CN1856579A - 使用热稳定酶合成多核苷酸的方法 - Google Patents

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玛乔丽·F.·奥莱克夏克
道格拉斯·L.·克劳福德
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明揭示了合成与靶多核苷酸互补的多核苷酸的方法，包括将包含热稳定聚合酶的非嗜热细胞置于有效破坏细胞的温度下以形成反应混合物，其中所述反应混合物包含靶多核苷酸及与靶多核苷酸的一段序列或者所述多核苷酸侧翼的一段序列杂交的一或多个引物，以及将所述反应混合物在使得所述多核苷酸得以合成的条件下温育的步骤。本发明还揭示了根据本发明的细胞文库和试剂盒。

Description

使用热稳定酶合成多核苷酸的方法
相关申请的交叉参考
本申请根据35 USC§119要求美国临时申请系列号60/505,300的优先权，该申请全文并入本文作为参考。
关于联邦资助的研究或开发的说明
美国政府依据National Science Foundation基金编号IBN9986602和DBI-007452在此申请中拥有一定权利。
导言
本发明一般涉及分子生物学和生物技术领域。特别地，本发明提供了使用在细胞中(in cyto)产生的热稳定酶合成靶序列的拷贝的方法、细胞和试剂盒。
生物技术领域通常依赖于酶的分离和纯化以进行克隆、测序、扩增及许多其它程序。热稳定酶的发现显著改良了这些程序，因为这些酶提供了较高的稳定性、活性和特异性，明显增强了其在实验室中的效用。目前使用热稳定酶的技术需要提前分离和纯化。在常规应用中，将纯化的热稳定酶加入含有分离的靶多核苷酸的合适的反应混合物中，随后在反应溶液中在升高的温度下使用。文献中有这些技术的许多实例，包括PCR、多核苷酸的测序及限制性内切核酸酶消化。
已经开发出了在加入酶之前不需要分离和纯化靶多核苷酸的一些技术。例如包括使用phi 29 DNA聚合酶及菌落的滚环扩增(RCA)或“dirty”PCR。用于这些技术的起始材料典型是含有靶质粒的细菌细胞。与从细胞污染物中分离所述靶质粒不同，这些技术是直接在裂解的细胞制备物上进行。
尽管存在不用预先分离和纯化而操纵靶多核苷酸的方法，但现有技术仍通常需要使用纯化的热稳定酶。预先进行酶纯化的必要性相当大地增加了利用分子技术所需的成本和处理步骤。
发明简述
一方面，本发明提供了合成与靶多核苷酸互补的多核苷酸的方法。所述方法包括将包含热稳定聚合酶的非嗜热细胞置于有效破坏细胞的温度下以形成反应混合物，其中所述反应混合物包含所述靶多核苷酸及与所述靶多核苷酸的序列或者与所述靶多核苷酸侧翼的序列杂交的一或多个引物，以及将所述反应混合物在使得与所述靶多核苷酸的至少一部分互补的多核苷酸得以合成的条件下温育的步骤。
另一方面，本发明提供了包含非嗜热细胞群的文库，所述细胞群包含多个靶多核苷酸，所述细胞群中至少一种细胞包含编码热稳定聚合酶的多核苷酸。
本发明进一步提供了用于合成多核苷酸的试剂盒。试剂盒包括非嗜热细胞群，其中至少一种细胞包含编码热稳定聚合酶的多核苷酸。
附图简述
图1描述了在具有编码水生栖热菌(Thermus aquaticus)热稳定聚合酶的单独质粒的大肠杆菌(E.coli)中靶1.1Kb cDNA的扩增的琼脂糖凝胶确认。
图2描述了在具有编码水生栖热菌热稳定聚合酶的单独的低拷贝质粒的大肠杆菌中靶1.1Kb cDNA的扩增的琼脂糖凝胶确认。
图3描述了在具有整合在染色体上的水生栖热菌热稳定聚合酶的大肠杆菌中质粒编码的靶1.1Kb cDNA的扩增的琼脂糖凝胶确认。
图4描述了从文库中扩增靶cDNA的琼脂糖凝胶确认。文库宿主细胞是表达水生栖热菌热稳定聚合酶及在单独的质粒上保持cDNA的大肠杆菌。
图5描述了从高拷贝、低拷贝和单拷贝克隆载体中扩增靶抗性序列的凝胶确认。
图6描述了从大肠杆菌中扩增基因组RNAse I的凝胶确认。
图7描述了从未鉴定的基因组文库中扩增靶多核苷酸的凝胶确认。
发明详述
生物技术中酶的常规应用需要纯化以及纯化的酶的贮存，然后将纯化的酶用于各种分子技术中。与所有纯化的酶一样，热稳定酶典型地需要单独的贮存和使用条件。例如，热稳定聚合酶在其发挥功能的缓冲液中是相对不稳定的。另外，贮存的纯化的酶随着时间的推移趋于丧失活性。本发明通过消除纯化的酶的单独贮存和使用需要而降低了使用热稳定酶的分子技术的成本。另外，由于处理步骤减少，因此本发明便于应用和提高产量。
一方面，本发明提供了使用热稳定聚合酶合成与感兴趣的靶多核苷酸互补的多核苷酸的方法。与热稳定聚合酶的常规应用不同，本发明的方法不需要预先纯化例如天然或重组的热稳定聚合酶。通常的，将表达热稳定聚合酶的非嗜热细胞暴露于有效破坏细胞的温度，从而将所述热稳定聚合酶在使得与所述靶多核苷酸的至少一部分互补的多核苷酸得以合成的条件下暴露于含有所述靶多核苷酸及一或多个引物的反应混合物。
根据本发明，非嗜热细胞用作宿主细胞。合适的非嗜热细胞是典型在正常细胞培养条件下能保持编码热稳定聚合酶的多核苷酸及表达功能性热稳定酶的那些细胞。在温度提高时，非嗜热细胞被破坏而所述热稳定聚合酶保持活性。应意识到非嗜热细胞的破坏可包括至少结构及其它细胞蛋白的热变性和/或破坏，由此所述热稳定聚合酶变得可用于反应混合物中。当然，有效破坏细胞的温度依赖于选择作为非嗜热宿主的细胞的类型。合适的非嗜热细胞包括原核细胞和真核细胞。一种合适的原核细胞是大肠杆菌，然而任何细菌细胞均可以由本领域技术人员选择用于本发明的方法中。可以使用的合适的真核细胞包括哺乳动物细胞和酵母细胞。
根据本发明由非嗜热细胞表达的热稳定聚合酶可包括例如DNA聚合酶、RNA聚合酶和逆转录酶。合适的聚合酶的选择依赖于希望的功能而定。只要在有效破坏宿主细胞蛋白质的温度是稳定的任何聚合酶均适用于本发明。典型地，热稳定聚合酶是在温度升高的条件下保持活性即能进行引物延伸的聚合酶。合适的聚合酶包括最初分离自嗜热细菌包括但非限于Thermococcus litoralis、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermos flavus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)或海栖热袍菌(Thermotoga maritem)的那些聚合酶。如本领域技术人员所意识到，具有突变的重组聚合酶也可以在非嗜热宿主细胞中表达。宿主细胞可表达一种以上的聚合酶。
编码热稳定聚合酶的多核苷酸可以通过标准方法在克隆载体上编码并导入宿主细胞中。所述载体可以是自主复制的多核苷酸，如质粒，其保持在宿主细胞质中或者可以整合进宿主细胞的基因组中。可以使用的克隆载体的代表性实例包括病毒颗粒、杆状病毒、噬菌体、质粒、噬菌粒、粘粒、phosmid、细菌人工染色体、病毒DNA(例如痘苗病毒、腺病毒、禽类痘病毒、假狂犬病病毒及SV40的衍生物)、基于P1的人工染色体、酵母质粒及酵母人工染色体。如本领域技术人员所意识到，只要在宿主中可复制并可存活，任何克隆载体都可以使用。另外，本领域已知将编码热稳定聚合酶的多核苷酸整合进宿主细胞基因组中的方法，可包括使用可转座的遗传元件、病毒载体、或者使用重组酶进行的等位基因交换。
编码非嗜热细胞中存在的热稳定聚合酶的多核苷酸可以与在宿主细胞中起作用的启动子可操纵地连接。启动子可以是组成型启动子或者诱导型启动子。如本领域技术人员所意识到，在细菌中有用的合适启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。在真核细胞中有用的合适启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR、及小鼠金属硫蛋白-I启动子。额外的控制序列例如增强子也可以与启动子或编码序列可操纵地连接。合适的启动子和/或控制序列的选择在本领域技术人员的知识水平范围内。
编码热稳定聚合酶的多核苷酸也可以包括编码可选择的标记的一或多个序列，以提供选择转化的宿主细胞的表型特性。本领域常规使用的可选择的标记包括抗生素抗性标记，如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性标记。
可以使用标准方法将靶多核苷酸导入非嗜热细胞中，例如用克隆载体转化或转染所述细胞，或者可以作为分离的DNA加入到反应混合物中。或者，可以将包含靶多核苷酸的第二种宿主细胞与用编码热稳定聚合酶的多核苷酸转化的细胞共培养或者加入到反应混合物中。当作为分离的DNA存在于反应混合物中时，所述靶多核苷酸可以是线性或附加型的。如本领域技术人员所意识到，其中将靶多核苷酸直接导入非嗜热细胞中的本发明的实施方案消除了在聚合之前分离和纯化所述靶多核苷酸的需要。在这些实施方案中，所述靶多核苷酸可以在也编码所述热稳定聚合酶的载体上编码，或者可以导入第二个克隆载体上，或者可以整合进所述非嗜热细胞基因组中。在聚合之前分离及纯化靶多核苷酸的需要也可以在其它实施方案中消除，其中在所述实施方案中靶多核苷酸在与包含所述热稳定聚合酶的非嗜热细胞共培养的第二种细胞中编码。
反应混合物基于非嗜热细胞被破坏而形成。细胞的破坏和细胞蛋白质的变性通过引物杂交和嗜热聚合酶介导的延伸而提供了靶多核苷酸的互补体的特异性聚合。引物可以与靶多核苷酸的序列杂交，或者与靶多核苷酸侧翼的序列杂交，例如与克隆载体的序列如多克隆序列杂交。也与靶多核苷酸的互补体杂交的引物任选地包含在反应混合物中以提供第二条链的合成。除了与靶多核苷酸(或者靶多核苷酸侧翼的序列)及其互补体杂交的引物之外，反应混合物适当地进一步含有可以由技术人员优化的缓冲液以调节杂交条件的严格性和/或优化聚合酶的性能。核苷酸如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸也适于包含在反应混合物中，并且可以修饰为掺入标记如放射性标记、荧光分子或生物素，以用于随后的应用中。对于测序应用可包括标记的双脱氧核苷酸。
应了解非嗜热细胞可以加入到含有引物、核苷酸和缓冲液的溶液中，之后破坏所述细胞以形成反应混合物，或者含有引物、核苷酸和缓冲液的溶液可以加入到被破坏的细胞中以形成反应混合物。应进一步意识到在不偏离本发明的范围内，细胞、靶多核苷酸、缓冲液、引物和核苷酸可以以任何顺序加入到反应混合物中，并且可以在任何时间施加有效破坏细胞的温度。
与靶多核苷酸互补的多核苷酸的聚合可以通过热循环或者PCR实现。热循环条件可以由技术人员根据经验考虑到一些因素如聚合酶的特性、引物的长度和碱基组成以及反应缓冲液的离子强度而不用过度实验确定。合适的循环方案的代表性实例如下：进行32次如下循环：94℃20秒以使DNA变性、随后在70℃进行1-4分钟以使得引物退火及延伸，在这些循环之后，最后在72℃进行15分钟延伸。本发明也涵盖了等温聚合。在等温聚合中，使用DNA解旋酶代替例如加热以分离靶链。DNA解旋酶也可以与热循环联合应用。
本发明还提供了细胞文库。本发明的细胞文库包括但非限于cDNA文库、基因组文库或表达文库。热稳定聚合酶在文库的至少一种细胞中表达，使得与基因组或cDNA插入体互补的多核苷酸基于在如上述适当条件下破坏细胞而聚合。
本发明还涵盖了包括非嗜热细胞群的试剂盒，所述细胞群中至少一种细胞表达热稳定聚合酶。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括一种包含克隆载体的多核苷酸。适当地，所述细胞是感受态细胞。试剂盒中任选进一步包含与所述克隆载体杂交的引物、至少一种反应缓冲液、核苷酸、至少一种限制性内切核酸酶、DNA解旋酶及本发明所述方法中试剂盒的使用指导。适当地，所述克隆载体包括多克隆序列。所述核苷酸可以是被标记的。
如本领域技术人员通过前文描述及如下实施例所显而易见，本发明可以包括使用可以在非嗜热细胞中表达的任何热稳定酶，包括但非限于聚合酶、连接酶、限制性内切核酸酶、DNA解旋酶及甲基化酶。另外，本发明可以使用在其它极端条件下起作用的酶，即分离自例如嗜盐微生物的那些酶等等。
提供如下实施例以助于进一步理解本发明。应用的特定材料和条件只是例证本发明而无限制之意。
实施例
实施例1：质粒编码的热稳定聚合酶
将水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶克隆进pUC18中，并与编码1.1Kb J5靶cDNA的单独质粒共转染进宿主大肠杆菌细胞中。Taq表达用0.1、0.5、1和5mM IPTG诱导。
将1-4μl的过夜宿主细胞细菌培养物加入到含有10pmol正向和反向pUC衍生质粒特异性引物中每一个引物的溶液中，所述引物为：5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACG3′[SEQ ID NO：1]5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG3′[SEQ ID NO：2]。
反应溶液还含有0.2mM dNTP和具有去污剂和DMSO的反应缓冲液，终浓度如下：50mM Tris HCl，pH 9.2(25℃)，16mM(NH4)2SO4，2.25mM MgCl2，2％(v/v)DMSO，0.1％(v/v)Tween 20。
将细菌与反应溶液的混合物加热至80℃持续20秒以使得细菌蛋白质变性，但是Taq DNA聚合酶不变性，如下进行热循环：32个如下循环：94℃ 20秒(DNA变性)、在70℃持续1-4分钟(引物退火和延伸；时间根据靶多核苷酸的大小而定)，最后在72℃延伸15分钟。为筛选聚合酶活性，将5-10％终体积在1％琼脂糖凝胶上解离。
结果示于图1。在2-5泳道观测到1.1Kb J5 cDNA的扩增受到IPTG诱导的热稳定聚合酶的影响。泳道6是没有热稳定聚合酶的对照泳道。
实施例2：低拷贝质粒编码的热稳定聚合酶
将Taq编码序列用AflIII和XbaI从pUC18切离，用T4 DNA聚合酶平端化，进行凝胶纯化，并连接进具有p15A复制起点的低拷贝质粒pACYC184的平端化的HindIII位点。将该质粒转染进也含有pBSSK-(Stratagene)中的J5 cDNA的细菌(大肠杆菌JM109和DH5α)中。如实施例1所述筛选聚合酶活性。
结果示于图2。1-5泳道示出降低的IPTG浓度。同样，靶J5 cDNA的扩增受到IPTG诱导的热稳定聚合酶的影响。
实施例3：编码热稳定聚合酶的高、低和单拷贝表达载体及抗性序列在所述表达载体上的扩增
A.表达载体的构建
扩增编码Taq热稳定聚合酶的序列并将其克隆进pUC18(氨苄青霉素抗性)的EcoRI位点，处于lacZ启动子控制之下。将这个质粒用PvuI和TfiI消化。消化后，将质粒片段用T4 DNA聚合酶平端化并在低熔点琼脂糖凝胶上纯化。将编码lacZ启动子控制下的Taq的片段在含有25ng载体DNA和50ng插入DNA的10μl体积中，使用T4 DNA连接酶连接进低拷贝(大约40个拷贝/细胞)质粒pSMARTLCKan(卡那霉素抗性质粒，Lucigen Corp，Middleton WI)和单拷贝质粒pSMART VC(氯霉素抗性质粒，Lucigen Corp，Middleton WI)中。将电感受态大肠杆菌细胞10G(Lucigen Corp，Middleton WI)用该连接混合物转化。将转化的细胞在TB培养基上生长1小时。在合适的抗生素平板上选择产生自转化的卡那霉素抗性(pSMART LCKan)或氯霉素抗性(pSMART VC)菌落。含有lacZ/Taq DNA聚合酶插入体的克隆通过在琼脂糖凝胶上进行大小分析而选择。
B.抗性序列在表达载体上的PCR扩增
挑取含有重组pUC19/Taq、pSMART LCKan/Taq和pSMARTVC/Taq的细菌的单菌落，并将每种菌落重悬于100μl裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油，0.1％TritonX-100，10μg RNaseA，1单位噬菌体T4溶菌酶)中。将裂解提取物在室温温育10分钟，在70℃温育10分钟及在冰上温育5分钟。将裂解提取物以13,000 RPM离心5分钟。
然后将裂解提取物上清进行PCR以分别从pUC19/Taq、pSMARTLCKan/Taq和pSMART VC/Taq中扩增抗性序列。PCR反应物由5μl与反应缓冲液(10mM Tris-HCl pH9.0，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，0.1％Triton X-100，25μM每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dGTP、dCTP、dTTP和dATP))混合的裂解细胞提取物及如下述引物对组成，终体积50μl。
  载体   抗性序列   引物序列
  pUC19/Taq(高拷贝)   氨苄青霉素 正向：5′-CCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAATATGTATCCGCT-3′[SEQ ID NO.：3]反向：5′-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT-3′[SEQ ID NO.：4]
  pSMARTLCKan/Taq(低拷贝)   卡那霉素 正向：5′-ACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCA-3′[SEQ ID NO.：5]反向：5′-AGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGA-3′[SEQ ID NO.：6]
  pSMART VC/Taq(单拷贝)   氯霉素 正向：5′-TATTGGGCCCTGATCGGCACGTAAGAGG-3′[SEQ ID NO.：7]反向：5′-CACCGGGCTGCATCCGATGCAAGTG-3′[SEQ ID NO.：8]
如下进行热循环：25次循环的94℃15秒、60℃15秒和72℃1分钟，最后在72℃延伸10分钟。
进行完毕的PCR反应进行凝胶电泳。结果示于图5。泳道M含有标准1Kb序列大小梯度。泳道1示出从单细菌菌落中通过高拷贝载体扩增出氨苄青霉素抗性序列。泳道2示出从单细菌菌落中通过低拷贝载体扩增出卡那霉素抗性序列。泳道3含有来自单细菌菌落的无Taq插入体的低拷贝载体。泳道4示出从单细菌菌落中通过单拷贝载体扩增出氯霉素抗性序列。泳道5含有来自单细菌菌落的无Taq插入体的单拷贝载体。这些结果表明本发明能从单细菌菌落中扩增DNA片段，而不用预先纯化DNA模板或DNA聚合酶。
实施例4：热稳定聚合酶的染色体整合
将质粒pAG408用KpnI消化以除掉绿色荧光蛋白和3′-氨基糖苷磷酸转移酶的编码序列，并重新连接以恢复原始质粒pBSL202。Taq编码序列使用AflIII从pUC18中切离，使用T4 DNA聚合酶平端化，随后用XbaI消化。将具有一个平端和一个XbaI突出端的经凝胶纯化的Taq编码序列连接进pBSL202(pAG408衍生的)的平端化的NotI位点和粘性XbaI位点，形成小-Tn5转座子衍生物以将Taq输送进革兰氏阴性菌中。这是一种基于R6K的自杀性小转座子输送质粒，在缺乏Pir蛋白的受体中不能存活，将该质粒在大肠杆菌S17-1(λpir)中增殖，并将预先用编码J5 cDNA的质粒转染的电感受态JM109细胞用纯化的编码Taq的质粒转染并用庆大霉素(30μg/ml)选择。如实施例1所述筛选庆大霉素抗性菌落的聚合酶活性。
结果示于图3。泳道3含有1.1Kb的扩增的J5 cDNA条带。
实施例5：靶多核苷酸从cDNA文库中的扩增
使用实施例1所述方法对16个不同的cDNA产物进行扩增。将表达热稳定聚合酶的细菌用从衍生自心脏文库的mRNA中逆转录的靶cDNA转染。聚合酶的表达用0.5mM IPTG诱导。
图4描述了16个靶cDNA的扩增。大小变化代表不同大小的cDNA(4,000-1,200bp)。
实施例6：使用高、低和单拷贝的Taq DNA聚合酶表达载体从大肠杆菌基因组DNA中扩增靶序列(RNase I基因)
挑取具有作为靶DNA的染色体RNAse I基因并含有克隆在高、低或单拷贝载体上的重组Taq的大肠杆菌的单菌落，将其重悬于100μl裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油，0.1％Triton X-100，10μg RNase A，1单位噬菌体T4溶菌酶)中。将裂解提取物在室温温育10分钟，在70℃温育10分钟及在冰上温育5分钟，随后以13,000RPM离心5分钟。
然后将裂解提取物的上清进行PCR。PCR反应物由5μl与反应缓冲液(10mM Tris-HCl pH 9.0，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，0.1％Triton X-100，25μM每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dGTP，dCTP，dTTP和dATP))混合的上清及针对RNAse I基因的引物对(如下所述)组成，终体积为50μl。
正向引物：
5′-AAAGCATTCTGGCGTAACGCCGCGTTGCT-3′  [SEQ  IDNO：9]
反向引物：
5′-GTGTCGCTTAAGTTAATAACCCGCTTTATCAATCACAAAGG-3′[SEQ ID NO：10]
如下进行热循环：25个循环的94℃15秒、随后60℃15秒、接着72℃1分钟，最后在72℃延伸10分钟。
将完成的PCR反应进行凝胶电泳。结果示于图6。泳道M含有标准1Kb序列大小梯度。泳道1示出从单细菌菌落使用RNase I正向和反向引物通过高拷贝质粒中的Taq聚合酶对大肠杆菌RNase I基因的扩增。泳道2示出从单细菌菌落使用RNase I正向和反向引物通过低拷贝质粒中的Taq聚合酶对大肠杆菌RNase I基因的扩增。泳道3示出从含有无插入体低拷贝载体的单细菌菌落使用RNase I正向和反向引物未扩增出大肠杆菌RNase I基因DNA。泳道4示出从单细菌菌落使用RNase I正向和反向引物通过单拷贝质粒中的Taq聚合酶对大肠杆菌RNase I基因的扩增。泳道5示出从含有无插入体单拷贝载体的单细菌菌落使用RNase I正向和反向引物未扩增出大肠杆菌RNase I基因DNA。
结果表明本发明能从单细菌菌落中扩增DNA片段，而不用预先纯化DNA模板或DNA聚合酶。将泳道4中的扩增产物经凝胶纯化，使用荧光染料化学方法(Applied Biosystems，Foster City，CA)确定该核苷酸序列是期望的RNase I基因产物。
实施例7：靶多核苷酸从基因组文库中的扩增
使用标准方法在pSMART HCKan中构建从未鉴定的嗜热细菌菌株中制备的基因组DNA的重组文库(Obsidian Library Y4.12MC)。将该重组文库转化进预先用如实施例3所述含有Taq的单拷贝载体pSMART VC转化的电感受态大肠杆菌10G细胞中。挑取含有pSMART VC/Taq和pSMART HCKan/随机DNA插入体的细菌的单菌落，将其重悬于100μl裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5，1mMEDTA，1mM DTT，50％甘油，0.1％Triton X-100，10μg RNase A，1单位噬菌体T4溶菌酶)中。将裂解提取物在室温温育10分钟，在70℃温育10分钟，及在冰上温育5分钟，随后在13,000 RPM离心5分钟。
然后将该裂解提取物的上清进行PCR。PCR反应物由5μl与反应混合物(10mM Tris-HCl pH 9.0，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，0.1％Triton X-100，25μM每种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dGTP，dCTP，dTTP和dATP))混合的上清及如下述引物对组成，终体积50μl。
氨苄青霉素正向引物：
5′-CCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAATATGTATCCGCT-3′[SEQ ID NO：11]
氨苄青霉素反向引物：
5′-TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT-3′[SEQ IDNO：12]
Z-正向引物：
5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ′[SEQ ID NO：13]
Z-反向引物：
5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′[SEQ ID NO：14]
如下进行热循环：25个循环的94℃15秒、60℃15秒和72℃1分钟，最后在72℃进行10分钟延伸。
将完成的PCR反应进行凝胶电泳。结果示于图7。泳道M含有标准1Kb序列大小梯度。泳道1示出从单细菌菌落中使用Amp引物通过单拷贝克隆的Taq聚合酶对pUC18序列进行的PCR扩增。泳道2，3，4和5示出在单细菌菌落中使用Z-正向和Z-反向引物通过单拷贝的Taq聚合酶对来自Obsidian Library Y4.12MC的质粒DNA进行的PCR扩增。
实施例8：热稳定的限制性内切酶
使用热稳定的限制性内切酶筛选质粒增殖的靶多核苷酸。高拷贝质粒用于克隆PCR产物，并且克隆被转染进具有整合进染色体中的限制性内切酶编码序列的大肠杆菌中，处于组成型启动子控制下。高拷贝质粒的多克隆位点侧翼为热稳定限制性内切酶的识别位点。为了测试插入的PCR产物的存在与否，将细胞等分例如10μl过夜培养物在存在针对所述限制性内切酶活性优化的10μl 2×缓冲液的情况下加热至80℃持续20秒。在这个温度，细菌蛋白质变性而热稳定限制性内切酶不变性。然后将加热的细菌/缓冲液溶液在热稳定限制性内切酶活性最佳的适当温度温育直至发生限制性内切酶切割。消化的产物使用凝胶电泳分辨。由于质粒的高拷贝数，来自质粒的信号(限制性内切酶消化)将完全盖过来自也是用热稳定限制性内切酶切割的细菌基因组DNA的背景干扰。
实施例9：热稳定的逆转录酶
使用整合进细菌染色体DNA中的热稳定的逆转录酶从哺乳动物细胞中产生的RNA中逆转录cDNA。这些cDNA代表靶基因的线性扩增，并已经掺入了标记以进行后续应用。具有与启动子可操纵地连接的感兴趣基因的靶质粒首先在宿主细菌中增殖。将细胞在使得诱导启动子及从DNA中产生RNA的条件下培养。然后在存在针对逆转录酶活性而优化的缓冲液的情况下将所述细菌加热至80℃持续20秒。在这个温度，细胞裂解，细菌蛋白质变性。然后向反应混合物中加入标记的三磷酸核苷酸和靶特异性引物。将反应混合物冷却以使得靶特异性引物与靶结合。随后，使用与模板RNA结合的靶特异性引物，热稳定逆转录酶可以逆转录特异性cDNA。最后的结果是单链cDNA的线性扩增，其可用于后续应用中。
实施例10：热稳定的甲基化酶
热稳定的甲基化酶在细菌内增殖的质粒上编码并用于甲基化编码靶多核苷酸的高拷贝质粒。将宿主细胞在存在针对甲基化活性而优化的缓冲液的情况下加热至80℃持续20秒，从而使得细菌蛋白质变性而热稳定甲基化酶不变性。甲基化的高拷贝质粒可以直接从反应混合物中使用。由于质粒的高拷贝数，甲基化的质粒将完全盖过来自细菌基因组DNA的背景干扰。
实施例11：测序
挑取含有克隆在高、低或单拷贝载体上的重组Taq聚合酶和克隆在另一个质粒上的靶多核苷酸的细菌单菌落并重悬于11μl水中。加入1μl引物(4pmol)，2μl BigDye(Applied Biosystems)和6μl 2.5×缓冲液[5×是400mM Tris pH 9，10mM MgCl2]。将反应混合物置于热循环设备中，最初在95℃放置3分钟，然后在96℃10秒钟、58℃4分钟，循环50次，最后在72℃放置7分钟结束。将反应物通过乙醇沉淀或旋转柱层析而澄清，在70℃干燥15分钟，重悬于20μl甲酰胺中，之后上样于ABI310自动DNA测序仪中。
如本说明书和所附权利要求所用，除非特别说明，单数的“一个”、“一种”包括复数指代。因此，例如含有“一种多核苷酸”的组合物包括两或多种多核苷酸的混合物。还应注意到术语“或”除非特别说明通常以“和/或”的含义应用。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均是本发明涉及领域的技术人员的水平的指示。所有出版物、专利和专利申请均并入参考，如同对每一篇出版物或专利申请特定地及单独地进行参考。在本文与并入的专利、出版物和参考文献之间有冲突的情况中，以本文为准。
以上参考各个具体的实施方案和技术对本发明进行了阐述。然而应理解在本发明的精神和范围内可以对本发明进行许多变化和修改。
                     序列表
<110>密苏里大学
<120>使用热稳定酶合成多核苷酸的方法
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<140>New International Application
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<151>2003-09-23
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
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<220>
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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<223>Synthetic oligonucleotide
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agcggataac aatttcacac agga                            24

Claims (37)

1.一种合成与靶多核苷酸互补的多核苷酸的方法，包括：
a)将包含热稳定聚合酶的非嗜热细胞置于有效破坏细胞的温度下以形成反应混合物，其中所述反应混合物包含所述靶多核苷酸及与所述靶多核苷酸的序列或者与所述靶多核苷酸侧翼的序列杂交的一或多个引物；和
b)将所述反应混合物在使得与所述靶多核苷酸的至少一部分互补的多核苷酸得以合成的条件下温育。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞包含与在细胞中起作用的启动子可操纵地连接的编码热稳定聚合酶的多核苷酸。
3.权利要求2的方法，其中所述编码热稳定聚合酶的多核苷酸整合入细胞的基因组中。
4.权利要求2的方法，其中所述细胞包含一种克隆载体，所述克隆载体包含编码热稳定聚合酶的序列。
5.权利要求4的方法，其中所述克隆载体进一步包含所述靶多核苷酸。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞包含一种克隆载体，所述克隆载体包含所述靶多核苷酸。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞包含第一个克隆载体，该载体包含编码热稳定聚合酶的序列，且其中所述细胞进一步包含第二个克隆载体，该载体包含靶多核苷酸。
8.权利要求1的方法，其中所述反应混合物进一步包含与步骤b)中合成的互补多核苷酸杂交的一或多个引物。
9.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含一或多种脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或双脱氧核苷酸。
10.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含一种反应缓冲液。
11.权利要求1的方法，其中所述反应混合物包含一种克隆载体，所述克隆载体包含靶多核苷酸。
12.权利要求11的方法，其中第二种非嗜热细胞包含所述克隆载体。
13.权利要求11的方法，其中病毒包含所述克隆载体。
14.权利要求11的方法，其中所述克隆载体是线性化的。
15.权利要求11的方法，其中所述克隆载体是附加型载体。
16.权利要求1的方法，其中所述热稳定聚合酶是一种逆转录酶、RNA聚合酶或DNA聚合酶。
17.权利要求1的方法，其中所述热稳定聚合酶选自在Thermococcus litoralis、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermus flavus)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)或海栖热袍菌(Thermotoga maritema)或其重组变体中天然表达的聚合酶。
18.权利要求1的方法，其中b)步骤的条件包括热循环。
19.权利要求1的方法，其中所述反应混合物进一步包含一种DNA解旋酶。
20.权利要求1的方法，其中所述细胞是原核细胞。
21.权利要求20的方法，其中所述原核细胞是大肠杆菌。
22.权利要求1的方法，其中所述细胞是真核细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
24.权利要求1的方法，其中所述细胞是酵母细胞。
25.一种包含非嗜热细胞群的文库，所述细胞群包含多个靶多核苷酸，所述细胞群中至少一种细胞包含编码热稳定聚合酶的多核苷酸。
26.用于根据权利要求1的方法合成多核苷酸的试剂盒，其包含非嗜热细胞群，所述细胞群中至少一种细胞包含编码热稳定聚合酶的多核苷酸。
27.权利要求26的试剂盒，其进一步包含一种多核苷酸，该多核苷酸包含克隆载体。
28.权利要求26的试剂盒，其中所述细胞是感受态细胞。
29.权利要求27的试剂盒，其进一步包含与所述克隆载体杂交的一或多个引物。
30.权利要求27的试剂盒，其中所述克隆载体包含一个多克隆序列。
31.权利要求26的试剂盒，其进一步包含至少一种反应缓冲液。
32.权利要求26的试剂盒，其进一步包含一或多种脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或双脱氧核苷酸。
33.权利要求32的试剂盒，其中至少脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或双脱氧核苷酸之一包含一可检测的标记。
34.权利要求26的试剂盒，其进一步包含至少一种限制性内切核酸酶。
35.权利要求26的试剂盒，其进一步包含一种连接酶。
36.权利要求26的试剂盒，其进一步包含一种DNA解旋酶。
37.权利要求26的试剂盒，其进一步包含试剂盒的使用说明书。
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