RT-PCR)方法的开发，人们的注意力集中在耐热性DNA聚合酶上，开发出适于上述PCR方法的各种DNA聚合酶，并使之商品化。

现在已知的DNA聚合酶根据其氨基酸序列的同源性可分为四大家族，其中家族A(polI型酶)和家族B(α型酶)占据了大多数。属于同一家族的各DNA聚合酶有大致相同的生化学特性，但是详细比较时，各种酶有其不同的性质，如基质特异性、基质类似物的摄取效率、引物延长的强度及速度、DNA合成方式、核酸外切酶活性、温度、pH等最佳反应条件、或对抑制剂的敏感性等。因此，要从目前可能的DNA聚合酶中选择应用具有最佳适用性质的。

例如超耐热性古细菌(Pyrocuccus furiosus)生产α型DNA聚合酶，已经分离出其基因(核酸研究(Nucleic Acids Research)，第21卷，259-265页(1993))。最近，在该菌株中发现一新型与目前已知的DNA聚合酶不存在结构相似性的DNA聚合酶。该DNA聚合酶是2种新型的蛋白质形成的复合体，表达DNA聚合酶活性。此外，该新型DNA聚合酶有强的3′→5′核酸外切酶活性并显示良好的引物延长活性。例如在PCR中应用该酶时，可扩增20kb长度的DNA片段。

另一方面，应用DNA聚合酶的DNA合成反应中，选择合适的酶与设定合适的反应条件同样重要。主要的反应条件包括反应液的组成、pH、反应温度、模板及引物的浓度等。而且，必须设定所使用的酶及与目的相应的反应条件。但是，有时这样的设定很困难。

已知，联合应用多个DNA聚合酶时可合成单个DNA聚合酶所不可能达到的高效DNA〔美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad Sci.US)，第91卷，第5695-5699(1994)〕。该方法是在PCR中混合使用具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶(例如上述Pyrococcus furiosus来源的α型DNA聚合酶)和没有该活性的DNA聚合酶(Taqpolymerase)〕的方法，称之为LA-PCR法。与以往只应用1种DNA聚合酶的PCR相比，该方法可增加扩增出的DNA的量，并且它能扩增以往的PCR所不能扩增的长链长DNA。但是，该效果只限于联合应用上述具有3′→5′核酸外切酶活性的酶和不具有该活性的酶时发挥作用。

如上所述，应用DNA聚合酶的DNA合成反应是基因工程学方法中所必不可缺少的手段。增加其效率对于提高研究的效率是很重要的。但是，现在应用的反应体系的缺点是它在研究应用中未得到充分优化。因此就要寻求与目前的DNA合成反应相比能更有效合成DNA的方法。

发明内容

本发明借鉴于以往的技术，其目的是提供(1)DNA合成反应促进剂，(2)以在该DNA合成反应促进剂存在的条件下进行反应为特征的DNA合成方法，(3)含有该DNA合成反应促进剂的DNA合成反应组合物，(4)含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的DNA合成反应组合物，(5)以在进行DNA合成反应时，应用了2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶为特征的DNA合成方法，(6)含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的试剂盒，以及(7)含有上述DNA合成反应促进剂及DNA聚合酶的试剂盒。

本发明者们进行了专心研究，结果发现至少1种选自酸性物质和阳离子络合物的物质存在时可提高DNA聚合酶的DNA合成反应的效率。另外发现当2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶混合使用时能使DNA的合成效率极高。而且，这些技术联合应用时可构建良好的基因扩增反应体系，这些组成了本发明。

也就是说，本发明的要点是，它涉及

[1]含有至少1种选自酸性物质和阳离子络合物的DNA合成反应促进剂；

[2]DNA合成方法，其特征在于，进行DNA合成反应时，在上述(1)中的DNA合成反应促进剂存在的条件下应用DNA聚合酶进行；

[3]含有上述(1)中DNA合成反应促进剂的DNA合成反应组合物；

[4]含有2种或更多种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的DNA合成反应组合物；

[5]DNA合成方法，其特征在于，进行DNA合成反应时它应用了2种或更多种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶；

[6]用于体外合成DNA的试剂盒，它含有2种或更多种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以及

[7]用于体外合成DNA的试剂盒，它含有上述[1]中的DNA合成反应促进剂及DNA聚合酶。

实施本发明的最佳方案

(1)本发明的DNA合成反应促进剂

本发明的DNA合成反应促进剂的一个大特征是它至少含有1种选自酸性物质及阳离子络合物的物质。本发明的DNA合成反应促进剂因含有至少1种(有效成分)选自酸性物质及阳离子络合物的物质，能发挥促进DNA聚合酶引起的DNA合成反应的作用。

本发明的“DNA合成反应促进剂”是单指上述酸性物质或阳离子络合物的，或者是含有酸性物质和阳离子络合物的混合物，每种均能显示促进DNA合成反应之作用。另外，当酸性物质与阳离子络合物形成复合体时，只要它能促进DNA聚合酶的DNA合成反应，也包含在本发明的“DNA合成反应促进剂”之内。

再者，在发挥促进DNA聚合酶的DNA合成反应的作用范围内添加了各种添加剂的混合物也包含在本发明的“DNA合成反应促进剂”中。

“促进DNA合成反应的作用”可通过单位时间内新合成的DNA链的长度及PCR扩增产物的量进行检测。另外，DNA聚合酶的活性测定可以，例如进行新合成的DNA链所摄取的标记核苷酸的活性测定时，可通过比较添加或未添加至少1种选自酸性物质及阳离子络合物的物质时的活性进行测定。所讲的“促进DNA合成反应的作用”也包含提高合成反应效率的作用。

作为本发明的DNA合成反应促进剂没有进行特殊限定，例如作为DNA聚合酶活性促进剂可以是作用于DNA聚合酶提高其催化活性的物质；或者该促进剂的有效成分的分子上保持DNA聚合酶，从而抑制酶与模板DNA的非特异性相互作用，提供模板DNA最适量的酶；或作用于模板DNA，通过保持其主体结构达到易于DNA合成反应进行的状态而有效发挥该DNA聚合酶的活性。另外，本发明的DNA合成反应促进剂的另一作用是能提高模板DNA和引物的退火效率。

上述DNA合成反应促进剂中的酸性物质，作为DNA聚合酶活性促进，它是具有促进DNA合成反应作用的物质，具体而言，它是带有负电荷的物质或其盐类，特别是酸性物质或其盐类等。

本发明的DNA合成反应促进剂中应用酸性物质时，它能在DNA合成反应的进行过程中通过使发生扩增的模板DNA与DNA聚合酶的相互作用最优化而促进DNA合成反应。

对有DNA合成反应促进作用的酸性物质包括但不局限于，例如酸性多糖样的酸性高分子物质。另外，也可应用聚乙烯硫酸、聚苯乙烯硫酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、没有模板功能的DNAs(即不能作为合成目的DNA的模板的DNAs)等。本说明书中的“酸性物质”也包含其盐类。酸性多糖包括，例如含有硫酸基团的硫酸多糖诸如含有硫酸岩藻糖多糖，硫酸葡聚糖、角叉(菜)胶、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸鼠李糖、硫酸软骨素等等，以及透明质酸、藻酸、果胶等多糖醛酸。另外，含有硫酸岩藻糖的多糖可应用，例如含有硫酸岩藻糖的多糖-F或多糖-U。这里“含有硫酸岩藻糖的多糖-F”可按照国际公开第97/26896号小册子中记载的方法，或者按第97/47208号小册子中记载的方法从褐藻植物中获得，基本上不含糖醛酸的含硫酸岩藻糖的多糖。另外，“含硫酸岩藻糖的多糖-U”可按照上述小册子中的方法获得，它是含有糖醛酸的含硫酸岩藻糖的多糖。

对上述酸性物质的盐类没有特别限定：只要有促进DNA合成反应的作用即可，但优选水溶性盐。例如葡聚糖硫酸钠、藻酸钠、多谷氨酸钠、聚苯乙烯硫酸钠、肝素钠、聚乙烯硫酸钠、葡聚糖硫酸钾、肝素锂等碱金属盐。

上述的酸性物质可以是从天然物中分离纯化出的，也可是化学或酶的合成物，只要有促进DNA合成反应的作用即可。另外，上述酸性物质也可以是含有该酸性物质的未纯化物或其部分纯化物质。也可在保持促进DNA合成反应的范围内进行适当修饰。只要具有促进DNA合成反应的作用，该物质可以是通过分解作用而得到的分子量适宜的物质，也可以是其后进行分子量分级而得到的物质。本发明中适于应用分子量数千以上的酸性物质。并且这些物质可单独应用或2种以上混合使用。

本发明的DNA合成反应促进剂中应用的阳离子络合物可以是任何物质，只要它有促进DNA聚合酶DNA合成反应的作用，具体而言，它可以是带有正电荷的络合物或其盐，特别是络阳离子或其络盐。

本发明的DNA合成反应促进剂中应用阳离子络合物时，它能提高模板DNA和引物的退火效率，从而促进DNA合成反应。此外，即使在目前DNA扩增困难的条件下，如低镁离子浓度、低引物浓度、低酶量、扩增富含GC的区域等，也可得到目的扩增片段。并且应用该阳离子络合物时可在长链DNA的PCR中促进扩增。

此外，上述酸性物质与阳离子络合物联合应用时可进一步促进DNA合成反应。

对具有DNA合成反应促进作用的阳离子络合物没有特殊限定，例如过渡金属络合物也可以应用。再者，本说明书中“阳离子络合物”也包含其盐类。

过渡金属络合物，只要是能发挥DNA合成反应促进作用的络合物即可，以元素周期表(化学辞典、第1版、东京化学同)中第8族过渡元素作为中心原子的络合物较适合。第8族过渡元素包括，但没有特殊限定，只要它产生的络合物能发挥DNA合成反应促进作用即可，例如可应用钴(Co)、铑(Rh)、铱(Ir)等。另外，络合物中的配位体包括但不特别局限于单价配位体、二价配位体、三价配位体、四价配位体等。例如可以是H₂O、NH₃、CO、NO、吡啶等中性配位体，也可以是H₂NCH₂CH₂NH₂样的螯合配位体。此外，若反应液中有作为络合阳离子存在的阳离子络合物，也可包含Cl^-、OH^-、NO₂ ^-、CN^-、CO₃ ^2-等阴离子性配位体。该络合物中配位体的种类可以是1种也可以是多种。若阳离子络合物存在几何异构体、光学异构体及结合异构体，只要它具有促进DNA合成反应的作用，就包含在本发明的DNA合成反应促进剂中。

作为过渡金属络合物的具体例子包括，例如[Co(NH₃)₆]Cl₃、[Co(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃、[Co(NH₃)₅(H₂O)]Cl₃、[Co(H₂O)(NH₃)₅]₂(SO₄)₃、[Co(OH)(NH₃)₅]Cl₂、[Rh(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃、[Rh(NH₃)₆]Br₃、[Rh(NH₃)₅(H₂O)]Cl₃、[RhCl₂(NH₃)₄]Cl、[Ir(NH₃)₆]Cl₃、[IrCl(NH₃)₅]Cl₂、[Ir(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]I₃等。上述过渡金属络合物特别优先1种以上选自[Co(NH₃)₆]Cl₃、[Co(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃及[Rh(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃的。

作为上述阳离子络合物的盐没有特殊限定，只要具有促进DNA合成反应的作用即可，但优先其水溶性的盐。例如有象氯化物样的齿化物的盐、硫酸盐样的无机酸的盐以及醋酸盐等有机酸的盐。也就是说，即使是本发明DNA合成反应促进剂中的酸性物质和阳离子络合物的盐，只要它在反应液中以电离状态存在也适于应用。

上述阳离子络合物只要能保持DNA合成反应的促进作用，它可以是任何物质。此外上述阳离子络合物可以是含有该络合物的未纯化物质，也可以是其部分纯化的物质。并且可以在保持DNA合成反应促进作用的范围内进行适当修饰。这些物质可单独应用或混合使用。

本发明的DNA合成反应促进剂对于促进该DNA合成反应的DNA聚合酶包括但不特别限定于，例如是polI型DNA聚合酶(大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段、来源于水生栖热属(Thermus aquatics)的DNA聚合酶(Taq polymerase)等)，α型DNA聚合酶(上述Pyrococcusfuriosus衍生的的α型的DNA聚合酶)，Thermococus Litralis衍生的DNA聚合酶(VENT DNA polymerase)、Pyrococcus sp.衍生的DNA聚合酶(Pyrobest DNA polymerase、KOD DNA polymerase)、Pyrococcussp.衍生的DNA聚合酶GB-D(DEEP VENT DNA polymerase)等)，不属于其中任何一种的非α非polI型DNA聚合酶。从氨基酸序列的同源性进行分类的话，polI型DNA聚合酶、α型DNA聚合酶均属于一类酶，其氨基酸序列的特征记载于核酸研究Nucleic Acids Research第15卷，4043-4057页(1991年)。

非α非polI型DNA聚合酶可包括国际公开第97/2444号小册子记载的来源于Pyrococcus furiosus DNA聚合酶，为区别起见，本说明书中将前示所讲的来源于Pyrococcus furiosus的非α非polI型DNA聚合酶记作Pfu DNA聚合酶II以区别于有相同来源的α型DNA聚合酶。将来源于上述Pyrococcus furiosus的α型DNA聚合酶记作Pfu DNA聚合酶I。

Pfu DNA聚合酶II具有如下性质：

1)以单链的模板DNA与引物退火时的复合体为底物来测定聚合酶活性时，比以活性DNA为底物进行测定时的活性高。

2)具有3′→5′核酸外切酶活性。

3)在以下条件下，以λDNA为模板进行聚合酶链式反应(PCR)时，不添加其它酶，可扩增出大约20kbp的DNA片段。

PCR的条件：

(a)反应液组成：10mM Tris-HCl(pH9.2)、3.5mM氯化镁、75mM氯化钾、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，0.01％牛血清白蛋白、0.1％Triton X-100、5.0ng/50μl λDNA、l0pmole/50μl引物λA(序列表中序列号1)和引物λB(序列表中序列号2)，以及3.7U/50μlDNA聚合酶；

(b)反应条件：98℃、10秒-68℃，10分钟为1个循环，共进行30个循环的PCR。

4)在SDS-PAGE上得到大约90,000道尔顿和大约140,000道尔顿的2种DNA聚合酶组成蛋白质。

此外，已经克隆了编码上述Pfu DNA聚合酶II的基因，用含有该基因的质粒pFu 1001转化的大肠杆菌JM 109命名为Escherichiacoli JM 109/p FU 1001，并用之表示，于平成7年(1995年)8月11日(原保藏日)保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(收件地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮政编码：305-8566)，保藏号为FERN BP-5579。因此，通过培养该转化体、得到其培养物，按照如国际公开第97/24444号小册子(28-29页，实施例3)中记载的方法可获得上述Pfu DNA聚合酶II。

在使用上述各种DNA聚合酶进行DNA合成反应的过程中，向其反应液中加入本发明的DNA合成反应促进剂时，可令人惊讶地提高该DNA聚合酶的DNA合成效率。此时，应用2种以上的DNA聚合酶，例如2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶(例如α型DNA聚合酶和非α非ポリI型DNA聚合酶)，具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶和不具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶时同样可提高DNA合成效率。

例如，应用添加了本发明DNA合成反应促进剂的反应液进行PCR时，与不添加该促进剂的PCR相比，扩增产物的量增加了。例如，通过添加本发明的DNA合成反应促进剂，即使在以往扩增困难的条件下也能得到扩增产物。此外，扩增产物的量可进行定量化，例如将一定量的PCR后的反应液进行电泳，用溴化乙锭或这类物质对电泳后的胶进行染色，通过影像分析可以测定扩增产物的带的荧光强度，由此进行定量。如此对扩增产物的量进行定量，可以发现：应用添加了本发明DNA合成反应促进剂的反应液进行PCR时与不添加该促进剂的反应液进行的PCR相比较，虽则扩增水平取决于扩增对象的长度、GC含量等，但扩增产物的量增加了大约2-5倍。另外，用少量的模板DNA也能有效扩增DNA。

应用本发明的DNA合成反应促进剂进行PCR的过程中，为了得到同等量的扩增产物，可缩短PCR的反应时间。

通常PCR要强过这样3步来实现DNA的扩增：双链模板DNA解开成单链(变性)、引物向单链DNA模板的退火、从引物开始的互补链合成(延伸)。此外，在上述3步反应中引物的退火与伸展的步骤在同一温度下进行的2步反应也能实现DNA的扩增，所谓的“穿梭PCR”(《PCR技术前沿》、[蛋白质、核酸和酶]增刊，第41卷，第5号，425-428页(1996))，它只有两步反应，其中上述三步反应中的退火步骤和延伸步骤可以在同样温度下进行。由于本发明的DNA合成反应促进剂能特异缩短上述延长步骤的时间，所以无论在上述3步反应还是2步反应中它均能缩短合成反应的整体时间。

用以往的PCR得到同量的扩增产物，其反应时间可以应用添加了本发明DNA合成反应促进剂的反应液进行PCR时的扩增产量为基准进行调整。也就是说，对不添加该促进剂时进行的PCR的各循环进行取样，按前述的方法对扩增产物的量进行定量，确定出与本发明的DNA合成反应促进剂存在下所得扩增产物的量相同时的循环数，用其循环数和每1个循环所需的时间来计算即可求出。可以设定应用本发明DNA合成反应促进剂进行PCR时1个循环所需的时间比通常PCR的1个循环所需的时间要短。每1个循环所需时间可以通过，例如通过计算3步反应中变性、引物的退火、引物延伸各步的反应时间，以及从变性到引物的退火、从引物的退火到引物的延伸、由从引物的延伸到下一个循环的变性时达到所设定温度的时间总值来求出。在2步反应中也可通过总计上述各步骤进行的时间及各步骤间过渡的时间来求出。应用添加了本发明的DNA合成反应促进剂的反应液进行PCR时的全长时间进行比较时发现，扩增对象的长度、GC含量等有一些影响之外，总体时间约缩短到1/2左右。

由于本发明的DNA合成反应促进剂能缩短扩增反应的整体时间，所以它能发挥更优良的效果，例如通过在以PCR法为基础进行的基因诊断方法中应用可以在更短的时间内进行基因诊断。

(II)本发明的DNA合成反应组合物

作为本发明的DNA合成反应组合物的一个实施例，包括例如含有上述(I)中DNA合成反应促进剂的组合物。该组合物中含有应用DNA聚合酶来合成PDA的各种必要成分，例如含有dNTP、氯化镁、和用于保证适宜pH的缓冲成分。而且也可包含DNA聚合酶。

对DNA合成反应组合物中所包含的DNA聚合酶没有特殊限定，可以是上面(I)中所示的各种DNA聚合酶。可只含有1种DNA聚合酶，也可含有2种以上(多种)DNA聚合酶。比如含有多种DNA聚合酶时，可将上述LA-PCR中应用的具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶与不具有该活性的DNA聚合酶联合应用。另外，含有耐热性DNA聚合酶的本发明的DNA合成反应组合物适用于具有容易形成高级结构的碱基序列的DNA的合成及PCR。

此外，本发明的DNA合成反应组合物的其它方案可推荐含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的组合物。该组合物也含有上述DNA合成时必要的各种成分及/或含有上述DNA合成反应促进剂。

已知含有多个DNA聚合酶的组合物是以往在LA-PCR中利用的组合物。如上在LA-PCR法中应用的组合物的制备是将具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶与不具有该活性或不发挥该活性的DNA聚合酶联用。

这里所讲的“具有3′→5′核酸外切酶活性”是指天然的DNA聚合酶具有3′→5′核酸外切酶活性，未用化学或基因工程学方法去除或减低其活性，也就是说基本上具有该活性。此外，“不发挥3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶”是指用化学或基因工程学方法去除或降低其3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

本发明者们惊奇地发现当将具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶们联合应用时可达到反应速度比LA-PCR法快的DNA合成反应。

对这样的组合物没有特殊限定，例如可以是α型耐热性DNA聚合酶和非α非polI型耐热性DNA聚合酶联合应用所组成的组合物。此外添加上述DNA合成反应促进剂后可提高该组合物的性能。

该组合物所具有的特征之一是单位时间内的DNA合成速度非常高。当该组合物用于PCR时，扩增同一链长的DNA所需的时间比以往的PCR法、LA-PCR法短。因此，即使在用以往的方法不可能进行DNA扩增的pCR条件下也能进行扩增。

由于本发明的DNA合成反应组合物能缩短扩增反应的整体时间，所以它能发挥更优良效果，例如通过在以PCR为基础进行的基因诊断法中应用，可用更短的时间进行基因诊断。

(III)本发明的DNA合成方法

通过制备应用了本发明DNA合成反应促进剂或本发明的DNA合成反应组合物的反应液可进行比以往更高效率的DNA合成反应。例如利用本发明的DNA合成方法进行PCR时，可在比以往的PCR法、或LA-PCR法更短的时间内得到扩增产物。

本发明的DNA合成方法的实施方案包括应用2种以上DNA聚合酶的方法；应用具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶和不具有该活性的DNA聚合酶的方法；使用2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的方法；应用α型DNA聚合酶和非α非polI型DNA聚合酶的方法。以及通过PCR来进行上述DNA合成方法的方法。

因为本发明的DNA合成方法能缩短扩增反应的整体时间，所以能发挥优良效果，例如在以PCR法为基础进行的基因诊断法等中应用时，可在更短的时间内进行基因诊断。

另外，在DNA标记，双脱氧法测定碱基序列等应用DNA聚合酶的操作中也可应用本发明的DNA合成方法。

(IV)本发明的DNA合成方法的试剂盒

应用本发明的试剂盒可更简便、有效地合成DNA。对该试剂盒没有进行特殊限制，只要是在伴随DNA合成的反应中应用的即可，包括用于体外进行DNA合成反应的试剂盒。具体而言，包括，例如用于用双脱氧法测定DNA碱基序列的试剂盒、DNA标记用的试剂盒、PCR用试剂盒、cDNA合成用试剂盒、导入位点特异性突变用的试剂盒等。

本发明的试剂盒的一大特征是它含有本发明的DNA合成反应促进剂和/或2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。也就是说，一个方案是含有本发明的DNA合成反应促进剂的试剂盒，其它的方案是含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的试剂盒。并且本发明中也包括含有本发明的DNA合成反应促进剂和2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的试剂盒。

作为DNA合成反应促进剂包括至少1种选自上述(I)中酸性物质和阳离子络合物的物质。作为2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶包括α型DNA聚合酶和非α非polI型DNA聚合酶，优选耐热性DNA聚合酶。含有本发明的DNA反应促进剂的试剂盒还可包含1种2种以上的适当DNA聚合酶，尤其是耐热性DNA聚合酶更合适。无论在哪种方案的情况上述试剂盒中均包含DNA聚合酶反应中所必要的试剂，如dNTP、氯化镁、使反应液保持适当pH的缓冲成分等。

上述DNA合成反应促进剂和DNA聚合酶可以单独的组分状态或已添加到反应用缓冲液的状态包含在试剂盒中。

应用本发明试剂盒的DNA合成反应，与在通常的反应体系中进行的反应相比，其单位时间内的DNA合成量非常多，因此它在以DNA标记、PCR、cDNA合成、位点特异性突变的导入等为代表的伴随DNA合成反应的各种操作中适用，此时它能发挥缩短操作时间的优越性。例如：用上述试剂盒进行PCR时，扩增相同链长的DNA所需的时间比以往的PCR法和LA-PCR法更短。因此，即使在用以往的方法不能进行DNA扩增的PCR条件下也能进行DNA扩增。此外，由于本发明的试剂盒能缩短扩增反应的整体时间，所以它能发挥优良效果，例如通过在以PCR为基础进行的基因诊断法中应用，达到在更短的时间内进行基因诊断的优良效果。

另外利用本发明的试剂盒通过PCR来扩增核酸时可发挥这样的优良效果：缩短扩增反应的整体时间，或通过扩增反应提高产量。此时，混合试剂盒中所包含的PCR所必要的试剂，制备扩增反应液，由向反应液中加入至少1种选自酸性物质和阳离子络合物的物质。经过变性、退火、延伸各步骤反复进行循环反应。至少1种选自酸性物质和阳离子络合物的物质，其添加量是缩短反应时间和/或增加扩增产物产量的有效量。并且，应用本发明的试剂盒进行PCR时与未利用它进行的PCR相比，它可发挥加长扩增片段的长度这样的优良效果。

上述反应液中含有以下成分：1)模板核酸，(2)适当的反应缓冲液，3)DNA聚合酶，4)dATP、dTTP、dGTP和dCTP，5)至少一个寡核苷酸引物。选自酸性物质和阳离子络合物的至少1种物质，可将其有效量加入制备好的该反应液中，或作为反应的缓冲液成分加入。

本发明可达到的优良效果是：采集多个样品以PCR为基础进行基因诊断时应用本发明，可达到在更短时间内进行基因诊断法的优良效果。

用以下的实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定在实施例的范围内。

下属的实施例中市售酶的活性按其表示方法来表示。但Pfu DNA聚合酶II的酶活性单位是以按实施例I描述的酶活性测定方法得到的数值表示。另外，含有商品酶的反应液的制备如没有特别限定，就按每种酶的说明书配制或者应用附加的反应缓冲液配制。除非特殊情况，PCR应用GeneAmp PCR系统9660(Gene Amp PCR System 9600，Perkin-Elmer公司)进行。

实施例1：Pfu DNA聚合酶II的制备

用含有编码Pfu DNA聚合酶II的基因的质粒pFU 1001转化大肠杆菌JM109，培养所得的E.Coli JM109/pFU 1001(FERM BP-5579)，从所得菌体中纯化Pfu DNA聚合酶II，用于以下操作中。转化体的培养及酶的纯化按照国际公开第97/24444号小册子(例如28-29页，实施例3)中记载的方法进行。

上述Pfu DNA聚合酶II的酶活性测定可以用以下方法进行。应用活化的小牛肠腺DNA(Worthington公司)(活化DNA)作为底物。DNA的活化及DNA聚合酶活性的测定按照Harper & Row社发行、D.R.Porvis编辑的《大肠杆菌的DNA聚合酶》(DNA polymerase fromEscherichia coli)第263-276页(C.C Richardson著)记载的方法进行。向5μl测定活性的样品中加入45μl反应液[20mM Tris-HCl(pH9.0)、15mM氯化镁、2mM 2-巯基乙醇、0.2mg/ml活性DNA、各40μM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，60nM[³H]dTTP(Amersham公司)，75℃反应5分钟。其后，将其40μl点到DE纸(Whatman公司)上，用5％(重量比)的Na₂HPO₄洗涤5次后，用液闪烁仪测定DE纸上残存的放射活性。通过上述酶活性测定方法，将每30分钟将10nmol ³H-dTMP摄取到底物DNA中的酶量定为1U。

实施例2：引物的制备

以λDNA的碱基序列为基础合成λ1～λ5、λ7～λ10、λL36及λR485共11种引物。引物λ1～λ5、λ8～λ10的碱基序列分别示于序列表的序列号3～10中。λ7的碱基序列如序列表中序列号11所示。λL36和λR485的碱基序列分别如序列表中序列号12～13所示。这些引物一起应用，以λDNA为模板进行PCR扩增出的DNA片段的长度如表1所示。再以大肠杆菌基因组的碱基序列为基础合成Eco11、Eco12和Eco15等3种引物。这3种引物的碱基序列分别如序列表中序列号14-16所示。一起应用这些引物、以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增出的DNA片段的长度如表1所示。再以人ApoE区域的碱基序列为基础合成ApoE-1和ApoE-2 2种引物。ApoE-1及ApoE-2的碱基序列分别如该序列表中序列号17-18所示。联合应用这些引物，以人基因组DNA为模板进行PCR所扩增出的DNA片段的长度如表1所示。

表1

引物对扩增产物DNA片段

的长度(Kb)

λ1/λ2 0.5

λ1/λ3 1

λ1/λ4 2

λ1/λ5 4

λ1/λ7 8

λ1/λ8 10

λ1/λ9 12

λ1/λ10 15

λL36/λR485 48.5

Eco1/Eco2 2

Eco1/Eco5 10

ApoE- 0.44

1/ApoE-2

实施例3：酸性物质对DNA合成反应的促进

(1)对Pfu DNA聚合酶II活性的影响

应用按国际公开第97/26896小册子记载的方法(例如实施例7按照第77页8行～第78页13行，实施例9按第79页7行～78行等)获得的含有硫酸岩藻糖的多糖-F、小牛肠腺DNA(Worthington公司)、肝素(和光纯乐公司)作为酸性物质，检测它们对Pfu DNA聚合酶活性II的影响。

以λDNA为模板、以引物λ1和λ3作为引物对、以Pfu DNA聚合酶II作为DNA聚合酶，配备含有这些物质的反应液进行PCR。反应液的组成如下所示：反应液组成：

10mM Tris-HCl(pH9.2)、75mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、1.25U的Pfu DNA聚合酶II、500pg的λDNA，及各5pmol的引入λ1和λ3(最终体积为23μl)。

再向上述反应液中分别加入5ng含硫酸岩藻糖的多糖-F、200ng小牛胸腺DNA或0.5ng、1ng、2ng、5ng的肝素。

反应时以98℃、0秒～68℃、0秒为1个循环，进行25个循环。本说明书中的“98℃，0秒″、“68℃、0秒″表示反应装置设定的程序是温度达到设定温度的同时就向着下次的设定温度下降。

反应终了后，取5nl所得各反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶中含有0.00005％的溴化乙锭。电泳后用紫外线照射胶体。由于可以看到扩增产物产生的带，所以可确认扩增片段。结果证实添加任何酸性物质均能很好地扩增出所预想的1kb片段。添加0.5ng肝素时扩增效率尤其好。另一方面，不添加酸性物质的同一反应液、在上述反应条件下进行PCR时，得不到1kb的扩增片段。

下面检测酸性物质对长链DNA扩增的影响。除模板λDNA的量为2.5ng，或引物对变为引物λ1和λ5或引物λ1和λ10外，制备与上面同样的PCR反应液。作为酸性物质，加入200ng的小牛肠腺DNA或5ng含硫酸岩藻糖的多糖-F。反应进行30个循环，每个循环包括98℃，0s-68℃，5min。结果发现，添加小牛肠腺DNA或含有硫酸岩藻糖的多糖-F时，应用引物λ1和λ5得到4kb的扩增片段，用引物λ1和λ10得到15kb的扩增片段。另一方面，未添加这些酸性物质时，无论哪对引物均未看到扩增片段。

(2)对Pfu DNA聚合酶I的DNA合成反应的影响

检测含有硫酸岩藻糖的多糖～F对Pfu DNA聚合酶I活性的影响。Pfu DNA聚合酶I是应用重组DNA技术制备的酶(Cloned PfuPolymerase，Stratagene公司)。

以λDNA为模板，以引物λ1和λ2作引物对、以Pfu DNA聚合酶I作DNA聚合酶，制备含有这些物质的反应液进行PCR。反应液的组成如下：

Pfu DNA聚合酶I用的缓冲液(Stratagene公司)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，1.25U的Pfu DNA聚合酶I、500pg的模板DNA、各5pmol的引物λ1和λ2(终体积为25μl)。制备加入了20ng含硫酸岩藻糖的多糖-F的反应液和未添加该物质的反应液。

制备的反应液以94℃、30秒～55℃、30秒～72℃ 60秒为1个循环进行25个循环的反应。其后取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增的DNA片段。用前述的方法肉眼比较扩增出的0.5kb的DNA片段的量，可以证明添加了含有硫酸岩藻糖的多糖-F的反应液中DNA的扩增量多。由此表明添加含硫酸岩藻糖的多糖-F可提高Pfu DNA聚合酶I的DNA扩增效率。

实施例4：应用2种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶进行PCR

同时应用均具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶-Pfu DNA聚合酶II和Pfu DNA聚合酶I进行PCR，对之进行检测。Pfu DNA聚合酶I应用上述的Cloned Pfu DNA polymerase(Stratagene公司)。

(1)混合使用Pfu DNA聚合酶I、Pfu DNA聚合酶II的PCR

制备以λDNA为模板，以引物λ1和λ8为引物对的反应液，进行PCR。该PCR中使用Pfu DNA聚合酶I和Pfu DNA聚合酶II二种物质。反应液的组成如下所示。

反应液的组成：

10mMTris-HCl(pH9.2)、75mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、0.01％的BSA、500pg的模板DNA。各5pmol的引物λ1和λ8。

为向上述反应液中加入0.375U的Pfu DNA聚合酶II和分别0.125U、0.375U、0.75U、1.25U的Pfu DNA聚合酶I，反应液的最终体积为25μl。另外对为作照，制备只加Pfu DNA聚合酶I的反应液和只添加Pfu DNA聚合酶II的反应液。

以98℃、0秒～68℃、3分为1个循环，进行25个循环的PCR反应。而后取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增的DNA片段，其胶中含有0.00005％的溴化乙锭。结果发现只应用Pfu DNA聚合酶I时，无论其用量多少均看不到有10kb的DNA扩增片段。只应用PfuDNA聚合酶II时可看到极微量的10kb片段，但向Pfu DNA聚合酶II中添加Pfu DNA聚合酶I时，可剂量依赖性地提高10kb片段的扩增效率。

(2)不同链长的DNA片段的扩增

以λDNA为模板，分别应用引物λ1和λ3、引物λ1和λ4或引物λ1及λ5作引物对，配制具有如下组成的反应液。

反应液组成：

10mM Tris-HCl(pH9.2)、73mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、1.25U的Pfu DNA聚合酶I和1.25U的Pfu DNA聚合酶II、500pg的λDNA、各5pmol的各引物、5ng或50ng含硫酸岩藻糖的多糖-F(终体积为25μl)。另外，作为对照制备不添加多糖-F的反应液。

以98℃、0秒～68℃、0秒为1个循环，对各反应液进行30个循环的反应。反应终止后，取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段，胶中含0.00005％的溴化乙锭。结果发现，扩增出与各引物相应的1kb、2kb、4kb的DNA片段。添加50ng含硫酸岩藻糖的多糖-F的比添加5ng的扩增效率好。另一方面，未添加该物质时未看到扩增片段。

实施例5：与以往的PCR技术进行比较

(1)长链DNA的扩增

将实施例4(2)中的反应体系与同时应用有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶和不具有该活性的DNA聚合酶的LA-PCR法进行比较，检测以λ为模板的10-15kb的DNA片段的扩增反应。LA-PCR反应液应用TaKaRa LA PCR kit Ver.2(室酒透)进行配制。

分别使用引物λ1和λ8、引物λ1和λ9或引物λ1及λ10作引物对，配备具有以下组成的反应液。

反应液组成：

10mM Tris-HCl(pH9.2)、70mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、1.25U的Pfu DNA聚合酶I和1.25U的Pfu DNA聚合酶II、500pg的λDNA、各5pmol的各种引物、50ng含硫酸岩藻糖的多糖-F(终体积为25μl)。

另外，应用TaKaRa LA-PCR kit Ver.2配备与上述反应液等量模板DNA、引物的LA-PCR反应体系(终体积25μl)。

以98℃、0秒～68℃、3分为1个循环对该反应液进行25个循环的反应，然后取5μl的反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确定扩增片段，胶中含有0.00005％的溴化乙锭。结果发现，联合应用实施例5(2)中的Pfu DNA聚合酶I和Pfu DNA聚合酶II时各对引物可扩增出分别为10kb、12kb、13kb的DNA片段。

而应用以往的LA-PCR的反应中可以看到10kb的扩增片段，但看不到12kb及15kb的扩增片段。

将1个循环的条件变为98℃、0秒～68℃、5分偿试扩增12kb的片段。此时在LA-PCR中也能看到扩增。

(2)短链DNA短反应时间内的扩增

应用实施例4(2)的反应体系和LA-PCR法、以及已知的DNA合成速度高的KOD DNA聚合酶进行比较，比较它们以λDNA为模板的0.5～4kb DNA片段的扩增反应。LA PCR反应液的配备应用上述TakaRa LA PCRkit Ver.2进行，KOD DNA聚合酶反应液应用东洋纺社的KOD DNA聚合酶和附添的反应缓冲液配备。

分别应用引物λ1和λ2、引物λ1和λ3或引物λ1和λ5作为引物对，配备具有如下组成的反应液。

反应液组成：

10mM Tris-HCl(pH9.2)、73mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、1.25U的Pfu DNA聚合酶和1.25U的DNA聚合酶II、500pg的λDNA、各5pmol的各种引物、50ng含硫酸岩藻糖的多糖-F(终体积25μl)。

另外应用与上面的反应液同样的引物对配备LA-PCR反应液、KODDNA聚合酶反应液(终体积均为25μl)。但是这2种反应液中模板λDNA各加2500pg。

以98℃、10秒～68℃、0秒为1个循环，对各反应液进行25个循环的反应，然后取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段，胶中含有0.00005％的溴化乙锭。结果发现Pfu DNA聚合酶I和Pfu DNA聚合酶II联合应用时，各引物对可分别扩增出0.5kb、1kb和4kb的DNA片段。

与此相对，在LA-PCR反应液、KOD DNA聚合酶反应液中尽管含有5倍量的模板DNA，但只看到有微弱地扩增出0.5kb的DNA片段。

(3)DNA检测灵敏度的比较

以微量λDNA为模板进行DNA片段的扩增，以此来将实施例4(2)的反应体系与LA-PCR法进行比较。用TaKaRa LA PCR kit Ver.2配备LA PCR反应液。

应用引物λ1和λ2作为引物对，配备具有如下组成的反应液。

反应液组成：

10mM Tris-HCl(pH9.2)、73mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、1.25U的Pfu DNA聚合酶和1.25U的DNA聚合酶II，0.05fg的λDNA、各5pmol的各种引物、30ng含硫酸岩藻糖的多糖-F(终体积25μl)。

另外，配备与上述反应液同样模板DNA量、引物量的LA-PCR反应液。

以98℃、0秒～68℃、0秒为1个循环，对这2种反应液进行50个循环的反应，然后取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段，其胶中含有0.00005％的溴化乙锭。结果只在实施例4(2)的反应体系中看到0.5kb的DNA扩增片段。

接着，将引物变为引物λ1和λ8，配备上面的2种反应液。以98℃、0秒～68℃，3分为1个循环对这2种反应液进行50个循环的反应，然后取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段，其胶中含0.00005％的溴化乙锭。结果在实施例4(2)的反应体系中可看到10kb的DNA扩增片段，而在LA-PCR反应液中未看到扩增片段。

实施例6：通过热水抽提制备含硫酸岩藻糖的多糖-F

以下的实施例中应用的含硫酸岩藻糖的多糖-F全是用以下方法纯化出的。以下是含硫酸岩藻糖多糖-F的制备例。

将Gagome海带充分干燥后，将干重20kg的Gagome海带粉碎，将所得干粉悬浮液900升含7.3kg 2水氯化钙的水中，搅拌40分钟在此过程中升温到90℃，在90℃～95℃保持1小时进行抽提。其后，冷却到20℃，停止搅拌，放置1晚，得到提取物。

然后用离心机(Westfalia Separator公司CNA型)进行固液分离。通过用离心机对上述提取物进行分离，可得到大约900升的上清液。将其中的360升进行过滤，其过滤的SPARKLER FILTER滤器(日本涂色机械公司)中整合了3μm大小的滤器(日本食品滤材公司)。将滤液在截留分子量为3万的UF膜(FE10-FC-FUS 0382，DAICEL化学工业公司)上浓缩为20升。然后加20升水，又浓缩为20升。如上的稀释浓缩操作重量5次后，得到大约25升的浓缩液。

向上述浓缩液700ml中加入终浓度为0.2M的氯化钙、20mM的醋酸钠，然后用含有0.2M氯化钙的20mM醋酸钠平衡缓冲液(pH6.0)透析。将透析后的溶液上样到利用上述平衡缓冲液10升平衡过的3500ml DEAE-sepharose FF柱(柱内径9.7cm)上，用5升平衡缓冲液洗涤。然后用以下所示的3阶段的梯度条件进行洗脱。

色谱柱的流速设定为3500ml/h。梯度条件为：

1)0～0.5M氯化钠的梯度(洗脱液量4.5升)

2)0.5～1.0M氯化钠的梯度(洗脱液量4.5升)

3)1.0～2.0M氯化钠的梯度(洗脱液量4.5升)

每250ml洗脱液收集作1部分。用酚-硫酸法测定各部分的糖含量，用咔唑硫酸法进行糖醛酸定量。结果糖含量高、糖醛酸含量低的部分是NO.40～53级分。将级分No.40～53做含硫酸岩藻糖的多糖-F的级分。用10万的超液膜对该级分进行浓缩，然后用50mm柠檬酸钠进行透析，再用蒸馏水透析一晚。然后进行冷冻干燥，从含硫酸岩藻糖的多糖-F级分中获得1.696g含硫酸岩藻糖的多糖-F。

实施例7：通过热水抽提制备含硫酸岩藻糖的多糖-U

以下的实施例中所应用的含硫酸岩藻糖的多糖-U全部是用以下方法纯化的。以下是含硫酸岩藻糖的多糖-U的制备例。

粉碎2t Gagome海带，将所得干粉悬浮到含有730kg冰氯化钙的44KL水中升温到95℃，在95℃搅拌1小时35分钟。在95℃保持2小时进行抽提。其后经一晚上冷却到室温。

接着用滗析器(Tanabe Wiltech公司)进行固液分离。转动条件是3000～3300rpm(2560G)，约8小时。将所得上清液通过截流分子量3万的UF膜(PE 10-FC-FUS 0382，DAICEL化学工业公司)浓缩到5升后，再用UF进行脱盐。

用装入ADVANTEC #327滤纸(ADVANTEC公司)的LINT FILTER滤器(内外酿机社)去除脱盐液的污物。过滤后用盘式加热器(Plateheater)(日预制作所)于98℃对过滤液灭菌40秒。所得提取液约4620升。将其中的一部分用冷冻干燥机(共和真空技术公司)进行冷冻干燥。

将340g冷冻干燥物溶解到21.2升含0.2M氯化钙的20mM醋酸钠平衡缓冲液(pH6.2)中。将该溶液上样到用平衡缓冲液平衡了的约35升DEAE-Sepharose FF柱(柱内径：35cm)上，用70升平衡缓冲液进行清洗。用如下的3步梯度条件进行洗脱。

色谱分析的流速设定为35升/小时。梯度条件：

1)0-0.5M氯化钠(洗脱液量：120升)

2)0.5～1.0M氯化钠(洗脱液量：120升)

3)1.0～1.5M氯化钠(洗脱液量：120升)

每10升洗脱液收集作1级分。用酚硫酸法测定各级分的糖含量、用咔唑硫酸法对糖醛酸定量。结果得到糖含量及糖醛酸含量高的级分-No.4～16级分。将No.4～16的级分别做含硫酸岩藻糖的多糖-U级分。用分子量截流为1万的超滤膜浓缩含硫酸岩藻糖的多糖-U级分，然后用分子量截流为12000～14000的纤维素袋进行透析。首先在50mM冰柠檬酸3钠溶液中放置3-4小时，交换该溶液进行2次后，再在该溶液中透析一晚。接着换到蒸馏水中3-4小时，换液2次后再在蒸馏水中透析一晚。然后进行冷冻干燥，从含有硫酸岩藻糖的多糖-U级分得到37.6g多糖-U。

实施例8：酸性物质对Pfu DNA聚合酶II DNA合成反应的促进作用

以下实施例中的PCR是应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal(宝酒透)在快速状态下进行。

(1)含硫酸岩藻糖的多糖-F、硫酸葡聚糖粉及藻酸钠对Pfu DNA聚合酶II活性的影响

应用在上述实施例6中得到的含硫酸岩藻糖-F、硫酸葡聚糖粉(Onco制造)、藻酸钠(100～150厘泊，和光纯药社制)检测它们对Pfu DNA聚合酶II活性的影响。配备以λDNA为模板，以引物λ1和λ2为引物对、以Pfu DNA聚合酶II为DNA聚和酶的反应液，进行PCR。反应液的组成如下：10mM Tris-HCl、pH9.2，75mM氯化钾、6mM氯化镁，各0.4mM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，0.01％BSA，1.25U的Pfu DNA聚合酶II、100pg的λDNA及各5pmol的引物λ1和λ2(终体积为25μl)。由向上述反应液中分别加入10ng的含硫酸岩藻糖的多糖-F、10ng硫酸葡聚糖粉或1μg的藻酸钠。

以98℃、5秒～66℃、15秒为1个循环对这些反应液进行25个循环的反应，然后取5μl的反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段，其胶中含有0.00005％的溴化乙锭。其结果如表2所示。

表2

酸性物质加入量扩增结果

含硫酸岩藻糖的多糖-F 10ng ++

硫酸葡聚糖粉 10ng +

藻酸钠 1μg +

不加成分 -

++：-可见到强扩增；

+：-可见到扩增；

±：-可见到微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表2所示，添加任一酸性物质时均能很好地扩增出所预想的0.5kb的片段。而不添加酸性物质的同一反应液在上述条件下进行PCR时看不到0.5kb的扩增片段。

(2)含硫酸岩藻糖的多糖-F、含硫酸岩藻糖的多糖-U及聚谷氨酸钠对Pfu DNA聚合酶II DNA合成反应的影响

由应用上述实施例6中获得的含硫酸岩藻糖的多糖-F、在上述实施例7中得到的含硫酸岩藻糖的多糖-U、聚谷氨酸钠(Sigma)作为酸性物质来检测它们的效果。除模板λDNA的量变为500pg或引物对变成引物λ1和λ3外配备与上面同样的PCR反应液。向上述反应液中分别加入5ng的含硫酸岩藻糖的多糖-F、分别5ng、10ng、20ng及30ng的含硫酸岩藻糖的多糖-U、分别250ng、500ng、750ng及1000ng的聚谷氨酸钠。

反应以98℃、3秒～66℃、15秒1个循环，进行30个循环。反应终止后取5μl反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳以确认扩增片段，其胶中含0.00005％的溴化乙锭。其结果如表3所示。

表3

酸性物质加入量(ng) 扩增结果

含硫酸岩藻糖的多糖-F 5 ++

含硫酸岩藻糖的多糖-U 5 ++

10 +

20 +

30 ±

聚谷氨酸钠 250 +

500 +

750 ++

1000 +

不加 -

++：-可观察到强扩增；

+：-可观察到扩增；

±：-可观察到微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表3所示，添加含硫酸岩藻糖的多糖-F、多糖U或聚谷氨酸钠任一物质时均能看到1kb的扩增片段。而不添加这些酸性物质时看不到1kb的扩增片段。

实施例9：酸性物质对Taq DNA聚合酶的DNA合成反应的促进作用

应用上述实施例6中得到的含硫酸岩藻糖的多糖-F、或藻酸钠，检测它们对Taq DNA聚合酶(宝酒透)的影响。本实施例中的PCR是应用TaKaRa Thermal Cycler Personal在普通状态下进行的。

配制以λDNA模板、以引物λ1和λ3作引物对、以TaKaRa Taq DNA聚合酶作DNA聚合酶的反应液，进行PCR。反应液的组成如下所示。

反应液组成：

TaKaRa Taq DNA聚合酶的缓冲液，各0.2mM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，1.25U的TaKaRa Taq DNA聚合酶，100pg的λDNA、各10pmol的引物λ1和λ3(终体积为50μl)。由向上述反应液中加入分别为0.1ng和0.25ng的含硫酸岩藻糖的多糖-F、或1μg的藻酸钠。

反应以98℃、10秒～68℃、1分为1个循环，进行30个循环。反应终了后取反应液5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳以确认扩增片段，其胶中含0.00005％的溴化乙锭。结果如表4所示。

表4

酸性物质加入量扩增效果

含硫酸岩藻糖的多糖-F 0.1ng ++

0.25ng ++

藻酸钠 1μg +

不加 -

++：-可观察到强扩增；

+：-可观察到扩增；

±：-可观察到微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表4所示，添加任一酸性物质时均能很好地扩增出预想的1kb片段。但不添加酸性物质用同样的反应液在上述反应条件下进行PCR时得不到1kb的扩增片段。

实施例10：酸性物质对LA-PCR中应用的DNA聚合酶的影响

(1)检测酸性物质对LA-PCR法的影响，LA-PCR法中联合应用具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶和不具有该活性的DNA聚合酶。制备以λDNA为模板，以引物λ1和λ8为引物对的反应液进行PCR。该PCR中应用TaKaRa EX-Taq DNA聚合酶(宝酒透)。反应液的组成如下所示。

以下实施例中的PCR是应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal(宝酒透)在快速状态下进行的。

反应液组成：

TaKaRa EX-Taq DNA聚合酶用的缓冲液，各0.2mM的dATP、dCTP。dGTP和dTTP，10pg的λDNA，1.25U的TaKaRa EX-Taq DNA聚合酶及各10pmol的引物λ1和λ8(最终体积为50μl)。再向上述反应液中分别加入1ng的含硫酸岩藻糖的多糖-F或0.5μg的藻酸钠。

反应是以98℃、5秒～68℃、3分为1个循环，进行27个循环。反应终止后取各反应液5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段，其胶中含0.00005％的溴化乙锭。其结果如表5所示。

除模板DNA为100pg的λDNA、酸性物质添加0.25μg的藻酸钠或1ng的含硫酸岩藻糖的多糖-F外由配备与上述反应液相同的反应液进行PCR。

反应以98℃、5秒～68℃、3分为1个循环，进行29个循环，反应终止后取各反应液5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳以确认扩增片段，其胶中含0.00005％的溴化乙锭。其结果如表5所示。

表5

模板DNA量酸性物质加入量扩增结果

10pg 含硫酸岩藻糖的多糖-F 1ng ++

藻酸钠 0.5μg ++

不加 - -

100pg 含硫酸岩藻糖的多糖-F 1ng ++

藻酸钠 0.25μg ++

不加 - ±

++：-可见强扩增；

+：-可见扩增；

±：-可见微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表5所示，无论哪一种模板DNA量，在添加酸性物质时均能很好地扩增出所预想的10kb的片段。而不添加酸性物质的反应液在相同反应条件下进行PCR时，只在模板为100pg的情况下有微量的10kb的DNA扩增片段。

(2)检测酸性物质对KOD dash DNA聚合酶(荡漾纺社)的影响，该聚合酶是由具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶和不具有该活性的DNA聚合酶组成的。配制以λDNA为模板，以引物λ1和λ9为引物对的反应液进行PCR。以下实施例中的PCR是应用TaKaRa PCR ThermalCycler Personal(宝酒透)在快速状态下进行的。反应液的组成如下所示。

反应液组成：

附添的KOD dash DNA聚合酶专用缓冲液，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，10pg的λDNA，2.5U的KOD dash DNA聚合酶以及各10pmol的引物λ1和λ9(终体积为50μl)。再向该反应液中分别加入1ng的含硫酸岩藻糖的多糖-F或0.5μg的藻酸钠。

反应时以98℃、5秒～68℃、3分为1个循环，进行25个循环的反应。反应终止后取各反应液5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳以确认扩增片段，其胶中含0.00005％的溴化乙锭。其结果如表6所示。

表6

酸性物质加入量扩增效果

含硫酸岩藻糖的多糖-F 1ng +

藻酸钠 0.5μg ++

不加 ±

++：-可见强扩增；

+：-可见扩增；

±：-可见微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表6所示，添加任何酸性物质时均能很好地扩增出所预想的12kb的扩增片段。但不添加酸性物质的相同反应液在上述反应条件下进行PCR时，仅看到微弱的12kb的扩增片段。

实施例11：应用具有3′→5′核酸外切酶活性的2种DNA聚合酶进行PCR

同时使用Pfu DNA聚合酶II和KOD DNA聚合酶(东洋纺社)、VENTDNA聚合酶(New England Biolab合成)、DEEP VENT DNA聚合酶(NewEngland Biolab合成)中任一种进行PCR，这些酶均具有3′→5′核酸外切酶活性。

配制以λDNA为模板，以引物λ1和λ8为引物对的反应液，进行PCR。该PCR中分别应用了Pfu DNA聚合酶II与KOD DNA聚合酶的组合、PfuDNA聚合酶II与VENT DNA聚合酶的组合、或Pfu DNA聚合酶II与DEEPDNA聚合酶的组合。反应液的组成如下。

反应液组成：

10mM Tris-HCl(pH9.2)、73mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、500pg的λDNA及各5pmol的引物λ1和λ8。向该反应液中分别加入0.375U的Pfu DNA聚合酶II及3.75mU的KOD DNA聚合酶、6.25mU的VENT DNA聚合酶或DEEP VENTDNA聚合酶，反应液的最终体积为25μl。

另外作为对照配备只添加Pfu DNA聚合酶II、KOD DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶或DEEP VENT DNA聚合酶的反应液。以98℃、5秒～68℃、3分为1个循环，将这些反应液进行30个循环的反应。然后取5μl的反应液进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，以确认扩增片段。其结果如表7所示。

表7

DNA聚合酶的组合(聚合所用酶量扩增结果

(聚合酶A/

酶A/聚合酶B)

聚合酶B)

Pfu DNA聚合酶 II/- 0.375U/- ±

-/KOD DNA聚合酶 -/3.75mU -

-/VENT DNA聚合酶 -/6.25mU -

-/DEEP VENT DNA聚合酶 -/6.25mU -

Pfu DNA聚合酶 II/ 0.375U/3.75mU +

KODDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶 II/ 0.375U/6.25mU +

VENTDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶 II/ 0.375U/6.25mU +

DEEP VENT DNA聚合酶

++：-可见强扩增；

+：-可见扩增；

±：-可见微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表7所示，只用KOD DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶或DEEP VENTDNA聚合酶时看不到10kb的扩增片段，但只应用Pfu DNA聚合酶II时看到极微量的10kb的扩增片段。再者，在0.375U的Pfu DNA聚合酶II和3.75mU的KOD DNA聚合酶、6.25mU VENT DNA聚合酶或DEEP VENT DNA聚合酶的组合体系中与只用Pfu DNA聚合酶II的情况相比，其扩增10kb片段的效率提高。

实施例12

联合应用实施例1中获得的Pfu DNA聚合酶II和α型DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶I(Stratagene公司制造)及酸性物质藻酸钠进行PCR反应。

配备以λDNA为模板、以引物λ1和λ3为引物对的反应液进行PCR。反应液的组成如下。

反应液组成：

PCR反应缓冲液(10mM Tris-HCl(pH9.2)、75mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、0.004％藻酸钠)，10pg的λDNA及各5pmol的引物λ1和λ3。向该反应液中添加包含1.25U Pfu DNA聚合酶II和1.14U Pfu DNA聚合酶I的酶液，反应液的最终体系为25μl。

另外准备不添加藻酸钠的反应液作对照。以98℃、5秒～66℃、15秒为1个循环、将这些反应液进行30个循环后反应，然后取5μl反应液进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。其结果如表8所示。

表8

所用试剂盒的类型扩增结果

反应缓冲液(含0.004％藻酸钠) ++

反应缓冲液(不含藻酸钠) -

++：-可见强扩增；

+：-可见扩增；

±：-可见微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表8所示，组合应用Pfu DNA聚合酶I、Pfu DNA聚合酶II及藻酸钠的反应中扩增1kb片段的扩增效率增加。由用市售的各个粘度(100～1000厘泊)的藻酸钠进行上述检测时发现它们可同样提高DNA合成的扩增效率。

实施例13：试剂盒的制备

组合实施例1才得到的Pfu DNA聚合酶II和Pfu DNA聚合酶I、及酸性物质藻酸钠就构成本发明的PCR反应应用的试剂盒(20回的份量)。

试剂盒的组成如下：

10×PCR反应缓冲液 50μl

100mM Tris-HCl(pH9.2)

750mM 氯化钾

0.1％BSA

0.04％藻酸钠(100-150厘泊)

25mM 氯化镁

120μl

2.5mM dNTP混合物(各2.5mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP) 80μl

DNA聚合酶混合液(2.5U Pfu DNA聚合酶II和2.28U

Pfu DNA聚合酶I/1μl) 10μl

应用上述试剂盒来配制PCR反应液。以λDNA作模板。反应液的组成示于表9中。

表9

反应混合物组成

10×PCR反应缓冲液 2.5μl

氯化镁溶液 6μl

dNTP混合物 4μl

DNA聚合酶混合液 0.5μl

λDNA 10pg

λ1引物 5pmol

λ3引物 5pmol

消毒蒸馏水加至

终体积 25μl

另外，对照是不含藻酸钠的与上述有相同组成的反应液。

上述反应液在实施例12所示的PCR条件下进行反应。结果可以看出与对照相比用含有藻酸钠的上述试剂盒配备的反应液可提高1kb片段的扩增效率。

实施例14：酸性物质对DNA合成反应促进的数值化

应用在实施例6中得到的含硫酸岩藻糖的多糖-F检测其对PfuDNA聚合酶II活性的影响。配备以λDNA为模板、以引物λ1和λ2为引物对，以Pfu DNA聚合酶II作DNA聚合酶的反应液进行PCR。反应液的组成如下所示。

反应液组成：

10mM Tris-HCl、pH9.2、75mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、1.25U的Pfu DNA聚合酶II，500pg的λDNA以及各5pmol的引物λ1和λ2(终体积25μl)。再向该反应液中加入10ng的含硫酸岩藻糖的多糖-F。

以98℃、5秒～66℃、15秒为1个循环对这些反应液进行30个循环的反应，然后取5μl的反应液进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认预想的0.5kb的扩增片段。另外，用荧光图像分析仪FM-BIO(宝酒造)对琼脂糖凝胶进行分析，将扩增片段的相对含量数值化。

结果，不添加酸性物质的反应体系为1时，添加酸性物质含硫酸岩藻糖的多糖-F为4.4。也就是说，PCR中添加酸性物质时扩增产物的量达4.4倍。

实施例15：酸性物质对DNA合成反应的促进

应用酸性物质聚丙烯酸，检测其对Pfu DNA聚合酶II活性的影响。制备以λDNA为模板，以引入λ1和λ3为引物对，以Pfu DNA聚合酶II为DNA聚合酶的反应液进行PCR。反应液的组成如下。

反应液组成：

10mM Tris-HCl、pH9.2、75mM氯化钾、6mM氯化镁、各0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP、0.01％BSA、1.25U的Pfu DNA聚合酶II，500pg的λDNA，各5pmol的引物λ1和λ3(终体积为25μl)。再向该反应液中加入100ng平均分子量分别为5千、2万5千、25万、100万的聚丙烯酸(均为和光纯药社)。

以98℃、5秒～66℃、15秒，为1个循环对这些反应液进行30个循环的反应，然后取5μl反应液进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增片段。结果如表10所示。

表10

酸性物质平均分子大小扩增结果

聚丙烯酸 5,000 ++

25,000 ++

250,000 ++

1,000,000 ++

不加 -

++：-可见强扩增；

+：-可见扩增；

±：-可见微量扩增；和

-：-未见扩增。

结果如表10所示，无论添加任一平均分子量的聚丙烯酸均能很好地扩增出预想的1kb的片段。而不添加酸性物质的相同反应液在上述反应条件下进行PCR后看不到1kb的扩增片段。

实施例16：酸性物质对α型DNA聚合酶的影响

(1)应用藻酸钠、透明质酸钠(生化学工业公司)、κ-角叉菜胶(Sigma)，检测它们对α型DNA聚合酶的影响。配备以λDNA为模板、以引物λ1和λ8为引物对、以KOD DNA聚合酶(东洋纺社)为DNA聚合酶的反应液进行PCR。反应液的组成如下所示。

反应液组成：

KOD DNA聚合酶缓冲液I(东洋纺社)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，0.625U的KOD DNA聚合酶，100pg的λDNA，各5pmol的引物λ1和λ8(终体积25μl)。再向该反应液中分别加入1μg或2.5μg的藻酸钠、0.1μg或0.5μg的透明质酸钠，0.1μg或0.25μg的κ-角叉菜胶。

以98℃、5秒～68℃、3分为1个循环，对这些反应液进行30个循环的反应，然后取5μl反应液进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳。结果如表11所示。

表11

酸性物质加入量(μg) 扩增结果

藻酸钠 1 ++

2.5 ++

透明质酸钠 0.1 +

0.5 +

κ角叉菜蚀 0.1 +

0.25 +

不加 ±

++：-可见强扩增；

+：-可见扩增；

±：-可见微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表11所示，无论添加任何酸性物质均能很好地扩增出预想的10kb的片段。而不添加酸性物质的同样的反应液在上述反应条件下进行PCR后可看到很弱的10kb的片段。

(2)与上面同样，检测藻酸钠，κ-角叉菜胶、乙酰肝素硫酸钠(Sigma)、硫酸软骨素钠(Sigma)、聚乙烯硫酸钾(nacalaitesque)及聚苯乙烯硫酸钠(平均分子量为5400及35000 2种，均为nacalaitesque)对α型DNA聚合酶的影响。配备含以λDNA为模板、以引物λ1和λ8为引物对、以KOD DNA聚合酶为DNA聚合酶的反应液进行PCR。反应液的组成如下所示。

反应液组成：

KOD DNA聚合酶缓冲液II(东洋纺社)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.25U的KOD DNA聚合酶，100pg的λDNA及各10pmol的引物λ1和λ8(终体积50μl)。再向该反应液中才分别加入25μg或5μg的藻酸钠、0.25μg或0.5μg的κ-角叉菜胶，125ng、250ng或375ng的硫酸软骨素钠、500ng的乙酰肝素硫酸钠，10ng的聚乙烯硫酸钠，2.5ng或5ng的聚苯乙烯硫酸钠(平均分子量5400)及5ng的聚苯乙烯硫酸钠(平均分子量35000)。

以98℃、5秒～68℃、3分为1个循环进行30个循环的反应，然后取5μl反应液进行含0.00005％溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶电泳。确认扩增片段。结果如表12所示。

表12

酸性物质加入量扩增结果

藻酸钠 2.5μg ++

5μg ++

κ角叉菜胶 0.25μg ++

0.5μg ++

硫酸软骨素钠 125ng +

250ng +

375ng +

乙酰肝素硫酸钠 500ng +

聚乙烯硫酸钠 10ng +

聚苯乙烯硫酸钠 2.5ng +

(平均分子量5,400) 5ng +

(平均分子量35,000) 5ng +

不加 -

++：-可见强扩增；

+：-可见扩增；

±：-可见微量扩增；和

-：-未见扩增。

如表12所示，添加任何酸性物质时均能看到预想10kb的片段得到很好地扩增。而不添加酸性物质的相同反应液在上述反应条件下进行PCR后未看到10kb的扩增片段。

实施例17：阳离子络合物对各种DNA聚合酶的影响

应用阳离子络合物六氨基钴(III)氯化物[Co(NH₃)₆]Cl₃(Sigma)、Tris钴(III)氯化物([Co(C₂H₈N₂)₃]Cl₃)(Aldrich公司)、Tris铑(III)3氯化物·3水和物([Rh(C₂HaN₂)₃]Cl₃·3H₂O)(Aldrich)，检测它们对各种DNA聚合酶的扩增反应的影响。DNA聚合酶用TaKaRaTaq DNA聚合酶(以下称作Taq DNA聚合酶，(宝酒透)、Pyrobest DNA聚合酶(宝酒透)及Ex Taq DNA聚合酶(宝酒透)。

配制含以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板、以引物Eco1和Eco2为引物时、DNA聚合酶的反应液进行PCR。包括各酶的反应液的组成如下所示。

反应液组成：

1)Taq DNA聚合酶反应体系

50μl的10*Taq PCR缓冲液(宝酒透)，0.2mM dATP、dCTP、dGTP及dTTP，1.25U的Taq DNA聚合酶，100pg的大肠杆菌JM 109基因组DNA及各10pmol的引物Eco1和Eco2(终体积为50μl)。

2)Pyrobest DNA聚合酶反应体系

5μl 10*Pyrobest缓冲液(宝酒透)，0.2mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，1.25U的Pyrobest DNA聚合酶，100pg的大肠杆菌JM 109基因组DNA，以及各10pmol的引物Eco1和Eco2(终体积为50μl)

3)Ex Taq DNA聚合酶反应体系

5μl 10×TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶用的缓冲液(宝酒透)，各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP，100pg的大肠肝菌JM 109基因组DNA，1.25U的TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及各10pmol的引物Eco1和Eco2(终体积为50μl)。

再向上述反应液中分别加入终浓度为50μM、100μM、200μM的上述络合物水溶液。

反应是应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal(宝酒透)在Fast状态下进行。对于Taq DNA聚合酶和Pyrobest DNA聚合酶反应条件是以98℃、5秒～68℃、2分为1个循环，进行30个循环，对于Ex Taq DNA聚合酶反应条件是98℃、5秒～68℃、1分为1个循环进行30个循环。反应后，取5ul反应液进行含0.00005％溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳，电泳后用紫外线照射胶体可看到由扩增产物而产生的带，由此可确认扩增片段，用荧光成像分析仪-FM-BI0100(宝酒透)将扩增的DNA量数值化。其结果如表13所示。

表13

阳离子络合物 DNA聚合酶

Tap Pyrobest ExTaq

[Co(NH₃)₆]Cl₃

50μM 2.3 2.1 1.9

100μM 2.9 2.1 1.9

200μM - 2.1 -

[Co(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃

50μM 2.6 2.1 2.0

100μM 3.0 2.2 2.0

200μM - - -

[Rh(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃

50μM 1.4 1.4 1.3

100μM 2.1 1.7 1.5

200μM 2.5 2.0 1.7

不加 1 1 1

结果表明，与Taq DNA聚合酶相关的是，加入了50μM和100μM氯化六氨基钴(III)，50μM和100μM Tris(ethylenediamine)钴(III)氯化物，50μM，100μM和200μM Tris(ethylenediamine)铑(III)3氯化物的反应中与不添加这些物质时相比，DNA的扩增量增加约1.4倍～3倍。

与Pyrobest DNA聚合酶相关的是：添加了50μM、100μM和200μM氯化六氨基钴(III)，50μM和100μMTris(ethylenediamine)钴(III)氯化物，50μM、100μM和200μM Tris(ethylenediamine)铑(III)3氯化物的反应与不添加这些物质时的反应相比，DNA的扩增产量增加约1.4倍～2.2倍。

与Ex Taq DNA聚合酶相关的是：添加了50μM和100μM的氯化六氨基钴(III)，50μM和100μM Tris(ethylenediamine)铑(III)3氯化物的反应与未添加这些物质的反应相比，DNA的扩增产量约增加1.3倍～2倍。

实施例18：添加氯化六氨基钴(III)对反应时间的影响

添加氯化六氨基钴(III)检测其对与各DNA聚合酶相关的反应时间的缩短效果。

所使用的DNA聚合酶和反应液组成与实施例17相同。但至于阳离子络合物，Taq DNA聚合酶和Pyrobes t DNA聚合酶时添加终浓度为100μM的氯化六氨基钴(III)，Ex Taq DNA聚合酶时添加浓度为50μM的氯化六氨基钴(III)。

反应是使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal在Fast状态下进行。应用Taq DNA聚合酶和Pyrobest DNA聚合酶时反应条件是98℃、5秒～68℃、60秒或80秒或100秒或120秒为1个循环，进行30个循环，应用Ex Taq DNA聚合酶时反应条件是98℃、5秒～68℃30秒或40秒或50秒或60秒为1个循环，进行30个循环。

另一方面，以不加上述阳离子络合物的作对照，求出其获得与上述反应相同扩增产物量时所需退火及伸长反应时间或循环数。

反应终止后聚5μl反应液进行含0.00005％溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳，电泳后用紫外线照射胶体可看到由扩增产物产生的带，由此确认扩增片段。其结果如表14所示。

表14

阳离子络合物

DNA聚合酶加不加

Taq和Pyrobest 98℃，5s-68℃，60s 98℃，5s-68℃，120s

30循环 31循环

(需时： (需时：

2953s) 4911s)

ExTaq 98℃，5s-68℃，40s 98℃，5s-60℃，60s

30循环 30循环

(需时： (需时：

2294s) 2953s)

如表14所示，应用Taq DNA聚合酶和Pyrobest DNA聚合酶时，添加100μM氯化六氨基钴(III)与不添加时相比反应时间约缩短到3/5。用Ex Taq DNA聚合酶时，添加50μM氯化六氨基钴(III)与不添加时相比反应时间缩短到约4/5。

实施例19：添加氯化六氨基钴(III)对扩增灵敏度的影响

添加氯化六氨基钴(III)检测其对各DNA聚合酶检测灵敏度的影响。

所使用的DNA聚合酶及反应液组成与实施例17相同，但对于TaqDNA聚合酶及Pyrobest DNA聚合酶添加终浓度为100μM的氯化六氨基钴(III)，对于Ex Taq DNA聚合酶添加终浓度为50μM的氯化六氨基钴(III)。模板DNA的量分别添加1pg、5pg、10pg、100pg或1ng。

反应时应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal在Fast状态下进行。应用Taq DNA聚合酶及Pyrobest DNA聚合酶时反应条件是98℃、5秒～68℃、2分为1个循环，进行30个循环；应用Ex Taq DNA聚合酶时反应条件是98℃、5秒～68℃，1分为1个循环，进行30个循环。

另一方面，以未添加阳离子络合物的作对照进行同样的反应。

反应终止后，取5μl各反应液进行含0.00005％溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶电泳，电泳后用紫外线照射胶体可看到由扩增产物而来的带，依此可进行确认。

结果表明，无论应用哪一种酶，添加氯化六氨基钴(III)后即使用1pg的模板DNA也能扩增。而不添加时在1pg模板DNA量时未进行扩增。

实施例20：添加氯化六氨基钴(III)对在低镁浓度反应液中进行的扩增反应的影响

应用氯化六氨基钴(III)，检测其在镁浓度比平时低的反应液中进行的扩增反应的影响。

除各DNA聚合酶应用的无镁10×PCR缓冲液(均为宝酒透)外，DNA聚合酶及反应液组成与实施例17相同。添加的氯化镁的量比通常的含量少，Taq DNA聚合酶时加0.7mM而非常量1.5mM，Pyrobest DNA聚合酶时加0.5mM而非常量1mM，Ex Taq DNA聚合酶时加1.25mM而非常量2mM。至于阳离子络合物，Taq DNA聚合酶和Pyrobest DNA聚合酶时加终浓度为100μM的氯化六氨基钴(III)，Ex Taq DNA聚合酶时加终浓度为10μM的氯化六氨基钴(III)。

反应时使用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal，在Fast状态下进行。应用Taq DNA聚合酶及Pyrobest DNA聚合酶时反应条件为98℃、5秒～68℃、2分为1个循环，进行30个循环；应用Ex Taq DNA聚合酶时反应条件98℃、5秒-68℃、1分为1个循环，进行30个循环。

另一方面，以不添加阳离子络合物的作对照进行同样的反应。

反应终止后，取5μl各反应液，进行含0.00005％溴化乙键的2％琼脂糖凝胶电泳，电泳后用紫外线照射胶体可看到扩增产物产生的带，由此可确定扩增片段。

结果，对于所有的DNA聚合酶，当镁离子浓度比通常含量低时，通过添加阳离子络合物仍可看到扩增片段。但不添加阳离子络合物时没有扩增。

实施例21：添加氯化六氨基钴(III)对在低引物浓度的反应液中进行的扩增反应的影响

应用氯化六氨基钴(III)，检测在比平常引物浓度低的反应液中对扩增反应的影响。

所使用的DNA聚合酶和反应液组成和实施例17相同。但所使用的2种引物的量分别为2、2.5、3.3、5、10或20pmol。应用Taq DNA聚合酶时添加终浓度为10μM的氯化六氨基钴(III)，应用Ex Taq DNA聚合酶时加终浓度为50μM的氯化六氨基钴(III)。

反应时应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal在Fast状态下进行。应用Taq DNA聚合酶及Pyrobest DNA聚合酶时，反应条件为98℃、5秒～68℃、2分为1个循环，进行30个循环；应用Ex TaqDNA聚合酶时以98℃、5秒～68℃，1分为1个循环，进行30个循环。

反应终了后，取5μl各反应液进行2％含0.00005％溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，电泳后由紫外线照射胶体可看到由扩增片段产生的带，由此来确定扩增片段。

结果表明，应用Taq DNA聚合酶时，存在阳离子络合物的情况下即使在2pmol的引物量也能进行扩增。而不添加时则不能扩增。应用Pyrobest DNA聚合酶时，阳离子络合物存在时引物量为3.3pmol时也能看到扩增。而不添加时则看不到扩增。应用Ex Taq DNA聚合酶时，阳离子络合物存在时即使引物量为2.5pmol也能进行扩增。而不添加时则不能扩增。

实施例22：添加氯化六氨基钴(III)对酶量与扩增反应的影响

在酶量为通常半量的情况下检测氯化六氨基钴(III)对扩增反应的影响。

酶应用Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶。

除所使用的DNA聚合酶量以外，反应液的组成与实施例17相同。

也就是使用0.625U的DNA聚合酶。应用Taq DNA聚合酶和PyrobestDNA聚合酶时添加的阳离子络合物是终浓度为100μM的氯化六氨基钴(III)；应用Ex Taq DNA聚合酶时添加终浓度为50μM的氯化六氨基钴(III)。

反应是应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal在Fast状态下进行。应用Taq DNA聚合酶时反应条件是98℃、5秒～68℃、2分为1个循环，进行30个循环；应用Ex Taq DNA聚合酶时，以98℃、5秒～68℃1分为1个循环，进行30个循环。

另一方面，以应用1.25U DNA聚合酶、不添加阳离子络合物的反应液对作照，进行同样的反应。

反应终止后取5μl各反应液进行2％含0.00005％溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，电泳后用紫外线照射胶体，可看到扩增产物产生的带，由此可确认扩增片段。

结果表明Taq DNA聚合酶和Ex Taq DNA聚合酶任一种酶在阳离子络合物存在的情况下，即使在通常用量的半量，可与不添加该物质时的常用量进行几乎同等的扩增。

实施例24：扩增高GC含有区域时添加阳离子络合物的效果

以高GC区域为目标进行PCR扩增时，检测添加阳离子络合物时的效果。阳离子络合物使用Tris(ethylenediamine)钴(III)氯化物和Tris(ethylenediamine)铑(III)3氯化物·3H₂O，按常规方法从HT29细胞制备模板DNA。扩增区域及扩增长度是：人ApoE基因组区域，441bp。该区域的GC含量是大约74％。DNA聚合酶是应用TaKaRa LA-Taq DNA聚合酶(宝酒透，以下称作LA-Taq DNA聚合酶)。反应液组成如下所示。

反应液组成：

25μl的2×GC缓冲液I(宝酒透)，0.4mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP，2.5U的LA-TaqDNA聚合酶，100ng的HT29细胞基因组DNA及各20pmol的引物ApoE-1和Apo E-2(终体积为30μl)。向该反应液中分别加入终浓度为50、100、200、500μm的上述阳离子络合物。

反应是应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal，在Fast状态下进行的。反应条件是98℃，5秒～64℃，10秒～72℃，40秒为1个循环，进行30个循环。另一方面，以未添加阳离子络合物的作对照进行同样的反应。

反应终止后取5μl的各反应液进行2％含0.00005％溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，电泳后用紫外线照射时可看到扩增产物产生的带，由此确认扩增片段。

结果表明，添加Tris(ethylenediamine)钴(III)氯化物时，随着添加浓度的增加而促进DNA合成反应。另外，添加Tirs(ethylenediamine)铑(III)3氯化物·3H₂O时随添加浓度1.10μm、200μm、500μm的增高可促进DNA合成反应。但是，不添加任何阳离子络合物时未进行扩增。

实施例24：添加阳离子络合物对扩增长度的影响

观察添加阳离子络合物时对扩增长度的影响。阳离子络合物是使用六基钴(III)3氯化物。模板DNA是应用大肠杆菌基因组或λDNA。应用Taq DNA聚合酶及Pyrobest DNA聚合酶时，应用引物组分Eco1和Eco5；应用LA-Taq DNA聚合酶时应用引物组合λL36和λR485。DNA聚合酶是应用TaqDNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶及LA-Taq DNA聚合酶。反应液的组成除Taq DNA聚合酶和Pyrobest DNA聚合酶时使用上述引物对及10ng大肠杆菌基因组作模板DNA以外，其余与实施例17相同。应用Taq DNA聚合酶时向反应液中加入终浓度为10μM及20μM的六氨基钴(III)3氯化物，Pyrobest DNA聚合酶时加入终浓度50μM及100μM的六氨基钴(III)3氯化物。制备不添加阳离子络合物的反应液作对照。

另一方面，用LA-Taq DNA聚合酶时反应液的组成如下所示。

5μl的10×LA-PCR缓冲液II(Mg²⁺)(宝酒透)，0.4mM的dATP、dCTP、dGTP及dTTP，2.5U的LA-Taq DNA聚合酶，1ng的λDNA，各20pmol的引物λL36和λR485(终体积为50μl)。向上述反应液中添加终浓度达50mM的六氨基钴(III)3氯化物。同样制备不含阳离子络合物的反应液作对照。

反应是应用TaKaRa PCR Thermal Cycler Personal，在Fast状态下进行。Taq DNA聚合酶及Pyrobest DNA聚合酶时，反应条件为98℃、5秒～68℃、10秒为1个循环，进行30个循环。LA-Taq DNA聚合酶时，94℃处理1分钟后，98℃、10秒～68℃、15分为1个循环进行30个循环，72℃、15分钟处理终止反应。

反应终止后取5μl各反应液进行2％含0.00005％溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，电泳后用紫外线照射可看到扩增产物产生的条带，由此确认扩增片段。

结果发现，使用Taq DNA聚合酶时，无论添加任何浓度的六氨基钴(III)3氯化物均能很好地扩增目的片段。但不添加时只有微量的扩增。使用Pyrobest DNA聚合酶时无论添加任何浓度的六基钴(III)3氯化物均能很好地扩增出目的片段。但不添加时只有微量扩增。使用LA-Taq DNA聚合酶时，添加六氨基钴(III)3氯化物时可很好地扩增目的DNA片段。但不添加时只能微量扩增目的片段。

产业上利用的可能性

本发明提供了促进由DNA聚合酶介导的DNA合成反应的DNA合成反应促进剂。该促进剂可作用于各种DNA聚合酶，促进其DNA合成反应。另外，本发明提供能高效合成DNA的DNA合成反应组合物。本发明的DNA合成反应促进剂及DNA反应组合物可用于DNA聚合酶适用的各种操作，如PCR法等，可用作基因工程学研究中用的试剂。

序列表

<110>宝酒造株式会社

<120>DNA合成方法

<130>99-017-PCT

<150>JP 10-114005

<151>1998-4-23

<150>JP 10-315243

<151>1998-11-6

<160>18

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gatgagttcg tgtccgtaca act 23

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

acaaagccag ccggaatatc tg 22

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatg 35

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ggttatcgaa atcagccaca gcgcc 25

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gcgtacctt tgtctcacggg caa 23

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gatagctgtc gtcataggac tc 22

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cttaaccagt gcgctgagtg act 23

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttgccacttc cgtcaaccag gcttatca 28

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

tgtccgtcag ctcataacgg tacttcacg 29

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atatctggcg gtgcaatatc ggtactgt 28

<210>11

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gacaatctgg aatacgccac ctgacttg 28

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gggcggcgac ctcgcgggtt ttcgctattt atga 36

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

taacctgtcg gatcaccgga aaggacccgt aaagtg 36

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ggtggcgatg caaatgcaat cttcgttgcc ccaac 35

<210>15

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ttatgtatgc cgcgtatcag cttcatgtct ggctc 35

<210>16

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

atcatctaac ctgttctgga aaacgcttgc gcagc 35

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

aagcgcctgg cagtgtacc 19

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

cttcggcgtt cagtgattgt c 21

Claims

1.DNA合成反应组合物，它含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

2.权利要求1的DNA合成反应组合物，它含有α型DNA聚合酶和非α非polI型DNA聚合酶。

3.DNA合成方法，其特征在于，进行DNA合成反应时应用了2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

4.权利要求3的DNA合成方法，它使用了α型DNA聚合酶和非α非polI型DNA聚合酶。

5.权利要求3或4的DNA合成方法，它通过聚合酶链式反应(PcR)法进行的。

6.用于体外合成DNA的试剂盒，它含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

7.权利要求6的试剂盒，它含有α型的DNA聚合酶和非α非polI型的DNA聚合酶。

8.权利要求6或7的试剂盒，它还含有用于DNA合成的试剂。

9.权利要求6-8任一权项中的试剂盒，其中DNA聚合酶是耐热性DNA聚合酶。